CN111961658A - 脂肪酶-金属有机框架复合催化材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了脂肪酶‑金属有机框架复合催化材料及其制备方法和应用，该复合催化材料以金属有机框架作为一种新型的固定化酶材料，将脂肪酶包裹在其内部形成。本发明制备得到脂肪酶‑金属有机框架复合催化材料后，将其加入植物甾醇和酯化试剂的混合溶液中，催化酯化反应得到植物甾醇酯产品。本发明的复合催化材料能够高效催化植物甾醇的酯化反应，不仅具有良好的热稳定性和化学稳定性，还能提高酶促反应速率，并可以实现多次回收利用同时保持较高的催化活性。

Description

脂肪酶-金属有机框架复合催化材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及催化剂技术领域，具体涉及一种脂肪酶-金属有机框架复合催化剂及其制备方法和应用。
背景技术
植物甾醇作为一类天然功能活性物质，广泛存在于植物细胞与组织中，但是其低油溶性极大地限制了其在现实中的应用。植物甾醇酯可以很好地解决这一问题，作为一个人工合成的天然物质，不仅无毒副作用而且保留了植物甾醇的生物活性，具有降低胆固醇、消炎、抗癌以及调节机体内生理激素水平等功能，作为一种功能性成分广泛应用于医药、食品等行业中，但是其水溶性、脂溶性较差，生物利用率较低，大大限制了植物甾醇的应用。然而植物甾醇酯则在保留了植物甾醇活性的同时，提高了其脂溶性，从而大大提高了植物甾醇在人体中的利用率。
目前国内外植物甾醇酯产品通常通过化学法和酶法来制备。化学合成法的优点在于成本较低，以及有较高的酯化率。然而其缺点却比较突出，通常涉及高温、真空、微波等苛刻反应条件，以及大量的化学试剂。酶法相比于化学法，其反应要求条件温和、酯化率高、副产物少、环保等，是一个更好的选择。化学法合成步骤过于复杂，且使用试剂不环保，酶法合成相对于化学法合成更为环保绿色，但是使用游离酶进行催化，难以维持酶的活性以重复利用，催化成本较高。所以急需一种新型复合催化剂则可以在绿色环保的基础上，极大程度的维持酶的活性以重复利用，降低酯化成本。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了脂肪酶-金属有机框架复合催化材料，本发明的脂肪酶-金属有机框架材料具有高多孔性、比表面积大、可调控的孔径、良好的热稳定性和化学稳定性等优点，可对酶进行保护，使酶能够耐受一定程度的变性条件，如温度、PH及有机溶剂等，维持酶的活性且实现酶的多次重复利用，解决了酯化反应中，酶易被环境影响其活性，难以重复利用，催化成本高的问题。
本发明还提供了脂肪酶-金属有机框架复合催化材料的制备方法和应用，通过使用本发明的脂肪酶-金属有机框架复合催化材料作为催化剂，解决脂肪酶催化合成植物甾醇酯的过程中，存在的脂肪酶活性易被环境影响难以多次重复利用的问题。
技术方案：本发明所述一种脂肪酶-金属有机框架复合催化材料，所述复合材料以Zn基MOFs材料作为载体，将脂肪酶包裹在其内部形成。
其中，所述Zn基MOFs材料为ZIF-8、ZIF-90或MAF-7。
其中，所述脂肪酶为Lipozyme 435脂肪酶、脂肪酶(Lipase from Candidarugosa)等。
本发明所述的脂肪酶-金属有机框架复合催化材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将脂肪酶液、硝酸锌溶液、咪唑溶液，搅拌反应后得到含有复合催化剂的反应液；
(2)将步骤(1)的反应液进行离心，取沉淀洗涤、离心，得到脂肪酶-金属有机框架复合催化剂。
其中，步骤(1)所述搅拌反应为在35-45℃搅拌反应15～25h得到含有复合催化剂的反应液。
作为优选，步骤(1)所述加入搅拌反应为在37℃、500rpm条件下反应24 h得到含有复合催化剂的反应液。
其中，步骤(2)所述离心条件为8,000～12,000rpm，4～6min。
本发明所述的脂肪酶-金属有机框架复合催化材料在制备在植物甾醇酯中的应用。
进一步地，所述应用，包括如下步骤：
(1)将植物甾醇和酯化试剂混合后加入有机溶剂，充入氮气密封后振荡混合；
(2)待植物甾醇溶解后，加入脂肪酶-金属有机框架复合催化材料及脱水剂，振荡反应；
(3)将步骤(2)振荡后的反应液进行抽滤，去除催化剂、分子筛和少量未反应完全的甾醇，并在抽滤后的澄清液中加入碳酸钠溶液充分振荡，去除水层，将得到的有机层洗涤至中性，旋转蒸发去除有机溶剂，最后对产品进行除水，得到植物甾醇酯。
其中，步骤(1)所述植物甾醇包括胆甾醇、谷甾醇、豆甾醇、或者菜油甾醇。
其中，步骤(1)所述酯化试剂包括丙酮酸，共轭亚油酸或者乙酸等一些小分子有机酸。
作为优选，步骤(1)所述植物甾醇与酯化试剂摩尔比为1:2～1:6。
作为优选，步骤(1)所述有机溶剂包括叔丁醇、丁酮、叔戊醇、环己烷或者正己烷。
其中，步骤(1)所述充入氮气密封后在35～40℃水浴中振荡混合，转速为100～300rpm，时间20-40min。
其中，步骤(2)所述脂肪酶-金属有机框架复合催化材料加入量为底物(植物甾醇与酯化试剂总质量)的5％～10％；所述振荡反应为50～60℃水浴振荡反应，转速为100～300rpm，反应时间为10～15h。
其中，步骤(3)所述的干燥温度为70～90℃，干燥1～2h。
其中，充入氮气为充满氮气对反应体系进行惰性气体保护。
其中，步骤(1)和(2)所述的酶复合催化剂催化反应路线为：
Figure BDA0002545119580000031
本发明中的植物甾醇主要包括包含植物甾醇乙酸酯和植物甾醇亚油酸酯为油状固体。
具体地，本发明的制备优选包括两个部分：
第一部分：脂肪酶-金属有机框架复合催化材料的制备
1、Lip@ZIF-8
在Zn(NO3)2·6H2O(40mM)溶液中加入Lipozyme 435脂肪酶(0.1-0.5mg/ml) 搅拌均匀后，加入2-methyl-imidazole(HmIm,640mM)，并加入超纯水定容。在 37℃、500rpm条件下反应15～25h。反应结束后，8,000～12,000rpm离心4～ 6min，回收沉淀物。然后用超纯水洗涤、超声处理并离心三次，以除去未被MOFs 材料包裹的脂肪酶。
2、Lip@ZIF-90
在Zn(NO3)2·6H2O(40mM)溶液中加入Lipozyme 435脂肪酶(0.1-0.5mg/ml) 搅拌均匀后，加入2-imidazole-carboxaldehyde(HICA,高温下溶解,160mM)，并加入超纯水定容。在37℃、500rpm条件下反应15～25h。反应结束后，8,000～ 12,000rpm离心4～6min，回收沉淀物。然后用超纯水洗涤、超声处理并离心三次，以除去未被MOFs材料包裹的脂肪酶。
3、Lip@MAF-7
在Zn(NO3)2·6H2O(40mM)溶液中加入Lipozyme 435脂肪酶(0.1-0.5mg/ml) 搅拌均匀后，加入3-methyl-1,2,4-triazole(Hmtz,120mM)，再制备Lip@MAF-7 时优选还加入了10％NH3·H2O(60μL)，并加入超纯水定容。在37℃、500rpm 条件下反应15～25h。反应结束后，8,000～12,000rpm离心4～6min，回收沉淀物。然后用超纯水洗涤、超声处理并离心三次，以除去未被MOFs材料包裹的脂肪酶。
第二部分：脂肪酶-金属有机框架复合催化材料催化植物甾醇的酯化反应
将摩尔比为1:2～1:6的植物甾醇和酯化试剂(丙酮酸、乙酸等一些小分子有机酸)混合后加入适量的有机溶剂(叔丁醇、丁酮、叔戊醇、环己烷及正己烷) 充入氮气密封并放入35～40℃的水浴振荡器中，一定转速下(100～300rpm) 充分混合20～40min，反应物溶解后，加入5％～10％(以底物植物甾醇和酯化试剂的总质量为标准)脂肪酶-金属有机框架复合催化材料，分子筛(40mg/mL) 作为脱水剂，在一定温度(50～60℃)和转速(100～300rpm)下充分反应10～ 15h后结束反应。将反应液进行抽滤，分离出催化剂、分子筛和少量未反应完全的甾醇，将得到的澄清液放入分液漏斗中并加入5％碳酸钠溶液充分震荡后，得到有机层并用超纯水洗至中性，随后旋转蒸发去除有机试剂，80℃干燥1～2h 除水。
采用上述组合工艺，将脂肪酶包裹在金属有机框架材料中，使得环境对酶活性的影响变小，维持了酶的活性，增强了酶的机械性能，提高操作稳定性，也加快了酶促反应的效率。本发明的复合催化剂能够高效催化植物甾醇的酯化反应，不仅具有良好的热稳定性和化学稳定性，还能提高酶促反应速率，并可以实现多次回收利用同时保持较高的催化活性。
本发明通过金属有机框架材料对脂肪酶进行包裹形成脂肪酶-金属有机框架复合催化材料，再使用复合催化材料对植物甾醇进行酯化，最后对复合催化材料进行收集以重复利用。使用MOF材料对脂肪酶进行包裹，保护酶免受外界环境影响，可使酶耐受温度、PH及有机溶剂的变化维持了酶的活性，提高酶的重复利用率，具体可以重复利用于植物甾醇酯化反应，降低植物甾醇的酯化反应成本。
本发明使用金属有机框架材料(Metal-Organic Frameworks,MOFs)，是一种以金属离子为连接点，有机配体为支撑，通过金属离子和有机配体之间通过自组装形成的具有二维或三维晶体结构。在酶催化反应中，用金属有机框架材料将酶进行包裹固定，形成酶-金属有机框架材料复合物相比于游离酶来说有以下优点：反应过程中，金属有机框架材料的多孔特性可以促进酶与底物的接触，提高反应速率；能够与产物进行有效的分离，降低反馈抑制，实现重复利用；增强了酶的机械性能，提高操作稳定性。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明制备的脂肪酶-金属有机框架复合催化材料是一种具有高孔隙率、高比表面积、结构可调控的稳定材料，在对脂肪酶进行包裹形成复合催化材料后，可极大程度的保持酶原有的高效、温和及专一的酶催化活性，同时克服了游离酶的不足，使酶的存储稳定性提高，易于回收，提高重复利用率，并且降低反应成本。
本发明将脂肪酶包裹在金属有机框架材料中，使得环境对酶活性的影响变小，维持了酶的活性，增强了酶的机械性能，提高操作稳定性，也加快了酶促反应的效率。本发明的复合催化剂能够高效催化植物甾醇的酯化反应，不仅具有良好的热稳定性和化学稳定性，还能提高酶促反应速率，并可以实现多次回收利用同时保持较高的催化活性。
本发明制备简单，使用方便，原料来源广泛，制备得到的植物甾醇酯保留了植物甾醇活性的同时，提高了其脂溶性，从而大大提高了植物甾醇在人体中的利用率，可广泛应用于医药、食品等行业中。
附图说明
图1为Lip@ZIF-8催化植物甾醇酯化生成植物甾醇乙酸酯的转化率示意图；
图2为Lip@ZIF-90催化植物甾醇酯化生成植物甾醇乙酸酯的转化率示意图；
图3为Lip@MAF-7催化植物甾醇酯化生成植物甾醇乙酸酯的转化率示意图；
图4为脂肪酶-金属有机框架复合催化材料的不同环境下酶活示意图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
其中，Lipozyme 435脂肪酶(购买于诺维信生物技术有限公司)、脂肪酶 (Lipasefrom Candida rugosa)(Sigma，L1754)；胆甾醇、谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇(购买于阿拉丁试剂有限公司)，共轭亚油酸(购买于国药集团化学试剂有限公司)；分子筛(
Figure BDA0002545119580000051
购自国药集团化学试剂有限公司)；2-methyl-imidazole (2-甲基咪唑，购买于阿拉丁试剂有限公司)、Imidazole-2-carboxaldehyde(咪唑-2-甲醛，购买于阿拉丁试剂有限公司)、3-methyl-1,2,4-triazole(3-甲基-1,2,4- 三氮唑，购买于阿拉丁试剂有限公司)。
实施例1
1、脂肪酶-金属有机框架复合催化材料Lip@ZIF-8
在2mL Zn(NO3)2·6H2O(40mM)溶液中加入2mL Lipozyme 435脂肪酶 (0.33mg/ml)搅拌均匀后，加入5mL 2-methyl-imidazole(HmIm，640mM)，并加入超纯水定容至10mL。在37℃、500rpm条件下反应24h。反应结束后， 11,000rpm离心4min，回收沉淀物并用超纯水洗涤、超声处理后离心三次，以除去未被MOFs材料包裹的脂肪酶。
2、脂肪酶-金属有机框架复合催化材料Lip@ZIF-90
在2mL Zn(NO3)2·6H2O(40mM)溶液中加入2mL Lipozyme 435脂肪酶 (0.33mg/ml)搅拌均匀后，加入5mL 2-imidazole-carboxaldehyde(HICA，高温下溶解，160mM)，并加入超纯水定容至10mL。在37℃、500rpm条件下反应 24h。反应结束后，11,000rpm离心4min，回收沉淀物并用超纯水洗涤、超声处理后离心三次，以除去未被MOFs材料包裹的脂肪酶。
3、脂肪酶-金属有机框架复合催化材料Lip@MAF-7
在2mL Zn(NO3)2·6H2O(40mM)溶液中加入2mL Lipozyme 435脂肪酶 (0.33mg/ml)搅拌均匀后，加入5mL 3-methyl-1,2,4-triazole(Hmtz，120mM)，1 mL质量分数10％NH3·H2O(60μL)，并加入超纯水定容至10mL。在37℃、 500rpm条件下反应24h。反应结束后，11,000rpm离心4min，回收沉淀物。然后用超纯水洗涤、超声处理并离心三次，以除去未被MOFs材料包裹的脂肪酶。
实施例2
脂肪酶-金属有机框架复合催化材料催化植物甾醇酯化生成植物甾醇乙酸酯的制备方法：
1、Lip@ZIF-8催化植物甾醇酯化生成植物甾醇乙酸酯
将丙酮酸(5ml，70.97mmol)，谷甾醇(5.89g，14.19.mmol)混合后(总质量约为12.14g)，按摩尔比(正己烷：丙酮酸为1:5)加入正己烷充入氮气密封并放入37℃的水浴振荡器中，150rpm转速下充分混合30min，反应物溶解后，加入1.2g实施例1制备的Lip@ZIF-8复合催化剂并添加
Figure BDA0002545119580000061
分子筛(40 mg/mL)作为脱水剂，充入氮气密封后在水浴振荡中150rpm转速，55℃下充分反应12h后结束反应。将反应液进行抽滤，分离出催化剂、分子筛和少量未反应完全的甾醇，将得到的澄清液放入分液漏斗中并加入2mL 5％碳酸钠溶液充分震荡后，得到有机层并用超纯水进行润洗至中性，随后旋转蒸发去除有机试剂，80℃干燥2h除水得到植物甾醇乙酸酯。将抽滤后分离出的复合催化剂进行收集，在其中加入乙酸乙酯振荡后离心重复3次，干燥后回收复合催化剂。
通过紫外分光光度计对植物甾醇乙酸酯进行定量分析，植物甾醇最大吸收波长为204nm左右，计算酯化反应的转化率(转化率为反应后剩余植物甾醇与反应前植物甾醇的比值)，转化率可以达到82.0％，随后对Lip@ZIF-8复合催化剂使用上述相同的酯化方法，进行重复利用并计算重复利用率，重复利用6次时其转化率仍可达到72.5％(图1)。
2、Lip@ZIF-90催化植物甾醇酯化生成植物甾醇乙酸酯
将丙酮酸(5ml，70.97mmol)，谷甾醇(5.89g，14.19.mmol)混合后，按摩尔比(正己烷：丙酮酸为1:5)加入正己烷充入氮气密封并放入37℃的水浴振荡器中，150rpm转速下充分混合30min，反应物溶解后，加入1.2g实施例1 制备的Lip@ZIF-90复合催化剂并添加
Figure BDA0002545119580000071
分子筛(40mg/mL)作为脱水剂，充入氮气密封后在水浴振荡中150rpm转速，55℃下充分反应12h后结束反应。将反应液进行抽滤，分离出催化剂、分子筛和少量未反应完全的甾醇，将得到的澄清液放入分液漏斗中并加入2mL 5％碳酸钠溶液充分震荡后，得到有机层并用超纯水进行润洗至中性，随后旋转蒸发去除有机试剂，80℃干燥2h除水得到植物甾醇乙酸酯。将抽滤后分离出的复合催化剂进行收集，在其中加入乙酸乙酯振荡后离心重复3次，干燥后回收复合催化剂。
通过紫外分光光度计对植物甾醇乙酸酯进行定量分析，植物甾醇最大吸收波长为204nm左右，计算酯化反应的转化率(转化率为反应后剩余植物甾醇与反应前植物甾醇的比值)，转化率可以达到83.0％，随后对Lip@ZIF-90复合催化剂使用上述相同的酯化方法，进行重复利用并计算重复利用率，重复利用6次时其转化率仍可达到77.7％(图2)。
3、Lip@MAF-7催化植物甾醇酯化生成植物甾醇乙酸酯
将丙酮酸(5ml，70.97mmol)，谷甾醇(5.89g，14.19.mmol)混合后，按摩尔比(正己烷：丙酮酸为1:5)加入正己烷充入氮气密封并放入37℃的水浴振荡器中，150rpm转速下充分混合30min，反应物溶解后，加入1.2g实施例1 制备的Lip@MAF-7复合催化剂并添加
Figure BDA0002545119580000072
分子筛(40mg/mL)作为脱水剂，充入氮气密封后在水浴振荡中150rpm转速，55℃下充分反应12h后结束反应。将反应液进行抽滤，分离出催化剂、分子筛和少量未反应完全的甾醇，将得到的澄清液放入分液漏斗中并加入2mL 5％碳酸钠溶液充分震荡后，得到有机层并用超纯水进行润洗中性，随后旋转蒸发去除有机试剂，80℃干燥2h除水得到植物甾醇乙酸酯。将抽滤后分离出的复合催化剂进行收集，在其中加入乙酸乙酯振荡后离心重复3次，干燥后回收复合催化剂。
通过紫外分光光度计对植物甾醇乙酸酯进行定量分析，植物甾醇最大吸收波长为204nm左右，计算酯化反应的转化率(转化率为反应后剩余植物甾醇与反应前植物甾醇的比值)，转化率可以达到83.0％，随后对Lip@MAF-7复合催化剂使用上述相同的酯化方法，进行重复利用并计算重复利用率，重复利用6次时其转化率仍可达到74.8％(图3)。
实施例3
1、脂肪酶-金属有机框架复合催化材料Lip@ZIF-8
在2mL Zn(NO3)2·6H2O(40mM)溶液中加入2mL Lipozyme 435脂肪酶(0.1 mg/ml)搅拌均匀后，加入5mL 2-methyl-imidazole(HmIm，640mM)，并加入超纯水定容至10mL。在45℃、500rpm条件下反应15h。反应结束后，8,000rpm 离心6min，回收沉淀物并用超纯水洗涤、超声处理后离心三次，以除去未被 MOFs材料包裹的脂肪酶。
2、脂肪酶-金属有机框架复合催化材料Lip@ZIF-90
在2mL Zn(NO3)2·6H2O(40mM)溶液中加入2mL Lipozyme 435脂肪酶(0.5 mg/ml)搅拌均匀后，加入5mL 2-imidazole-carboxaldehyde(HICA，高温下溶解， 160mM)，并加入超纯水定容至10mL。在37℃、500rpm条件下反应25h。反应结束后，12,000rpm离心4min，回收沉淀物并用超纯水洗涤、超声处理后离心三次，以除去未被MOFs材料包裹的脂肪酶。
3、脂肪酶-金属有机框架复合催化材料Lip@MAF-7
在2mL Zn(NO3)2·6H2O(40mM)溶液中加入2mL脂肪酶(from candida rugosa)(0.3mg/ml)搅拌均匀后，加入5mL 3-methyl-1,2,4-triazole(Hmtz，120 mM)，1mL 10％NH3·H2O(60μL)，并加入超纯水定容至10mL。在35℃、500 rpm条件下反应20h。反应结束后，10,000rpm离心5min，回收沉淀物。然后用超纯水洗涤、超声处理并离心三次，以除去未被MOFs材料包裹的脂肪酶。
实施例4
1、Lip@ZIF-8催化植物甾醇酯化生成植物甾醇乙酸酯
将丙酮酸(5ml，70.97mmol)，胆甾醇(14.72g，35.49.mmol)混合后(总质量约为13.72g)，按摩尔比(丁醇：丙酮酸为1:5)加入丁醇充入氮气密封并放入35℃的水浴振荡器中，100rpm转速下充分混合40min，反应物溶解后，加入底物质量的5％实施例3制备的Lip@ZIF-8复合催化剂并添加
Figure BDA0002545119580000092
分子筛(40 mg/mL)作为脱水剂，充入氮气密封后在水浴振荡中100rpm转速，50℃下充分反应15h后结束反应。将反应液进行抽滤，分离出催化剂、分子筛和少量未反应完全的甾醇，将得到的澄清液放入分液漏斗中并加入2mL 5％碳酸钠溶液充分震荡后，得到有机层并用超纯水进行润洗至中性，随后旋转蒸发去除有机试剂，70℃干燥2h除水得到植物甾醇乙酸酯。将抽滤后分离出的复合催化剂进行收集，在其中加入乙酸乙酯振荡后离心重复3次，干燥后回收复合催化剂。
2、Lip@ZIF-90催化植物甾醇酯化生成植物甾醇乙酸酯
将乙酸(5mL，87.43mmol)，豆甾醇(5.63g，14.57.mmol)混合后，按摩尔比(丁酮：乙酸为1:5)加入丁酮充入氮气密封并放入40℃的水浴振荡器中， 300rpm转速下充分混合10min，反应物溶解后，加入底物质量的10％实施例3 制备的Lip@ZIF-90复合催化剂并添加
Figure BDA0002545119580000091
分子筛(40mg/mL)作为脱水剂，充入氮气密封后在水浴振荡中300rpm转速，60℃下充分反应10h后结束反应。将反应液进行抽滤，分离出催化剂、分子筛和少量未反应完全的甾醇，将得到的澄清液放入分液漏斗中并加入2mL 5％碳酸钠溶液充分震荡后，得到有机层并用超纯水进行润洗至中性，随后旋转蒸发去除有机试剂，90℃干燥1h除水得到植物甾醇乙酸酯。将抽滤后分离出的复合催化剂进行收集，在其中加入乙酸乙酯振荡后离心重复3次，干燥后回收复合催化剂。
实施例5
Lip@MAF-7催化植物甾醇酯化生成植物甾醇亚油酸酯
将共轭亚油酸(10mL，32.09mmol)，谷甾醇(2.66g，6.41mmol)混合后，按摩尔比(环己烷：丙酮酸为1:5)加入环己烷充入氮气密封并放入37℃的水浴振荡器中，150rpm转速下充分混合30min，反应物溶解后，加入底物质量的 8％实施例3制备的Lip@MAF-7复合催化剂并添加
Figure BDA0002545119580000093
分子筛(40mg/mL)作为脱水剂，充入氮气密封后在水浴振荡中150rpm转速，55℃下充分反应12h 后结束反应。将反应液进行抽滤，分离出催化剂、分子筛和少量未反应完全的甾醇，将得到的澄清液放入分液漏斗中并加入2mL 5％碳酸钠溶液充分震荡后，得到有机层并用超纯水进行润洗中性，随后旋转蒸发去除有机试剂，80℃干燥2h除水得到植物甾醇亚油酸酯。将抽滤后分离出的复合催化剂进行收集，在其中加入乙酸乙酯振荡后离心重复3次，干燥后回收复合催化剂。
实施例6
测试本发明实施例1中不同脂肪酶-金属有机框架复合催化材料的不同环境下酶活，对比为未被MOFs材料包裹的游离的脂肪酶的酶活。结果如图4所示(图中从左到右按顺序为游离脂肪酶以及Lip@MAF-7、Lip@ZIF-90、Lip@ZIF-8包裹的脂肪酶)。
将实施例1中三种脂肪酶-金属有机框架复合催化材料以及游离酶分别置于不同温度、有机溶剂和不同pH的溶液中处理2小时。将处理后的三种复合催化材料及游离酶用于植物甾醇的酯化反应，然后通过紫外分光光度计对植物甾醇酯进行定量分析，计算酯化反应的转化率(转化率为反应后剩余植物甾醇与反应前植物甾醇的比值)，酶活性比值(相对活性％)为处理后酯化反应转化率与原有游离酶催化的转化率之比。从图4的实验结果进行分析可以得出，Lip@ZIF-8、 Lip@ZIF-90、Lip@MAF-7包裹的脂肪酶与游离酶相比都对酶具有很好的保护作用，并且Lip@MAF-7对酶的保护效果对比来说最好。

Claims (10)

1.一种脂肪酶-金属有机框架复合催化材料，其特征在于，所述复合催化材料以Zn基MOFs材料作为载体，将脂肪酶包裹在其内部形成。
2.根据权利要求1所述的脂肪酶-金属有机框架复合催化材料，其特征在于，所述Zn基MOFs材料为ZIF-8、ZIF-90或MAF-7。
3.根据权利要求1所述的脂肪酶-金属有机框架复合催化材料，其特征在于，所述脂肪酶优选为Lipozyme 435脂肪酶或者脂肪酶(Lipase from Candida rugosa)。
4.一种权利要求1所述的脂肪酶-金属有机框架复合催化材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将脂肪酶液、硝酸锌溶液、咪唑溶液混合，搅拌反应后得到含有复合催化剂的反应液；
(2)将步骤(1)的反应液进行离心，取沉淀洗涤、离心，得到脂肪酶-金属有机框架复合催化剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)搅拌反应为在35-45℃搅拌反应15～25h得到含有复合催化剂的反应液；步骤(2)所述离心条件为8,000～12,000rpm，4～6min。
6.一种权利要求1所述的脂肪酶-金属有机框架复合催化材料在制备在植物甾醇酯中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将植物甾醇和酯化试剂混合后加入有机溶剂，充入氮气密封后振荡混合；
(2)待植物甾醇溶解后，加入脂肪酶-金属有机框架复合催化材料及脱水剂，振荡反应；
(3)将步骤(2)振荡后的反应液进行抽滤，并在抽滤后的澄清液中加入碳酸钠溶液充分振荡，去除水层，将得到的有机层洗涤至中性，旋转蒸发去除有机溶剂，最后对产品进行除水，得到植物甾醇酯。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述植物甾醇包括胆甾醇、谷甾醇、豆甾醇、或者菜油甾醇；所述酯化试剂包括丙酮酸，共轭亚油酸或者乙酸；所述有机溶剂包括叔丁醇、丁酮、叔戊醇、环己烷或者正己烷，其中酯化试剂与植物甾醇摩尔比为1:2～1:6。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述充入氮气密封后在35～40℃水浴中振荡混合，转速为100～300rpm，时间20-40min。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述脂肪酶-金属有机框架复合催化材料加入量为酯化试剂与植物甾醇总质量的5％～10％；所述振荡反应为50～60℃水浴振荡反应，转速为100～300rpm，反应时间为10～15h。
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