CN111100894A - 一种对干扰素IFN α-2b进行定点聚乙二醇长效化修饰的方法 - Google Patents
一种对干扰素IFN α-2b进行定点聚乙二醇长效化修饰的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及药物合成领域,公开了一种对干扰素IFN α‑2b进行定点聚乙二醇长效化修饰的方法,本方法是利用一种固定化的谷氨酰胺转氨酶对干扰素IFN α‑2b进行定点的聚乙二醇化修饰。谷氨酰胺转氨酶是一种用于催化酰基转移反应的转移酶,这种酶被证明具有高度的定点催化作用,因此在谷氨酰胺转氨酶的介导作用下可以实现干扰素IFN α‑2b的定点聚乙醇化修饰。另一方面,由于使用的是固定化谷氨酰胺转氨酶,其化学和pH稳定性较高,而且在定点修饰过程中操作方便,可重复利用率高,因此可大幅度降低产品的生产成本。
Description
技术领域
本发明属于药物合成领域,具体涉及一种对干扰素IFN α-2b进行定点聚乙二醇长效化修饰的方法。
背景技术
干扰素(Interferon, IFN)是一种在特定的诱导剂作用下,由单核细胞分泌的具有高活性、多生物功能的细胞因子,具有抑制病毒复制、抑制细胞分裂以及免疫调节等功能。在众多干扰素IFN类型当中,IFN α-2b是最早被发现的亚型之一,是一种抗病毒、抗肿瘤药物,并且具有免疫调节活性,其广谱抗病毒、抗肿瘤和调节免疫功能能力最强,在多种疾病治疗中发挥不可替代的作用,例如可以用于治疗病毒性乙型肝炎、丁型肝炎、病毒性脑膜炎、病毒性眼感染、复发性角膜炎、肾癌、毛细白血病、恶性皮肤淋巴瘤、成骨肉瘤、多发性硬化症等疾病。
但是目前对于使用干扰素进行治疗的病人来说,干扰素IFN α-2b具有免疫原性高、体内循环半衰期短和稳定性差的问题,需要经常进行皮下注射使药物的血药浓度维持在有效的范围内,这给病人带来了较大的痛苦和极大的不便。因此制备高纯度的长效化IFNα-2b有着极大的研究和临床意义。目前许多研究者正致力于长效干扰素IFN α-2b的改造,而利用聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)聚合物对其进行共价修饰是克服这些弊端的有效方法之一。蛋白质的聚乙二醇化是通过增加药物分子的流体力学体积,减少肾清除,从而延长蛋白质药物的血浆半衰期。目前进行的PEG化反应,多是针对蛋白质肽链上自由末端胺基进行的,由于蛋白质分子中这样的位点较多,PEG的修饰无选择性,导致修饰产物多样化而带其分离困难,质量不易控制的问题。因此需要使用一种对IFN α-2b进行定点修饰的方法来避免蛋白质药物随机修饰带来的活性下降和二次分离提纯的弊端。
发明内容
为克服上述技术问题,本发明提供了一种对干扰素IFN α-2b进行定点聚乙二醇长效化修饰的方法。
为达到上述目的,本发明是通过以下的技术方案来实现的。
一种对干扰素IFN α-2b进行定点聚乙二醇长效化修饰的方法,包括以下步骤:
1)使用带有功能性官能团的固体载体对谷氨酰胺转氨酶进行固定,制得固定化的谷氨酰胺转氨酶;所述功能性官能团包括可以与酶大分子上的伯胺基团发生化学反应的羧基、醛基、环氧基、琥珀酰亚胺基中的一种;
2)首先将干扰素IFN α-2b溶于磷酸缓冲液中形成浓度为1.5 mg/mL的蛋白质溶液,在蛋白质溶液中加入带有伯胺基团的聚乙二醇搅拌使其完全溶解,然后加入固定化的谷氨酰胺转氨酶,搅拌反应5 h,然后加入碘乙酰胺使反应停止,得到的反应产物使用pH 7.4、浓度10 mM的磷酸缓冲液稀释至蛋白质浓度为1.0 mg/mL的溶液,然后使用pH 7.4、浓度10 mM的磷酸缓冲液进行两次透析得到定点聚乙二醇化的干扰素IFN α-2b。
利用谷氨酰胺转移酶(Transglutaminase, TGase)的介导作用是一种对干扰素IFN α-2b进行定点PEG修饰的有效手段。相对于一般的化学修饰方法,酶催化法具有反应条件温和、催化效率高、能够准确修饰特点位点、产物均一且质量容易控制,是非常有前景的修饰方法之一。TGase是一种用于催化酰基转移反应的转移酶,可使蛋白质或多肽的谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基团与赖氨酸残基的ε-胺基之间发生酰基转移反应,从而在蛋白质分子之间或之内发生共价交联对蛋白质进行改性。更重要的是,TGase介导的这种反应被证明具有高度的定点修饰作用,即使蛋白质分子本身含有多个谷氨酰胺Gln残基,但TGase催化反应使含有伯胺基的PEG只选择性的发生在位于蛋白质分子柔性区域内谷氨酰胺的γ-酰胺基团上。对于干扰素IFN α-2b,只有Gln101一个谷氨酰胺残基位于蛋白质的柔性区域内,因此使用TGase定点PEG修饰干扰素IFN α-2b,得到一个定点长效化修饰的干扰素IFN α-2b。
酶的固定化是指采用固定载体材料将酶包埋起来或者束缚、限制于载体的表面和孔隙中,同时保持催化活性,并且可回收及重复利用的酶化学技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足,呈现出贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简单等一系列的优点。
进一步地所述步骤1)中固体载体包括多孔微球、多孔膜、多孔纤维、多孔凝胶中的一种。这些多孔固体载体的原材料包括有无机材料(硅藻土、二氧化硅、氧化铝、分子筛、改性硅胶)、天然高分子(壳聚糖、纤维素、脂质体、琼脂糖、角叉菜胶、明胶)、合成高分子(聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物、聚β-羟基丁酸酯、聚己内酯)以及无机和有机的复合材料。
进一步地所述步骤2)中聚乙二醇的分子量包括5 kD、10 kD、20 kD、40 kD中的一种,其分子链结构类型包括有直链型、分支型和多臂型中的一种。
进一步地所述步骤2)中干扰素IFN α-2b与带有伯胺基团的聚乙二醇其摩尔比为1:1~1.05。
进一步地所述步骤2)中干扰素IFN α-2b、伯胺基团的聚乙二醇与固定化的谷氨酰胺转氨酶在37±0.5°C搅拌反应。
进一步地所述步骤2)中透析再4±0.5°C进行。
进一步地所述步骤2)中所得到的固定化谷氨酰胺转氨酶通过磷酸缓冲液洗涤后进行再次重复使用。
有益效果:与现有技术相比,本发明的优点在于:
1)使用谷氨酰胺转移酶TGase用于催化酰基转移反应的转移酶能够在Gln101一个谷氨酰胺残基位于蛋白质的柔性区域内定点修饰干扰素IFN α-2b,得到一个定点长效化修饰的干扰素IFN α-2b;
2)谷氨酰胺转移酶TGase固定于载体后使其具有贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简单的特点,使得定点PEG化的干扰素IFN α-2b的生产成本进一步降低。
附图说明
图1为使用固定化谷氨酰胺转氨酶对干扰素IFN α-2b进行定点PEG化长效修饰的示意图;
图2为固定在多孔薄膜上的谷氨酰胺转氨酶重复使用时的残余活性柱状图。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步的详细说明。本发明所用的原料均为市售产品。
实施例1
使用带有羧基的多孔薄膜对谷氨酰胺转氨酶进行固定,步骤如下:羧基化的多孔薄膜置于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液(pH 4.5,0.1 M)中,其中EDC和Sulfo-NHS的浓度都为10 mg/mL,使多孔薄膜上的羧基在4 °C下进行活化。活化1.5 h后对薄膜用双蒸水进行洗涤,然后将活化后的多孔薄膜置于谷氨酰胺转移酶的磷酸缓冲溶液中反应12 h,再用双蒸水进行充分的洗涤,就得到了固定有谷氨酰胺转氨酶的多孔薄膜。
干扰素IFN α-2b溶于磷酸缓冲液(pH 7.4,10 mM)中形成浓度为1.5 mg/mL的蛋白质溶液,在溶液中加入与干扰素IFN α-2b物质的量的1倍的带有伯氨基团的聚乙二醇(分子量为20 kDa,直链型)搅拌使其完全溶解,然后加入固定化的谷氨酰胺转氨酶。整个反应体系在37±0.5 °C下搅拌反应5 h,然后加入碘乙酰胺使反应停止。得到的反应产物使用磷酸缓冲液(pH 7.4,10 mM)稀释为蛋白质浓度为1.0 mg/mL的溶液,并在4±0.5 °C下使用磷酸缓冲液(pH 7.4,10 mM)进行两次透析得到定点聚乙二醇化的干扰素IFN α-2b。
对固定在多孔薄膜上的谷氨酰胺转氨酶进行再回收使用,具体方法是在室温下使用磷酸缓冲液(pH 7.4,10 mM)对多孔薄膜进行洗涤,洗涤次数不少于3次,然后进行酶活性的测定,在重复使用5次之后没有明显的酶活力下降。
实施例2
使用带有环氧基的多孔微球对谷氨酰胺转氨酶进行固定,步骤如下:将带有环氧基的多孔微球置于磷酸缓冲液(pH 8.0,50 mM)中进行平衡2 h,离心之后转入到溶有谷氨酰胺转氨酶的磷酸缓冲溶液中进行酶的固定化,整个反应体系在室温下搅拌反应18 h后完成酶的固定,最后使用双蒸水对固定有谷氨酰胺转氨酶的多孔微球进行多次离心洗涤以除去物理吸附的谷氨酰胺转氨酶以及副产物。
干扰素IFN α-2b溶于磷酸缓冲液(pH 7.4,10 mM)中形成浓度为1.5 mg/mL的蛋白质溶液,在溶液中加入干扰素IFN α-2b物质的量的1.01倍的的带有伯氨基团的聚乙二醇(分子量为5kDa,分支型)搅拌使其完全溶解,然后加入固定化的谷氨酰胺转氨酶。整个反应体系在37±0.5°C下搅拌反应5 h,然后加入碘乙酰胺使反应停止。得到的反应产物使用磷酸缓冲液(pH 7.4,10 mM)稀释为蛋白质浓度为1.0 mg/mL的溶液,并在4±0.5 °C下使用磷酸缓冲液(pH 7.4,10 mM)进行两次透析得到定点聚乙二醇化的干扰素IFN α-2b。
对固定在多孔微球上的谷氨酰胺转氨酶进行再回收使用,具体方法是在室温下使用磷酸缓冲液(pH 7.4,10 mM)对多孔微球进行离心并洗涤,洗涤次数不少于3次,然后进行酶活性的测定,在重复使用5次之后没有明显的酶活力下降。
实施例3
使用带有醛基的多孔纤维对谷氨酰胺转氨酶进行固定,步骤如下:带有醛基的多孔纤维置于磷酸缓冲液(pH 8.0,50 mM)中进行平衡2 h,离心去除上清之后转入到溶有谷氨酰胺转氨酶的磷酸缓冲溶液中进行酶的固定化,整个反应体系在室温下搅拌反应18 h后完成酶的固定,最后使用双蒸水对固定有谷氨酰胺转氨酶的多孔纤维进行多次离心洗涤以除去物理吸附的谷氨酰胺转氨酶以及副产物。
干扰素IFN α-2b溶于磷酸缓冲液(pH 7.4,10 mM)中形成浓度为1.5 mg/mL的蛋白质溶液,在溶液中加入干扰素IFN α-2b物质的量的1.03倍的的带有伯氨基团的聚乙二醇(分子量为10kDa,多臂型)搅拌使其完全溶解,然后加入固定化的谷氨酰胺转氨酶。整个反应体系在37±0.5°C下搅拌反应5 h,然后加入碘乙酰胺使反应停止。得到的反应产物使用磷酸缓冲液(pH 7.4,10 mM)稀释为蛋白质浓度为1.0 mg/mL的溶液,并在4±0.5 °C下使用磷酸缓冲液(pH 7.4,10 mM)进行两次透析得到定点聚乙二醇化的干扰素IFN α-2b。
对固定在多孔纤维上的谷氨酰胺转氨酶进行再回收使用,具体方法是在室温下使用磷酸缓冲液(pH 7.4,10 mM)对多孔纤维进行离心并洗涤,洗涤次数不少于3次,然后进行酶活性的测定,在重复使用5次之后没有明显的酶活力下降。
实施例4
使用带有琥珀酰亚胺基团的多孔凝胶对谷氨酰胺转氨酶进行固定,步骤如下:带有琥珀酰亚胺基团的多孔凝胶置于磷酸缓冲液(pH 8.0,50 mM)中进行平衡2 h,去除上清之后转入到溶有谷氨酰胺转氨酶的磷酸缓冲溶液中进行酶的固定化,整个反应体系在室温下搅拌反应18 h后完成酶的固定,最后使用双蒸水对固定有谷氨酰胺转氨酶的多孔凝胶进行多次洗涤以除去物理吸附的谷氨酰胺转氨酶以及副产物。
干扰素IFN α-2b溶于磷酸缓冲液(pH 7.4,10 mM)中形成浓度为1.5 mg/mL的蛋白质溶液,在溶液中加入干扰素IFN α-2b物质的量的1.03倍的的带有伯氨基团的聚乙二醇(分子量为40kDa,直链型)搅拌使其完全溶解,然后加入固定化的谷氨酰胺转氨酶。整个反应体系在37±0.5°C下搅拌反应5 h,然后加入碘乙酰胺使反应停止。得到的反应产物使用磷酸缓冲液(pH 7.4,10 mM)稀释为蛋白质浓度为1.0 mg/mL的溶液,并在4±0.5 °C下使用磷酸缓冲液(pH 7.4,10 mM)进行两次透析得到定点聚乙二醇化的干扰素IFN α-2b。
对固定在多孔凝胶上的谷氨酰胺转氨酶进行再回收使用,具体方法是在室温下使用磷酸缓冲液(pH 7.4,10 mM)对多孔凝胶进行洗涤,洗涤次数不少于3次,然后进行酶活性的测定,在重复使用5次之后没有明显的酶活力下降。
本发明按照上述实施例进行了说明,应当理解,上述实施例不以任何形式限定本发明,凡采用等同替换或等效变换方式所获得的技术方案,均落在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种对干扰素IFN α-2b进行定点聚乙二醇长效化修饰的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)使用带有功能性官能团的固体载体对谷氨酰胺转氨酶进行固定,制得固定化的谷氨酰胺转氨酶;所述功能性官能团包括可以与酶大分子上的伯胺基团发生化学反应的羧基、醛基、环氧基、琥珀酰亚胺基中的一种;
2)首先将干扰素IFN α-2b溶于磷酸缓冲液中形成浓度为1.5 mg/mL的蛋白质溶液,在蛋白质溶液中加入带有伯胺基团的聚乙二醇搅拌使其完全溶解,然后加入固定化的谷氨酰胺转氨酶,搅拌反应5 h,然后加入碘乙酰胺使反应停止,得到的反应产物使用pH 7.4、浓度10 mM的磷酸缓冲液稀释至蛋白质浓度为1.0 mg/mL的溶液,然后使用pH 7.4、浓度10 mM的磷酸缓冲液进行两次透析得到定点聚乙二醇化的干扰素IFN α-2b。
2.根据权利要求1所述的一种对干扰素IFN α-2b进行定点聚乙二醇长效化修饰的方法,其特征在于,所述步骤1)中固体载体包括多孔微球、多孔膜、多孔纤维、多孔凝胶中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种对干扰素IFN α-2b进行定点聚乙二醇长效化修饰的方法,其特征在于,所述步骤2)中聚乙二醇的分子量包括5 kD、10 kD、20 kD、40 kD中的一种,其分子链结构类型包括有直链型、分支型和多臂型中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种对干扰素IFN α-2b进行定点聚乙二醇长效化修饰的方法,其特征在于,所述步骤2)中干扰素IFN α-2b与带有伯胺基团的聚乙二醇其摩尔比为1:1~1.05。
5.根据权利要求1所述的一种对干扰素IFN α-2b进行定点聚乙二醇长效化修饰的方法,其特征在于,所述步骤2)中干扰素IFN α-2b、伯胺基团的聚乙二醇与固定化的谷氨酰胺转氨酶在37±0.5°C搅拌反应。
6.根据权利要求1所述的一种对干扰素IFN α-2b进行定点聚乙二醇长效化修饰的方法,其特征在于,所述步骤2)中透析在4±0.5°C进行。
7.根据权利要求1所述的一种对干扰素IFN α-2b进行定点聚乙二醇长效化修饰的方法,其特征在于,所述步骤2)中所得到的固定化谷氨酰胺转氨酶通过洗涤进行再次重复使用。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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