CN113980926A - 磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料及其制备方法和应用 - Google Patents
磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了磁性纳米粒‑糖基转移酶‑无定型金属有机框架复合催化材料及其制备方法和应用，本发明复合催化材料以无定型金属有机框架作为一种新型的固定化酶材料，将糖基转移酶和磁性纳米粒包裹在其内部形成。本发明制备复合催化材料后，将其加入糖基供体和糖基受体的混合溶液中，催化糖基化反应得到肝素二糖产品。本发明的无定型金属有机框架材料具有比普通金属有机框架更大的孔径，降低传质阻力提高酶促效率，并且内部中空化，更加有利于酶分子活性的维持。利用此复合催化材料能够高效催化单糖的糖基化反应，不仅具有良好的热稳定性和化学稳定性，还能提高酶促反应速率，并可以实现多次回收利用同时保持较高的催化活性以及简化了分离步骤。
Description
技术领域
本发明涉及催化剂技术领域，具体涉及一种磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料及其制备方法和应用。
背景技术
目前，肝素已被成功用作注射用抗凝血药物用于预防和治疗血栓性疾病，肝素能够通过中和炎症因子、选择素等发挥抗炎活性，也能抑制肿瘤新血管生成、抑制肿瘤细胞生长，还能阻断肿瘤细胞对内皮细胞的勃附作用及抑制肿瘤转移相关酶的活性，进而发挥抑制肿瘤转移的作用。此外，肝素还具有调节血脂、抗病毒、抗过敏等多种生物活性。目前广泛应用的低分子量肝素主要是从猪肠和牛肺等器官中分离提取后，经化学法或者酶法降解得到的。但动物来源肝素是结构不均一的混合物，因此临床应用中也存在很多问题，比如生物利用度低、药效难预测、副作用多等。而“肝素钠”等问题导致了人的死亡，暴露了动物来源肝素在安全性和可靠性上的问题。同时，肝素本身结构复杂、多样，且来源和批次不同的产品常存在精细结构的差异，直接用普通肝素和低分子量肝素研究其与蛋白质的相互作用及新的生物活性也面临巨大挑战。
当前合成肝素的方法主要有两种策略，即化学法合成和酶法合成。化学合成法优点在于成本较低，副作用低。而缺点是反应步数繁多、反应复杂，收率极低。酶法相比于化学法合成选择性高、特异性强，无须保护基操作，且合成产率高，因此极大的减少了时间和金钱的投入。此外，该方法反应条件温和，减少了不安全隐患和对环境污染的危害。但是使用游离酶进行催化，难以维持酶的活性以重复利用，催化成本较高。所以急需一种新型复合催化剂来维持酶的活性并实现重复利用，而金属有机框架(MOF)作为一种结构可控的的高结晶性多孔材料，可以通过包埋或者吸附酶来作为酶的金属铠甲，在最大程度上保护酶的稳定性并实现重复利用。但在MOFs包裹酶形成复合材料过程中，多数MOFs合成条件苛刻，不适用于对酶的包裹，同时，MOFs合成后的孔径过小会影响反应传质效率。因此，筛选出适合生物大分子的固定化MOF材料具有极其重要的意义。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料或者复合催化材料。本发明的无定型金属有机框架材料具有普通金属有机框架材料良好的热稳定性和化学稳定性等优点。此外，还具有孔径更大、材料内部形成中空化等优点。利用无定型金属有机框架材料可以更大程度上维持酶的活性且实现酶的多次重复利用，解决了糖基化反应中，酶易溶于水且易被环境影响其活性，难以收集以重复利用，催化成本高的问题。同时磁性纳米粒的增加，可以使复合催化材料更易于后续磁性吸附分离，简化后续催化材料的分离步骤；并首次实现了无定型金属有机框架复合催化材料应用在性质不稳定、价格昂贵的糖基转移酶固定化中。
本发明还提供了磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料的制备方法和应用，通过使用本发明的磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料作为催化剂，解决糖基转移酶催化合成肝素二糖的过程中，存在的糖基转移酶溶于水且活性易被环境影响，难以收集以多次重复利用的问题。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料，所述复合催化材料以无定型Zn基ZIF-90材料作为载体，将磁性纳米粒与糖基转移酶包裹在其内部形成，所述无定型Zn基ZIF-90材料由锌与有机配体2-甲醛咪唑按摩尔比1:0.8～1:1.2形成。所述无定型Zn基ZIF-90材料是通过调节金属离子与有机配体的比例，从而控制MOF的结晶度。
作为优选，所述糖基转移酶为肝素合酶2(heparosan synthase B，HS2)，包括pmHS2(Pasteurella multocida HS2)或者syntheticconstruct HS2。
本发明所述的磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备磁性纳米粒(MNPs)：首先将FeCl3与FeCl2放入容器中，加热搅拌震荡反应；
(2)反应结束后冷却至室温，步骤(1)得到的反应液中加入氨水，继续加热搅拌震荡反应；
(3)待溶液冷却至室温，在磁场条件下，回收磁性纳米粒(MNPs)，加水配制成MNP溶液；
(4)将制备的MNP溶液加入到糖基转移酶液、硝酸锌溶液、2-甲醛咪唑溶液混合液中搅拌均匀，反应后得到含有复合催化材料的反应液，此处aZIF-90合成中锌与有机配体(2-甲醛咪唑)摩尔比为1:0.8～1:1.2；
(5)将步骤(4)的反应液进行离心洗涤，得到磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料。
作为优选，步骤(1)中FeCl3与FeCl2摩尔比为1:1～1:4，所述加热搅拌反应为水浴恒温振荡温度为70～80℃，转速为200～400rpm，反应时间为1～3h；
步骤(2)中氨水与步骤(1)的反应液体积比为1:3～1:5，所述加热搅拌反应为水浴恒温振荡，温度为75～90℃，转速为200～400rpm，反应0.5～2h；
步骤(4)将0.1～0.6mL浓度为1mg/mL的MNPs溶液加入到含有糖基转移酶液、硝酸锌溶液、咪醛溶液混合液中，硝酸锌与2甲醛咪醛的摩尔比为1:0.8～1:1.2，优选摩尔比1:1，糖基转移酶液的浓度为0.1-0.5mg/mL，并定容至终体积为4ml。所述反应在25～40℃搅拌反应10～20h得到含有复合催化材料的反应液。
作为优选，步骤(4)所述搅拌反应在25℃、300rpm条件下反应12h得到含有复合催化材料的反应液。
本发明所述的磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料在制备肝素中的应用。
其中所述的应用，包括如下步骤：
(1)将糖基受体与糖基供体混合，加入二价金属溶剂后振荡混合；
(2)加入磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料，振荡反应；
(3)将步骤(2)的反应液进行磁性吸附以收集复合催化剂，洗涤以重复利用，并取上清进行TLC分离，得到肝素二糖。
其中，步骤(1)所述糖基供体是尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖或其衍生物。
具体包括尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖，包括4-叠氮基-尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖、4-氨基-尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖、4-氟-尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖、4-巯基-尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖、3-叠氮基-尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖、3-氨基-尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖、3-氟-尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖、3-巯基-尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖、2-叠氮基-尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖、2-氨基-尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖、2-氟-尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖、2-巯基-尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖、6-叠氮基-尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖、6-氨基-尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖、6-氟-尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖、6-巯基-尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖中的一种或者几种。
其中，步骤(1)所述糖基受体是指对硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸及葡萄糖醛酸衍生物。
作为优选，步骤(1)所述糖基受体与糖基供体摩尔比为1:1～6:1。
作为优选，步骤(1)所述二价金属溶液包括镁离子盐溶液、二价铁离子盐溶液、锰离子盐溶液中的一种或几种。
其中，步骤(1)所述在25～45℃水浴中振荡混合，转速为100～300rpm，时间3-5min。
其中，步骤(2)所述磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料加入量为底物(糖基受体与糖基供体总)质量的5％～10％；所述振荡反应为20～50℃水浴振荡反应，转速为100～300rpm，反应时间为10～15h。
其中，步骤(1)和(2)所述的酶复合催化材料催化反应路线为：
具体地，本发明的制备优选包括三个部分：
第一部分：磁性纳米粒(MNPs)的制备
首先将FeCl3与FeCl2(FeCl3与FeCl2摩尔比为1:1～1:4)放入双颈烧瓶中，加入磁子，通入氮气，排出氧气，放置于70～80℃水浴恒温磁力搅拌器中，加热搅拌震荡反应，转速为200～400rpm；1～3h反应结束后冷却至室温，在得到的反应液中加入氨水，氨水与反应液的体积比为1:3～1:5，放置于水浴恒温磁力搅拌器中，75～90℃加热搅拌震荡反应，转速为200～400rpm，反应0.5～2h；待溶液冷却至室温，在磁场条件下，回收磁性纳米粒(MNPs)，加水配置成一定浓度的MNP溶液；
第二部分：磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料的制备
MNPs-HS2@aZIF-90
取制备的将0.1～0.6mL浓度为1mg/mL的MNPs溶液，搅拌混匀后加入到Zn(NO3)2·6H2O(40mM)和糖基转移酶(0.1-0.5mg/mL)混合溶液中，再加入2-imidazole-carboxaldehyde(HICA，高温下溶解，40mM)溶液并加入超纯水定容。在37℃、500rpm条件下反应10～20h。反应结束后，8,000～12,000rpm离心4～6min，回收沉淀物。然后用超纯水洗涤三次，以除去未被MOFs材料包裹的糖基转移酶。
第三部分：磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料(MNPs-HS2@aZIF-90)催化糖基化反应。
将摩尔比为1:1～6:1的糖基受体与糖基供体(单糖分子)混合后加入适量的二价金属溶剂(镁离子盐溶液、二价铁离子盐溶液、锰离子盐溶液)在35～45℃的水浴振荡器中，一定转速下(100～300rpm)充分混合5min，反应物溶解后，加入5％～10％(以底物糖基受体与糖基供体的总质量为标准)糖基转移酶-金属有机框架复合催化材料，在一定温度(20～50℃)和转速(100～300rpm)下充分反应10～15h后结束反应。将产物进行磁性吸附以收集复合催化材料，并用超纯水洗涤以重复利用。
采用上述制备方法，使得糖基转移酶被包裹在无定型金属有机框架材料中，使得环境对酶的影响变小，增强了酶的机械性能，提高操作稳定性，并且因为添加了磁性纳米粒，从而使得催化剂与反应产物的分离更为容易，简化了后续分离纯化步骤。
本发明通过特定的金属离子和有机配体的配比最终导致无定型的合成，合成的无定型ZIF-90材料，相比于具有固定晶型的ZIF-90而言，具有更大的孔径和中空的内部结构。无定型ZIF-90应用于酶催化当中，不仅具有良好的热稳定性和化学稳定性，还能提高酶促反应速率，并可以实现多次回收利用同时保持较高的催化活性。
本发明通过无定型金属有机框架材料对糖基转移酶、磁性纳米粒进行包裹形成磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料，再使用复合催化材料对单糖进行糖基化，最后对复合催化材料进行收集以重复利用。使用aMOF材料(无定型金属有机框架材料)对糖基转移酶进行包裹，保护酶免受外界环境影响，可使酶耐受温度、pH及有机溶剂的变化维持了酶的活性，提高酶的重复利用率，具体可以重复利用于单糖的糖基化反应，降低单糖的糖基化反应成本。此外，复合磁性纳米粒(MNPs)的加入，更加有利于简化催化剂与反应物的分离步骤，提高复合催化剂复合催化材料的机械性能，提高操作的简便性，进而降低反馈抑制实现复合催化剂复合催化材料的重复利用。
本发明使用无定型金属有机框架材料(amorphous Metal-Organic Frameworks,aMOFs)，是一种以金属离子为连接点，有机配体为支撑，通过金属离子和有机配体之间通过自组装形成的不具有长程有序的固定晶型的材料。但在MOFs包裹酶形成复合材料过程中，多数MOFs合成条件苛刻，不适用于对酶的包裹，同时，MOFs合成后的孔径过小会影响反应传质效率，因此MOFs包裹酶过程中存在需筛选最佳MOFs、扩大MOF孔径，调整MOF自身内部空间的方法。而本发明利用的aZIF-90金属有机框架材料将性质极其不稳定、价格较高的糖基转移酶进行包裹固定化。在酶催化反应中，本发明得到的酶-无定型金属有机框架材料复合物相比于游离酶来说有以下优点：无定型金属有机框架材料具有较大的孔径及内部中空结构，并且将糖基转移酶限制在一定的空间范围内，避免了酶之间的无序运动造成的酶分子的絮凝失活；反应过程中，能够耐受一定程度的变性条件，如温度、pH及有机溶剂等；金属有机框架材料的多孔特性可以促进酶与底物的接触，提高反应速率。在酶-无定型金属有机框架材料复合物的基础上复合磁性纳米粒(MNPs)，更加有利于简化催化剂与反应物的分离步骤，且省去了离心过程中剪切力对酶活性的影响，提高复合催化材料的机械性能，提高操作的简便性，进而降低反馈抑制实现复合催化材料的重复利用。
本发明的创新点在于1)合成了具有较大孔径及内部中空结构的aZIF-90(无定型Zn基ZIF-90材料)，其合成条件温和、不需要高温、高压，原料成本低，合成过程简单；2)相较于比较稳定的、易得的脂肪酶，本发明中的糖基转移酶极其不稳定，在常用反应中，室温下反应过夜后酶就可能絮凝失活，需要进行补料以保证反应的继续进行，而本发明中使用aMOF包裹可以重复利用糖基转移酶6次活性都超过90％；3)目前对于MOF包裹酶的研究都集中于脂肪酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶等廉价易得的酶，催化的反应也都是如过氧化氢水解等简单的反应，本发明包裹了一个较为复杂、价格昂贵的酶，并且催化了一个较复杂的聚合反应，具有较大的工业意义。
此外，由于糖基转移酶的性质极其不稳定，游离的酶过夜反应后就可能会絮凝失活，为了提高糖基转移酶的稳定性，本发明发现利用aZIF-90可以很好的避免这种情况发生。同时在离心过程中，离心机存在的剪切力会从一定程度上破坏酶，本发明引入了磁性纳米粒，利用磁铁的吸附作用就能实现复合材料和和反应液的分离，避免了离心时剪切力的影响。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明制备的磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料是一种易磁性吸附分离、具有较大孔径、内部具有中空结构、高比表面积、结构可调控的稳定材料，在对糖基转移酶进行包裹形成复合催化材料后，可极大程度的保持酶原有的高效、温和及专一的酶催化活性，同时克服了游离酶的不足，使酶的存储稳定性提高，易于后续回收，简化复合催化材料回收步骤、提高重复利用率，并且降低反应成本。
2、本发明将糖基转移酶、磁性纳米粒包裹在无定型金属有机框架材料中，使得环境对酶活性的影响变小，维持了酶的活性，增强了酶的机械性能，提高操作稳定性，也加快了酶促反应的效率。本发明的复合催化材料能够高效催化单糖的糖基化反应，不仅具有良好的热稳定性和化学稳定性，而且因为添加了磁性纳米粒，可以简化复合催化材料的后续分离步骤，进而可以更为简便的回收利用进一步降低生产成本。
3、本发明制备简单，使用方便，可以用来制备得到碳链长度均一的肝素寡糖，可广泛应用于医药、食品等行业中。
附图说明
图1为MNPs-HS2@ZIF-90及MNPs-HS2@aZIF-90所做的重复利用对比图；
图2为MNPs-HS2@ZIF-90，MNPs-HS2@aZIF-90及游离HS2所做的有机溶剂稳定性对比图；
图3为不同有机配体与金属离子比例的XRD图(HICA：Zn2+)；
图4为有机配体与金属离子比例为1:1的无定型ZIF-90的选区电子衍射图；
图5为aZIF-90(A)及ZIF-90(B)的透射电镜图；
图6为ZIF-90及aZIF-90的氮气吸附解吸附图(A)及孔径分布图(B)。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
其中，糖基转移酶pmHS2(购自青岛糖科学生物技术有限公司)；尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物(均购买于阿拉丁试剂有限公司)，对硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸(购买于国药集团化学试剂有限公司)；2-Imidazole-carboxaldehyde(2-甲醛-咪唑，购买于阿拉丁试剂有限公司)。
实施例1
磁性纳米粒(MNPs)的制备：
首先将FeCl3溶液(10mL，5mM)与FeCl2溶液(10mL，10mM)放入双颈烧瓶中，加入磁子，通入氮气，排出氧气，放置于75℃水浴恒温磁力搅拌器中，加热搅拌反应，转速为300rpm，1h反应结束后冷却至室温，在得到的反应液中加入氨水(10％)，氨水与反应液的体积比为1:3，放置于水浴恒温磁力搅拌器中，75℃加热搅拌反应，转速为200rpm，反应1h；待溶液冷却至室温，在磁场条件下，回收磁性纳米粒(MNPs)，干燥后加水配置成一定浓度的MNP溶液。
实施例2
MNPs-HS2@aZIF-90的制备：
取实施例1制备的将0.6mL浓度为1mg/mL的MNPs溶液，搅拌混匀后加入到1mL Zn(NO3)2·6H2O(40mM)和1mL糖基转移酶pmHS2(0.3mg/mL)混合溶液中，再加入1mL 2-imidazole-carboxaldehyde(HICA，高温下溶解，40mM)溶液并加入超纯水定容至4mL。在37℃、500rpm条件下反应15h。反应结束后，8,000rpm离心4min，回收沉淀物。然后用超纯水洗涤三次，以除去未被aZIF-90材料包裹的糖基转移酶，得到磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料。
实施例3
MNPs-HS2@aZIF-90催化单糖糖基化生成肝素二糖的制备方法：
在Tris-HCl缓冲液(50mM pH 7.4)中加入尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(终浓度10mM)，对硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸(终浓度10mM)、氯化镁(终浓度10mM)在37℃水浴中振荡混合，转速为150rpm，时间5min，混匀后，加入尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖和对硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸质量的5％实施例2制备的MNPs-HS2@aZIF-90复合催化剂在37℃水浴振荡中150rpm转速，充分反应12h后结束反应。将产物离心，条件为10000rpm、5min，取上层油状物，其余溶液进行磁性吸附以收集复合催化材料，洗涤以重复利用，并取上清进行TLC分离，得到肝素二糖。通过高效液相对肝素二糖进行定量分析，色谱柱：YMC-Pack PolyamineⅡ，流动相A：0.7M NaCl，流动相B：H2O，时间程序：0-40min 100％流动相A，柱温：25℃。肝素二糖最大吸收波长为300nm左右，计算糖基化反应的转化率(转化率为反应后剩余糖基供体与反应前糖基供体的比值)，转化率可以达到98.0％，随后对MNPs-HS2@aZIF-90复合催化剂使用上述相同的糖基化方法，进行重复利用并计算重复利用率，重复利用6次时其转化率仍可达到90.0％(图1)。
本实施例糖基化反应结束后将产物进行收集，在收集后的溶液中放入磁铁，对复合催化材料进行吸附，随后将吸附的颗粒物取下，并用超纯水洗涤重复进行单糖糖基化反应，并对糖基化转化率进行计算，因为添加了磁性纳米粒，可以简化复合催化材料的后续分离步骤，进而可以更为简便的回收利用进一步降低生产成本。
实施例4
MNPs-HS2@aZIF-90催化单糖糖基化生成肝素二糖的制备方法：
在Tris-HCl缓冲液(50mM pH 7.4)中加入4-F-尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(终浓度10mM)、硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸(终浓度10mM)、氯化镁(终浓度10mM)在45℃水浴中振荡混合，转速为100rpm，时间3min，混匀后，加入底物质量的5％实施例2制备的MNPs-HS2@aZIF-90复合催化剂后在50℃水浴振荡中200rpm转速，下充分反应12h后结束反应。将产物进行磁性吸附以收集复合催化材料，洗涤以重复利用，并取上清进行TLC分离，得到肝素二糖。
实施例5
MNPs-HS2@ZIF-90的制备
取制备的将0.6mL浓度为1mg/mL的MNPs溶液，搅拌混匀后加入到1mLZn(NO3)2·6H2O(40mM)和1mL糖基转移酶(0.3mg/mL)混合溶液中，再加入1mL 2-imidazole-carboxaldehyde(HICA，高温下溶解，160mM)溶液并加入超纯水定容。在37℃、500rpm条件下反应15h。反应结束后，8,000rpm离心4min，回收沉淀物。然后用超纯水洗涤三次，以除去未被ZIF-90材料包裹的糖基转移酶，得到磁性纳米粒-糖基转移酶-定型金属有机框架复合催化材料，采用实施例3的方法对MNPs-HS2@ZIF-90复合催化剂使用上述相同的糖基化方法，进行重复利用并计算重复利用率，重复利用6次时其转化率明显不如本发明的MNPs-HS2@aZIF-90(图1)。
实施例6
测试本发明实施例2中MNPs-HS2@aZIF-90与实施例5中MNPs-HS2@ZIF-90的不同环境下酶活，对比为未被aZIF-90材料包裹的游离的糖基转移酶的酶活。
将实施例2中MNPs-HS2@aZIF-90与实施例5中MNPs-HS2@ZIF-90以及游离酶分别置于不同温度(35-75℃)、有机溶剂(MeOH、EtOH、DMF)和不同pH(5-9)的溶液中处理2小时。将处理后得到的MNPs-HS2@aZIF-90、MNPs-HS2@ZIF-90及游离酶(游离酶的投入量保证和复合材料中的酶一致)用于单糖的糖基化反应(按实施例3)，高效液相对肝素二糖进行定量分析，计算糖基化化反应的转化率(转化率为反应后剩余糖基受体与糖基供体的比值)，酶活性比值(相对活性％)为处理后糖化反应转化率与原有游离酶催化的转化率之比。通过实验分析可以得出，MNPs-HS2@aZIF-90、MNPs-HS2@ZIF-90与游离酶相比对酶具有很好的保护作用，且MNPs-HS2@aZIF-90更佳(图2)。本发明在最适条件下(35℃、pH7)游离的糖基转移酶的糖基化反应的转化率效果较好，但是其在极性pH，温度，有机溶剂中游离脂肪酶容易失活，并且回收效率不高，回收后的酶活性也降低了，而本发明固定化酶的酯化催化效率虽然不能达到游离脂肪酶，但是它的稳定性好，重复利用率高，更能达到缩减成本的效果。同时相比较定型的固定化酶，本发明的无定型的固定化相比于定型的固定化酶可以显著提高转化率，在一些特定的极端条件下可以达到10-20％以上，效果非常突出(在糖基化反应的转化率中百分之几的提升即可认为是显著提升了)。
实施例7
aZIF-90与ZIF-90的合成及材料表征
将1mLZn(NO3)2·6H2O(40mM)和1mL 2-imidazole-carboxaldehyde(HICA，高温下溶解，40mM)溶液进行混合后，在37℃、500rpm条件下反应15h。反应结束后，8,000rpm离心4min，回收沉淀物。然后用超纯水洗涤三次，得到aZIF-90材料。
将1mLZn(NO3)2·6H2O(40mM)和1mL 2-imidazole-carboxaldehyde(HICA，高温下溶解，160mM)溶液进行混合后，在37℃、500rpm条件下反应15h。反应结束后，8,000rpm离心4min，回收沉淀物。然后用超纯水洗涤三次，得到ZIF-90材料。
利用Rigaku SmartLab仪器对两种材料的XRD数据进行检测，结果如图3所示，可以发现随着有机配体与金属离子的比例降低(图3中从上到下依次为2:1，1.5:1，1:1，0.6:1)，2-Theta角度5-20°的峰在逐渐消失，并且当有机配体与金属离子比例为1:1及以下时其特征峰几乎全消失了。随后利用FEI TALOS200S仪器对比例为金属离子与有机配体为1:1的固体材料的选区电子衍射进行表征(图4)，发现没有可见的衍射环，因此可以判断合成的材料为无定型ZIF-90材料。
实施例8
aZIF-90与ZIF-90的形貌及孔径的分析
利用FEI TALOS 200S仪器对实施例7的aZIF-90及ZIF-90进行投射电镜扫描，利用Japan Microtrac 2460仪器对孔径进行测试。实验结果如图5及图6显示，aZIF-90显现出较大的内部囊腔，并且aZIF-90孔径也从原来的2-5nm扩大至5-15nm左右，具有更大的较大囊腔及较大孔径，保证制备的MNPs-HS2@aZIF-90活性更好。
实施例9
实施例9与实施例1制备方法相同，不同之处在于：FeCl3与FeCl2摩尔比为1:1，加热搅拌反应的水浴恒温振荡温度为70℃，转速为400rpm，反应时间为3h；氨水与反应液体积比为1:5，水浴恒温振荡温度为90℃，转速为200rpm，反应2h。
实施例10
实施例10实施例1制备方法相同，不同之处在于：FeCl3与FeCl2摩尔比为1:4。
实施例11
实施例11与实施例2制备方法相同，不同之处在于：硝酸锌与2甲醛-咪醛的摩尔比为1:0.8，糖基转移酶液的浓度为0.1mg/mL，反应在25℃搅拌反应20h得到含有复合催化材料的反应液。
实施例12
实施例12与实施例2制备方法相同，不同之处在于：硝酸锌与2甲醛-咪醛的摩尔比为1:1.2，糖基转移酶液的浓度为0.5mg/mL，反应在40℃搅拌反应10h得到含有复合催化材料的反应液。
实施例13
实施例13与实施例3制备方法相同，不同之处在于：糖基受体与糖基供体摩尔比为6:1，二价金属溶液为氯化亚铁溶液，磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料添加量为糖基受体与糖基供体总质量的10％；反应为20℃水浴振荡反应，转速为300rpm，反应时间为15h。
实施例14
实施例14与实施例3制备方法相同，不同之处在于：磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料添加量为糖基受体与糖基供体总质量的8％；反应为50℃水浴振荡反应，转速为100rpm，反应时间为10h。
实施例15
实施例15与实施例5制备方法相同，不同之处在于：2-imidazole-carboxaldehyde(HICA，高温下溶解，20mM)，得到磁性纳米粒-糖基转移酶-定型金属有机框架复合催化材料。
实施例16
实施例16与实施例5制备方法相同，不同之处在于：2-imidazole-carboxaldehyde(HICA，高温下溶解，60mM)，得到磁性纳米粒-糖基转移酶-定型金属有机框架复合催化材料。
Claims (10)
1.一种磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料，其特征在于，所述复合催化材料以无定型Zn基ZIF-90材料作为载体，将磁性纳米粒与糖基转移酶包裹在其内部形成，所述无定型Zn基ZIF-90材料由锌离子与有机配体2-甲醛咪唑按摩尔比1:0.8～1:1.2形成。
2.根据权利要求1所述的磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料，其特征在于，所述糖基转移酶为肝素合酶2(heparosan synthase B，HS2)，优选包括pmHS2(Pasteurella multocida HS2)或者syntheticconstruct HS2。
3.一种权利要求1所述的磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备磁性纳米粒(MNPs)：首先将FeCl3与FeCl2放入容器中，加热搅拌反应；
(2)反应结束后冷却至室温，步骤(1)得到的反应液中加入氨水，继续加热搅拌反应；
(3)待溶液冷却至室温，在磁场条件下，回收磁性纳米粒(MNPs)，加水配制成MNP溶液；
(4)将制备的MNP溶液加入到糖基转移酶液、硝酸锌溶液、2-甲醛咪唑溶液混合液中搅拌均匀，反应后得到含有复合催化材料的反应液；
(5)将步骤(4)的反应液进行离心洗涤，得到磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中FeCl3与FeCl2摩尔比为1:1～1:4，所述加热搅拌反应为水浴恒温振荡温度为70～80℃，转速为200～400rpm，反应时间为1～3h；步骤(2)中氨水与步骤(1)的反应液体积比为1:3～1:5，所述加热搅拌反应为水浴恒温振荡温度为75～90℃，转速为200～400rpm，反应0.5～2h。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中将0.1～0.6mL浓度为1mg/mL的MNPs溶液加入到含有糖基转移酶液、硝酸锌溶液、咪醛溶液混合液中，硝酸锌与2-甲醛咪唑的摩尔比为1:0.8～1:1.2，糖基转移酶液的浓度为0.1-0.5mg/mL，所述反应在25～40℃，搅拌反应10～20h得到含有复合催化材料的反应液。
6.一种权利要求1所述的磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料在制备肝素中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将糖基受体与糖基供体混合，加入二价金属溶剂后振荡混合；
(2)加入磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料，振荡反应；
(3)将步骤(2)的反应液进行磁性吸附以收集复合催化剂，洗涤以重复利用，并取上清进行TLC分离，得到肝素二糖。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述糖基供体为尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖或者其衍生物；所述糖基受体为对硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸及葡萄糖醛酸衍生物；所述糖基受体与糖基供体摩尔比为1:1～6:1。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述二价金属溶液包括镁离子盐溶液、二价铁离子盐溶液、锰离子盐溶液、锌离子盐溶液中的一种或者几种。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述磁性纳米粒-糖基转移酶-无定型金属有机框架复合催化材料添加量为糖基受体与糖基供体总质量的5％～10％；所述振荡反应为20～50℃水浴振荡反应，转速为100～300rpm，反应时间为10～15h。
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