CN108018281A - 一种固定化漆酶在亚甲基蓝脱色中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固定化漆酶及其在水处理中的应用，该固定化漆酶以聚甲基丙烯酸甲酯包覆在羧基碳纳米管表面所制备的复合材料为载体，戊二醛为结合剂，利用共价结合法将漆酶固定于用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管上。本发明的固定化漆酶所采用的载体是用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管，使得漆酶的负载率高，可以同时发挥吸附与催化降解的作用对亚甲基蓝进行高效脱色处理，脱色率可达95%～97%，重复使用10次后的脱色率仍超过83%，具有物理化学性能稳定、载酶率高、重复利用率高、处理高效等优点。

Description

一种固定化漆酶在亚甲基蓝脱色中的应用
技术领域
本发明涉及一种固定化漆酶在亚甲基蓝脱色中的应用，属于环境保护中的水处理领域。
背景技术
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，由肽链、糖配基和Cu2+ 3个部分组成。漆酶在自然界中广泛分布于植物、真菌、少数昆虫和细菌中 , 一些动物肾脏和血清中也发现了漆酶。漆酶能催化许多化合物的氧化反应，作用底物比较广泛，包括氨基苯酚、多酚、多胺、木质素、芳基二胺、香草酸、藜芦醇、阿魏酸和吐温等，且反应产物是水，绿色、环保。因此，漆酶被广泛应用于各种领域，例如：纸浆造纸领域、生物合成领域、食品领域、能源领域、木材加工领域、环保领域、改善纤维特性领域、生物检测领域等。但是漆酶易受环境因素影响而失活，不可重复利用等缺点。
酶的固定化是用载体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应 ,并能够实现酶重复连续使用和稳定性改善一类技术。固定化方法包括表面吸附法、包埋法、共价结合法和系统截流法。表面吸附法是利用具有许多孔径结构的天然或人工合成材料吸附酶到载体表面，或者将酶通过静电引力附着于带有相异电荷的载体上使之固定。包埋法是将细胞包裹在凝胶网格结构或半透性聚合薄膜内或使细胞扩散进入多孔性载体内部。共价结合法指在利用特殊试剂的特性或功能，使酶表面的反应基团直接与试剂发生反应，通过基团的相互交联形成网状结构的固定化酶。系统截流法是指利用各种膜，例如渗析膜、超滤膜、中空纤维膜等半透膜将细胞限定在特定的空间范围内的方法。
染料废水大量进入我国水体环境，已成为污染我国水环境质量的重要因素之一。染料工业废水处理的突出问题包括色度的脱除和复杂难降解有机物的矿化存在技术困难。目前应用最广泛的染料可以分为三类：偶氮染料、蒽醌染料及三苯基甲烷类染料。为了实现染料废水的脱色和矿化高效处理，需要从染料的微观结构入手，对其降解机制进行分析，并开发出针对性较好的染料废水处理技术。亚甲基蓝可用于制造墨水和色淀及生物、细菌组织的染色等方面。与ZnCl2制成复盐，可用于棉、麻、蚕丝织物、纸张的染色和竹、木的着色。
发明内容
本发明的目的在于提供一种固定化漆酶能够高效处理亚甲基蓝废水的应用。
本发明提供一种固定化漆酶在亚甲基蓝脱色中的应用，包括如下步骤：
（1）称取0.2 g上述反应得到的羧基碳纳米管分散到5 mL 6%的正辛烷溶液中，加入0.2g十二烷基硫酸钠和30 mL水，冰溶超声15 min；
（2）加入4 mL甲基丙烯酸甲酯、1 mL二乙烯基苯、8 mL1%过硫酸钾，反应温度70 ℃，搅拌聚合24 h，反应完成后，自然降温至室温，离心；
（3）上述反应的得到的固体用水和乙醇交替洗涤，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色固体颗粒，即是用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管；
（4）称取0.2 g用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管，加入20 ml 10%的戊二醛水溶液，室温机械搅拌6 h，反应完成后，用水洗涤；
（5）将合成的材料加入到30 ml蒸馏水中，加入漆酶粉末0.02 g，然后放入转速为120rpm的摇床中，30℃反应6 h；
（6）最后用PH=7.0，0.1 mol/l的磷酸缓冲液洗涤三次，去除未能结合上去的游离酶，收集固定化漆酶，备用。
（7）称取0.05 g固定化漆酶，放入20 mL浓度为10 mg/L的亚甲基蓝溶液中，在转速为120 r/min，温度为30 ℃，pH=7，反应24 h。然后收集上清液测吸光度。
步骤（1）中所述的超声是对羧基碳纳米管分散到正辛烷溶液时先超声2 min，保证羧基碳纳米管在溶液中的分散性，然后再加入其它试剂进行冰溶超声15 min。
步骤（1）中所用的羧基碳纳米管具有较大的比表面积，可以使聚甲基丙烯酸甲酯充分的分散聚合到羧基碳纳米管上，提高了载体的表面积。
步骤（1）中所制备的羧基碳纳米管在6%的正辛烷中的分散液的浓度为40 mg/ml。
步骤（2）中聚合反应温度应始终处于70 ℃下。
步骤（3）中用水和乙醇洗涤过程中，需先用乙醇充分浸泡6 h，保证充分去除杂质。
步骤（5）中聚甲基丙烯酸甲酯与漆酶的质量比为，10：1。
步骤（7）中测上清液吸光度是为了得出脱色处理后的亚甲基蓝溶液的浓度，进而算出脱色率。
本发明制备的这种固定化漆酶的特征在于：羧基碳纳米管在体系中起到吸附剂的作用，可以吸附部分漆酶，其结构有利于亚甲基蓝在载体表面的富集。另外，聚甲基丙烯酸甲酯包覆在羧基碳纳米管，可以有效增加表面积，为戊二醛与漆酶之间的结合提供大量的反应位点。
本发明的优点在于：用聚甲基丙烯酸甲酯包覆在羧基碳纳米管，其中既能发挥羧基碳纳米管比表面积大的优势，能够吸附漆酶，增加载酶率，富集更多的亚甲基蓝，又能通过包覆了聚甲基丙烯酸甲酯增加表面积，为戊二醛和漆酶提供更多结合位点，具有物理化学性能稳定、载酶率高、重复利用率高、处理高效等特点。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管的扫描电镜图；
图2为本发明实施例2提供的用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管的X射线衍射图谱；
图3为本发明实施例3提供的用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管的红外谱图；
图4(a)为本发明实施例4提供的固定化漆酶对亚甲基蓝随温度变化的脱色率；
图4(b)为本发明实施例4提供的固定化漆酶对亚甲基蓝随使用次数增加的脱色率变化。
具体实施方式
为使发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1：
（1）称取0.2 g上述反应得到的羧基碳纳米管分散到5 mL 6%的正辛烷溶液中，加入0.2g十二烷基硫酸钠和30 mL水，冰溶超声15 min；
（2）加入4 mL甲基丙烯酸甲酯、1 mL二乙烯基苯、8 mL1%过硫酸钾，反应温度70 ℃，搅拌聚合24 h，反应完成后，自然降温至室温，离心；
（3）上述反应的得到的固体用水和乙醇交替洗涤，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色固体颗粒，即是用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管；
（4）称取0.2 g用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管，加入20 ml 10%的戊二醛水溶液，室温机械搅拌6 h，反应完成后，用水洗涤；
（5）将合成的材料加入到30 ml蒸馏水中，加入漆酶粉末0.02 g，然后放入转速为120rpm的摇床中，30℃反应6 h；
（6）最后用PH=7.0，0.1 mol/l的磷酸缓冲液洗涤三次，去除未能结合上去的游离酶，收集固定化漆酶，备用。
将制备的用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管置于扫描电子显微镜（SEM）下观察材料的形态学和粒径，发现羧基碳纳米管上附着有聚甲基丙烯酸甲酯，表明聚甲基丙烯酸甲酯聚合在羧基碳纳米管上，如图1所示。
实施方式2：
（1）称取0.2 g上述反应得到的羧基碳纳米管分散到5 mL 6%的正辛烷溶液中，加入0.2g十二烷基硫酸钠和30 mL水，冰溶超声15 min；
（2）加入4 mL甲基丙烯酸甲酯、1 mL二乙烯基苯、8 mL1%过硫酸钾，反应温度70 ℃，搅拌聚合24 h，反应完成后，自然降温至室温，离心；
（3）上述反应的得到的固体用水和乙醇交替洗涤，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色固体颗粒，即是用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管；
（4）称取0.2 g用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管，加入20 ml 10%的戊二醛水溶液，室温机械搅拌6 h，反应完成后，用水洗涤；
（5）将合成的材料加入到30 ml蒸馏水中，加入漆酶粉末0.02 g，然后放入转速为120rpm的摇床中，30℃反应6 h；
（6）最后用PH=7.0，0.1 mol/l的磷酸缓冲液洗涤三次，去除未能结合上去的游离酶，收集固定化漆酶，备用。
为了进一步确定聚甲基丙烯酸甲酯是否已经包覆羧基碳纳米管，将所制备样品进行X射线衍射图谱分析。如图2所示，与羧基碳纳米管相比较，用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管缺少了25.9°的峰，这表明聚甲基丙烯酸甲酯已经包覆羧基碳纳米管。
实施方式3：
（1）称取0.2 g上述反应得到的羧基碳纳米管分散到5 mL 6%的正辛烷溶液中，加入0.2g十二烷基硫酸钠和30 mL水，冰溶超声15 min；
（2）加入4 mL甲基丙烯酸甲酯、1 mL二乙烯基苯、8 mL1%过硫酸钾，反应温度70 ℃，搅拌聚合24 h，反应完成后，自然降温至室温，离心；
（3）上述反应的得到的固体用水和乙醇交替洗涤，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色固体颗粒，即是用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管；
（4）称取0.2 g用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管，加入20 ml 10%的戊二醛水溶液，室温机械搅拌6 h，反应完成后，用水洗涤；
（5）将合成的材料加入到30 ml蒸馏水中，加入漆酶粉末0.02 g，然后放入转速为120rpm的摇床中，30℃反应6 h；
（6）最后用PH=7.0，0.1 mol/l的磷酸缓冲液洗涤三次，去除未能结合上去的游离酶，收集固定化漆酶，备用。
为了验证包覆羧基碳纳米管的是聚甲基丙烯酸甲酯，将所制备样品进行傅里叶红外光谱分析。如图3所示，与羧基碳纳米管相比较，用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管的峰发生变化，在2900 cm -1处观察到用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管的特征带对应于甲基亚甲基。此外，在波长为1700 cm -1，1200 cm -1处分别存在吸收峰。这表明聚甲基丙烯酸甲酯已经包覆羧基碳纳米管。
实施方式4：
（1）称取0.2 g上述反应得到的羧基碳纳米管分散到5 mL 6%的正辛烷溶液中，加入0.2g十二烷基硫酸钠和30 mL水，冰溶超声15 min；
（2）加入4 mL甲基丙烯酸甲酯、1 mL二乙烯基苯、8 mL1%过硫酸钾，反应温度70 ℃，搅拌聚合24 h，反应完成后，自然降温至室温，离心；
（3）上述反应的得到的固体用水和乙醇交替洗涤，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色固体颗粒，即是用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管；
（4）称取0.2 g用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管，加入20 ml 10%的戊二醛水溶液，室温机械搅拌6 h，反应完成后，用水洗涤；
（5）将合成的材料加入到30 ml蒸馏水中，加入漆酶粉末0.02 g，然后放入转速为120rpm的摇床中，30℃反应6 h；
（6）最后用PH=7.0，0.1 mol/l的磷酸缓冲液洗涤三次，去除未能结合上去的游离酶，收集固定化漆酶，备用。
（7）称取0.05 g固定化漆酶，放入20 mL浓度为10 mg/L的亚甲基蓝溶液中，在转速为120 r/min，温度为30 ℃，pH=7，反应24 h。然后收集上清液测吸光度。
为了研究固定化漆酶对亚甲基蓝的脱色效果，将固定化漆酶用于脱色实验。如图4（a）所示，在温度为30℃，固定化漆酶的亚甲蓝脱色率可以达到96.16％。如图4（b）所示，固定漆酶在循环使用10次后对亚甲基蓝的脱色率高于83％。

Claims (8)

1.一种固定化漆酶在亚甲基蓝脱色中的应用，其特征在于该过程包括以下步骤：
(1)称取0.2g上述反应得到的羧基碳纳米管分散到5mL 6％的正辛烷溶液中，加入0.2g十二烷基硫酸钠和30mL水，冰溶超声15min；
(2)加入4mL甲基丙烯酸甲酯、1mL二乙烯基苯、8mL 1％的过硫酸钾，反应温度70℃，搅拌聚合24h，反应完成后，自然降温至室温，离心；
(3)上述反应的得到的固体用水和乙醇交替洗涤，真空干燥，冷却，收集产物得到黑色固体颗粒，即是用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管；
(4)称取0.2g用聚甲基丙烯酸甲酯包覆的羧基碳纳米管，加入20ml 10％的戊二醛水溶液，室温机械搅拌6h，反应完成后，用水洗涤；
(5)将合成的材料加入到30ml蒸馏水中，加入漆酶粉末0.02g，然后放入转速为120rpm的摇床中，30℃反应6h；
(6)最后用PH＝7.0，0.1mol/l的磷酸缓冲液洗涤三次，去除未能结合上去的游离酶，收集固定化漆酶，备用。
(7)称取0.05g固定化漆酶，放入20mL浓度为10mg/L的亚甲基蓝溶液中，在转速为120r/min，温度为30℃，pH＝7，反应24h。然后收集上清液测吸光度。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的超声是对羧基碳纳米管分散到正辛烷溶液时先超声2min，保证羧基碳纳米管在溶液中的分散性，然后再加入其它试剂进行冰溶超声15min。
3.步骤(1)中所用的羧基碳纳米管具有较大的比表面积，可以使聚甲基丙烯酸甲酯充分的分散聚合到羧基碳纳米管上，提高了载体的表面积。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所制备的羧基碳纳米管在6％的正辛烷中的分散液的浓度为40mg/ml。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中聚合反应温度应始终处于70℃下。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中用水和乙醇洗涤过程中，需先用乙醇充分浸泡6h，保证充分去除杂质。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中聚甲基丙烯酸甲酯与漆酶的质量比为，10：1。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)中测上清液吸光度是为了得出脱色处理后的亚甲基蓝溶液的浓度，进而算出脱色率。
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