CN107619824A

CN107619824A - 一种基于光固化水凝胶制备固定化酶方法

Info

Publication number: CN107619824A
Application number: CN201711034224.4A
Authority: CN
Inventors: 王涛; 余柳俭; 王勇
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2017-10-30
Filing date: 2017-10-30
Publication date: 2018-01-23

Abstract

本发明提供了一种基于光固化水凝胶制备固定化酶的方法，所述方法包括如下步骤：（1）合成水溶性光敏树脂；（2）配置水溶性光固化树脂体系和酶的共混液，光固化树脂体系由水溶性丙烯酸酯预聚体和光引发剂组成；（3）将配置好的共混液在紫外或可见光固化光源下固化得到包埋有酶的水凝胶。采用该方法制备固定化酶，操作简单快捷，反应的条件比较温和，反应可以在水溶液中进行，并且光反应的速度较快，反应可以控制，更重要的是，所用的光源不使酶失活失活。并且所用的引发剂有很好的生物相容性，对酶活性的影响非常小。

Description

一种基于光固化水凝胶制备固定化酶方法

技术领域

本发明涉及固化酶技术领域，具体设计一种基于光固化水凝胶制备固定化酶方法。

背景技术

酶是具有生物催化功能的大分子，和化学催化试剂相比，酶具有催化效率高、底物专一性强、绿色环保等优点，但这些优点往往需要在活细胞的环境下才能得体现。在离体条件下，酶会因寿命短、不易保存、稳定性差、催化效率低等问题而无法正常发挥作用。

将水溶性游离酶与不溶于水的载体相结合，使之成为不溶于水的酶衍生物，即“固定化酶”，固定化酶不仅保留了游离酶的大部分活性，还延长酶的寿命，使它更容易保存，并且能够重复使用，使酶能够适应更苛刻的反应条件。目前固定化酶在食品、医疗、能源、环境治理等广泛领域均实现了一定的应用，但现有固定化技术仍存在适用范围小、成本较高等缺陷。酶的固定化方法一般分为四种：（1）吸附法；（2）包埋发；（3）共价键结合法；（4）交联法。前面两种属于物理方法，主要靠酶分子与载体间的范德华力或正负电的吸引力，物理固定化方法使得酶与载体之间的结合不是很牢固，酶容易从载体上脱落，随着重复使用率的增加，物理法固定化的酶催化效率会明显降低。后两种方法属于化学方法，酶主要是通过共价键与载体相连或者通过共价键与单体交联聚合，化学方法需要在酶和载体上引入活性基团，这类活性基团能使酶和载体能够在相对温和的条件下通过共价键相连接。化学方法固定化酶虽然使得酶与载体的连接更加牢固，但是共价键的形成通常在要高温、强酸强碱等苛刻条件下进行，此外有些反应需要在有机溶剂中反应，这也限制了这种方法的应用。

发明内容

为了解决上述现有的问题，本发明的目的在于提供一种基于光固化水凝胶制备固定化酶方法。

为了达到上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种基于光固化水凝胶制备固定化酶方法，其特征在于包含如下步骤：

（1）制备水性光敏树脂：制备水溶性的α，ω-聚乙二醇二丙烯酸酯光敏树脂，结构通式如下：

其中R为H或CH₃，n=22～450；

（2）按质量百分数将α，ω-聚乙二醇二丙烯酸酯10%～50%，缓冲液50%～90%，光引发剂0.5%～10%配置成水溶性光固化体系；

（3）将游离酶加入到（2）的溶液中，混合均匀后将涂覆成膜或者涂覆在基材上，然后在365～405nm光源下光照1～5min，制备得固定化酶制剂。

步骤（1）所述的水溶性的α，ω-聚乙二醇二丙烯酸酯光敏树脂的合成方法如下：

将聚乙二醇（PEG）和缚酸剂混合，然后缓慢滴加缚酸剂相同摩尔量的酰氯，0℃~30℃下搅拌12~24h，然后用水洗掉过量的酰氯和缚酸剂，有机相干燥后浓缩，得到α，ω-聚乙二醇二丙烯酸酯光敏树脂。

步骤（2）所述的缓冲液的PH值为6~8。

步骤（2）所述的缓冲液为Tris-HCl缓冲液、Good's缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或多种。

步骤（2）所述的光引发剂为2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化磷（TPO）、1-羟基环已基苯基甲酮（184）、安息香双甲醚（651）、2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮（I2959）、2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮（1173）中的一种或多种。

步骤（3）所述的酶为有机磷水解酶（OPH）、甲基对硫磷水解酶（MPH）、有机磷水解酶C2（OPHC2）、二异丙基氟磷酸酯酶（DFPase）、人血清对氧磷酶（PON1）和有机磷酸酐酶（OPAA）、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、蛋白酶、果胶酶、漆酶中的一种或多种。

本发明相对于现有技术具有如下优点：

（1）本发明所采用的固载酶技术为光固化固载酶技术，该技术操作简单快捷，反应的条件比较温和，反应可以在水溶液中进行，并且光反应的速度较快，反应可以控制，更重要的是，所用的光源不使酶失活失活。并且所用的引发剂有很好的生物相容性，对酶活性的影响非常小，固载后酶的活力回收为70%~90%。

（2）本发明制备的固定化酶保存10天后酶活基本不变，重复使用10次后，酶的活力依然保持60%以上，大大提高了酶的经济价值。

附图说明

图1：PEG2000DA、PEG4000DA、PEG6000DA、PEG10000DA、PEG20000DA的¹H-NMR谱图；

图2：对硝基酚浓度-吸光度标准曲线；

图3：PEG2000DA、PEG4000DA、PEG6000DA、PEG10000DA、PEG20000DA制备的固定化酶水凝胶分别在使用10次后酶活的变化曲线图；

图4：PEG2000DA制备的固定化酶水凝胶保存10天酶活的变化曲线；

图5：PEG4000DA制备的固定化酶水凝胶保存10天酶活的变化曲线；

图6：PEG6000DA制备的固定化酶水凝胶保存10天酶活的变化曲线；

图7：PEG10000DA制备的固定化酶水凝胶保存10天酶活的变化曲线；

图8：PEG20000DA制备的固定化酶水凝胶保存10天酶活的变化曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。应当理解，以下的实施例为本发明的优选实施例，以便更好的理解本发明，因而不应该视为限定本发明的范围。

实施例1

一种基于光固化水凝胶制备固定化酶方法，包括以下步骤：

（1）在250ml单口烧瓶中溶解50g 聚乙二醇(分子量2000，PEG2000)，然后加入13.82g的K₂CO₃固体，最后缓慢滴加丙烯酰氯，室温搅拌24h后，用水洗掉过量的丙烯酰氯和K₂CO₃，用无水MgSO₄干燥有机相，干燥后的有机相通过旋转蒸发浓缩得到聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG2000DA），用核磁共振波普仪表征其结构。

（2）在1ml有机磷水解酶溶液（1mg/ml）溶解0.30g的PEG2000DA、6.0mg的2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮和3.0mg TPO，然后将40μl该溶液加入到聚四氟乙烯模具（模具深为1mm，直径为10mm）中并在5mW/cm²的365nm光源下光照2min，得到固载有酶的水凝胶。

（3）1个酶活力单位（U）定义为：在特定条件下，在1分钟内能转化1微摩尔底物或生成1微摩尔产物所需的酶量。有机磷水解酶水解有机磷化合物的产物之一对硝基酚在400nm处有吸收，因此采用吸光度法测试对硝基酚的量来测试酶活，具体测试方法如下：

将固载有酶的水凝胶加入到1ml Tris-HCl缓冲液中，然后加入5μl甲基对硫磷的甲醇溶液（10mg/ml），37℃下反应10分钟后加入1ml 10%的三氯乙酸水溶液终止反应，再加入1ml10%的Na₂CO₃显色，最后用紫外分光光度计测溶液在400nm的吸光度，根据对硝基酚浓度-吸光度标准曲线得到对硝基酚的浓度。

根据以上测试方法得固定化酶的酶活回收率为66.0%，重复利用10次后酶活还保持初始酶活的81.1%。将固定化酶在室温下保存，每隔一天测一次固定化酶的酶活，保存十天后酶活基本不变。

实施例2

一种基于光固化水凝胶制备固定化酶方法，包括以下步骤：

（1）在250ml单口烧瓶中溶解50g 聚乙二醇(分子量4000，PEG4000)，然后加入6.91g的K₂CO₃固体，最后缓慢滴加丙烯酰氯溶液，室温搅拌24h后，用水洗掉过量的丙烯酰氯和K₂CO₃，用无水MgSO₄干燥有机相，干燥后的有机相通过旋转蒸发浓缩后加入到200ml的正己烷中析出白色固体，过滤得到白色粉末固体聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG4000DA），用核磁共振波普仪表征其结构。

（2）在1ml有机磷水解酶溶液（1mg/ml）溶解0.30g的PEG4000DA、6.0mg的2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮和3.0mg TPO，然后将40μl该溶液加入到聚四氟乙烯模具（模具深为1mm，直径为10mm）中并在5mW/cm²的365nm光源下光照2min，得到固载有酶的水凝胶。根据实施例1中酶活的测试方法，测得固定化酶的酶活回收率为73.5%，重复利用10次后酶活还保持初始酶活的74.0%。将固定化酶在室温下保存，每隔一天测一次固定化酶的酶活，保存十天后酶活基本不变。

实施例3

一种基于光固化水凝胶制备固定化酶方法，包括以下步骤：

（1）在250ml单口烧瓶中溶解50g 聚乙二醇(分子量6000，PEG6000)，然后加入4.61g的K₂CO₃固体，最后缓慢滴加丙烯酰氯溶液，室温搅拌24h后，用水洗掉过量的丙烯酰氯和K₂CO₃，用无水MgSO₄干燥有机相，干燥后的有机相通过旋转蒸发浓缩得到白色粉末固体聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG6000DA），用核磁共振波普仪表征其结构。

（2）在1ml有机磷水解酶溶液（1mg/ml）溶解0.30g的PEG6000DA、6.0mg的2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮和3.0mg TPO，然后将40μl该溶液加入到聚四氟乙烯模具（模具深为1mm，直径为10mm）中并在5mW/cm²的365nm光源下光照2min，得到固载有酶的水凝胶。根据实施例1中酶活的测试方法，测得固定化酶的酶活回收率为78.5%，重复利用10次后酶活还保持初始酶活的64.6%。将固定化酶在室温下保存，每隔一天测一次固定化酶的酶活，保存十天后酶活基本不变。

实施例4

一种基于光固化水凝胶制备固定化酶方法，包括以下步骤：

（1）在250ml单口烧瓶中溶解50g 聚乙二醇(分子量10000，PEG10000)，然后加入2.76g的K₂CO₃固体，最后缓慢滴加丙烯酰氯溶液，室温搅拌24h后，用水洗掉过量的丙烯酰氯和K₂CO₃，用无水MgSO₄干燥有机相，干燥后的有机相通过旋转蒸发浓缩过滤得到白色粉末固体聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG10000DA），用核磁共振波普仪表征其结构。

（2）在1ml有机磷水解酶溶液（1mg/ml）溶解0.30g的PEG10000DA、6.0mg的2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮和3.0mg TPO，然后将40μl该溶液加入到聚四氟乙烯模具（模具深为1mm，直径为10mm）中并在5mW/cm²的365nm光源下光照2min，得到固载有酶的水凝胶。根据实施例1中酶活的测试方法，测得固定化酶的酶活回收率为81.5%，重复利用10次后酶活还保持初始酶活的50.3%。将固定化酶在室温下保存，每隔一天测一次固定化酶的酶活，保存十天后酶活基本不变。

实施例5

一种基于光固化水凝胶制备固定化酶方法，包括以下步骤：

（1）在250ml单口烧瓶中溶解50g 聚乙二醇(分子量20000，PEG20000)，然后加入1.38g的K₂CO₃固体，最后缓慢滴加丙烯酰氯溶液，室温搅拌24h后，用水洗掉过量的丙烯酰氯和K₂CO₃，用无水MgSO₄干燥有机相，干燥后的有机相通过旋转蒸发浓缩后得到白色粉末固体聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG20000DA），用核磁共振波普仪表征其结构。

（2）在1ml有机磷水解酶溶液（1mg/ml）溶解0.30g的PEG20000DA、6.0mg的2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮和3.0mg TPO，然后将40微升该溶液加入到聚四氟乙烯模具（模具深为0.5mm，直径为10mm）中并在5mW/cm²的365nm光源下光照2min，得到固载有酶的水凝胶。根据实施例1中酶活的测试方法，测得固定化酶的酶活回收率为92.3%，重复利用10次后酶活还保持初始酶活的51.4%。将固定化酶在室温下保存，每隔一天测一次固定化酶的酶活，保存十天后酶活基本不变。

Claims

1.一种基于光固化水凝胶制备固定化酶方法，其特征在于包含如下步骤：

其中R为H或CH₃，n=22～450；

2.根据权利要求1所述的一种基于光固化水凝胶制备固定化酶方法，其特征在于：步骤（1）所述的水溶性的α，ω-聚乙二醇二丙烯酸酯光敏树脂的合成方法如下：

3.根据权利要求1所述的一种基于光固化水凝胶制备固定化酶方法，其特征在于：步骤（2）所述的缓冲液的PH值为6~8。

4.根据权利要求1所述的一种基于光固化水凝胶制备固定化酶方法，其特征在于：步骤（2）所述的缓冲液为Tris-HCl缓冲液、Good's缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的一种基于光固化水凝胶制备固定化酶方法，其特征在于：步骤（2）所述的光引发剂为2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化磷（TPO）、1-羟基环已基苯基甲酮（184）、安息香双甲醚（651）、2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮（I2959）、2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮（1173）中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的一种基于光固化水凝胶制备固定化酶方法，其特征在于：步骤（3）所述的酶为有机磷水解酶（OPH）、甲基对硫磷水解酶（MPH）、有机磷水解酶C2（OPHC2）、二异丙基氟磷酸酯酶（DFPase）、人血清对氧磷酶（PON1）和有机磷酸酐酶（OPAA）、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、蛋白酶、果胶酶、漆酶中的一种或多种。