CN117511899A - 一种Zn-NiMOF材料固定化的糖基转移酶及其制备方法与应用 - Google Patents
一种Zn-NiMOF材料固定化的糖基转移酶及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种Zn‑Ni MOF材料固定化的糖基转移酶及其制备方法与应用，属于固定化酶生物催化剂的制备及应用技术领域，以溶剂热法合成了高度稳定的介孔Zn‑Ni MOF纳米颗粒，再采用介孔Zn‑Ni MOF纳米颗粒一步纯化和固定化糖基转移酶UGT，固定化后的UGT具有更好的pH适应性、热稳定性、优越的重复使用性和储存稳定性。本发明制备的Zn‑Ni MOF对带有组氨酸标签的UGT具有较强的特异性吸附性能，采用本发明制备的UGT@Zn‑Ni MOF作为酶生物催化剂进行催化反应时可以实现较高的人参皂苷Rh2转化率，故在纳米技术和生物催化方面具有巨大的工业应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及固定化酶生物催化剂的制备及应用技术领域，具体涉及一种Zn-NiMOF材料固定化的糖基转移酶及其制备方法与应用。
背景技术
人参皂苷为三萜皂苷，是人参的主要活性成分，具有抗衰老、抗氧化和抗癌等特性，由于其独特的三萜骨架与不同的糖基相互作用而产生的结构多样性，使得人参皂苷表现出多种生物活性。人参皂苷Rh2，又称3-O-β-D-glucopyranosyl-protopanaxadiol，是一种价格昂贵且稀有的PPD型人参皂苷。其在癌症治疗中具有抗增殖、抗侵袭、抗转移、诱导细胞周期阻滞和促进分化等作用，但人参提取物中人参皂苷Rh2含量极低(总干重0.0001％～0.0003％[w/w])。因此，人参皂苷Rh2的合成受到了广泛的关注。
人参皂苷Rh2的制备方法包括植物提取法、化学合成法和合成生物学构建细胞工厂法。然而，这些方法不环保，产量低，无法工业化。相比之下，酶催化转化法绿色高效，是实现人参皂苷Rh2工业化生产的一种很有前景的方法。PPD被葡萄糖或其他糖在C3或C20位置糖基化，从而产生PPD型人参皂苷Rh2。糖基化过程中使用的生物合成酶尿苷二磷酸(UDP)-糖基转移酶(UGT)可通过形成O-β1,2-或O-β1,6-糖苷键合成多种人参皂苷。
UGTs是自然界常见的酶，广泛用于低聚糖、多糖、糖缀合物和新型衍生物的合成，是生物合成人参皂苷Rh2最后一步的关键酶。但是，直接使用游离酶催化反应面临两个问题：一是工程菌表达后，需要对粗酶进行纯化(如果不进行纯化，粗酶中的糖苷酶会将糖基化的PPD再次去糖基化，影响催化反应活性)；然而纯化过程复杂，所用试剂和材料昂贵，纯化时间长，且会降低酶的活性；二是试剂和物料在催化反应过程中需要严格控制pH值，难以回收再利用。而游离酶的固定化不仅可以有效地克服上述问题，而且能够高效改善酶性能。因此，为了酶催化合成Rh2，必须开发一种能够一步纯化和固定化酶的载体材料。
金属有机骨架(MOF)因其高比表面积、可调节和超高孔隙率、可设计的功能和良好的热稳定性而被广泛应用。现有的MOF固定方法包括物理吸附法、共价交联法和共沉淀法。上述方法存在以下缺点：酶在催化过程中容易脱落，使用交联剂导致酶活性丧失，并且需要高纯度的酶，这大大增加了固定化过程的难度和成本。为此，本发明提供一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶及其制备方法与应用。
发明内容
本发明提供了一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶及其制备方法与应用，不仅克服了现有合成人参皂苷Rh2时直接使用UGTs催化时对粗酶纯化过程复杂、时间长且会降低酶活性以及催化过程需要严格控制pH的问题，而且解决了采用MOF材料固定化UGTs导致的催化过程酶易脱落、酶失活以及增加固定化过程难度和成本的技术问题，同时提供了一种能够实现较高的人参皂苷Rh2转化率的具有更好的温度、pH和储存稳定性的固定化糖基转移酶。
本发明的第一个目的是提供一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，制备Zn-Ni MOF：将可溶性锌盐和可溶性镍盐溶解于DMF和乙二醇的混合液中，加入有机配体，磁力搅拌，得到混合物，将所述混合物转移到聚四氟乙烯反应釜中，于110～150℃下保温，得到沉淀物，洗涤，干燥，得到黄棕色Zn-Ni MOF粉末；
S2，将S1的Zn-Ni MOF粉末与含有糖基转移酶的细胞裂解液于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于冰水浴磁力搅拌，离心，得到Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶(UGT@Zn-Ni MOF)。
pH＝7.4的磷酸盐缓冲液的配置：缓冲液中含137mmol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，10mmol/LNa2HPO4，2mmol/LKH2PO4。称取7.946g的NaCl，0.201g的KC1，3.581g的Na2HPO4，0.272g的KH2PO4配置成1000ml的溶液，调节pH至7.4即得。
作为优选的实施方式，S1中，所述可溶性锌盐与可溶性镍盐的摩尔比为1:0.3～3。
作为优选的实施方式，S1中，所述可溶性锌盐和可溶性镍盐与有机配体的摩尔比为1:0.25～4。
作为优选的实施方式，S1中，所述可溶性锌盐为硝酸锌，所述可溶性镍盐为硝酸镍。
作为优选的实施方式，S1中，所述有机配体包括对苯二甲酸、2-氨基对苯二甲酸。
作为优选的实施方式，S1中，所述保温的时间为4～8h，搅拌的时间为2.5h。
作为优选的实施方式，S2中，所述Zn-Ni MOF粉末与含有糖基转移酶的细胞裂解液的用量比为10mg：0.1～1.0mL。
作为优选的实施方式，S2中，所述糖基转移酶为从枯草芽孢杆菌SL-44基因组中挖掘出的糖基转移酶基因GE02773，构建糖基转移酶表达工程菌BL21-GE02773-28a，最后诱导其表达的可溶性蛋白UGT。
具体为：向200ml的液体培养基中依次加入200μL卡那和4ml菌液，在37℃培养箱中振荡培养至OD595nm＝0.6～0.8后，加入200μLIPTG进行诱导表达，在16℃培养箱中振荡培养12-16h。
粗酶液提取过程：将诱导表达后的菌液在4℃下8000rpm离心3min，用pH＝7.4的PBS缓冲液清洗两次后，再加入20mlPBS缓冲液，用细胞破碎仪进行细胞破碎，细胞破碎仪工作参数为：工作时间5s，间隔时间5s，工作总时长20min。最后，在4℃下12000rpm离心10min得到粗酶液。
作为优选的实施方式，S2中，所述冰水浴的温度为4℃。
本发明的第二个目的在于提供一种上述制备方法制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶(UGT@Zn-Ni MOF)。
本发明的第三个目的在于提供一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶在合成人参皂苷Rh2中的应用，其特征在于，所述应用为：按照3:1.2:10的质量比将尿苷二磷酸葡萄糖与原人参二醇和Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后采用正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供了一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，本发明能够有效地完成金属离子和有机配体的组装，以溶剂热法在150℃下合成了高度稳定的介孔Zn-Ni MOF纳米颗粒，再采用介孔Zn-Ni MOF纳米颗粒一步纯化和固定化糖基转移酶(UGT)，由于金属离子和UGT酶蛋白分子中组氨酸上的咪唑基团之间的螯合作用，实现了从粗酶液中一步纯化和固定化糖基转移酶，固定化后的UGT具有更好的pH适应性、热稳定性、优越的重复使用性和储存稳定性，经过在合成人参皂苷Rh2的应用中循环使用7次后仍能保持约76％的初始活性；储存七天后，固定化酶的相对活性保持在87％。本发明制备的Zn-Ni MOF对带有组氨酸标签的UGT具有较强的特异性吸附性能，采用本发明制备的UGT@Zn-Ni MOF作为酶生物催化剂进行催化反应时可以实现较高的人参皂苷Rh2转化率，故在纳米技术和生物催化方面具有巨大的工业应用潜力。
(2)采用本发明制备的UGT@Zn-Ni MOF作为酶生物催化剂合成人参皂苷Rh2时，其转化率为78.74％。
(3)本发明提供的UGT@Zn-Ni MOF制备方法，原材料简单易得，成本低廉；所需设备较为常规，易于制备和调控。
附图说明
图1为本发明实施例1的Zn-Ni MOF以及固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF的扫描电镜图；
图2为本发明实施例1的Zn-Ni MOF以及固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF的X射线衍射图；
图3为本发明实施例1的Zn-Ni MOF以及固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF的红外光谱分析图；
图4为本发明实施例1的固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF的激光扫描共聚焦显微镜图；
图5为本发明实施例1的固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF在合成人参皂苷Rh2的应用中循环使用0～7次的相对活性图；
图6为本发明实施例1的Zn-Ni MOF的粒径分布图；
图7为本发明实施例1的Zn-Ni MOF以及固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF的热重分析图；
图8为本发明实施例1的Zn-Ni MOF以及固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF的N2-吸附脱附曲线图；
图9为本发明实施例1的Zn-Ni MOF以及固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF的孔径分布图；
图10为本发明实施例1的Zn-Ni MOF以及固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF的XPS分析图；其中，(a)图为全谱分析；(b)图为N1s；(c)图为Zn2p；(d)图为Ni2p；
图11为本发明实施例1的固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图12为本发明实施例1的UGT及其固定化后的UGT@Zn-Ni MOF的蛋白质二级结构图；其中，(a)图为游离UGT和UGT@Zn-Ni MOF中酶的二级结构的红外光谱分析图；(b)图为游离UGT的二级结构分峰拟合结果图；(c)图为UGT@Zn-Ni MOF中酶的二级结构分峰拟合结果图；(d)图为游离UGT和UGT@Zn-Ni MOF中酶的二级结构比例。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。下述试验方法和检测方法，如没有特殊说明，均为常规方法；所述试剂和原料，如没有特殊说明，均为市售。
本发明采用溶剂热法将金属离子和有机配体进行有效组装组装合成了高度稳定的介孔Zn-Ni MOF纳米颗粒，再采用介孔Zn-Ni MOF纳米颗粒一步纯化和固定化糖基转移酶(UGT)，由于金属离子和UGT酶蛋白分子中组氨酸上的咪唑基团之间的螯合作用，实现了从粗酶液中一步纯化和固定化糖基转移酶，固定化后的UGT具有更好的pH适应性、热稳定性、优越的重复使用性和储存稳定性，经过在合成人参皂苷Rh2的应用中循环使用7次后仍能保持约76％的初始活性；储存七天后，固定化酶的相对活性保持在87％。
本发明所采用的所述糖基转移酶为从枯草芽孢杆菌SL-44基因组中挖掘出的糖基转移酶基因GE02773，构建糖基转移酶表达工程菌BL21-GE02773-28a，最后诱导其表达为可溶性蛋白UGT。具体为：
向200ml的液体培养基中依次加入200μL卡那和4ml菌液，在37℃培养箱中振荡培养至OD595nm＝0.6～0.8后，加入200μLIPTG进行诱导表达，在16℃培养箱中振荡培养12-16h。
粗酶液提取过程：将诱导表达后的菌液在4℃下8000rpm离心3min，用pH＝7.4的PBS缓冲液清洗两次后，再加入20mlPBS缓冲液，用细胞破碎仪进行细胞破碎，细胞破碎仪工作参数为：工作时间5s，间隔时间5s，工作总时长20min。最后，在4℃下12000rpm离心10min得到粗酶液。
本发明使用的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液的配置：缓冲液中含137mmol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，10mmol/LNa2HPO4，2mmol/LKH2PO4。称取7.946g的NaCl，0.201g的KC1，3.581g的Na2HPO4，0.272g的KH2PO4配置成1000ml的溶液，调节pH至7.4即得。
实施例1
一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备Zn-Ni MOF：将0.2789g硝酸锌和0.0906g硝酸镍溶解于16mLDMF和10mL乙二醇的混合液中，磁力搅拌1h，加入0.91g的2-氨基对苯二甲酸，磁力搅拌0.5h，得到混合物，将所述混合物转移到50mL聚四氟乙烯反应釜中，于150℃下保温8h，得到沉淀物，采用乙醇和去离子水反复洗涤所述沉淀物，于60℃的真空干燥箱中干燥8小时，得到黄棕色Zn-NiMOF粉末；
S2，将10mgS1的Zn-Ni MOF粉末与0.25mL含有糖基转移酶的细胞裂解液于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于4℃的冰水浴磁力搅拌2.5h，离心，得到Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶(UGT@Zn-Ni MOF)。
将上述制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶用于合成人参皂苷Rh2，具体为：将3mg尿苷二磷酸葡萄糖与1.2mg原人参二醇和10mgZn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后使用800μL正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
实施例2
一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备Zn-Ni MOF：将0.2454g硝酸锌和0.1233g硝酸镍溶解于16mLDMF和10mL乙二醇的混合液中，磁力搅拌1h，加入0.91g的2-氨基对苯二甲酸，磁力搅拌0.5h，得到混合物，将所述混合物转移到50mL聚四氟乙烯反应釜中，于150℃下保温8h，得到沉淀物，采用乙醇和去离子水反复洗涤所述沉淀物，于60℃的真空干燥箱中干燥8小时，得到黄棕色Zn-NiMOF粉末；
S2，将10mgS1的Zn-Ni MOF粉末与0.25mL含有糖基转移酶的细胞裂解液于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于4℃的冰水浴磁力搅拌2.5h，离心，得到Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶(UGT@Zn-Ni MOF)。
将上述制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶用于合成人参皂苷Rh2，具体为：将3mg尿苷二磷酸葡萄糖与1.2mg原人参二醇和10mgZn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后使用800μL正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
实施例3
一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备Zn-Ni MOF：将0.1859g硝酸锌和0.1813g硝酸镍溶解于16mLDMF和10mL乙二醇的混合液中，磁力搅拌1h，加入0.91g的2-氨基对苯二甲酸，磁力搅拌0.5h，得到混合物，将所述混合物转移到50mL聚四氟乙烯反应釜中，于150℃下保温8h，得到沉淀物，采用乙醇和去离子水反复洗涤所述沉淀物，于60℃的真空干燥箱中干燥8小时，得到黄棕色Zn-NiMOF粉末；
S2，将10mgS1的Zn-Ni MOF粉末与0.25mL含有糖基转移酶的细胞裂解液于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于4℃的冰水浴磁力搅拌2.5h，离心，得到Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶(UGT@Zn-Ni MOF)。
将上述制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶用于合成人参皂苷Rh2，具体为：将3mg尿苷二磷酸葡萄糖与1.2mg原人参二醇和10mgZn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后使用800μL正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
实施例4
一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备Zn-Ni MOF：将0.1264g硝酸锌和0.2393g硝酸镍溶解于16mLDMF和10mL乙二醇的混合液中，磁力搅拌1h，加入0.91g的2-氨基对苯二甲酸，磁力搅拌0.5h，得到混合物，将所述混合物转移到50mL聚四氟乙烯反应釜中，于150℃下保温8h，得到沉淀物，采用乙醇和去离子水反复洗涤所述沉淀物，于60℃的真空干燥箱中干燥8小时，得到黄棕色Zn-NiMOF粉末；
S2，将10mgS1的Zn-Ni MOF粉末与0.25mL含有糖基转移酶的细胞裂解液于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于4℃的冰水浴磁力搅拌2.5h，离心，得到Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶(UGT@Zn-Ni MOF)。
将上述制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶用于合成人参皂苷Rh2，具体为：将3mg尿苷二磷酸葡萄糖与1.2mg原人参二醇和10mgZn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后使用800μL正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
实施例5
一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备Zn-Ni MOF：将0.0930g硝酸锌和0.2719g硝酸镍溶解于16mLDMF和10mL乙二醇的混合液中，磁力搅拌1h，加入0.91g的2-氨基对苯二甲酸，磁力搅拌0.5h，得到混合物，将所述混合物转移到50mL聚四氟乙烯反应釜中，于150℃下保温8h，得到沉淀物，采用乙醇和去离子水反复洗涤所述沉淀物，于60℃的真空干燥箱中干燥8小时，得到黄棕色Zn-NiMOF粉末；
S2，将10mgS1的Zn-Ni MOF粉末与0.25mL含有糖基转移酶的细胞裂解液于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于4℃的冰水浴磁力搅拌2.5h，离心，得到Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶(UGT@Zn-Ni MOF)。
将上述制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶用于合成人参皂苷Rh2，具体为：将3mg尿苷二磷酸葡萄糖与1.2mg原人参二醇和10mgZn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后使用800μL正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
实施例6
一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备Zn-Ni MOF：将0.7437g硝酸锌和0.7250g硝酸镍溶解于16mLDMF和10mL乙二醇的混合液中，磁力搅拌1h，加入0.2275g的2-氨基对苯二甲酸，磁力搅拌0.5h，得到混合物，将所述混合物转移到50mL聚四氟乙烯反应釜中，于150℃下保温8h，得到沉淀物，采用乙醇和去离子水反复洗涤所述沉淀物，于60℃的真空干燥箱中干燥8小时，得到黄棕色Zn-NiMOF粉末；
S2，将10mgS1的Zn-Ni MOF粉末与0.25mL含有糖基转移酶的细胞裂解液于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于4℃的冰水浴磁力搅拌2.5h，离心，得到Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶(UGT@Zn-Ni MOF)。
将上述制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶用于合成人参皂苷Rh2，具体为：将3mg尿苷二磷酸葡萄糖与1.2mg原人参二醇和10mgZn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后使用800μL正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
实施例7
一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备Zn-Ni MOF：将0.7437g硝酸锌和0.7250g硝酸镍溶解于16mLDMF和10mL乙二醇的混合液中，磁力搅拌1h，加入0.455g的2-氨基对苯二甲酸，磁力搅拌0.5h，得到混合物，将所述混合物转移到50mL聚四氟乙烯反应釜中，于150℃下保温8h，得到沉淀物，采用乙醇和去离子水反复洗涤所述沉淀物，于60℃的真空干燥箱中干燥8小时，得到黄棕色Zn-NiMOF粉末；
S2，将10mgS1的Zn-Ni MOF粉末与0.25mL含有糖基转移酶的细胞裂解液于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于4℃的冰水浴磁力搅拌2.5h，离心，得到Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶(UGT@Zn-Ni MOF)。
将上述制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶用于合成人参皂苷Rh2，具体为：将3mg尿苷二磷酸葡萄糖与1.2mg原人参二醇和10mgZn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后使用800μL正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
实施例8
一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备Zn-Ni MOF：将0.3719g硝酸锌和0.3625g硝酸镍溶解于16mLDMF和10mL乙二醇的混合液中，磁力搅拌1h，加入0.455g的2-氨基对苯二甲酸，磁力搅拌0.5h，得到混合物，将所述混合物转移到50mL聚四氟乙烯反应釜中，于150℃下保温8h，得到沉淀物，采用乙醇和去离子水反复洗涤所述沉淀物，于60℃的真空干燥箱中干燥8小时，得到黄棕色Zn-NiMOF粉末；
S2，将10mgS1的Zn-Ni MOF粉末与0.25mL含有糖基转移酶的细胞裂解液于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于4℃的冰水浴磁力搅拌2.5h，离心，得到Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶(UGT@Zn-Ni MOF)。
将上述制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶用于合成人参皂苷Rh2，具体为：将3mg尿苷二磷酸葡萄糖与1.2mg原人参二醇和10mgZn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后使用800μL正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
实施例9
一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备Zn-Ni MOF：将0.3719g硝酸锌和0.3625g硝酸镍溶解于16mLDMF和10mL乙二醇的混合液中，磁力搅拌1h，加入0.91g的2-氨基对苯二甲酸，磁力搅拌0.5h，得到混合物，将所述混合物转移到50mL聚四氟乙烯反应釜中，于150℃下保温8h，得到沉淀物，采用乙醇和去离子水反复洗涤所述沉淀物，于60℃的真空干燥箱中干燥8小时，得到黄棕色Zn-NiMOF粉末；
S2，将10mgS1的Zn-Ni MOF粉末与0.25mL含有糖基转移酶的细胞裂解液于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于4℃的冰水浴磁力搅拌2.5h，离心，得到Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶(UGT@Zn-Ni MOF)。
将上述制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶用于合成人参皂苷Rh2，具体为：将3mg尿苷二磷酸葡萄糖与1.2mg原人参二醇和10mgZn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后使用800μL正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
实施例10
一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备Zn-Ni MOF：将0.1859g硝酸锌和0.1813g硝酸镍溶解于16mLDMF和10mL乙二醇的混合液中，磁力搅拌1h，加入0.91g的2-氨基对苯二甲酸，磁力搅拌0.5h，得到混合物，将所述混合物转移到50mL聚四氟乙烯反应釜中，于150℃下保温8h，得到沉淀物，采用乙醇和去离子水反复洗涤所述沉淀物，于60℃的真空干燥箱中干燥8小时，得到黄棕色Zn-NiMOF粉末；
S2，将10mgS1的Zn-Ni MOF粉末与0.25mL含有糖基转移酶的细胞裂解液于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于4℃的冰水浴磁力搅拌2.5h，离心，得到Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶(UGT@Zn-Ni MOF)。
将上述制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶用于合成人参皂苷Rh2，具体为：将3mg尿苷二磷酸葡萄糖与1.2mg原人参二醇和10mgZn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后使用800μL正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
实施例11
一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备Zn-Ni MOF：将0.2789g硝酸锌和0.0906g硝酸镍溶解于16mLDMF和10mL乙二醇的混合液中，磁力搅拌1h，加入0.91g的2-氨基对苯二甲酸，磁力搅拌0.5h，得到混合物，将所述混合物转移到50mL聚四氟乙烯反应釜中，于150℃下保温8h，得到沉淀物，采用乙醇和去离子水反复洗涤所述沉淀物，于60℃的真空干燥箱中干燥8小时，得到黄棕色Zn-NiMOF粉末；
S2，将10mgS1的Zn-Ni MOF粉末与0.10mL含有糖基转移酶的细胞裂解液于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于4℃的冰水浴磁力搅拌2.5h，离心，得到Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶(UGT@Zn-Ni MOF)。
将上述制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶用于合成人参皂苷Rh2，具体为：将3mg尿苷二磷酸葡萄糖与1.2mg原人参二醇和10mgZn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后使用800μL正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
实施例12
一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备Zn-Ni MOF：将0.2789g硝酸锌和0.0906g硝酸镍溶解于16mLDMF和10mL乙二醇的混合液中，磁力搅拌1h，加入0.91g的2-氨基对苯二甲酸，磁力搅拌0.5h，得到混合物，将所述混合物转移到50mL聚四氟乙烯反应釜中，于150℃下保温8h，得到沉淀物，采用乙醇和去离子水反复洗涤所述沉淀物，于60℃的真空干燥箱中干燥8小时，得到黄棕色Zn-NiMOF粉末；
S2，将10mgS1的Zn-Ni MOF粉末与0.50mL含有糖基转移酶的细胞裂解液于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于4℃的冰水浴磁力搅拌2.5h，离心，得到Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶(UGT@Zn-Ni MOF)。
将上述制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶用于合成人参皂苷Rh2，具体为：将3mg尿苷二磷酸葡萄糖与1.2mg原人参二醇和10mgZn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后使用800μL正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
实施例13
一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备Zn-Ni MOF：将0.2789g硝酸锌和0.0906g硝酸镍溶解于16mLDMF和10mL乙二醇的混合液中，磁力搅拌1h，加入0.91g的2-氨基对苯二甲酸，磁力搅拌0.5h，得到混合物，将所述混合物转移到50mL聚四氟乙烯反应釜中，于150℃下保温8h，得到沉淀物，采用乙醇和去离子水反复洗涤所述沉淀物，于60℃的真空干燥箱中干燥8小时，得到黄棕色Zn-NiMOF粉末；
S2，将10mgS1的Zn-Ni MOF粉末与0.75mL含有糖基转移酶的细胞裂解液于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于4℃的冰水浴磁力搅拌2.5h，离心，得到Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶(UGT@Zn-Ni MOF)。
将上述制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶用于合成人参皂苷Rh2，具体为：将3mg尿苷二磷酸葡萄糖与1.2mg原人参二醇和10mgZn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后使用800μL正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
实施例14
一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备Zn-Ni MOF：将0.2789g硝酸锌和0.0906g硝酸镍溶解于16mLDMF和10mL乙二醇的混合液中，磁力搅拌1h，加入0.91g的2-氨基对苯二甲酸，磁力搅拌0.5h，得到混合物，将所述混合物转移到50mL聚四氟乙烯反应釜中，于150℃下保温8h，得到沉淀物，采用乙醇和去离子水反复洗涤所述沉淀物，于60℃的真空干燥箱中干燥8小时，得到黄棕色Zn-NiMOF粉末；
S2，将10mgS1的Zn-Ni MOF粉末与1.0mL含有糖基转移酶的细胞裂解液于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于4℃的冰水浴磁力搅拌2.5h，离心，得到Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶(UGT@Zn-Ni MOF)。
将上述制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶用于合成人参皂苷Rh2，具体为：将3mg尿苷二磷酸葡萄糖与1.2mg原人参二醇和10mgZn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后使用800μL正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
实施例15
一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备Zn-Ni MOF：将0.2789g硝酸锌和0.0906g硝酸镍溶解于16mLDMF和10mL乙二醇的混合液中，磁力搅拌1h，加入0.91g的2-氨基对苯二甲酸，磁力搅拌0.5h，得到混合物，将所述混合物转移到50mL聚四氟乙烯反应釜中，于150℃下保温2h，得到沉淀物，采用乙醇和去离子水反复洗涤所述沉淀物，于60℃的真空干燥箱中干燥8小时，得到黄棕色Zn-NiMOF粉末；
S2，将10mgS1的Zn-Ni MOF粉末与0.25mL含有糖基转移酶的细胞裂解液于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于4℃的冰水浴磁力搅拌2.5h，离心，得到Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶(UGT@Zn-Ni MOF)。
将上述制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶用于合成人参皂苷Rh2，具体为：将3mg尿苷二磷酸葡萄糖与1.2mg原人参二醇和10mgZn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后使用800μL正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
实施例16
一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备Zn-Ni MOF：将0.2789g硝酸锌和0.0906g硝酸镍溶解于16mLDMF和10mL乙二醇的混合液中，磁力搅拌1h，加入0.91g的2-氨基对苯二甲酸，磁力搅拌0.5h，得到混合物，将所述混合物转移到50mL聚四氟乙烯反应釜中，于150℃下保温4h，得到沉淀物，采用乙醇和去离子水反复洗涤所述沉淀物，于60℃的真空干燥箱中干燥8小时，得到黄棕色Zn-NiMOF粉末；
S2，将10mgS1的Zn-Ni MOF粉末与0.25mL含有糖基转移酶的细胞裂解液于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于4℃的冰水浴磁力搅拌2.5h，离心，得到Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶(UGT@Zn-Ni MOF)。
将上述制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶用于合成人参皂苷Rh2，具体为：将3mg尿苷二磷酸葡萄糖与1.2mg原人参二醇和10mgZn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后使用800μL正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
实施例17
一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备Zn-Ni MOF：将0.2789g硝酸锌和0.0906g硝酸镍溶解于16mLDMF和10mL乙二醇的混合液中，磁力搅拌1h，加入0.91g的2-氨基对苯二甲酸，磁力搅拌0.5h，得到混合物，将所述混合物转移到50mL聚四氟乙烯反应釜中，于150℃下保温6h，得到沉淀物，采用乙醇和去离子水反复洗涤所述沉淀物，于60℃的真空干燥箱中干燥8小时，得到黄棕色Zn-NiMOF粉末；
S2，将10mgS1的Zn-Ni MOF粉末与0.25mL含有糖基转移酶的细胞裂解液于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于4℃的冰水浴磁力搅拌2.5h，离心，得到Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶(UGT@Zn-Ni MOF)。
将上述制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶用于合成人参皂苷Rh2，具体为：将3mg尿苷二磷酸葡萄糖与1.2mg原人参二醇和10mgZn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后使用800μL正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
实施例18
一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：
S1，制备Zn-Ni MOF：将0.2789g硝酸锌和0.0906g硝酸镍溶解于16mLDMF和10mL乙二醇的混合液中，磁力搅拌1h，加入0.91g的2-氨基对苯二甲酸，磁力搅拌0.5h，得到混合物，将所述混合物转移到50mL聚四氟乙烯反应釜中，于150℃下保温10h，得到沉淀物，采用乙醇和去离子水反复洗涤所述沉淀物，于60℃的真空干燥箱中干燥8小时，得到黄棕色Zn-Ni MOF粉末；
S2，将10mgS1的Zn-Ni MOF粉末与0.25mL含有糖基转移酶的细胞裂解液于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于4℃的冰水浴磁力搅拌2.5h，离心，得到Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶(UGT@Zn-Ni MOF)。
将上述制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶用于合成人参皂苷Rh2，具体为：将3mg尿苷二磷酸葡萄糖与1.2mg原人参二醇和10mgZn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后使用800μL正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
为了进一步证明本发明的技术效果，本发明还设置有对比例，具体如下：
对比例1
采用游离的糖基转移酶催化合成人参皂苷Rh2，并检测其转化率为88.24％。
将游离的糖基转移酶用于合成人参皂苷Rh2，具体为：将3mg尿苷二磷酸葡萄糖与1.2mg原人参二醇和0.25mL游离的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后使用800μL正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
由于游离的糖基转移酶为液体，并与pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)混为一体，使用后无法再进行回收循环利用。
由于上述实施例1～18制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶性能近似，现仅以实施例1为例进行效果说明，针对本发明实施例1制备得到的Zn-Ni MOF以及固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF的各项性能检测如下：
图1为本发明实施例1制备得到的Zn-Ni MOF扫描电镜图，由图1可知，Zn-Ni MOF形貌为多孔的球状结构，而由图6的Zn-Ni MOF粒径分布图可知，Zn-Ni MOF的平均粒径为600～700nm。
图2为本发明实施例1的Zn-Ni MOF以及固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF的X射线衍射图，由图2可知，Zn-Ni MOF负载酶之后，材料晶体结构几乎没有变化，说明酶的引入没有改变材料的原始结构。
图3为本发明实施例1的Zn-Ni MOF以及固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF的红外光谱分析图；更好地证明了Zn-Ni MOF和UGT的固定化作用，固定化酶后，UGT@Zn-Ni MOF在酰胺I、II和III条带(从1650cm-1到1410cm-1)以及1080cm-1处的拉伸增强，其中在1560cm-1处出现的吸附带，属于UGT中氨基的变形振动。另外，UGT@Zn-Ni MOF在1060cm-1处还形成了CN的拉伸振动特征峰。FTIR光谱分析进一步证明了UGT在Zn-Ni MOF复合材料上的成功固定化。
图4为本发明实施例1的固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF的激光扫描共聚焦显微镜图(CLSM图像)，由图4可知，复合材料表面和向内延伸的区域发出均匀的绿色荧光，这表明UGT被成功封装并均匀分布在UGT@Zn-Ni MOF上。
图5为本发明实施例1的固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF在合成人参皂苷Rh2的应用中循环使用1～7次的相对活性图，由图5可知，实施例1的固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF在合成人参皂苷Rh2的应用中循环使用0～7次后，UGT@Zn-Ni MOF的相对活性分别可达98.7％、96.5％、92.1％、87.4％、85.3％、81.0％、79.14％、76.0％。因此，经过在合成人参皂苷Rh2的应用中循环使用7次后仍能保持约76％的初始活性。
图7为本发明实施例1的Zn-Ni MOF以及固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF的热重分析图；由图7可知，到800℃时，UGT@Zn-Ni MOF的总热重损失为69.01％，而Zn-Ni MOF只损失了50.22％，这表明UGT在Zn-Ni MOF上被成功固定。
图8为本发明实施例1的Zn-Ni MOF以及固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF的N2-吸附脱附曲线图，由图8可知，Zn-Ni MOF表现出Ⅴ型吸附等温线，而UGT@Zn-Ni MOF表现出Ⅳ型吸附等温线，这属于介孔材料的典型等温线类型。两者在较高的相对压力下均产生了迟滞效应，说明其吸附-脱附过程是不完全可逆的，并且在较高的相对压力下，吸附质发生毛细管凝聚，毛细管凝聚段越陡峭，介孔分布越均匀。另外，介孔的孔径越大，发生毛细管凝聚的压力越大。
图9为本发明实施例1的Zn-Ni MOF以及固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF的孔径分布图，由图9可知，载酶之后Zn-Ni MOF材料的孔径明显减小，说明酶分子不仅在Zn-Ni MOF材料的外表面进行了吸附固定，而且在Zn-Ni MOF材料的内部孔道参与了酶的固定化。
图10为本发明实施例1的Zn-Ni MOF以及固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF的XPS分析图，由图10中的(a)图可知，实施例1制备的Zn-Ni MOF和UGT@Zn-Ni MOF主要由C、N、O、Zn、Ni组成。由图10中的(b)图可知，与Zn-Ni MOF相比，UGT@Zn-Ni MOF的N1s峰显著增强，表明酶成功固定化在了材料上面，另外，N1s图谱中400.56eV和400.36eV处的峰证明了C-NH2的存在，并且一般认为，当氮与金属结合时，由于电子密度从氮转移到金属上，N 1s的结合能会向较低的值转移。由图10中的(c)和(d)图可知，Zn2p1/2和Zn2p3/2的峰分别为1023.95eV和1046.75eV为ZnO的特征峰，Ni2p图谱中855.77eV和854.81eV的峰为Ni2O3和NiO的特征峰。
在使用六水合硝酸镍为原料制备Zn-Ni MOF的过程中，硝酸镍受热温度高于110℃时开始分解并形成碱式盐，继续加热生成棕黑色的Ni2O3和绿色的NiO的混合物，这与我们前面的表征结果一致。另外，从图10中可以观察到，Zn-Ni MOF在固定化酶之后，其Zn、Ni和N三种元素的峰均向低结合能处发生偏移。这可能是由于酶的加入使得材料表面元素的化学环境发生变化，故使峰发生偏移。同时，负载酶之后材料中各元素的峰高明显变低，而XPS峰的强度与元素在表面的浓度和原子灵敏度因子成正比。进行固定化反应的时候，通过UGT上的咪唑基团与Zn-Ni MOF上的Zn2+和Ni2+进行金属螯合后，材料表面的Ni2O3或者ZnO含量变低，所以其峰发生偏移。
图12本发明实施例1的UGT及其固定化后的UGT@Zn-Ni MOF的蛋白质二级结构图，利用FTIR分析对游离UGT和UGT@Zn-Ni MOF酶的二级结构进行了表征，如图12中的(a)图，对1600cm-1～1700cm-1波长范围内的FTIR光谱曲线进行基线校正，高斯反卷积、二阶导数拟合，如图12中的(b)和(c)图。随后，根据峰面积计算确定各二级结构的比例，如图12中的(d)图。从图12中的(d)可以看出，将UGT固定在Zn-Ni MOF上后，β-sheet和β-turn结构的比例显著降低，而α-helix和random coil结构的比例显著增加。这些发现表明，UGT具有灵活的构象，可以通过催化过程中的构象调整促进过渡态的稳定。
针对本发明实施例1制备的UGT@Zn-Ni MOF进行验证：采用咪唑缓冲液对UGT@Zn-Ni MOF进行洗脱，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析固定化酶洗脱液，具体如下：
500mM咪唑缓冲液的配置：称取8.510g的咪唑溶于250mL的蒸馏水中，最后转移至容量瓶中定容。
700mM咪唑缓冲液的配置：取11.914g的咪唑溶于250mL的蒸馏水中，最后转移至容量瓶中定容。
一步纯化和固定化的验证：将得到的UGT@Zn-Ni MOF称取2份，经磷酸盐缓冲液淋洗之后，分别采用500mM和700mM的咪唑缓冲液进行洗脱并收集洗脱液，最后将洗脱液合并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，其结果如图11所示。
图11为本发明实施例1的固定化酶后的UGT@Zn-Ni MOF的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，由图11可知，通过SDS-PAGE分析，在特异性吸附固定化之前，目标酶的蛋白带在44.3kDa处观察到一条宽的深蓝色带(line1)。然而，在用Zn-Ni MOF固定化UGT后(line2)，固定化酶被缓冲溶液浸湿，浸透溶液中残留的目标条带是由于材料达到吸附饱和后UGT未完全吸附所致。最后，用500mM和700mM的咪唑溶液洗脱UGT@Zn-Ni MOF，随着咪唑浓度的增加，更多的UGT被洗脱下来(line 3和line 4)。该洗脱液只含有目标UGT条带，成功地证明了Zn-Ni MOF对带有His标签的UGT的特异性吸附性能。这一发现表明Zn-Ni MOF可以有效地用于His标记的UGT的分离和纯化。
综上所述，本发明提供的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，以溶剂热法合成了高度稳定的介孔Zn-Ni MOF纳米颗粒，再采用介孔Zn-Ni MOF纳米颗粒一步纯化和固定化糖基转移酶(UGT)，固定化后的UGT具有更好的pH适应性、热稳定性、优越的重复使用性和储存稳定性，本发明制备的Zn-Ni MOF对带有组氨酸标签的UGT具有较强的特异性吸附性能，采用本发明制备的UGT@Zn-Ni MOF作为酶生物催化剂进行催化反应时可以实现较高的人参皂苷Rh2转化率，故在纳米技术和生物催化方面具有巨大的工业应用潜力。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备Zn-Ni MOF：将可溶性锌盐和可溶性镍盐溶解于DMF和乙二醇的混合液中，加入有机配体，磁力搅拌，得到混合物，将所述混合物于110～150℃下保温，得到沉淀物，洗涤，干燥，得到Zn-Ni MOF粉末；
将Zn-Ni MOF粉末与含有糖基转移酶的细胞裂解液于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于冰水浴搅拌，离心，得到Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述可溶性锌盐与可溶性镍盐的摩尔比为1:0.3～3。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述可溶性锌盐和可溶性镍盐与有机配体的摩尔比为1:0.25～4。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述可溶性锌盐为硝酸锌，所述可溶性镍盐为硝酸镍。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有机配体包括对苯二甲酸、2-氨基对苯二甲酸。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述保温的时间为4～8h，所述搅拌的时间为2.5h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Zn-Ni MOF粉末与含有糖基转移酶的细胞裂解液的用量比为10mg：0.1～1.0mL。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述糖基转移酶为从枯草芽孢杆菌SL-44基因组中挖掘出的糖基转移酶基因GE02773，构建糖基转移酶表达工程菌BL21-GE02773-28a，并诱导其表达为可溶性蛋白UGT。
9.一种含权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶。
10.一种权利要求9所述的Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶在合成人参皂苷Rh2中的应用，其特征在于，所述应用为：按照3:1.2:10的质量比将尿苷二磷酸葡萄糖、原人参二醇和Zn-Ni MOF材料固定化的糖基转移酶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中混合，于40℃水浴振荡2h，最后采用正丁醇萃取，得到人参皂苷Rh2。
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Citations (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140212944A1 (en) * | 2013-11-29 | 2014-07-31 | Beijing Star New Material Co., Ltd. | MOF-based hierarchical porous materials, methods for preparation, methods for pore regulation and uses thereof |
| US20150087044A1 (en) * | 2011-06-16 | 2015-03-26 | Shengqian Ma | Polyhedral cage-containing mesoporous metal-organic frameworks as platform for biocatalysis, methods of making these frameworks, and methods of using these frameworks |
| CN109897846A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-06-18 | 辽宁大学 | 一种固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法和应用 |
| CN112111478A (zh) * | 2020-08-04 | 2020-12-22 | 江苏大学 | 一种介孔Me/UIO-66-Zr MOF材料及其制备方法和应用 |
| CN113801873A (zh) * | 2021-09-18 | 2021-12-17 | 南京师范大学 | 一种金属有机框架多酶复合催化材料、制备方法及其应用和使用方法 |
| CN113832136A (zh) * | 2021-09-18 | 2021-12-24 | 南京师范大学 | 一种基于Mn-ZIF-90固定化Nahk的复合催化材料及其制备方法和应用 |
| CN113980926A (zh) * | 2021-10-22 | 2022-01-28 | 南京师范大学 | 磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料及其制备方法和应用 |
| CN114426958A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-05-03 | 南京师范大学 | 糖基转移酶-双金属有机框架复合催化材料及其制备方法和在二糖和多糖合成中的应用 |
| WO2022127326A1 (zh) * | 2020-12-18 | 2022-06-23 | 华南理工大学 | 一种蛋白质与多级孔道金属有机骨架复合物及其制备方法与应用 |
| JP2022160976A (ja) * | 2021-04-07 | 2022-10-20 | 浙江工業大学 | 酵素複合材料及びその製造方法と使用方法 |
| CN116286776A (zh) * | 2023-02-20 | 2023-06-23 | 西安工程大学 | L-天冬氨酸改性的双金属介孔mof固定化酶材料及其应用 |
| CN116284815A (zh) * | 2023-02-15 | 2023-06-23 | 江南大学 | 一种铜锌双金属有机框架固定化漆酶及其制备方法 |
| CN116376892A (zh) * | 2023-03-12 | 2023-07-04 | 北京化工大学 | 一种基于亲水中空层状双金属氢氧化物原位封装酶的方法 |
| CN116814719A (zh) * | 2022-03-21 | 2023-09-29 | 南京师范大学 | 制备不同分子量糖胺聚糖的方法 |
-
2023
- 2023-11-06 CN CN202311462493.6A patent/CN117511899A/zh active Pending
Patent Citations (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150087044A1 (en) * | 2011-06-16 | 2015-03-26 | Shengqian Ma | Polyhedral cage-containing mesoporous metal-organic frameworks as platform for biocatalysis, methods of making these frameworks, and methods of using these frameworks |
| US20140212944A1 (en) * | 2013-11-29 | 2014-07-31 | Beijing Star New Material Co., Ltd. | MOF-based hierarchical porous materials, methods for preparation, methods for pore regulation and uses thereof |
| CN109897846A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-06-18 | 辽宁大学 | 一种固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法和应用 |
| CN112111478A (zh) * | 2020-08-04 | 2020-12-22 | 江苏大学 | 一种介孔Me/UIO-66-Zr MOF材料及其制备方法和应用 |
| WO2022127326A1 (zh) * | 2020-12-18 | 2022-06-23 | 华南理工大学 | 一种蛋白质与多级孔道金属有机骨架复合物及其制备方法与应用 |
| JP2022160976A (ja) * | 2021-04-07 | 2022-10-20 | 浙江工業大学 | 酵素複合材料及びその製造方法と使用方法 |
| CN113832136A (zh) * | 2021-09-18 | 2021-12-24 | 南京师范大学 | 一种基于Mn-ZIF-90固定化Nahk的复合催化材料及其制备方法和应用 |
| CN113801873A (zh) * | 2021-09-18 | 2021-12-17 | 南京师范大学 | 一种金属有机框架多酶复合催化材料、制备方法及其应用和使用方法 |
| CN113980926A (zh) * | 2021-10-22 | 2022-01-28 | 南京师范大学 | 磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料及其制备方法和应用 |
| CN114426958A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-05-03 | 南京师范大学 | 糖基转移酶-双金属有机框架复合催化材料及其制备方法和在二糖和多糖合成中的应用 |
| CN116814719A (zh) * | 2022-03-21 | 2023-09-29 | 南京师范大学 | 制备不同分子量糖胺聚糖的方法 |
| CN116284815A (zh) * | 2023-02-15 | 2023-06-23 | 江南大学 | 一种铜锌双金属有机框架固定化漆酶及其制备方法 |
| CN116286776A (zh) * | 2023-02-20 | 2023-06-23 | 西安工程大学 | L-天冬氨酸改性的双金属介孔mof固定化酶材料及其应用 |
| CN116376892A (zh) * | 2023-03-12 | 2023-07-04 | 北京化工大学 | 一种基于亲水中空层状双金属氢氧化物原位封装酶的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| YUFEI ZHANG等: "Heterologous expression of Bacillus subtilis SL-44 glycosyltransferase catalyzed synthesis of ginsenoside Rh2", APPLIED MATHEMATICS AND NONLINEAR SCIENCES, 11 October 2023 (2023-10-11), pages 1 * |
| 冯小倩等: "金属有机框架材料固定化酶的研究进展", 生物加工过程, vol. 20, no. 5, 15 September 2022 (2022-09-15), pages 494 * |
| 高霞;张国春;乔成芳;: "Cu-MOFs固定化酶制备及染料降解应用研究", 商洛学院学报, no. 04, 20 August 2018 (2018-08-20), pages 27 - 33 * |
| 高霞;潘会宾;乔成芳;陈凤英;周元;杨文华;: "基于多级孔金属有机骨架构筑HRP固定化酶反应器及其染料降解应用", 高等学校化学学报, no. 07, 10 July 2020 (2020-07-10), pages 1591 - 1599 * |
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