CN105132347B - 一株高效转化l-天冬氨酸生产l-天冬酰胺的工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株用于生产l‑天冬酰胺的基因工程菌CICC 11034S，宿主为大肠埃希氏菌BL21(DE3)（Escherichia coli BL21(DE3)），含有来源于大肠埃希氏菌JM109（Escherichia coli JM109）的l‑天冬酰胺合成酶基因的表达载体。利用构建的工程菌全细胞高密度催化，可以高效转化l‑天冬氨酸生产l‑天冬酰胺，转化率为95.8%，l‑天冬酰胺产量可达126.5 g/L，生产速率为15.81 g/(L·h)，底物廉价，生产过程简便，副产物少，有效降低生产成本，具有很好的应用价值和可观的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一株基因工程菌及其应用，以L-天冬氨酸和氨水为底物转化生产L-天冬酰胺，属于生物工程技术领域。
背景技术
L-天冬酰胺，又名天门冬酰胺、天门冬素、α-氨基丁二酸一酰胺（L-Asparagine，L-Asn），在食品、医药、化工合成等行业得到广泛应用。
在食品领域，L-天冬酰胺作为添加剂，与糖共热进行氨基-羰基反应，能形成特殊香味物质。用于清凉饮料。在医药行业，可以用于氨基酸输液及降压、平喘、抗消化性溃疡、胃功能障碍等，在生命科学领域研究中，常用于治疗心肌梗死、心肌代谢障碍、心力衰竭、心脏传导阻滞、疲劳等症，在微生物培养中也有添加。工业领域L-天冬酰胺可以用于医药中间体及化工原料进行合成化工，也可用于丙烯腈的污水处理等。
目前，L-天冬酰胺的制备方法主要是提取法和化学合成法。直接提取方法主要是从L-天冬酰胺含量高的羽扇豆和大豆的豆芽的水提取物分离而得，以白羽扇豆为原料，经发芽、成浆、加热处理等流程，在pH小于6的条件下，经硅藻土过滤、离心，获得粗品，随后经过浓缩、结晶获得成品，该方法受原材料质量因素影响大，并且工艺复杂不易控制，污染严重；化学合成法主要通过L-天冬氨酸与氢氧化铵进行酰胺化而得，化学方法存在普遍的污染大、副反应多等缺陷。
生物转化法在天冬酰胺生产领域的应用鲜有报道，虽然该方法具有反应条件温和、生产效率高、副产物少等优点，同时对设备的要求低、投资小、生产过程简单，易于操作控制，但是由于酶法催化过程需要ATP的参与，因ATP价格昂贵限制了生物转化法的应用，目前未进入产业化阶段。
发明内容
本发明提供一株可以表达L-天冬酰胺合成酶的基因工程菌株CICC 11034S，利用菌体细胞ATP再生体系，转化L-天冬氨酸和氨水生产L-天冬酰胺，以替代现有L-天冬酰胺生产工艺，实现绿色生产。
本发明成功实现了将asnA基因在E. coli BL21(DE3)宿主菌中的高效表达，并以此基因工程菌株转化L-天冬氨酸和氨水生产L-天冬酰胺，具有原料成本低、生产过程简易、简便高效等特点（附图1）。
本发明底物L-天冬氨酸及产物L-天冬酰胺的定量测定分析采用柱前衍生-高效液相色谱方法（Hender JW, et al., Rapid, accurate, sensitive and reproducibleHPLC analysis of amino acids. Agilent Technologies. USA. 2000）。
本发明具有的突出特点是：
（1）本发明通过菌体细胞的ATP再生系统为反应提供ATP，有效降低了原料的成本。
（2）本发明方法构建的基因工程菌生产L-天冬酰胺的过程简便，易于操作。
（3）本发明的基因工程菌生产L-天冬酰胺，转化率为95.8%，产量可达126.5 g/L，生产速率15.81 g/(L·h)。
（4）本发明方法构建的基因工程菌可用于DL-天冬氨酸的拆分，生产L-天冬酰胺和D-天冬氨酸。
附图说明
图 1 工程菌CICC 11034S转化L-天冬氨酸生产L-天冬酰胺示意图。
图 2 工程菌CICC 11034S全细胞高密度转化L-天冬氨酸生产L-天冬酰胺。
具体实施方式
实施例1. 菌株E. coli BL21(DE3)/pET28a-asnA的构建
利用天根基因组提取试剂盒提取E. coli JM109的基因组DNA，以其为模板，以引物AsnAU（5’-GCC GAA TTC ATG AAA ACC GCT TAC-3’，携带EcoRI酶切位点）和AsnAD（5’-GTT AAGCTT TTA CAG CAG AGA AGG GAC-3’，携带Hind III酶切位点）扩增asnA基因。随后以EcoRI/HindIII同时酶切处理扩增的asnA基因和pET28a(+)载体，纯化后采用T4 DNA连接酶连接，转化E. coli BL21(DE3)，挑取转化子，鉴定、测序，获得基因工程菌株，命名为E. coli BL21(DE3)/pET28a-asnA，于CICC保藏，保藏号：CICC 11034S。
实施例2. 基因工程菌CICC 11034S的发酵
将基因工程菌接种到发酵培养基（1 L水中加入玉米浆干粉10 g，硫酸镁0.2 g，磷酸二氢钾1.0 g，氯化钠1.5 g，氨水调节pH 6.5 -7.5，卡那霉素0.05 g）中，37±1℃摇床培养12±2 h，获得种子液。随后将种子液以0.1-5%接种量转接到发酵培养基中，37±1℃，220rpm培养2-3 h后加入2 g/L乳糖，20-25℃，160 rpm诱导表达12±2 h，获得发酵液。
实施例3.基因工程菌CICC 11034S全细胞高密度转化生产L-天冬酰胺
L-天冬氨酸0.8-1.2 M，以氨水调pH7-9，葡萄糖0.01-0.03 M，氯化镁1-3 mM，菌体浓度为OD600nm=5-20，25-50℃，30-80 rpm搅拌催化6-12 h，定时取样采用柱前衍生-HPLC方法检测L-天冬氨酸和L-天冬酰胺，筛选优选条件。随后采用优选条件，将133 g L-天冬氨酸加入转化罐中，加入800 mL的水，然后边搅拌边加入氨水，并以pH计测定溶液pH变化情况，待L-天冬氨酸完全溶解，再以氨水调节pH为8.0，加入终浓度0.02 M葡萄糖，2 mM氯化镁，定容1 L。将发酵液离心收集菌体，生理盐水悬浮后，加入L-天冬氨酸溶液中，至菌体密度OD600nm= 10。调节温度37℃，转速50 rpm，以HPLC定量检测不同时间L-天冬氨酸和L-天冬酰胺，催化反应8 h，转化率95.8%，L-天冬酰胺的产量可达126.5 g/L，生产速率15.81 g/L（附图2）。
实施例4.基因工程菌CICC 11034S全细胞高密度拆分DL-天冬氨酸
采用实施例3优化的最佳转化条件进行DL-天冬氨酸的拆分，D-天冬氨酸保留率为100%，L-天冬氨酸转化率为93.2%。
<110> 中国食品发酵工业研究院
<120>一株高效转化天冬氨酸生产天冬酰胺的工程菌及其应用
<141>2015-07-20
<160> 1
<170> Patent In version 3.5
<210> 1
<211>993
<212>DNA
<213>大肠杆菌属
<221>asnA
<222>(1)…(993)
<400>1
atgaaaaccg cttacattgc caaacaacgt caaattagct tcgtgaaatc tcacttttct 60
cgtcaactgg aagaacgtct ggggctgatc gaagtccagg cgccgattct tagccgtgtg 120
ggggatggca cgcaggacaa cttgtcgggc tgtgaaaaag cggtgcaggt aaaagtgaaa 180
gctctgcctg atgcccagtt cgaagtggtt cattcactgg cgaagtggaa acgtcagacc 240
ttagggcaac acgacttcag cgcgggcgaa gggctgtaca cgcacatgaa agcccttcgc 300
cccgatgaag accgtctttc tccgttgcac tcggtctatg ttgaccagtg ggactgggaa 360
cgcgtaatgg gcgacggtga gcgtcaattc tcgactctga aaagcacggt agaggcgatc 420
tgggcgggaa ttaaagcaac cgaagctgcg gttagcgaag agtttggcct ggcaccgttc 480
ctgccggatc agatccactt cgtacacagc caggagttac tgtctcgtta tccggatctt 540
gatgccaaag ggcgtgagcg ggcgatagcg aaagatcttg gcgcggtatt ccttgtcggg 600
attggcggca agctgagcga tggtcatcgc cacgacgtgc gcgcaccgga ttatgatgac 660
tggagcaccc cgtcagagct gggccatgcg ggtctgaacg gcgatattct ggtgtggaac 720
ccggtactgg aagatgcgtt tgagctttcc tccatgggga tccgtgtaga tgccgacacg 780
ctgaagcatc aactggcgct gaccggtgac gaagatcgcc tggagctgga gtggcatcag 840
gcgctgctgc gcggtgaaat gccgcagacc atcggcggcg gtatcggcca gtctcgtttg 900
actatgctgc tgctgcaact gccgcatatc ggccaggttc agtgtggagt atggccagct 960
gctgttcgcg agagcgtccc ttctctgctg taa 993
Claims (3)
1.一株生产L-天冬酰胺的基因工程菌株E. coli BL21(DE3)/pET28a-asnA CICC11034S，其特征在于，所述基因工程菌的制备方法包括以下步骤：1）利用大肠埃希氏菌（Escherichia coli）JM109的基因组DNA为模板，以携带EcoRI酶切位点的AsnAU：5’-GCCGAA TTC ATG AAA ACC GCT TAC-3’，和携带Hind III酶切位点的AsnAD：5’-GTT AAGCTTTTA CAG CAG AGA AGG GAC-3’为引物扩增L-天冬氨酸合成酶基因asnA；2）用EcoRI/HindIII酶切处理asnA基因，将asnA基因插入到pET28a(+)载体上的EcoRI和HindIII酶切位点之间，得重组载体；以及3）将重组载体转化宿主E. coli BL21(DE3)，得基因工程菌株E. coli BL21(DE3)/pET28a-asnA CICC 11034S。
2.如权利要求1所述的生产L-天冬酰胺的基因工程菌株的应用，其特征在于，该菌株能够以活菌体细胞降解葡萄糖产生的ATP为能量，以L-天冬氨酸为底物，通过表达的L-天冬酰胺合成酶转化生产L-天冬酰胺。
3.如权利要求1所述的生产L-天冬酰胺的基因工程菌株的应用，其特征在于，该菌株能够以活菌体细胞降解葡萄糖产生的ATP为能量，以DL-天冬氨酸为底物，通过表达的L-天冬酰胺合成酶拆分生产L-天冬酰胺和D-天冬氨酸。
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