CN104805144B

CN104805144B - 一种高效生产l-瓜氨酸的方法

Info

Publication number: CN104805144B
Application number: CN201510230669.4A
Authority: CN
Inventors: 刘立明; 刘佳; 宋伟
Original assignee: Wuxi Chen Ming Bioisystech Co Ltd; Jiangnan University
Current assignee: Wuxi Chen Ming Bioisystech Co Ltd; Jiangnan University
Priority date: 2015-05-07
Filing date: 2015-05-07
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2035-05-07
Also published as: CN104805144A

Abstract

本发明公开了一种高效生产L‑瓜氨酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过分子生物学手段从乳酸菌中克隆获得精氨酸脱亚胺酶基因，采用分子生物学和过程优化等手段，提高ADI生产菌株产酶能力，通过优化催化体系，建立高效生物催化生产L‑瓜氨酸的平台。发酵得到的菌体无需破碎，即可直接用于转化，在50℃条件下，工程菌具有较高的透性，更有利于底物的吸收和产物的释放，反应速度得到极大的提高，转化周期仅需4‑12h，瓜氨酸产量可达150‑180g/L，转化率94％以上。

Description

一种高效生产L-瓜氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种高效生产L-瓜氨酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-瓜氨酸是生物体内普遍存在的氨基酸之一，是一种非蛋白氨基酸L-瓜氨酸可以通过抗羟基对DNA和酶进行保护，可以使DNA免受氧化反应的侵害。瓜氨酸的积聚可以增强细胞的抗氧化作用，保护细胞不受到氧化作用的侵害。L-瓜氨酸在医药方面的应用主要是作为异体排斥效应的指示剂。在疾病治疗中，瓜氨酸的血管舒张作用也起到了很重要的作用。在机体中瓜氨酸可以由精氨酸转化而成，这个反应释放内生NO，这种内生NO可保持血压正常。在风湿关节炎(RA)诊断治疗中，瓜氨酸的作用也开始受到人们的关注。还有研究发现西瓜中瓜氨酸与“伟哥”(化学名称为枸椽酸西地非那)具有相类似的药理作用。

L-瓜氨酸作为一种重要的高值精细化学品，广泛应用于食品、医药、化工和化妆品等工业领域中。伴随着对L-瓜氨酸研究的不断深入，使得L-瓜氨酸在很多方面有着广泛的应用前景，国内外需求巨大，拥有广阔的市场前景。

目前，瓜氨酸常用生产方法主要有化学合成法、提取法、发酵法、酶转化法等。化学合成法生产瓜氨酸是在碱性条件下水解精氨酸得到瓜氨酸。生产过程难以准确控制，产物中含有D-瓜氨酸，影响质量，并且污染环境。由于天然产物中瓜氨酸含量较少，因此提取法受原料来源限制，生产规模小，工艺较复杂，分离提纯困难，产酸率低，成本高，经济效益差，因而一直没有很好的发展。发酵法生产L-瓜氨酸，主要以传统诱变选育为主，但是传统的诱变法来获得L-瓜氨酸生产菌株随机性较大，不易得到高产菌种，尤其是瓜氨酸高产菌株筛选条件难以确定，同时发酵过程不易控制。而酶转化法生产L-瓜氨酸有很多的优点，比如：工艺简单、成本低、产物纯度非常高，最后的纯化步骤也较其它制备方法少。

已有报道采用Baker’s yeast、Streptococcus faecalis、Micrococcuspyogenes、Clostridium perfringens、Bacillus pyocyaneus等微生物生产的精氨酸脱亚胺基酶(Arginine Deiminase，EC3.5.3.6，简称ADI)，转化L-精氨酸生产L-瓜氨酸。IchiroChibata等在1973年发现Leuconnostoc citrovorum ATCC 8081、Pseudomonas fluorescenIFO 3081、Pseudomonas ovalis IAM 1002和Psudomonas putida ATCC 4359等菌株可以产生ADI，以精氨酸为底物，L-瓜氨酸的终浓度可以达到80g/L。

但是，目前经酶转化法生产L-瓜氨酸，存在转化率不够高、产量不高、转化时间长以及生产强度小的问题。为了解决上述问题，本发明提供了一种高效生产L-瓜氨酸的方法。

发明内容

本发明提供了一种高产精氨酸脱亚胺酶工程菌及其构建方法，并利用该工程菌转化L-精氨酸生产L-瓜氨酸。本发明提供一种高生产强度，经济，环保，低能耗的手段来生产L-瓜氨酸的方法，该方法具有极高的生产强度，减少了工业生产的生产周期、极大提高了工业化生产的生产效率。

本发明的第一个目的是提供一种高效生产L-瓜氨酸的方法，是将来源于乳酸菌的编码精氨酸脱亚胺酶的基因在大肠杆菌中诱导表达，然后以菌体或破碎后的菌体为催化剂，转化L-精氨酸生产L-瓜氨酸。

所述转化的条件，在本发明的一种实施方式中，是：菌体或破碎后的菌体6-25g/L、底物精氨酸浓度为150-200g/L，转化温度为30-50℃，转化时间4-12h。

所述转化，在本发明的一种实施方式中，温度为45-50℃，转化时间为4-8h。

所述转化，在本发明的一种实施方式中，pH为6.5-7.5。

所述转化，在本发明的一种实施方式中，优选pH7.2、50℃、菌体15-25g/L。

所述转化，在本发明的一种实施方式中，是在摇床中进行，摇床转速为150-250rpm。

所述精氨酸脱亚胺酶，在本发明的一种实施方式中，其氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

所述精氨酸脱亚胺酶，在本发明的一种实施方式中，其核苷酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列。

所述基因在大肠杆菌中诱导表达，在本发明的一种实施方式中，是将编码SEQ IDNO.1序列的基因克隆到pET28a，然后将重组质粒转化到E.coliBL21(DE3)中进行表达。

所述转化条件，在本发明的一种实施方式中，还包括添加终浓度为2％(v/v)的异丙醇。

所述诱导表达，在本发明的一种实施方式中，是菌株培养至OD₆₀₀为0.4-0.6，加入IPTG进行诱导，2-8h后收集菌体。

所述诱导表达，在本发明的一种实施方式中，是菌株培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG进行诱导，6h后收集菌体。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：(1)将编码SEQ ID NO.1序列的基因克隆到pET28a，然后将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中得到基因工程菌；(2)诱导基因工程菌表达精氨酸脱亚胺酶，然后收集菌体；(3)将菌体洗涤后，加入菌体或破碎后的菌体7-25g/L、精氨酸浓度为150-200g/L，在30-50℃下转化时间4-12h。

本发明的第二个目的是一种高效表达精氨酸脱亚胺酶的方法，是：以pET28a为载体，E.coli BL21(DE3)为宿主，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的精氨酸脱亚胺酶。

本发明还要求保护按上述方法得到的L-瓜氨酸，以及其在食品、化工、化妆品，以及制备药物方面的应用。

在本发明中，菌体添加量按湿重计，是指菌悬液在8000rpm离心10min后去除上清得到的菌体的重量。

本发明的优点：

1、本发明是使用来源于食品级微生物乳酸菌的精氨酸脱亚胺酶转化L-精氨酸生产L-瓜氨酸，该酶在大肠杆菌内表达后，仍表现出很高的活力，可以满足工业化规模生产的需求。

2、发酵得到的菌体无需破碎，即可直接用于转化，转化使用的温度范围较宽，可以在酶的最适温度50℃进行，高温下工程菌具有较高的透性，更有利于底物的吸收和产物的释放，反应速度得到极大的提高。在30-50℃，产量可达110-180g/L，整个转化过程的平均生产强度可达15.0-37.5g/L/h，仅需4-12h的转化周期即可达到转化终点。

附图说明

图1：底物浓度(A)和菌体浓度(B)对L-瓜氨酸产量的影响；

图2：透性剂对瓜氨酸产量的影响；

图3：水解生产L-瓜氨酸的过程曲线。

具体实施方式

ADI酶活力的测定：采用改进的阿氏法。酶活定义：在50℃和pH7.2的条件下，1min时间内产生1mol瓜氨酸的酶量为一个酶活单位。

L-瓜氨酸产量检测

取转化液10000rpm离心2min，收集上清液，并以L-瓜氨酸作为标准品，配制标准溶液。将适度稀释后的上清液和标准溶液分别与2,4-二硝基氟苯衍生，经0.22μm微孔滤膜过滤后，，用高效液相色谱法测定L-瓜氨酸的含量。标准曲线在200-800mg/L之间呈现良好的线性关系，回归方程：y＝0.5319x-103.5203，R²＝0.9990。

高效液相色谱法测定L-瓜氨酸的含量

色谱柱：C18ODSHYPERSIL；

流动相：磷酸盐缓冲液(pH7.0)-乙腈-水(体积比为70:20:10)，用0.22μm滤膜过滤；

柱温：35℃；

检测波长：360nm；

进样量：10μl；

流速:1ml/min。

实施例1：含精氨酸脱亚胺酶基因工程菌的构建

按以下方法构建含精氨酸脱亚胺酶基因工程菌：

(1)通过分子生物学手段用序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的引物1：

5'-CATGCCATGGCAATGAACAATGGAATTAATGTTAACTCAG-3'和引物2:

5'-CCGCTCGAGTTACAAATCTTCACGGCAAAGTGG-3'将来自于Lactococcus lactis的精氨酸脱亚胺酶基因(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)进行PCR扩增：体系中加入LAtaq酶，94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环，最后72℃延伸10min；

(2)用限制性内切酶NcoI和xhoI将目的基因和表达载体pET28a37℃酶切2h；

(3)用T4连接酶分别将酶切并胶回收后的目的基因和质粒pET28a16℃连接10h；

(4)将构建好的表达质粒导入E.coliBL21(DE3)，在含有卡纳霉素的LB平板中培养12h；

(5)将平板中长出的菌落进行PCR及酶切验证，将含有目的基因的质粒进行测序验证，选出目的基因完全正确的菌株，即为表达精氨酸脱亚胺酶基因工程菌。

实施例2：基因工程菌的诱导表达

按以下方法诱导基因工程菌表达精氨酸脱亚胺酶：

(1)将构建的基因工程菌接入LB斜面培养基培养12h；

(2)接一环斜面种子到LB培养基内，培养6h；

(3)将种子液接入LB发酵培养基内，培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG进行诱导，6h后收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体。

实施例3：转化L-精氨酸生产L-瓜氨酸

培养实施例1构建的基因工程菌，并诱导其表达精氨酸脱亚胺酶，然后收集基因工程菌菌体，并用无菌生理盐水洗涤菌体两次；

取菌体7g(湿重)，破碎后投入1L转化液中进行转化，其转化条件为：底物精氨酸浓度为200g，转化温度为50℃，pH7.2，转化时间8h；

取适量转化液，用高效液相色谱法测定转化液中L-瓜氨酸的含量。结果显示L-瓜氨酸的产量可达120.9g/L，生产强度可达15.1g·(L·h)^-1。

实施例4：转化L-精氨酸生产L-瓜氨酸

取诱导表达精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌菌体，按菌体15g/L(湿重)投入转化液中进行转化，其转化条件为：底物精氨酸浓度为150g/L，转化温度为45℃、pH为6.5-7.5，转化时间4h，摇床转速200rpm；

取适量转化液，用高效液相色谱法测定转化液中L-瓜氨酸的含量。结果显示L-瓜氨酸的产量可达110.3g/L，生产强度可达25.6g·(L·h)^-1。

实施例5：转化L-精氨酸生产L-瓜氨酸

培养表达精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌，收集菌体后，按菌体25g/L(湿重)投入转化液中进行转化，其转化条件为：底物精氨酸浓度为175g/L，转化温度为30℃，转化时间12h，摇床震荡反应；

取适量转化液，用高效液相色谱法测定转化液中L-瓜氨酸的含量。结果显示：L-瓜氨酸的产量可达150.9g/L。

实施例6：底物对L-瓜氨酸产量的影响

在转化温度为50℃、pH7.2、菌体浓度为6g·L^-1的条件下，转化反应8h，研究底物浓度(100-200g·L^-1)对L-瓜氨酸产量的影响。结果如图1A所示，当底物L-精氨酸的浓度低于190g·L^-1时，L-瓜氨酸的产量随着底物浓度的增加而增加；当底物浓度为190g·L^-1时，瓜氨酸的产量达到最高，为121.8g·L^-1，此时转化率为63.7％，生产强度为15.2g·(L·h)^-1；当底物浓度超过190g·L^-1时，瓜氨酸的产量反而降低。可能是因为：(1)底物浓度过高，引起反应体系粘度增大而不利于反应的进行；(2)底物浓度过高，反应体系渗透压增大，改变了ADI的构象，对转化反应产生了不利影响。

实施例7：菌体对L-瓜氨酸产量的影响

在转化温度为50℃、pH7.2、底物浓度为190g·L^-1的条件下，转化反应8h，研究菌体浓度(0-24g·L^-1)对L-瓜氨酸产量的影响，结果如图1B所示。结果显示：(1)15-25g·L^-1破碎菌体可以使L-瓜氨酸的产量达到最大值166.0g·L^-1，转化率为86.9％，生产强度为20.8g·(L·h)^-1，单位菌体的L-瓜氨酸产量为11.1g·g^-1；(2)24g·L^-1未经破碎的菌体，可使得L-瓜氨酸产量达到最大值165.1g·L^-1。

实施例8：透性剂对L-瓜氨酸产量的影响

为验证细胞通透性对酶促脱亚胺生产L-瓜氨酸的影响，在底物浓度为190g·L^-1，菌体浓度为15g·L^-1，转化温度为50℃，pH7.2的条件下，以相同浓度(2％，V·V^-1)的不同透性剂(曲拉通X-114、曲拉通X-100、乳化剂OP-10、乙醇、异丙醇、吐温20、吐温80)分别处理菌体，考察其对L-瓜氨酸产量的影响。结果如图2所示，在同等浓度条件下，异丙醇对L-瓜氨酸生产具有促进作用，此时L-瓜氨酸产量为172.5g·L^-1，比对照提高了6.4％，此时的转化率为90.3％，生产强度为21.6g·(L·h)^-1。其他透性剂均对L-瓜氨酸的生产表现出负面作用，其中乙醇和吐温20对L-瓜氨酸生产的抑制作用最强，L-瓜氨酸产量分别降低了16.3％和20.1％。

实施例9：酶促胍基水解生产L-瓜氨酸的过程曲线

培养表达精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌，用菌体进行酶促胍基水解转化试验，在50℃，pH7.2，190g·L^-1L-精氨酸，15g·L^-1菌体细胞(2％的异丙醇处理30min)，进行转化试验，每隔2h取样检测瓜氨酸产量，转化过程曲线如图3所示。瓜氨酸产量在4h即可达到120g·L^-1以上，生产强度达30g·(L·h)^-1。瓜氨酸产量在8h达到最大值172.1g·L^-1，转化率90.1％，生产强度21.5g·(L·h)^-1。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种高效生产L-瓜氨酸的方法，其特征在于，所述方法是将来源于乳酸菌的编码精氨酸脱亚胺酶的基因在大肠杆菌中诱导表达，然后以菌体为催化剂，转化L-精氨酸生产L-瓜氨酸；所述转化的条件是：菌体的添加量为6-25g/L、底物精氨酸浓度为150-200g/L，转化温度为30-50℃，转化时间4-12h，所述精氨酸脱亚胺酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化温度为45-50℃，转化时间为4-8h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化条件还包括添加终浓度为2％的异丙醇。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因在大肠杆菌中诱导表达是将编码SEQID NO.1序列的基因克隆到pET28a，然后将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：(1)将编码SEQ ID NO.1序列的基因克隆到pET28a，然后将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中得到基因工程菌；(2)诱导基因工程菌表达精氨酸脱亚胺酶，然后收集菌体；(3)将菌体洗涤，加入菌体7-25g/L、精氨酸浓度为150-200g/L，在30-50℃下转化时间4-12h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化具体是：加入菌体15-25g/L、精氨酸浓度为150-200g/L，在pH 7.2、50℃下转化时间4-8h。