CN111220807A - 一种基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞染色领域，具体涉及一种基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法。所述方法为：将卵母细胞转移至酶标孔，滴加水凝胶覆盖卵母细胞并进行光固化；随后进行4％多聚甲醛固定、Triton‑X100透化、1％BSA或山羊血清封闭，再进行一抗孵育、二抗孵育、DAPI染色。本发明针对卵母细胞这种体积大、数量有限、不贴壁、不增殖的细胞，采用水凝胶包裹技术进行细胞免疫荧光染色，所述水凝胶具有良好的生物相容性及通透性，整个免疫荧光染色过程均在水凝胶封闭的酶标孔中进行，避免了传统卵母细胞免疫荧光染色过程中，口吸管多次转移所造成了卵母细胞丢失、操作繁琐、效率较低等问题，染色效果较好，十分适用推广。

Description

一种基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法
技术领域
本发明属于细胞染色领域，具体涉及一种基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法。
背景技术
哺乳动物中，卵母细胞在卵巢内卵泡中生长和发育。卵母细胞的成熟(细胞质和细胞核成熟)对于成功受精、胚胎发育等过程至关重要，并影响最终妊娠结果。卵母细胞免疫荧光染色是在各项卵母细胞研究中必不可少的技术之一。目前较为通用的卵母细胞免疫荧光染色方法是在整个染色过程中，持续用口吸管转移卵母细胞进行固定、透化、封闭、染色、洗涤等实验操作。口吸管的多次转移难免造成卵母细胞丢失、操作繁琐、效率较低等问题。
水凝胶(Hydrogel)是一类极为亲水的三维网络结构凝胶，由于存在交联网络，水凝胶可以溶胀和保有大量的水。凝胶的聚集态既非完全的固体也非完全的液体。固体的行为是一定条件下可维持一定的形状与体积，液体行为是溶质可以从水凝胶中扩散或渗透。水凝胶在细胞培养、细胞筛选等生物医学领域有着广泛的应用，但是关于一种基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法目前还未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
一种基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法，包括如下步骤：
(1)将卵母细胞经口吸管转移至酶标孔中央，沿孔壁滴加适量一定浓度的水凝胶覆盖卵母细胞并进行光固化，随后用PBS缓冲液洗涤；
(2)向酶标孔内加入4％多聚甲醛固定，随后用PBS缓冲液洗涤；
(3)向酶标孔内加入Triton-X100透化，随后用PBS缓冲液洗涤；
(4)向酶标孔内加入1％BSA或山羊血清，室温下封闭，吸干表面液体，加入一抗，4℃冰箱孵育过夜或室温孵育8h，随后用PBS缓冲液洗涤；
(5)再避光加入荧光标记的二抗室温下孵育，随后用PBS缓冲液洗涤；加入DAPI，室温避光孵育30min，然后用PBS缓冲液洗涤；最后加入抗荧光淬灭剂，置于显微镜下观察。
上述方案中，步骤(1)所述水凝胶为甲基丙烯酰化明胶(GelMA)。
上述方案中，步骤(1)所述水凝胶的加入量为30～60μL，所述水凝胶的浓度为5％～10％。
上述方案中，步骤(1)所述光固化的参数为405nm波长的可见蓝光照射固化30s～60s。
上述方案中，步骤(2)所述多聚甲醛固定的时间为30～40min，随后用PBS缓冲液洗涤的时间为20～30min，重复洗涤三次。
上述方案中，步骤(3)所述Triton-X100透化的时间为30～40min，随后用PBS缓冲液洗涤的时间为20～30min，重复洗涤三次。
上述方案中，步骤(4)所述室温下封闭的时间为1～2h。
上述方案中，步骤(4)所述一抗为α-tublin鼠单克隆抗体，所述一抗孵育的时间为4℃冰箱孵育过夜或室温孵育8h，随后用PBS缓冲液洗涤时间为20～30min，重复洗涤三次。
上述方案中，步骤(5)所述二抗为FITC标记山羊抗小鼠IgG，所述二抗孵育的时间为1～2h，随后用PBS缓冲液洗涤时间为20～30min，重复洗涤三次。
本发明的有益效果：本发明针对卵母细胞这种体积大、数量有限、不贴壁、不增殖的细胞，采用水凝胶包裹技术进行细胞免疫荧光染色，所述水凝胶具有良好的生物相容性及通透性，整个免疫荧光染色过程均在水凝胶封闭的酶标孔中进行，避免了传统卵母细胞免疫荧光染色过程中，口吸管多次转移所造成了卵母细胞丢失、操作繁琐、效率较低等问题，染色效果较好，十分适用推广。
附图说明
图1为卵母细胞经口吸管转移至酶标孔中央的图片。
图2为沿孔壁滴加适量一定浓度的水凝胶覆盖卵母细胞并进行光固化后的图片。
图3为对卵母细胞α-tubμlin的染色。
图4为对卵母细胞DNA的染色。
图5是图3、图4的叠加。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
一、实验材料
实验动物：3周龄c57雌鼠
细胞：上述实验动物经孕马血清促性腺激素(宁波第二激素厂)促排，获取GV期卵母细胞。
试剂：4％多聚甲醛、磷酸盐缓冲液(PBS)(Hyclone)，1％BSA(Aspen)，Triton-X100，一抗:α-tublin鼠单克隆抗体(Proteintech)，二抗：FITC标记山羊抗小鼠IgG(Aspen)，DAPI，抗荧光淬灭剂。
设备：体视显微镜(Nikon)，4℃冰箱(美的)，激光共聚焦显微镜(Nikon)。
一种基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法，包括如下步骤：
1.卵母细胞经口吸管转移至酶标孔中央；
2.沿孔壁滴加60ul的5％浓度水凝胶覆盖卵母细胞并进行405nm波长的可见蓝光照射30s～60s快速固化；
3.加入100μl PBS缓冲液洗涤10min；
4.重复3步骤；
5.加入50μl 4％多聚甲醛，固定30min；
6.加入100μl PBS洗涤20min；
7.重复6步骤；
8.加入50μl 0.5％Triton-X100，透化30min；
9.重复6、7步骤；
10.加入1％BSA或山羊血清，室温孵育1h，以封闭细胞表面的非特异性抗原；
11.吸干表面液体；
12.加入一抗，4℃冰箱孵育过夜(12h以上)；
13.重复6、7步骤；
14.避光加入荧光标记的二抗，室温孵育1h；
15.重复6、7步骤；
16.加入DAPI，室温避光孵育30min；
17.重复6、7步骤；
18.加入抗荧光淬灭剂
19.激光共聚焦显微镜观察。
需要说明的是，4％多聚甲醛、0.5％Triton-X100、1％BSA加入的量均为50μl，加入的量足够与细胞反应充分，同时可以避免试剂浪费。PBS加入的量均为100μl，满足对前一步骤残留的试剂的彻底清洗，避免残余试剂的影响。一般采用5％水凝胶对卵母细胞进行包裹，水凝胶具有良好的生物相容性和通透性，既能够固定卵母细胞，又能够允许卵母细胞与试剂充分接触，加入的量约为30～60μl，既可以充分覆盖卵母细胞，又可以避免试剂浪费。
三、实验结论
请参照附图1～5，图1是卵母细胞经口吸管转移至酶标孔中央的图片；图2是沿孔壁滴加适量一定浓度的水凝胶覆盖卵母细胞并进行光固化后的图片；图3是对卵母细胞α-tubμlin的染色；图4是对卵母细胞DNA的染色；图5是图3、图4的叠加。为了判断卵母细胞纺锤体的形态与结构，对卵母细胞α-tubμlin及DNA进行染色，激光共聚焦图片清楚显示了α-tubμlin和DNA在卵母细胞中的分布情况。
本发明先将卵母细胞经口吸管转移至酶标孔中央，沿孔壁滴加适量一定浓度的水凝胶覆盖卵母细胞并进行光固化。然后分别加入4％多聚甲醛固定、Triton-X100透化、1％BSA封闭，再依次加入一抗、二抗孵育，以上每步操作后均进行PBS洗涤，用DAPI进行染色后，置于显微镜下观察。本发明是一种基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法，水凝胶具有良好的生物相容性及通透性。此外，整个免疫荧光染色过程均在水凝胶封闭的酶标孔中进行，避免了传统卵母细胞免疫荧光染色过程中，口吸管多次转移所造成了卵母细胞丢失、操作繁琐、效率较低等问题，染色效果较好，对于像卵母细胞这样体积大、数量有限、不贴壁、不增殖的细胞，此方法十分适用。
实施例2
一种基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法，包括如下步骤：
1.卵母细胞经口吸管转移至酶标孔中央；
2.沿孔壁滴加30μL浓度为10％的水凝胶覆盖卵母细胞并进行405nm波长的可见蓝光照射30s～60s快速固化；
3.加入100μl PBS缓冲液洗涤10min；
4.重复3步骤；
5.加入50μl 4％多聚甲醛，固定40min；
6.加入100μl PBS洗涤30min；
7.重复6步骤；
8.加入50μl 0.5％Triton-X100，透化40min；
9.重复6、7步骤；
10.加入1％BSA或山羊血清，室温封闭2h，以封闭细胞表面的非特异性抗原；
11.吸干表面液体；
12.加入一抗，室温孵育8h；
13.重复6、7步骤；
14.避光加入荧光标记的二抗，室温孵育2h；
15.重复6、7步骤；
16.加入DAPI，室温避光放置40min；
17.重复6、7步骤；
18.加入抗荧光淬灭剂
19.激光共聚焦显微镜观察。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将卵母细胞经口吸管转移至酶标孔中央，沿孔壁滴加适量一定浓度的水凝胶覆盖卵母细胞并进行光固化，随后用PBS缓冲液洗涤；
（2）向酶标孔内加入4%多聚甲醛固定，随后用PBS缓冲液洗涤；
（3）向酶标孔内加入Triton-X100透化，随后用PBS缓冲液洗涤；
（4）向酶标孔内加入1% BSA或山羊血清，室温下封闭，吸干表面液体，加入一抗，4℃冰箱孵育过夜或室温孵育8h，随后用PBS缓冲液洗涤；
（5）再避光加入荧光标记的二抗室温下孵育，随后用PBS缓冲液洗涤；加入DAPI，室温避光孵育30min，然后用PBS缓冲液洗涤；最后加入抗荧光淬灭剂，置于显微镜下观察。
2.根据权利要求1所述基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法，其特征在于，步骤（1）所述水凝胶为甲基丙烯酰化明胶。
3.根据权利要求1所述基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法，其特征在于，步骤（1）所述水凝胶的加入量为30~60μL，所述水凝胶的浓度为5%~10%。
4.根据权利要求1所述基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法，其特征在于，步骤（1）所述光固化的参数为405nm波长的可见蓝光照射固化30s~60s。
5.根据权利要求1所述基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法，其特征在于，步骤（2）所述多聚甲醛固定的时间为30~40min，随后用PBS缓冲液洗涤的时间为20~30min，重复洗涤三次。
6.根据权利要求1所述基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法，其特征在于，步骤（3）所述Triton-X100透化的时间为30~40min，随后用PBS缓冲液洗涤的时间为20~30min，重复洗涤三次。
7.根据权利要求1所述基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法，其特征在于，步骤（4）所述室温下封闭的时间为1~2h。
8.根据权利要求1所述基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法，其特征在于，步骤（4）所述一抗为α-tublin鼠单克隆抗体，所述一抗孵育的时间为4℃冰箱孵育过夜或室温孵育8h，随后用PBS缓冲液洗涤时间为20~30min，重复洗涤三次。
9.根据权利要求1所述基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法，其特征在于，步骤（5）所述二抗为FITC标记山羊抗小鼠IgG，所述二抗孵育的时间为1~2h，随后用PBS缓冲液洗涤时间为20~30min，重复洗涤三次。
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