CN109280660B - 表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器及应用，该方法首先在埃洛石纳米管上修饰磁性材料四氧化三铁，然后在磁性埃洛石纳米管表面依次修饰3‑氨丙基三乙氧基硅烷和聚乙烯亚胺，使修饰后的磁性埃洛石纳米管内、外壁都带正电，最后依次在其管内通过物理吸附、外壁通过共价结合固定氯过氧化物酶，即得到酶反应器。本发明基于内外壁同时固定提高了氯过氧化物酶的固载量，所得酶反应器回收简单便捷，重复使用9次后能保持92.20％催化活性，在70～80℃的热稳定性较游离酶好，在DMF、甲醇、乙腈等有机溶剂中耐受性好，用于降解利福昔明的降解效率高，当利福昔明的含量为50μg/mL以内时，降解效率均可达到90％以上。
Description
技术领域
本发明属于酶的固定化技术领域，具体涉及一种氨基修饰的外部改性的磁性埃洛石纳米管固定氯过氧化物酶反应器及应用。
背景技术
生物酶是由活细胞产生的具有催化作用的有机物，大部分为蛋白质，它是一种无毒、对环境友好的生物催化剂。生物酶催化效率非常高，具有高度特异性，一种酶只能催化一种或者一类化学反应，反应条件温和。但是游离酶在高温、强酸强碱、有机溶剂等环境容易失活，采用固定化酶的方式可以有效提高酶对温度、酸碱性、有机溶剂的耐受性。对固定化载体用磁性物质修饰，使酶的回收更加简单，降低了使用成本。
氯过氧化物酶(CPO)是从海洋真菌Caldariomyces fumago中分离出来的一种血红素过氧化物酶(42kDa)，兼具血红素过氧化物酶、过氧化氢酶以及细胞色素P-450等多种酶的催化特征，目前被认为是过氧化物酶家族中应用最广泛的酶。CPO可以催化多种有机反应，如：卤化反应、过氧化反应、羟基化反应、环氧化反应、磺化氧化反应，所以CPO具有很大的应用潜力。
埃洛石纳米管(Halloysite nanotubes，简称HNTs)的化学通式为Al2Si2O5(OH)4·nH2O，呈中空管状结构，管壁是由SiO4四面体层与AlO6八面体层堆叠卷曲而成，内层主要是Al-O带正电，而外层主要是Si-O带负电。埃洛石纳米管价格低廉，具有良好的生物相容性，可被用作生物酶固定化的固相载体。但埃洛石纳米管的这种内腔带正电、外壁带负电，内外表面组成成分不同的管状结构在选择性修饰上具有明显优势，却不利于酶的固载量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有埃洛石纳米管固定化酶技术中存在的酶固载量不高的问题，利用埃洛石纳米管表面组成成分不同的优势先对其外表面进行表面修饰，既引入磁性材料提高其重复使用性，同时又引入倍增的氨基提高固定化效果，还可以改变埃洛石纳米管的表面电性，使得其内外壁同时带有正电荷；在此基础上通过减压真空操作及改变pH调整CPO所带电荷，从而提供一种磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器。并为该固定化酶反应器提供一种新的应用。
解决上述技术问题所采用的固定化酶反应器是：首先在埃洛石纳米管上修饰磁性材料四氧化三铁，然后在磁性埃洛石纳米管表面依次修饰3-氨丙基三乙氧基硅烷和聚乙烯亚胺，使修饰后的磁性埃洛石纳米管内、外壁都带正电，最后依次在其管内通过物理吸附、外壁通过共价结合固定氯过氧化物酶，即得到酶反应器。
上述在磁性埃洛石纳米管表面依次修饰3-氨丙基三乙氧基硅烷和聚乙烯亚胺的方法为：将磁性埃洛石纳米管均匀分散于无水乙醇中，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷水溶液，常温搅拌20～30h，通过强磁铁收集产物，用无水乙醇离心洗涤固体至上清液呈中性，冷冻干燥10～15h，再将干燥产物均匀分散于甲醇中，加入聚乙烯亚胺，常温搅拌20～30h，再加入质量分数为0.3％～0.8％的戊二醛水溶液，搅拌反应2～4h，通过强磁铁收集产物，用去离子水和无水乙醇离心洗涤至上清液透明呈中性，冷冻干燥12h，得到管内、外壁都带正电的表面改性磁性埃洛石纳米管。
上述在表面改性磁性埃洛石纳米管的管内通过物理吸附固定氯过氧化物酶的方法为：将表面改性磁性埃洛石纳米管加入pH＝3.5～5的磷酸缓冲溶液，常温超声处理25～40min，然后加入游离氯过氧化物酶溶液，超声处理4～6min后，最后循环抽真空、放气至少3次，每次真空条件下常温保持20～40min。其中所述表面改性磁性埃洛石纳米管与游离氯过氧化物酶溶液的质量-体积比优选为1g：10～15mL，所述游离氯过氧化物酶溶液中氯过氧化物酶的浓度为22～28μmol·L-1。
上述在表面改性磁性埃洛石纳米管的外壁通过共价结合固定氯过氧化物酶的方法为：在最后一次抽真空、放气完后，将反应液在15～20℃、100～200rpm下振荡10～15h，通过强磁铁收集产物，并用pH＝3.5～5的磷酸缓冲溶液洗涤，将所得产物真空干燥，得到表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器。其中真空干燥的温度为20～30℃。
本发明表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器在降解利福昔明中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明将磁性埃洛石纳米管用APTES和PEI这两种物质进行修饰，增加了埃洛石纳米管表面的氨基数目，增大了酶与载体的结合机会，而且这些修饰可使埃洛石纳米管外壁变为正电，通过减压真空操作及改变溶液pH从而调整CPO所带电荷，再分别通过物理和共价结合的方式固定在纳米管内管外壁，提高了酶的固载量。同时，酶反应器可采用磁性分离方式，可以简化回收步骤，节省时间，且酶分子从载体上脱落的可能性减小，在移去上层反应液时材料的损失也会更小，降低了酶的成本，具有客观的经济效益。
本发明利用管内、外壁都带正电的表面改性磁性埃洛石纳米管作为载体固定CPO，既能保持酶的催化活性又能克服游离酶的一些缺点，使酶分子结构的稳定性及操作稳定性提高，而且容易从反应环境中分离出来，提高重复使用次数，重复使用9次后能保持92.20％催化活性，使用12次后催化活性为41.60％；在70℃放置1h后能保持99％左右的催化活性，80℃放置1h后能保持78.08％活性，较游离酶热稳定性好；在10％DMF、甲醇、乙腈等有机溶剂中的催化活性分别为97.44％、99.46％、98.57％；用于降解利福昔明的降解效率高，当利福昔明的含量为50μg/mL以内时，降解效率均可达到90％以上。
附图说明
图1是实施例1制备的表面改性磁性埃洛石纳米管的磁性分离效果图。
图2是温度对CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI催化活性的影响图。
图3是CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI在缓冲溶液中的重复使用性图。
图4是DMF对CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI催化活性的影响图。
图5是甲醇对CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI催化活性的影响图。
图6是乙腈对CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI催化活性的影响图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、制备磁性埃洛石纳米管
称取5g埃洛石纳米管置于600mL烧杯中，加入400mL去离子水，超声处理15min，继续加入3.8g FeCl3·6H2O和3g FeSO4·7H2O，完全溶解后转移至三口烧瓶中，加入3～5滴浓盐酸，通入N2，120℃油浴3h后，停止加热，冷却至50℃。再逐滴加入4moL·L-1NaOH水溶液，调节pH值为9～10，在50℃下继续搅拌2.5h，得到黑色固体并用强磁铁收集，用去离子水和无水乙醇交替离心洗涤至上清液无色，50℃真空干燥6h，得到磁性埃洛石纳米管。
2、制备表面改性磁性埃洛石纳米管
称取2g磁性埃洛石纳米管置于250mL烧杯中，加入100mL无水乙醇，500rpm转速搅拌均匀；将10mL APTES和10mL去离子水搅拌充分混匀后，逐滴加入烧杯中，继续搅拌24h，得到黑褐色浊液。停止反应，通过强磁铁收集产物，用无水乙醇离心洗涤固体至上清液呈中性，冷冻干燥12h。将1g干燥产物均匀分散在99mL甲醇中，加入1mL PEI，800rpm搅拌24h，再加入200mL质量分数为0.5％的戊二醛水溶液，剧烈搅拌反应30min，得到黑褐色浊液，并出现少许絮状物；通过强磁铁收集产物(见图1)，使用去离子水和无水乙醇离心洗涤至上清液透明呈中性，冷冻干燥12h，得到管内、外壁都带正电的表面改性磁性埃洛石纳米管。
3、物理吸附固定化氯过氧化物酶
称取10mg表面改性磁性埃洛石纳米管于10mL离心管中，加入1380μL 0.1mol·L- 1pH＝4.5的磷酸缓冲溶液，常温超声处理30min，然后加入120μL游离CPO溶液(27.2μmol·L-1，pH＝4.0)，超声处理5min后，敞开管口，放入真空箱，循环抽真空、放气过程4次，每次抽真空至0.09MPa，真空条件下常温保持30min。
4、共价结合固定氯过氧化物酶
在最后一次抽真空、放气完后，取出离心管后盖紧，在20℃、200rpm下振荡12h，通过强磁铁收集产物，并用0.1mol·L-1pH＝4.5的磷酸缓冲溶液洗涤2次后，将固体在30℃真空干燥12h，得到表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定CPO反应器(记为CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI)。经测试，CPO的固载量为27mg/g。
对制备的CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI进行性能测试，具体试验如下：
1、催化活性实验
以CPO催化2-氯-5,5-二甲基-1,3-环己二酮(MCD)作为模型反应来考察固定化酶的催化活性，MCD在278nm处有明显的特征吸收峰，而2,2-二氯-5,5-二甲基-1,3-环己二酮(DCD)无吸收峰，因此CPO将MCD转化为DCD后，278nm处的吸收峰会有所降低，甚至完全消失，从而判断催化活性。其催化反应如下所示：
具体步骤如下：取2个2mL离心管，分别加入CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI与等酶量的游离CPO溶液(5μL，c＝27.2μmol·L-1)，再加入1348μL 0.1mol·L-1pH＝2.75的PBS缓冲溶液、100μL 2.5mmol·L-1MCD水溶液和50μL 0.1mol·L-1H2O2水溶液。将离心管置于摇床中振荡15min，取出，离心后测定上清液在278nm处吸光度值。MCD的转换率由下述公式计算：
式中At：加酶后上清液在t时刻的吸光度值；A0：未加酶时反应体系的吸光度值。
以游离CPO的催化活性为100％计，CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI保留有较高的催化活性，约为96.88％。
2、热稳定性实验
分别将CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI与等酶量的游离CPO溶液(5μL，c＝27.2μmol·L-1)在不同温度(25～100℃)下温育1h后取出，待冷却至室温，利用催化MCD的模型反应来测定其催化活性，将对MCD的最高转化率视为100％，以其他温度下的催化活性与它的相对活性对时间作图，来表示CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI的热稳定性。
如图2，CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI在70℃放置1h后能保持99％左右的催化活性；80℃放置1h后能保持78.08％活性，与游离CPO相比，在高温下都具有良好的热稳定性。
3、重复使用性实验
取1个2mL离心管，加入10mg CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI，再加入1350μL0.1mol·L-1pH＝2.75的PBS缓冲液、100μL 2.5mmol·L-1MCD水溶液和50μL 0.1mol·L-1H2O2水溶液。将离心管置于摇床中振荡15min，取出，离心后测定上清液在278nm处吸光度值。吸取出上层反应液后将固体材料用于下一次MCD催化反应。将第一次对MCD的转化率视为100％，并以之后每次转化率对第一次的比值表示催化活性，以每次反应的催化活性考察CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI的重复使用性。
如图3所示，CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI重复使用9次后能保持92.20％催化活性，使用12次后催化活性为41.60％，说明其重复使用性好。
4、有机溶剂耐受性实验
(1)对N,N-二甲基甲酰胺(DMF)耐受性
将CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI与等酶量游离CPO溶液(5μL，c＝27.2μmol·L-1)分别加入1.5mL不同体积分数DMF水溶液(体积分数为0％、5％、10％、15％、20％、25％)中，放置1h用于催化MCD氯化反应，将不加入DMF水溶液时CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI和游离CPO溶液对MCD的转化率视为100％，分别以不同浓度DMF下CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI和游离CPO的催化活性与它的相对活性对DMF体积分数作图，来表示CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI和游离CPO的DMF耐受性。
由图4可见，在10％DMF水溶液中CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI的催化活性为97.44％，在20％DMF水溶液中CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI的催化活性为54.55％。
(2)对甲醇耐受性
将CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI与等酶量游离CPO溶液(5μL，c＝27.2μmol·L-1)分别加入1.5mL不同体积分数甲醇水溶液(体积分数为0％、5％、10％、15％、20％、25％)，放置1h用于催化MCD氯化反应，将不加入甲醇时CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI和游离CPO对MCD的转化率视为100％，分别以不同浓度甲醇下CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI和游离CPO的催化活性与它的相对活性对甲醇体积分数作图，来表示CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI和游离CPO的有甲醇受性。
由图5可见，在10％甲醇水溶液中CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI的催化活性为99.46％，在20％甲醇水溶液中CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI的催化活性为49.17％。
(3)对乙腈耐受性
将CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI与等酶量游离CPO溶液(5μL，c＝27.2μmol·L-1)分别加入1.5mL不同体积分数乙腈水溶液(体积分数为0％、5％、10％、15％、20％、25％)，放置1h用于催化MCD氯化反应，将不加入乙腈时CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI和游离CPO对MCD的转化率视为100％，分别以不同浓度乙腈下CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI和游离CPO的催化活性与它的相对活性对乙腈体积分数作图，来表示CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI和游离CPO的乙腈耐受性。
由图6可见，在10％乙腈水溶液中CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI的催化活性为98.57％，在20％乙腈水溶液中CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI的催化活性为38.55％。
实施例2
采用实施例1制备的CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI降解利福昔明
1、配制流动相
称量KH2PO4 3.4g，溶解并在250mL容量瓶中定容，称量NaAc 2.05g，溶解并在250mL容量瓶中定容，然后将二者等体积混合。用0.1mol·L-1柠檬酸水溶液调节溶液pH为2.6，此溶液为缓冲液。以乙腈、甲醇、缓冲液体积比＝44:16:40为流动相。
2、降解利福昔明
以蒸馏水为溶剂，配制不同浓度的利福昔明标准液(10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL)的样品；取五个10mL离心管分别加入500μL利福昔明标准液、2400μL PBS缓冲溶液(pH＝2.75)、10mg CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI、100μL质量分数为30％的H2O2溶液，室温反应30min。反应后用磁铁除去固体材料，用乙酸乙酯萃取产物(3mL×3次)，利用旋转蒸发将产物提取出来，然后用流动相溶解样品，得到粗样。粗样经0.22μm有机相过滤膜过滤后用于高效液相色谱(HPLC-15C)分析测定。高效液相色谱测定条件为：等梯度模式下采用乙腈-甲醇-缓冲液体积比＝44:16:40为流动相，流速1.0mL·min-1，检测波长254nm，柱温为室温，进样量20μL。
实验结果显示，利福昔明浓度为10μg/mL时，CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI对利福昔明的降解率为90.66％；利福昔明浓度为20μg/mL时，CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI对盐利福昔明的降解率为91.89％；利福昔明浓度为30μg/mL时，CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI对盐利福昔明的降解率为93.34％；利福昔明浓度为40μg/mL时，CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI对盐利福昔明的降解率为92.42％；利福昔明浓度为50μg/mL时，CPO@HNTs-Fe3O4-APTES-PEI对盐利福昔明的降解率为90.41％。
Claims (8)
1.一种表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器，其特征在于：首先在埃洛石纳米管上修饰磁性材料四氧化三铁，然后在磁性埃洛石纳米管表面依次修饰3-氨丙基三乙氧基硅烷和聚乙烯亚胺，使修饰后的磁性埃洛石纳米管内、外壁都带正电，最后依次在其管内通过物理吸附、外壁通过共价结合固定氯过氧化物酶，即得到酶反应器。
2.根据权利要求1所述的表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器，其特征在于：在磁性埃洛石纳米管表面依次修饰3-氨丙基三乙氧基硅烷和聚乙烯亚胺的方法为：将磁性埃洛石纳米管均匀分散于无水乙醇中，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷水溶液，常温搅拌20～30h，通过强磁铁收集产物，用无水乙醇离心洗涤固体至上清液呈中性，冷冻干燥10～15h，再将干燥产物均匀分散于甲醇中，加入聚乙烯亚胺，常温搅拌20～30h，再加入质量分数为0.3％～0.8％的戊二醛水溶液，搅拌反应2～4h，通过强磁铁收集产物，用去离子水和无水乙醇离心洗涤至上清液透明呈中性，冷冻干燥12h，得到管内、外壁都带正电的表面改性磁性埃洛石纳米管。
3.根据权利要求2所述的表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器，其特征在于：在表面改性磁性埃洛石纳米管的管内通过物理吸附固定氯过氧化物酶的方法为：将表面改性磁性埃洛石纳米管加入pH＝3.5～5的磷酸缓冲溶液，常温超声处理25～40min，然后加入游离氯过氧化物酶溶液，超声处理4～6min后，最后循环抽真空、放气至少3次，每次真空条件下常温保持20～40min。
4.根据权利要求3所述的表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器，其特征在于：所述表面改性磁性埃洛石纳米管与游离氯过氧化物酶溶液的质量-体积比为1g：10～15mL。
5.根据权利要求4所述的表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器，其特征在于，所述游离氯过氧化物酶溶液中氯过氧化物酶的浓度为22～28μmol·L-1。
6.根据权利要求3所述的表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器，其特征在于：在表面改性磁性埃洛石纳米管的外壁通过共价结合固定氯过氧化物酶的方法为：在最后一次抽真空、放气完后，将反应液在15～20℃、100～200rpm下振荡10～15h，通过强磁铁收集产物，并用pH＝3.5～5的磷酸缓冲溶液洗涤，将所得产物真空干燥，得到表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器。
7.根据权利要求6所述的表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器，其特征在于：真空干燥的温度为20～30℃。
8.权利要求1所述的表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器在降解利福昔明中的应用。
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