WO2020241340A1 - 新規な人工タンパク質触媒 - Google Patents

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WO2020241340A1
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田中　克典
ケンワード ヴォン
泰治 下田
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株式会社糖鎖工学研究所
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Definitions

  • the present invention relates to a novel artificial protein catalyst.
  • In vivo synthetic chemotherapy is a concept in which a non-active or non-toxic raw material or reagent is introduced into the body, and the raw material or reagent is activated by a catalyst at a specific place in the body to exert an effect. Under such circumstances, there is increasing interest in the development of new catalysts applicable to therapeutic applications (Non-Patent Document 1).
  • metal catalysts such as gold (Au), palladium (Pd), and ruthenium (Ru) are thiols present in the intracellular range of 0.5 to 10 mM and in plasma in the range of about 2 to 20 ⁇ M. It is known to rapidly deactivate when exposed to the contained glutathione (GSH).
  • Au gold
  • Pd palladium
  • Ru ruthenium
  • Non-Patent Document 2 ⁇ 17).
  • An object of the present invention is to provide a novel artificial protein catalyst that enables protection of a catalyst from in vivo substances and has potential usefulness for in vivo synthetic chemotherapy.
  • HSA Human serum albumin
  • the present inventors considered selecting HSA as a protein and accommodating a metal catalyst in the hydrophobic binding pocket of HSA. Then, when ruthenium, which is a metal catalyst, was used as a catalyst and the metal catalyst was fixed to albumin drug binding site I, which is known to bind (interact) with coumarin derivatives (warfarin, etc.), 20 mM GSH under in vitro conditions. We have found that the catalytic activity of bound ruthenium can be protected even in the presence of, and have completed the present invention.
  • the present invention includes the following features: [1] A complex of a protein and a catalyst selected from a metal catalyst or an organic catalyst.
  • the protein is a protein having a hydrophobic spot in its three-dimensional structure.
  • the complex houses the catalyst in the hydrophobic spot so that the catalyst is not or substantially not exposed to a hydrophilic environment. Complex.
  • the protein is a natural or artificial protein, Complex.
  • the complex according to [1] or [2].
  • the proteins include human serum albumin (HSA), immunoglobulin G (IgG), immunoglobulin A (IgA), transferase, antitrypsin, haptoglobin, ⁇ 1-acid glycoprotein, Myoferlin, Trk receptor, and estrogen receptor. , And selected from the group consisting of folic acid receptors, Complex.
  • the metal catalyst includes a boron catalyst, a magnesium catalyst, an aluminum catalyst, a silicon catalyst, a calcium catalyst, a scandium catalyst, a titanium catalyst, a vanadium catalyst, a chromium catalyst, a manganese catalyst, an iron catalyst, a cobalt catalyst, a nickel catalyst, a copper catalyst, and a zinc catalyst.
  • Complex Ittium catalyst, zirconium catalyst, niobium catalyst, molybdenum catalyst, ruthenium catalyst, rhodium catalyst, palladium catalyst, silver catalyst, indium catalyst, tin catalyst, barium catalyst, hafnium catalyst, tungsten catalyst, renium catalyst, osmium catalyst, iridium catalyst, platinum catalyst , Gold catalyst, and lanthanoid Lewis acid catalyst.
  • the lanthanoid Lewis acid catalyst is selected from the group consisting of an itribium catalyst, a lanthanum catalyst, a cerium catalyst, a samarium catalyst, a europium catalyst, a gadolinium catalyst, a terbium catalyst, a thulium catalyst, and a lutetium catalyst.
  • the complex according to any one of [1] to [5].
  • the protein is human serum albumin
  • the catalyst is a metal catalyst, Complex.
  • the metal catalyst is a ruthenium catalyst, Complex.
  • the complex according to any one of [6] to [8].
  • the metal catalyst is attached to the hydrophobic spot via a ligand for human serum albumin. Complex.
  • the ligands are warfarin, azapropazone, acenocoumarol, phenylbutazone, salicylate, indomethacin, phenytoin, tolbutamide, chlorpropamide, iofenoxate, yodipamide, sulfadimethoxyn, phenoproxone, glibenclamide, sulfathiazole, tenoxicam, From the group consisting of camptothecin, baldidendeazi,dinllatan, diadereal,minllatan, diadereal,minllatan, diaderealtan, prodan, bilirubin, eicosanoid, and carboxy-methyl-propyl-franpropanoate (urine tolbutazone), and coumarin. Selected, Complex.
  • the linker is an alkyl chain or a polyethylene glycol (PEG) chain having an amino group and a carboxyl group at both ends. Complex.
  • the complex according to any one of [1] to [13].
  • the protein further comprises a portion that interacts with a target site in vivo. Complex.
  • the protein is human serum albumin, Complex.
  • composition according to [18] which is a pharmaceutical composition further containing a pharmaceutically acceptable carrier.
  • composition according to [19] Used in combination with a prodrug that can be activated by the complex, Composition.
  • composition [21] The composition according to [19]. Further comprising a prodrug that can be activated by the complex. Composition.
  • composition according to [19]. Used to selectively tag specific cells, Composition.
  • composition according to [22] Administered in combination with chemicals that are tagged on the cells, Composition.
  • composition according to [18] Used as a biosensor, Composition.
  • composition according to [18] Used as a biosensor to detect ethylene, Composition.
  • a pharmaceutical composition containing a prodrug can be activated by the complex according to any one of [1] to [17].
  • the pharmaceutical composition is used in combination with the complex according to any one of [1] to [17].
  • Pharmaceutical composition is used in combination with the complex according to any one of [1] to [17].
  • a combination drug The first drug containing the complex according to any one of [1] to [17] and A combination drug comprising a second agent comprising a prodrug that can be activated by the complex.
  • a novel artificial protein catalyst that enables protection of the catalyst from in vivo substances is provided.
  • FIG. 1 shows the fluorescence assay results of the product obtained by the reaction of ruthenium catalysts Ru1-3, 6 with HSA.
  • FIG. 2 shows a saturated bond curve when the reaction with ruthenium catalysts Ru1-3 and 6 was carried out after the reaction between HSA and warfarin or ibuprofen.
  • FIG. 3 shows an experimental system for testing the catalytic ability of the alb-Ru complex used in the examples of the present application.
  • FIG. 4 shows the evaluation results of the catalytic ability of the alb-Ru complex under different conditions.
  • FIG. 5 shows the evaluation results of the catalytic ability of the alb-Ru complex under different conditions.
  • FIG. 6 shows the Michaelis-Menten kinetic parameters of substrate 1a-e in the presence or absence of GSH with respect to ArM activity (artificial metal enzyme activity).
  • FIG. 7 shows molecular modeling of the ruthenium catalyst Ru1-3, 6 when docked with human serum albumin (PDB: 1H9Z).
  • FIG. 8 is the result of cell imaging showing that GArM-Ru1 (2,3-Sia) accumulates better in SW620 human colon adenocarcinoma cells.
  • FIG. 9 shows a comparison between SW620 human colon adenocarcinoma cells, HeLa human cervical cancer-derived cells and A549 human alveolar basal epithelial adenocarcinoma cells with respect to the accumulation of GArM-Ru1 (2,3-Sia).
  • FIG. 10 shows kinetic experiments on activation of prodrugs 1 g and 1 h by the GArM-Ru complex.
  • FIG. 11 shows a comparison of the cell growth inhibitory effects of prodrugs, prodrugs and alb-Ru1, or prodrugs and GArM-Ru1 on cancer cell lines.
  • FIG. 12 shows a synthesis scheme for an ArmM ethylene probe (AEP).
  • FIG. 13 shows the observed fluorescence intensities of the alb-Ru compound compared to the AEP probe.
  • FIG. 14 shows a comparison of CD spectra to examine changes in the folding structure of various protein compounds in this study.
  • FIG. 15 shows the results of observing changes in ethylene production expressed in various organelles (outer pericarp, ovary, pillar axis) at different developmental stages (immature and mature) of kiwifruit using AEP. Shown. The number of samples was the outer pericarp (
  • FIG. 16 shows the fluorescence intensity of the epidermis on which AEP (100 ⁇ M) was applied, an imaging image of wild-type Col-0 (b) under a bright-field microscope (magnification 40 times), and ACC (an ethylene biosynthesis accelerator). The result of detection by further adding 1 mM) is shown.
  • FIG. 16 shows the fluorescence intensity of the epidermis on which AEP (100 ⁇ M) was applied, an imaging image of wild-type Col-0 (b) under a bright-field microscope (magnification 40 times), and ACC (an ethylene biosynthesis accelerator). The result of detection by
  • FIG. 18 shows a comparison of the flow cytometry results of HeLa cells treated with GArM and HeLa cells not treated.
  • FIG. 19 shows a comparison of the flow cytometry results of mouse peritoneal macrophages treated with GArM and mouse peritoneal macrophages not treated.
  • FIG. 20 shows a comparison of flow cytometric results of GAArM-treated HeLa cells and mouse peritoneal macrophages and non-GArM-treated HeLa cells and mouse peritoneal-derived macrophages. The values of Q3 in the upper left figure and the lower left figure are 99.09% and 43.06%, respectively.
  • FIG. 21 shows the results of the cell adhesion assay performed in Example 8.
  • the present invention relates to a novel artificial protein catalyst.
  • the artificial protein catalyst according to the present invention is a complex of a protein and a catalyst selected from a metal catalyst or an organic catalyst (hereinafter, also referred to as "complex of the present invention").
  • the complex of the present invention can be characterized by a configuration in which the catalyst is contained within the hydrophobic spot of a protein having a hydrophobic spot within its conformation so that it is not or substantially not exposed to a hydrophilic environment. .. That is, the complex of the present invention can protect the catalyst from in vivo substances by avoiding exposure or substantial exposure of the catalyst to the hydrophilic environment.
  • the complex of the present invention may contain the catalyst in only one of the hydrophobic spots present in the protein, or may contain the catalyst in a plurality of (or all) locations.
  • the complex of the present invention also has a configuration that avoids exposure or substantial exposure of the catalyst to the hydrophilic environment, while still promoting the reaction of interest to the catalyst. It can also be characterized by obtaining. That is, in a preferred embodiment, the complex of the present invention can exert a desired activity in vivo while protecting the catalyst from substances in vivo.
  • substantially the catalyst is not exposed to the hydrophilic environment means that exposure to the hydrophilic environment is permitted to the extent that protection of the catalyst from the hydrophilic environment is recognized.
  • Protection of the catalyst from the hydrophilic environment is recognized means that the activity of the catalyst contained in the complex of the present invention is longer in the same environment as compared with the case where the free catalyst is exposed to the in vivo environment. It refers to being maintained at, and can be evaluated, for example, by turnover (TON). The extent to which exposure is acceptable may vary depending on the type of catalyst used, the type of protein used in combination, and the like.
  • substantially the catalyst is not exposed to a hydrophilic environment means that the relative solvent accessible surface area (SASA) of the catalyst when housed in the hydrophobic spot of the protein is 5.0 or less.
  • SASA solvent accessible surface area
  • Preferred 4.0 or less more preferably 3.5 or less, more preferably 3.0 or less, more preferably 2.5 or less, more preferably 2.0 or less, more preferably 1.5 or less, more. It is preferably 1.0 or less, more preferably 0.9 or less, more preferably 0.8 or less, more preferably 0.7 or less, more preferably 0.6 or less, more preferably 0.5 or less, and more preferably. It means that it is 0.4 or less, more preferably 0.3 or less, more preferably 0.2 or less, or more preferably 0.1 or less.
  • substantially the catalyst is not exposed to the hydrophilic environment is 50% or more, preferably 55% or more, more preferably 60% or more, more preferably 60% or more of the total surface area of the catalyst. 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96. It means that% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, or more preferably 99% or more is contained inside the hydrophobic spot of the protein.
  • the proteins that can be used in the complex of the present invention are not limited as long as they have one or more hydrophobic spots that allow accommodation of the catalyst, and natural or artificial proteins can be used.
  • artificial proteins include mutant proteins in which mutations are artificially introduced into a part of natural proteins.
  • the protein used in the complex of the present invention is a protein for which a ligand that binds or interacts with any of its hydrophobic spots is readily available.
  • Such proteins may be preferred in that they facilitate ligand-mediated catalytic complexation.
  • the proteins used in the complex of the invention are human serum albumin (HSA), immunoglobulin G (IgG), immunoglobulin A (IgA), transferrin, antitrypsin, haptoglobin, and ⁇ 1- It is a protein selected from acidic glycoproteins and the like. These proteins are considered suitable for drug delivery systems because they are proteins that can move freely in the blood.
  • the protein used in the complex of the invention is a protein selected from Myoferlin, Trk receptor, estrogen receptor, folic acid receptor and the like. Since these proteins are known to be highly expressed in cancer cells, it is possible to produce a complex capable of directly killing cancer by coordinating a ligand and a metal to the protein. It is believed that there is.
  • the organic catalyst or metal catalyst that can be used in the composite of the present invention is not particularly limited and can be arbitrarily selected by those skilled in the art.
  • the organocatalyst or metal catalyst that can be used in the complex of the present invention is one that has the activity of converting a given prodrug into an active form.
  • the organic catalyst used in the complex of the present invention is not limited to, but is not limited to, a proline derivative, an interphase transfer catalyst based on a quaternary ammonium salt derivative, a thiourea derivative, a thiazolium salt or an imidazolium.
  • a proline derivative an interphase transfer catalyst based on a quaternary ammonium salt derivative
  • a thiourea derivative a thiazolium salt or an imidazolium
  • Examples thereof include N-heterocyclic carben derivatives obtained from salts, cyclic ketone derivatives, 4-dimethylaminopyridine derivatives, and secondary amines typified by amino acids.
  • the metal catalyst used in the composite of the present invention includes, but is not limited to, a boron catalyst, a magnesium catalyst, an aluminum catalyst, a silicon catalyst, a calcium catalyst, a scandium catalyst, a titanium catalyst, a vanadium catalyst, and chromium.
  • lanthanoid Lewis acid catalyst examples include, but are not limited to, itribium catalyst, lanthanum catalyst, cerium catalyst, samarium catalyst, europium catalyst, gadolinium catalyst, terbium catalyst, thulium catalyst, and lutetium catalyst. Can be done.
  • a method of binding the catalyst in the hydrophobic spot via a ligand that interacts with or binds to the hydrophobic spot can be mentioned.
  • a linker such as a peptide, a hydrocarbon chain, or PEG can be appropriately used for linking the ligand and the catalyst (for example, a metal catalyst).
  • the length of the linker used should be such that the catalyst is housed in a hydrophobic spot and is not or substantially not exposed from the hydrophilic environment.
  • the linker used when the linker used is too long for the size of the hydrophobic spot, the ligand interacting with it, and the catalyst used, when binding the catalyst to the hydrophobic spot via the linker and ligand.
  • the catalyst may not fit within the hydrophobic spot, and some or all of it may be exposed to the hydrophilic environment from the hydrophobic spot, resulting in insufficient protection against the hydrophilic environment.
  • Another means of accommodating the catalyst in the hydrophobic spot of the protein is, for example, on the side chain functional groups of cysteine or lysine (thiol and amino groups, respectively) present in or proximal to the hydrophobic pocket of the protein.
  • a method of allowing maleimide or succinimide to act to activate and covalently bond with a catalyst can be mentioned.
  • Yet another means of accommodating the catalyst in the hydrophobic spots of the protein is to introduce mutations at specific positions in the amino acid sequences that make up the hydrophobic pocket to introduce double bonds or azides, metathesis or click.
  • a method of carrying out a reaction and covalently bonding with a catalyst can be mentioned (Young TS, Ahmad I, Block A, Schultz PG., Expanding the biochemical repertoire of the methylotropic yearast Pichia pastoris. Pichia pastoris. : 2643-53 .; Wang L, Schultz PG., Expanding the genetic code., Angew Chem Int Ed Engl. 2004. 44 (1): 34-66.).
  • the catalyst for example, a metal catalyst
  • a catalyst having a linker such as a peptide or PEG can be used.
  • the complex of the invention is modified to interact with a target site in vivo.
  • the complex of the present invention can be guided to a desired site in the living body / or can target the desired site.
  • "interacting with a target site in vivo" means accumulating or typically binding to the target site with a significantly stronger directivity compared to other sites in the body. obtain.
  • the target site may be a specific organ or organ, a specific cell tumor, or the like.
  • a sugar chain modification can be mentioned.
  • an asparagine-linked sugar chain (N-linked sugar chain) can be used for protein modification, and its orientation to a specific organ can be changed according to the cluster and / or the number of bonds of the sugar chain.
  • N-linked sugar chain an asparagine-linked sugar chain
  • its orientation to a specific organ can be changed according to the cluster and / or the number of bonds of the sugar chain.
  • the complex of the present invention has enhanced directivity toward the target site. Can be done.
  • the sugar chain modification uses, for example, a plurality of sugar chains (for example, 5 to 30) having sialic acid, galactosamine, galactose, or mannose at the non-reducing end, which interact with various types of cancer. be able to.
  • a sugar chain having fucose can be used as the sugar chain modification.
  • the plurality of sugar chains to be modified may be of the same type or of a plurality of types, and the size of each sugar chain can be in the range of 1 sugar to 25 sugars.
  • non-reducing ends of sialic acid, galactosamine, galactose, or mannose that selectively migrate to specific organs such as, for example, liver, pancreas, intestinal tract, gallbladder, bladder, or brain.
  • a plurality of sugar chains (for example, 5 to 30) can be used.
  • the plurality of sugar chains to be modified may be of the same type or of a plurality of types, and the size of each sugar chain shall be in the range of 1 sugar to 25 sugars. Can be done.
  • the modification site is typically the protein surface of the complex.
  • a method for modifying a specific site on the protein surface is known to those skilled in the art, and any method may be used.
  • sugar chain modification can be introduced into the protein surface by the click reaction described in International Publication No. 2008/0967060, Japanese Patent No. 6327547, International Publication No. 2017/002918 and the like. ..
  • the complex of the present invention further comprises a moiety that interacts with a target site in vivo.
  • interacting with a target site can mean accumulating or typically binding to a target site with significantly stronger directivity as compared to other sites.
  • the target site may be a specific organ or organ, a specific cell tumor, or the like.
  • the "part that interacts with the target site in the living body” may be an antibody or a fragment thereof, a peptide ligand or a fragment thereof, DNA or RNA, or a pNA (peptide nucleic acid) or a fragment thereof.
  • the "part that interacts with the target site in vivo” may be produced, for example, as a fusion protein with a protein used in the complex, or the protein used in the complex and the "target in vivo".
  • the “parts that interact with the site” may be prepared separately and bound (eg, covalently) by means known to those skilled in the art.
  • the present invention relates to an artificial metal enzyme (ArM) which is a complex of a protein and a metal catalyst.
  • ArM artificial metal enzyme
  • the ArM of the present invention is a composite of HSA and a metal catalyst, wherein the metal catalyst is HSA so that the metal catalyst is not or substantially not exposed to a hydrophilic environment. It is characterized by being housed in a hydrophobic spot of.
  • the metal catalyst used together with HSA can be appropriately selected by those skilled in the art depending on, for example, the type of prodrug to be activated.
  • the metal catalyst used with HSA is ruthenium.
  • the hydrophobic spots of the HSA containing the metal catalyst are not particularly limited, and one hydrophobic spot may contain the metal catalyst, or a plurality of hydrophobic spots contain the metal catalyst. May be good.
  • Hydrophobic spots of HSA can include albumin drug binding site I and albumin drug binding site II.
  • the complex of the invention houses a metal catalyst at albumin drug binding site I of HSA.
  • the metal catalyst can be accommodated in the hydrophobic spot of HSA by connecting the metal catalyst and the ligand for HSA and binding the metal catalyst in the hydrophobic spot via the ligand.
  • the ligands that can be used for this purpose can vary depending on the hydrophobic spots that house the metal catalyst. For example, when a metal catalyst is contained in the albumin drug binding site I of HSA, warfarin, azapropazone, acenocoumarol, phenylbutazone, salicylate, indomethacin, phenytoin, tolbutamide, chlorpropamide, and iophenoki are used as the ligands.
  • a metal catalyst is contained in albumin drug-binding site II of HSA, diazepam, ketoprofen, clofibrate, ibuprofen, iopanoate, azidodeoxytimidin, flufenamate, as the ligands, are used.
  • the hydrophobic spot of HSA is the drug binding site I, and a coumarin derivative, such as 7-dimethylaminocoumarin, is used as the ligand to accommodate ruthenium at the site.
  • the connection between the metal catalyst and the ligand may be carried out via a linker.
  • the linker typically, an Arikil chain or a polyethylene glycol (PEG) chain having an amino group and a carboxy group at both ends can be used.
  • the alkyl chain linker is, for example, -NH- (CH 2 ) x- CO- (in the formula, x is an integer and is not limited as long as it does not interfere with the desired linker function. For example, it can be an integer of 1 to 15), -NH- (CH 2 CH 2 O) y -CH 2- CO- (in the formula, y is an integer, as long as it does not interfere with the desired linker function.
  • z is an integer.
  • z is an integer.
  • the length of the linker used is such that the metal catalyst is housed in the hydrophobic spot of the HSA and is not or substantially not exposed to the hydrophilic environment. It should be noted that this is the case.
  • ruthenium is accommodated at albumin drug binding site I of HSA using coumarin or a derivative thereof (eg, 7-dimethylaminocoumarin, 7-diethylaminocoumarin (DEAC)) as a ligand, "substantially exposed to a hydrophilic environment”. "Not” means that the exposed area of ruthenium to the hydrophilic environment can be 40% or less, preferably 35% or less of the total surface area of ruthenium.
  • substantially not exposed to a hydrophilic environment can mean that the SASA of ruthenium when housed in albumin drug binding site I of HSA is 3.0 or less, preferably 1.0 or less.
  • An exemplary linker used in this case is -NH- (CH 2 CH 2 O) y- CH 2- CO-, in which y is an integer of 1 to 6, preferably 1 to 3. Can be an integer of.
  • the surface of HSA is modified with a sugar chain.
  • the content of sugar chain modification can change depending on the target in vivo.
  • the modification position on the HSA surface is not particularly limited as long as the sugar chain can be introduced, and an example includes the lysine residue at position 30 on the HSA surface.
  • the complex of the present invention can activate the prodrug in vivo depending on the type of catalyst contained in the complex.
  • the complex of the present invention can accumulate at a specific position in the living body and activate the prodrug in a regioselective manner, depending on the type of catalyst contained in the complex.
  • the present invention relates to a composition comprising the complex of the present invention in another aspect.
  • composition of the present invention is, in one embodiment, a pharmaceutical composition used in combination with a prodrug that can be activated by the complex of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the invention may be in single agent form further comprising a pharmaceutically acceptable carrier and optionally a prodrug that can be activated by the complex of the invention.
  • examples of the prodrug that can be used in the present invention and can be activated by the complex of the present invention include, but are not limited to, various anticancer agents, and specifically, mitomycin. C, doxorubicin, taxol, endoxyphen and the like can be exemplified.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is, in another embodiment, a form of a combination drug in which the complex of the present invention and the prodrug that can be activated by the complex are provided as separate agents.
  • the first drug containing the complex of the present invention and the second drug containing a prodrug that can be activated by the complex can be administered to the subject simultaneously or at different times. ..
  • composition of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a prodrug that can be activated by the complex of the invention and any pharmaceutically acceptable carrier. It can be characterized by being used in combination with the complex.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used to selectively tag specific cells in a living body.
  • "tagging" is a non-toxic chemical substance that can be administered endogenously or externally, that can disrupt cell function (eg, an adhesion inhibitor) or that can elicit an immunological response.
  • Such chemicals are in vivo or in vitro chemicals that are converted from inactive to active by any metal catalyst, or in vivo or in vitro chemicals whose function is enhanced by any metal catalyst. possible.
  • Such a technique in therapeutic applications is called selective cell tagging (SeCT), which significantly damages surrounding tissues, as opposed to conventional chemotherapy, which removes cancer cells directly with highly cytotoxic agents.
  • cRGD-PE cRGD-propargyl ester
  • the composition of the present invention can be used as a biosensor in another embodiment.
  • a linker for example, a coumarin derivative
  • the complex or composition of the present invention can be designed as an appropriate biosensor according to the type of the substance to be detected.
  • the composition of the invention is used as a biosensor for detecting ethylene in plants.
  • first and second may be used to describe various elements, but these elements should not be limited by those terms. These terms are used only to distinguish one element from the other, for example, the first element is referred to as the second element, and similarly, the first element is the second element. Is possible without departing from the scope of the present invention.
  • Example 1 Production of alb-Ru A drug-binding site of albumin for the design of a biocompatible artificial metal enzyme (ArM) capable of preventing exposure of a metal catalyst to a solvent (having a binding pocket).
  • I drug site I
  • a metal catalyst was immobilized on a drug binding site I, which is known to bind (interact) with a coumarin derivative (warfarin, etc.) (Guman, J .; Zunszain, PA; Petitpas). , I .; Catalystcharya, A.A .; Otagiri, M .; Curry, SJ Mol. Biol. 2005, 353, 38-52).
  • Coumarin-Ru complexes Ru1-3, 6 having different PEG linker lengths were used for fixing the metal catalyst.
  • Ruthenium complex III is a known technique (Lo, C .; Ringenberg, MR; Gnandt, D .; Wilson, Y .; Ward, TR ChemComm 2011, 47, 12065-12067; Kajetanowicz, A .; Chatterjee. , A .; Reuter, R .; Ward, TR Catal. Lett. 2014, 144, 373-379; Zhao, J .; Kajetanowicz, A .; Ward, TR Org. Biomol. Chem. 2015 , 13,5652-5655). Hydrochloric acid gas is bubbled into a solution of ruthenium complex III (80.0 mg, 0.106 mmol) in dichloromethane (3 mL) at 25 ° C.
  • Hydrochloric acid gas is prepared by dropping concentrated sulfuric acid into ammonium chloride. After stirring for 45 minutes, dichloromethane (1 mL) is added to the reaction with a syringe and stirred at the same temperature. After an additional 15 minutes, the reaction is concentrated under reduced pressure to give amine IV, which is used in the next reaction without purification.
  • the production of alb-Ru was carried out by reacting the ruthenium catalysts Ru1-3 and 6 with human serum albumin (HAS) to form an alb-Ru complex.
  • the composition of the reaction solution contained 30 ⁇ M human serum albumin (hereinafter referred to as HSA; 167 ⁇ L of 50 nmol, 300 ⁇ M stock solution (aqueous solution) was used) and catalysts (Ru1-3, 6) at various concentrations.
  • HSA human serum albumin
  • catalysts for example, 37 ⁇ M Ru1 (using 167 ⁇ L of 62 nmol and 370 ⁇ M stock solution (dioxane solution)) was used.
  • the total reaction volume was 1670 ⁇ L with PBS buffer (pH 7.4) containing 10% dioxane.
  • the reaction mixture was gently mixed and incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • the reaction solution was then washed with PBS buffer using an Amicon® ultracentrifugation filter (30 kDa) and concentrated.
  • the concentrated alb-Ru solution was then diluted with PBS buffer to give 1000 ⁇ L as a 50 ⁇ M stock solution.
  • Example 2 Verification of reactivity of alb-Ru Next, the ability of the alb-Ru complex to catalyze ring-closing metathesis (RCM) of olefins 1a to 1d and enyne 1e was examined (FIG. 3). In addition, since alb-Ru1 to 3 and 6 have different PEG linker lengths, the effective size and compatibility of the hydrophobic binding pockets were also verified.
  • RCM ring-closing metathesis
  • the reaction solution basically contained 1ae and album-Ru complex (that is, Ru1 to 3,6) as substrates in a 1: 9 dioxane: PBS buffer solution (pH 7.4).
  • the reaction was incubated at 37 ° C. for 2 hours, then quenched with dodecane thiol, further diluted with methanol, the samples were filtered, HPLC analyzed and the turnover (TON) to each product 2a-e was performed. Calculated.
  • TON turnover
  • Example 3 Verification of biocompatibility of alb-Ru After confirming that the alb-Ru complex exhibits activity to catalyze ring-closing metathesis and enyne cross metathesis, the action of glutathione is then evaluated. We aimed to prove biocompatibility. For this study, compound 1d was selected as the model substrate.
  • FIG. 4 shows an experiment performed at a physiologically appropriate GSH concentration (200 ⁇ M, 10 equivalents relative to alb-Ru1).
  • substrate 1d was incubated with 10 mol% alb-Ru1 complex at 37 ° C. for 2 hours.
  • the yield of 2d was about 2% with 1: 8: 1 fetal bovine serum / DMEM medium / dioxane and about 1% with 1: 8: 1 normal rat serum / PBS buffer / dioxane.
  • the recovered starting material 1d was approximately 8% and 3%, respectively, the low production yields are likely due to the capture or degradation of the substrate by proteins normally present in serum.
  • prodrug therapy which is particularly beneficial for the development of drug candidates at risk of side effects, such as anticancer therapy based on cytotoxic molecules.
  • glycoalbumin bound to specific complex N-glycan aggregates provides different cognitive and binding properties between different cancer cells. It has been found that it can be demonstrated.
  • gold-catalyzed glycoalbumin has an N-glycan structure for protein labeling based on propargyl esters. Localized to specific organs of live mice and showed in vivo catalytic activity (Tsubokura, K .; Vong, KHK; Pradipta, A.R .; Ogura, A .; Urano, S.
  • glucosylated ArM (GARM) -Ru1 (2,3-Sia) on which the ruthenium catalyst Ru1 was immobilized was prepared, and then the targeting ability (targeting ability) to SW620 human colon adenocarcinoma cells was evaluated by a binding experiment. did.
  • GArM-Ru1 (2,3-Sia) cancer cells were seeded at a density of 10 4 cells / well in clear bottom 96 well plate, and cultured overnight. Then, the medium is removed, and the final concentration of [1] GArM-Ru1 (2,3-Sia), [2] alb-Ru, [3] GA (2,3-Sia), or [4] Ru1 is obtained.
  • Umberiprenin known as a natural product extracted from plants of the genus Ferula, has been shown to have cytotoxic activity against various cancer cell lines (Shakeri, A .; Iranshahy, M .; Iranshahi, M.J. Asian.Nat.Prod.Res.2014,16,884-889; Rashidi, M .; Khalilnezhad, A .; Amani, D .; Jameshidi, H .; Bengalnejad, A .; A.J. Cell. Physiol. 2018, 233, 8908-8918; Jun, M .; Bay, AF; Moyer, J .; Webb, A .; Carrico-Moniz, D. Bioorganic Med.
  • Coumarin precursor is usually known that the RCM reaction is inferior in aqueous conditions, very little reactive coumarin derivative 1g (k cat / K M ⁇ 1) was unexpected.
  • precursor 1g the results of binding experiments have shown that a very low binding affinity (K D about 129MyuM) to albumin.
  • significantly higher activity of a hydrophobic prodrug 1h (at least 1500-fold compared to 1g higher k cat / K M), probably due to the long alkyl chain moiety of 1h to facilitate entry to the hydrophobic binding pocket To do.
  • Cell viability measurements were performed using CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) from Promega. Cultured cells in 96-well microplates Falcon (TM), seeded at a density of about 10 3 cells / well, and cultured overnight. The medium was then removed and compounds of various concentrations were added. DMSO was used to lyse the compound and the DMSO concentration was 1% upon addition to the cells. After 96 hours of incubation, the cell culture was replaced with 85 ⁇ L of fresh medium. Then, 15 ⁇ L of MTS reagent was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 2.5 hours, and then the absorbance was measured at 490 nm.
  • MTS CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay
  • FIG. 12 describes a synthesis scheme for an ArmM ethylene probe (AEP).
  • AEP ArmM ethylene probe
  • the fluorescence emitted by 7-diethylaminocoumarin (DEAC) itself is highly sensitive to the polarity of the surrounding solvent, and the quantum yield of DEAC-Ru is from a polar environment (10% dioxane / water) to a non-polar environment.
  • the change to the bottom (60% dioxane / water) increases about 20 times. Therefore, in this synthesis, AEP was synthesized based on the reaction between a DABCYL inactivating agent (quencher) containing an olefin and album-Ru.
  • quencher DABCYL inactivating agent
  • Preparation of AEP alb-Ru was prepared by mixing a 30 ⁇ M HSA solution (50 nmol, 167 ⁇ L from a 300 ⁇ M aqueous solution) and a 37 ⁇ M DEAC-Ru solution (62 nmol, 167 ⁇ L from a 370 ⁇ M dioxane solution).
  • the reaction solution was a PBS buffer solution having a pH of 7.4 containing 10% dioxane, and the total volume was 1670 ⁇ L. After initiation of the reaction with the addition of HSA, the reaction solution was gently stirred and incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • the reaction solution was then concentrated using an Amicon Ultra Centrifugal Filter (30 kDa) and washed 3 times with PBS buffer. Water was added to the concentrated alb-Ru solution and diluted to 50 ⁇ L to obtain a 1 mM stock solution.
  • a mixed solution of 100 ⁇ M alb-Ru solution (50 nmol, 50 ⁇ L from 1 ⁇ M aqueous solution) and 500 ⁇ M DABCYL quencher solution (250 nmol, 555 ⁇ M DMSO: water 1: 8 solution to 450 ⁇ L) was prepared. The reaction solution was gently stirred and incubated at 37 ° C. for 5 minutes.
  • reaction solution was then concentrated using an Amicon Ultra Centrifugal Filter (30 kDa) and washed 3 times with PBS buffer. Water was added to the concentrated AEP solution to dilute it to 500 ⁇ L to obtain a 100 ⁇ M stock solution.
  • the fluorescence intensity of the protein complex was measured using a JASCO FP-6500 Spectrofluorometer with a JASCO FMP-963 microplate reader.
  • alb-Ru and AEP were prepared in an aqueous solution at a concentration of 10 ⁇ M.
  • CD circular dichroism
  • the RuQ complex (DEAC-Ru-DABCYL complex) present in the albumin binding pocket has significantly lower fluorescence intensity due to the quencher, which is compared with the fluorescence intensity of alb-Ru and the AEP probe in FIG. Is also clear. Furthermore, since these circular dichroisms (CDs) completely overlapped, it was confirmed that no significant structural modification of the protein was observed (Fig. 14).
  • AEP Detection of Ethylene by AEP
  • the mechanism of ethylene detection by AEP is to replace ethylene with a DABCYL quencher by reacting it with a ruthenium catalyst in AEP and activate it into a fluorescent signal. Therefore, in this example, AEP was used for the detection of ethylene in fruits and plants.
  • Kiwifruit imaging Immature or aged kiwifruit was purchased at a grocery store. Kiwifruit fragments were prepared by cutting the kiwifruit into pieces approximately 2.0 cm x 4.5 cm with a kitchen knife in order to obtain fragments containing the outer pericarp, ovary, and pillar axis. To track ethylene production, 170 ⁇ L of AEP (400 ⁇ M solution) was poured into the center of a 10 cm petri dish. Subsequently, the sample was allowed to act on the AEP solution. Samples were incubated at room temperature and imaging was performed at specific times (after 1, 24 hours). For imaging, Keyence BZ-X710 All-in-one Fluorescence Spec.
  • Arabidopsis thaliana was grown in soil at 23 degrees Celsius with a light intensity of 85 ⁇ mol m- 2 s- 1 . A photoperiod was applied that brightened for 10 hours and darkened for 14 hours. To track ethylene production, leaves were first taken from plants for 4-6 weeks. The clear epidermis was then peeled from the leaves using forceps and placed on a 96-well clear bottom plate. After adding water (100 ⁇ L), the samples were incubated for 12 hours at room temperature to rule out the effects of wound stress.
  • the Col-0 ecotype of Arabidopsis thaliana was used as a wild-type model plant.
  • a wide variety of plant variants such as acs1 / 2/6/4/5/9/7/11 and eto1-1 were also used.
  • the mutant acs 1/2/6/4/5/9/7/11 is a mutant in which eight ACS genes are knocked out, and the amount of ethylene does not increase even when a pathogen invades. This is because ACS plays an important role in the ethylene biosynthetic pathway.
  • eto1-1 which overproduces ethylene, was used.
  • ETO1 ethylene-overexpression protein 1
  • proteasome-dependent degradation is suppressed and ACS activity is positively regulated. This is based on the interaction between the C-terminus of Type II ACS and ETO1.
  • FIG. 17 An imaging image of Col-0 incubated at room temperature with or without AEP is shown in FIG. As quantified in FIG. 17, a significant increase in fluorescence intensity was observed, confirming that AEP can be used to detect ethylene in the epidermis of Arabidopsis thaliana. As a positive control, it was compared to Col-0 (ethylene product) exogenously stimulated by ACC. As expected, it showed a higher increase in fluorescence intensity compared to wild-type Col-0.
  • glucosylated ArM can be used for selective cell tagging (SeCT) therapy to disrupt cancer cell adhesion at the single cell level, mimicking the dissemination process of micrometastases. I examined whether. Specifically, it was examined whether it can be achieved by selectively accumulating a GArM complex targeting HeLa in cancer cells and then selectively tagging surface proteins with cRGD.
  • the number of bound sugar chains was confirmed using MALDI-TOF-MS (possive mode), whereby the molecular weight of sugar chain albumin (85.8 kDa) in which 6.2 molecules of sugar chains were bound per molecule of albumin. was detected.
  • a PBS buffer solution (60.6 ⁇ L, pH 7.4) of a sugar chain albumin solution (66.7 nmol) is mixed with a DMSO solution (6.1 ⁇ L) of a coumarin-gold complex (66.7 nmol). added.
  • the solution was gently stirred and incubated at 37 ° C. for 1 hour, then the solution was concentrated using an Amicon ultracentrifugal filter (30 kDa) and washed with PBS buffer to give the desired GARM complex.
  • HeLa cancer cells are known to overexpress RGD-specific integrins ( ⁇ 5 ⁇ 1 , ⁇ v ⁇ 3 , ⁇ v ⁇ 5 ), HeLa cells were selected as a model in this study. HeLa cells used were those provided by the Cell Culture Development Office of RIKEN.
  • HeLa cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • FBS heat-inactivated fetal bovine serum
  • HeLa-Luc cell lines were generated by stable transfection of HeLa cells with firefly luciferase and puromycin acetyltransferase cultured in DMEM containing 10% FBS and 0.01% puromycin.
  • HeLa-V cell lines were generated by stable transfection of HeLa cells with DMEM-cultured firefly luciferase and Venus (V) containing 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, and 0.8% geneticin. All cell lines were grown in a 37 ° C.
  • mice were collected from the abdominal cavity of BALB / c-nu / nu mice.
  • Flow cytometry and cell sorting were performed by a general method using Sony SH800 Cell Sorter (Sony Corporation).
  • Adhering cells were quantified using the commercially available MTS assay, CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega).
  • the HeLa cells used in this experiment were made serum-free 16 hours before the experiment by exchanging the growth medium with DMEM (serum-free). Subsequently, cells were subcultured to a concentration of a stock solution of 6x10 5 call / mL, to remove residual trypsin by further centrifugation. HeLa cells (360 ⁇ L from cell stock solution), cRGD-PE (0, 160, 320, 640, 1280, 2560, 5120, 10240 ⁇ M from stock solution 45 ⁇ L), and GARM (400 ⁇ M PBS buffered 45 ⁇ L).
  • the PBS buffer solution was intermittently pipette up and down to remove non-specific binding cells.
  • 100 ⁇ L DMEM (10% FBS + 1% penicillin-streptomycin) and 20 ⁇ L MTS reagent were added. After incubating at 37 ° C. for 4 hours, the absorbance at the end point at 490 nm was obtained using a SpectraMax iD3 multi-mode microplate reader (Molecular Devices, USA).

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Abstract

【課題】　本発明は、生体内物質からの触媒の保護を可能にし、生体内合成化学治療に対する潜在的有用性を有する新規な人工タンパク質触媒を提供することを目的とする。　【解決手段】　タンパク質と金属触媒または有機触媒から選択される触媒との複合体が提供される。本発明の複合体において、前記タンパク質は、その立体構造内に疎水性スポットを有するタンパク質であり、前記触媒が親水性環境に暴露されないまたは実質的に暴露されないように、前記触媒が前記疎水性スポット内に収容される。

Description

新規な人工タンパク質触媒
　本発明は、新規な人工タンパク質触媒に関する。
　現在、触媒を利用した「生体内合成化学治療」に関する試みが検討されている。生体内合成化学治療は、活性や毒性のない原料または試薬を体内に導入して、体内の特定の場所で当該原料または試薬を触媒によって活性化して、効果を発現させるコンセプトである。そのような中、治療用途に適用可能な新たな触媒の開発に関する関心が高まっている（非特許文献１）。
　そのような触媒の開発における障壁の１つは、生体内物質からの触媒の保護である。例えば、金属触媒（ｍｅｔａｌｌｏｅｎｚｙｍｅ）である金（Ａｕ）、パラジウム（Ｐｄ）、およびルテニウム（Ｒｕ）などは、細胞内で０．５～１０ｍＭ、また血漿中で約２～２０μＭの範囲で存在するチオール含有グルタチオン（ＧＳＨ）に曝されると、急速に失活することが知られている。
　現時点では、多くの研究において、人工金属酵素または金属触媒錯体のいずれかを介して、細胞またはゼブラフィッシュなどの哺乳動物以外のモデルでのみしか触媒反応の検討が行われていない（非特許文献２～１７）。
Ｒｅｂｅｌｅｉｎ，Ｊ．Ｇ．；Ｗａｒｄ，Ｔ．Ｒ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１８，５３，１０６－１１４． Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ａｓｋｅｖｏｌｄ，Ｂ．；Ｍｉｋｕｌａ，Ｈ．；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｒ．Ｈ．；Ｐｉｒｏｖｉｃｈ，Ｄ．；Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，Ｒ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７，８，１５９０６． Ｃｌａｖａｄｅｔｓｃｈｅｒ，Ｊ．；Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｓ．；Ｌｉｌｉｅｎｋａｍｐｆ，Ａ．；Ｍａｃｋａｙ，Ｌ．；Ｙｕｓｏｐ，Ｒ．Ｍ．；Ｒｉｄｅｒ，Ｓ．Ａ．；Ｍｕｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｊ．；Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｍ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２０１６，５５，１５６６２－１５６６６． Ｃｌａｖａｄｅｔｓｃｈｅｒ，Ｊ．；Ｉｎｄｒｉｇｏ，Ｅ．；Ｃｈａｎｋｅｓｈｗａｒａ，Ｓ．Ｖ．；Ｌｉｌｉｅｎｋａｍｐｆ，Ａ．；Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｍ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２０１７，５６，６８６４－６８６８． Ｗｅｉｓｓ，Ｊ．Ｔ．；Ｄａｗｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．；Ｍａｃｌｅｏｄ，Ｋ．Ｇ．；Ｒｙｂｓｋｉ，Ｗ．；Ｆｒａｓｅｒ，Ｃ．；Ｔｏｒｒｅｓ－Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｃ．；Ｐａｔｔｏｎ，Ｅ．Ｅ．；Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｍ．；Ｃａｒｒａｇｈｅｒ，Ｎ．Ｏ．；Ｕｎｃｉｔｉ－Ｂｒｏｃｅｔａ，Ａ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１４，５，３２７７． Ｐeｒｅｚ－Ｌoｐｅｚ，Ａ．Ｍ．；Ｒｕｂｉｏ－Ｒｕｉｚ，Ｂ．；Ｓｅｂａｓｔｉaｎ，Ｖ．；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｌ．；Ａｄａｍ，Ｃ．；Ｂｒａｙ，Ｔ．Ｌ．；Ｉｒｕｓｔａ，Ｓ．；Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｐ．Ｍ．；Ｌｌｏｙｄ－Ｊｏｎｅｓ，Ｇ．Ｃ．；Ｓｉｅｇｅｒ，Ｄ．；Ｓａｎｔａｍａｒｉａ，Ｊ．；Ｕｎｃｉｔｉ－Ｂｒｏｃｅｔａ，Ａ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２０１７，５６，１２５４８－１２５５２． Ｂｒａｙ，Ｔ．Ｌ．；Ｓａｌｊｉ，Ｍ．；Ｂｒｏｍｂｉｎ，Ａ．；Ｐｅｒｅｚ－Ｌｏｐｅｚ，Ａ．Ｍ．；Ｒｕｂｉｏ－Ｒｕｉｚ，Ｂ．；Ｇａｌｂｒａｉｔｈ，Ｌ．Ｃ．Ａ．；Ｐａｔｔｏｎ，Ｅ．Ｅ．；Ｌｅｕｎｇ，Ｈ．Ｙ．；Ｕｎｃｉｔｉ－Ｂｒｏｃｅｔａ，Ａ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０１８，９，７３５４－７３６１． Ｌｉｕ，Ｙ．；Ｐｕｊａｌｓ，Ｓ．；Ｓｔａｌｓ，Ｐ．Ｊ．Ｍ．；Ｐａｕｌｏｈｒｌ，Ｔ．；Ｐｒｅｓｏｌｓｋｉ，Ｓ．Ｉ．；Ｍｅｉｊｅｒ，Ｅ．Ｗ．；Ａｌｂｅｒｔａｚｚｉ，Ｌ．；Ｐａｌｍａｎｓ，Ａ．Ｒ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１８，１４０，３４２３－３４３３． Ｌｉ，Ｊ．；Ｙｕ，Ｊ．；Ｚｈａｏ，Ｊ．；Ｗａｎｇ，Ｊ．；Ｚｈｅｎｇ，Ｓ．；Ｌｉｎ，Ｓ．；Ｃｈｅｎ，Ｌ．；Ｙａｎｇ，Ｍ．；Ｊｉａ，Ｓ．；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．；Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｒ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．２０１４，６，３５２－３６１． Ｖｉｄａｌ，Ｃ．；Ｔｏｍａｓ－Ｇａｍａｓａ，Ｍ．；Ｄｅｓｔｉｔｏ，Ｐ．；Ｌｏｐｅｚ，Ｆ．；Ｍａｓｃａｒｅｎａｓ，Ｊ．Ｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１８，９，１９１３． Ｄｅｓｔｉｔｏ，Ｐ．；Ｓｏｕｓａ－Ｃａｓｔｉｌｌｏ，Ａ．；Ｃｏｕｃｅｉｒｏ，Ｊ．Ｒ．；Ｌｏｐｅｚ，Ｆ．；Ｃｏｒｒｅａ－Ｄｕａｒｔｅ，Ｍ．Ａ．；Ｍａｓｃａｒｅｎａｓ，Ｊ．Ｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０１９，１０，２５９８－２６０３． Ｔｏｎｇａ，Ｇ．Ｙ．；Ｊｅｏｎｇ，Ｙ．；Ｄｕｎｃａｎ，Ｂ．；Ｍｉｚｕｈａｒａ，Ｔ．；Ｍｏｕｔ，Ｒ．；Ｄａｓ，Ｒ．；Ｋｉｍ，Ｓ．Ｔ．；Ｙｅｈ，Ｙ．－Ｃ．；Ｙａｎ，Ｂ．；Ｈｏｕ，Ｓ．；Ｒｏｔｅｌｌｏ，Ｖ．Ｍ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．２０１５，７，５９７－６０３． Ｓｔｒｅｕ，Ｃ．；Ｍｅｇｇｅｒｓ，Ｅ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２００６，４５，５６４５－５６４８． Ｖｏｌｋｅｒ，Ｔ．；Ｄｅｍｐｗｏｌｆｆ，Ｆ．；Ｇｒａｕｍａｎｎ，Ｐ．Ｌ．；Ｍｅｇｇｅｒｓ，Ｅ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２０１４，５３，１０５３６－１０５４０． Ｔｏｍａｓ－Ｇａｍａｓａ，Ｍ．；Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｃａｌｖｏ，Ｍ．；Ｃｏｕｃｅｉｒｏ，Ｊ．Ｒ．；Ｍａｓｃａｒｅｎａｓ，Ｊ．Ｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６，７，１２５３８． Ｙｕｓｏｐ，Ｒ．Ｍ．；Ｕｎｃｉｔｉ－Ｂｒｏｃｅｔａ，Ａ．；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．Ｖ．；Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．；Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｍ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．２０１１，３，２３９－２４３． Ｕｎｃｉｔｉ－Ｂｒｏｃｅｔａ，Ａ．；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｅ．　Ｍ．Ｖ．；Ｙｕｓｏｐ，Ｒ．Ｍ．；Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｍａｒｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．；Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｍ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２，７，１２０７－１２１８．
　本発明は、生体内物質からの触媒の保護を可能にし、生体内合成化学治療に対する潜在的有用性を有する新規な人工タンパク質触媒を提供することを目的とする。
　ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、血漿中に豊富に存在する６６．５ｋＤａのタンパク質で、血清中での半減期は約１９日間であることが知られている（Ｐｅｔｅｒｓ，Ｔ．，Ｊｒ．Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍ．１９８５，３７，１６１－２４５．）。ＨＳＡは、さまざまなホルモン、脂肪酸、および低分子薬剤に対するキャリアタンパク質であることが知られており、多種類のリガンドに対する、メジャー結合サイトおよびマイナー結合サイトがＨＳＡに複数存在することが確認されている（Ｇｈｕｍａｎ，Ｊ．；Ｚｕｎｓｚａｉｎ，Ｐ．Ａ．；Ｐｅｔｉｔｐａｓ，Ｉ．；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ａ．Ａ．；Ｏｔａｇｉｒｉ，Ｍ．；Ｃｕｒｒｙ，Ｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５，３５３，３８－５２．）。
　本発明者らは、生体適合性の人工タンパク質触媒を設計するために、タンパク質としてＨＳＡを選択し、ＨＳＡの疎水性結合ポケットに金属触媒を収容することを検討した。そして、触媒として金属触媒であるルテニウムを用い、クマリン誘導体（ワルファリンなど）との結合（相互作用）が知られているアルブミン薬物結合サイトＩに、金属触媒を固定したところ、インビトロ条件下、２０ｍＭ　ＧＳＨの存在下でさえ、結合したルテニウムの触媒活性を保護することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下の特徴を包含する：
　［１］　タンパク質と金属触媒または有機触媒から選択される触媒との複合体であって、
　前記タンパク質は、その立体構造内に疎水性スポットを有するタンパク質であり、
　前記複合体は、前記触媒が親水性環境に暴露されないまたは実質的に暴露されないように、前記触媒を前記疎水性スポット内に収容する、
複合体。
　［２］　［１］に記載の複合体であって、
　前記タンパク質は、天然のまたは人工のタンパク質である、
複合体。
　［３］　［１］または［２］に記載の複合体であって、
　前記タンパク質は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、トランスフェリン、アンチトリプシン、ハプトグロビン、α１－酸性糖タンパク質、ミオフェルリン（Ｍｙｏｆｅｒｌｉｎ）、Ｔｒｋ受容体、エストロゲン受容体、および葉酸受容体からなる群より選択される、
複合体。
　［４］　［１］から［３］のいずれかに記載の複合体であって、
　前記金属触媒は、ホウ素触媒、マグネシウム触媒、アルミニウム触媒、ケイ素触媒、カルシウム触媒、スカンジウム触媒、チタン触媒、バナジウム触媒、クロム触媒、マンガン触媒、鉄触媒、コバルト触媒、ニッケル触媒、銅触媒、亜鉛触媒、イットリウム触媒、ジルコニウム触媒、ニオブ触媒、モリブデン触媒、ルテニウム触媒、ロジウム触媒、パラジウム触媒、銀触媒、インジウム触媒、スズ触媒、バリウム触媒、ハフニウム触媒、タングステン触媒、レニウム触媒、オスミウム触媒、イリジウム触媒、白金触媒、金触媒、およびランタノイドルイス酸触媒からなる群より選択される、
複合体。
　［５］　［４］に記載の複合体であって、
　前記ランタノイドルイス酸触媒は、イットリビユム触媒、ランタン触媒、セリウム触媒、サマリウム触媒、ユーロピウム触媒、ガドリニウム触媒、テルビウム触媒、ツリウム触媒、およびルテチウム触媒からなる群より選択される、
複合体。
　［６］　［１］から［５］のいずれかに記載の複合体であって、
　前記タンパク質は、ヒト血清アルブミンであり、
　前記触媒が金属触媒である、
複合体。
　［７］　［６］に記載の複合体であって、
　前記金属触媒は、ルテニウム触媒である、
複合体。
　［８］　［６］または［７］に記載の複合体であって、
　前記ヒト血清アルブミンの疎水性スポットは、アルブミン薬物結合サイトＩ（ｄｒｕｇ　ｓｉｔｅ　Ｉ）である、
複合体。
　［９］　［６］から［８］のいずれかに記載の複合体であって、
　前記金属触媒は、ヒト血清アルブミンに対するリガンドを介して前記疎水性スポットに結合している、
複合体。
　［１０］　［９］に記載の複合体であって、
　前記リガンドは、ワルファリン、アザプロパゾン、アセノクマロール、フェニルブタゾン、サリチル酸塩、インドメタシン、フェニトイン、トルブタミド、クロルプロパミド、イオフェノキサート、ヨジパミド、スルファジメトキシン、フェノプロクソモン、グリベンクラミド、スルファチアゾール、テノキシカム、カンプトテシン、バルジデンデアジ、アンデレラタン、ジアデレアル、アンデレラタン、ジアデレアル、アンデレラタン、ジアデレアルタン、プロダン、ビリルビン、エイコサノイド、およびカルボキシ－メチル－プロピル－フランプロパノエート（尿毒症毒素）、およびクマリンからなる群より選択される、
複合体。
　［１１］　［９］または［１０］に記載の複合体であって、
　前記金属触媒は、前記リガンドに結合したリンカーを介して前記疎水性スポットに結合している、
複合体。
　［１２］　［１１］に記載の複合体であって、
　前記リンカーは、両末端にアミノ基およびカルボキシル基を有する、アルキル鎖またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である、
複合体。
　［１３］　［１２］に記載の複合体であって、
　前記リンカーは、Ｃ１～Ｃ３アルキルまたは重合度１～３のＰＥＧ鎖である
複合体。
　［１４］　［１］から［１３］のいずれかに記載の複合体であって、
　前記タンパク質の表面が生体内の標的部位と相互作用するように修飾される、
複合体。
　［１５］　［１４］に記載の複合体であって、
　前記修飾は、糖鎖による修飾である、
複合体。
　［１６］　［１］から［１３］のいずれかに記載の複合体であって、
　前記タンパク質が、生体内の標的部位と相互作用する部分をさらに含む、
複合体。
　［１７］　［１４］または［１５］に記載の複合体であって、
　前記タンパク質は、ヒト血清アルブミンである、
複合体。
　［１８］　［１］から［１７］のいずれかに記載の複合体を含む組成物。
　［１９］　薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物である、［１８］に記載の組成物。
　［２０］　［１９］に記載の組成物であって、
　前記複合体によって活性化され得るプロドラッグと組み合わせて使用される、
組成物。
　［２１］　［１９］に記載の組成物であって、
　前記複合体によって活性化され得るプロドラッグをさらに含む、
組成物。
　［２２］　［１９］に記載の組成物であって、
　特定の細胞を選択的にタギングするために用いられる、
組成物。
　［２３］　［２２］に記載の組成物であって、
　前記細胞にタギングされる化学物質と組み合わせて投与される、
組成物。
　［２４］　［１８］に記載の組成物であって、
　バイオセンサーとして使用される、
組成物。
　［２５］　［１８］に記載の組成物であって、
　エチレンを検出するためのバイオセンサーとして使用される、
組成物。
　［２６］　プロドラッグを含む医薬組成物であって、
　前記プロドラッグは、［１］から［１７］のいずれかに記載の複合体によって活性化され得るものであり、
　前記医薬組成物は、［１］から［１７］のいずれかに記載の複合体と組み合わせて使用される、
医薬組成物。
　［２７］　組み合わせ医薬であって、
　［１］から［１７］のいずれかに記載の複合体を含む第１の薬剤と、
　前記複合体によって活性化され得るプロドラッグを含む第２の薬剤と
を含む、組み合わせ医薬。
　以上述べた本発明の一または複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれることを、当業者であれば理解するであろう。
　本発明によれば、生体内物質からの触媒の保護を可能にする、新規な人工タンパク質触媒が提供される。
図１は、ルテニウム触媒Ｒｕ１－３、６とＨＳＡとの反応によって得られた産物の蛍光アッセイ結果を示す。 図２は、ＨＳＡとワルファリンまたはイブプロフェンとの反応後に、ルテニウム触媒Ｒｕ１－３、６との反応を行った際の飽和結合曲線を示す。 図３は、本願実施例で用いた、ａｌｂ－Ｒｕ複合体の触媒能力を試験するための実験系を示す。 図４は、異なる条件における、ａｌｂ－Ｒｕ複合体の触媒能力の評価結果を示す。 図５は、異なる条件における、ａｌｂ－Ｒｕ複合体の触媒能力の評価結果を示す。 図６は、ＡｒＭ活性（人工金属酵素活性）に関して、ＧＳＨの存在下または非存在下での、基質１ａ－ｅのミカエリス－メンテンのカイネティック（速度論的）パラメーターを示す。 図７は、ルテニウム触媒Ｒｕ１－３，６が、ヒト血清アルブミン（ＰＤＢ：１Ｈ９Ｚ）にドッキングされる際の分子モデリングを示す。 図８は、ＧＡｒＭ－Ｒｕ１（２，３－Ｓｉａ）がＳＷ６２０ヒト結腸腺癌細胞によりよく蓄積することを示す細胞イメージングの結果である。 図９は、ＧＡｒＭ－Ｒｕ１（２，３－Ｓｉａ）の蓄積に関する、ＳＷ６２０ヒト結腸腺癌細胞、ＨｅＬａヒト子宮頸癌由来細胞およびＡ５４９ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞間での比較を示す。 図１０は、ＧＡｒＭ－Ｒｕ複合体によるプロドラッグ１ｇおよび１ｈの活性化に関する速度論的実験を示す。 図１１は、癌細胞株に対する、プロドラッグ、プロドラッグおよびａｌｂ－Ｒｕ１、またはプロドラッグおよびＧＡｒＭ－Ｒｕ１による細胞増殖抑制効果の比較を示す。 図１２は、ＡｒＭエチレンプローブ（ＡＥＰ）の合成スキームを示す。 図１３は、ＡＥＰプローブと比較したａｌｂ－Ｒｕ化合物の観測された蛍光強度を示す。 図１４は、この研究における様々なタンパク質化合物の折り畳み構造の変化を調べるための、ＣＤスペクトルの比較を示す。 図１５は、ＡＥＰを用いたキウイフルーツの異なる発達段階（未熟成と熟成）における様々な小器官（外側の果皮や子房室、柱軸）に発現するエチレン生産量の変化を観測した結果を示す。サンプル数は、外側の果皮（ｎ＝２４）、子房室（ｎ＝２）、柱軸（ｎ＝４）であり、統計分析は１対のサンプルのｔ－ｔｅｓｔを用いて行った。＊Ｐ＜０．０３、＊＊Ｐ＜０．００２、＊＊＊Ｐ＜０．０００２、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓ＝重要でない部分。 図１６は、野生型Ｃｏｌ－０（ｂ）の、ＡＥＰ（１００μＭ）を作用させた表皮の蛍光強度と明視野顕微鏡でのイメージング画像（４０倍拡大）、およびエチレン生合成促進剤であるＡＣＣ（１ｍＭ）をさらに添加して検出した結果を示す。 図１７は、ＡＣＣ添加によりシロイヌナズナから生産されるエチレンの量を蛍光強度で観察した結果を示す。全ての値は３組の実験で得られた。統計分析はテューキーの多重比較検定の一元配置分散分析を用いて行った。＊Ｐ＜０．０３、＊＊Ｐ＜０．００２、＊＊＊Ｐ＜０．０００２、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓ＝重要でない部分。 図１８は、ＧＡｒＭで処理したＨｅＬａ細胞と処理しなかったＨｅＬａ細胞のフローサイトメトリー結果の比較を示す。 図１９は、ＧＡｒＭで処理したマウス腹腔由来マクロファージと処理しなかったマウス腹腔由来マクロファージのフローサイトメトリー結果の比較を示す。 図２０は、ＧＡｒＭで処理したＨｅＬａ細胞およびマウス腹腔由来マクロファージ、ならびにＧＡｒＭで処理しなかったＨｅＬａ細胞およびマウス腹腔由来マクロファージ、のフローサイトメトリー結果の比較を示す。なお、左上図および左下図のＱ３の値は、それぞれ９９．０９％および４３．０６％である。 図２１は、実施例８で行った細胞接着アッセイの結果を示す。
　本発明は、新規な人工タンパク質触媒に関する。具体的に、本発明に係る人工タンパク質触媒は、タンパク質と金属触媒または有機触媒から選択される触媒との複合体（以下、「本発明の複合体」とも称する。）である。
　本発明の複合体は、その立体構造内に疎水性スポットを有するタンパク質の前記疎水性スポット内に、親水性環境に暴露されないまたは実質的に暴露されないように触媒を収容する構成によって特徴付けることができる。すなわち、本発明の複合体は、触媒の親水性環境への暴露または実質的暴露を回避することによって、生体内物質から触媒を保護することができる。本発明の複合体は、タンパク質に存在する疎水性スポットのうちの１カ所のみに触媒を収容していてもよいし、複数箇所（またはすべて）に触媒を収容していてもよい。
　本発明の複合体はまた、触媒の親水性環境への暴露または実質的暴露を回避する構成を有している一方、当該構成を有していてもなお、触媒が対象とする反応を促進し得ることによっても特徴付けることができる。すなわち、本発明の複合体は、好ましい実施形態において、触媒を生体内物質から保護しつつ、生体内で所望の活性を発揮し得る。
　本発明において、「触媒が親水性環境に実質的に暴露されない」とは、親水性環境からの触媒の保護が認められる限度で親水性環境への暴露が許容されることを指す。「親水性環境からの触媒の保護が認められる」は、フリーの触媒を生体内環境に暴露した場合に比較して、本発明の複合体に収容された触媒の活性が同一環境下でより長期に維持されることを指し、例えば、代謝回転（ＴＯＮ）によって評価することができる。暴露が許容される程度は、使用する触媒の種類、または組み合わせて使用されるタンパク質の種類などによって変化し得る。
　本発明の一実施形態において、「触媒が親水性環境に実質的に暴露されない」は、タンパク質の疎水性スポットに収容された際の触媒の相対溶媒接近可能表面積(ＳＡＳＡ)が、５．０以下、好ましくは４．０以下、より好ましくは３．５以下、より好ましくは３．０以下、より好ましくは２．５以下、より好ましくは２．０以下、より好ましくは、１．５以下、より好ましくは１．０以下、より好ましくは０．９以下、より好ましくは０．８以下、より好ましくは０．７以下、より好ましくは０．６以下、より好ましくは０．５以下、より好ましくは０．４以下、より好ましくは０．３以下、より好ましくは０．２以下、またはより好ましくは０．１以下であることを意味する。
　本発明の別の実施形態において、「触媒が親水性環境に実質的に暴露されない」は、触媒の表面積全体の、５０％以上、好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、またはより好ましくは９９％以上が、タンパク質の疎水性スポット内部に収容されることを意味する。あるいは、「触媒が親水性環境に実質的に暴露されない」は、親水性環境に対する触媒の露出面積が、触媒の表面積全体の、５０％以下、好ましくは４５％以下、より好ましくは４０％以下、より好ましくは３５％以下、より好ましくは３０％以下、より好ましくは２５％以下、より好ましくは２０％以下、より好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、より好ましくは４％以下、より好ましくは３％以下、より好ましくは２％以下、またはより好ましくは１％以下であることを意味する。
　本発明の複合体に使用することができるタンパク質は、触媒の収容を可能にする１つ以上の疎水性スポットを有する限り制限されず、天然または人工のタンパク質を用いることができる。人工のタンパク質には、天然のタンパク質の一部に人工的に変異を導入した変異タンパク質を挙げることができる。
　一実施形態において、本発明の複合体に使用されるタンパク質は、その疎水性スポットのいずれかに対して結合または相互作用するリガンドの入手が容易なタンパク質である。そのようなタンパク質は、リガンドを介した触媒の複合体化を容易にする点で好ましい場合がある。
　具体的な実施形態において、本発明の複合体に使用されるタンパク質は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、トランスフェリン、アンチトリプシン、ハプトグロビン、およびα１－酸性糖タンパク質などから選択されるタンパク質である。これらのタンパク質は、血液中を自由に移動可能なタンパク質であるため、ドラッグデリバリーシステムに適していると考えられる。さらに別の具体的な実施形態において、本発明の複合体に使用されるタンパク質は、ミオフェルリン（Ｍｙｏｆｅｒｌｉｎ）、Ｔｒｋ受容体、エストロゲン受容体、および葉酸受容体などから選択されるタンパク質である。これらのタンパク質は、がん細胞で多く発現することが知られているため、これに対するリガンドおよび金属を配位させることで、癌を直接的に死滅させることが可能な複合体の製造が可能であると考えられる。
　本発明の複合体に使用することができる有機触媒または金属触媒は、特に制限されず、当業者が任意に選択することができる。一実施形態において、本発明の複合体に使用することができる有機触媒または金属触媒は、所与のプロドラッグを活性型に変更する活性を有するものである。
　例えば、本発明の複合体に使用される有機触媒として、これに限定されるものではないが、プロリン誘導体、四級アンモニウム塩誘導体を基盤とする相間移動触媒、チオ尿素誘導体、チアゾリウム塩やイミダゾリウム塩から得られるＮ－ヘテロサイクリックカルベン誘導体、環状ケトン誘導体、４－ジメチルアミノピリジン誘導体、アミノ酸を代表とする二級アミンなどを挙げることがきる。
　例えば、本発明の複合体に使用される金属触媒として、これに限定されるものではないが、ホウ素触媒、マグネシウム触媒、アルミニウム触媒、ケイ素触媒、カルシウム触媒、スカンジウム触媒、チタン触媒、バナジウム触媒、クロム触媒、マンガン触媒、鉄触媒、コバルト触媒、ニッケル触媒、銅触媒、亜鉛触媒、イットリウム触媒、ジルコニウム触媒、ニオブ触媒、モリブデン触媒、ルテニウム触媒、ロジウム触媒、パラジウム触媒、銀触媒、インジウム触媒、スズ触媒、バリウム触媒、ハフニウム触媒、タングステン触媒、レニウム触媒、オスミウム触媒、イリジウム触媒、白金触媒、金触媒、およびランタノイドルイス酸触媒などを挙げることができる。また、前記ランタノイドルイス酸触媒として、これに限定されるものではないが、イットリビユム触媒、ランタン触媒、セリウム触媒、サマリウム触媒、ユーロピウム触媒、ガドリニウム触媒、テルビウム触媒、ツリウム触媒、およびルテチウム触媒などを挙げることができる。
　タンパク質の疎水性スポットに触媒を収容させるための手段としては、例えば、前記疎水性スポットと相互作用するまたは結合するリガンドを介して疎水性スポット内に触媒を結合する手法を挙げることができる。この場合、リガンドと触媒（例えば金属触媒）との連結には、適宜ペプチド、炭化水素鎖、ＰＥＧなどのリンカーを用いることができる。使用するリンカーの長さは、触媒が疎水性スポット内に収容され、親水性環境から暴露されないまたは実質的に暴露されない長さとするべきである。すなわち、疎水性スポット、これと相互作用するリガンド、および使用される触媒のサイズに対して、使用されるリンカーが長すぎる場合には、リンカーおよびリガンドを介して触媒を疎水性スポットに結合する際に、触媒が疎水性スポット内に収まらず、その一部または全部が疎水性スポットから親水性環境に暴露し、親水性環境に対する十分な保護が得られない可能性がある。
　タンパク質の疎水性スポットに触媒を収容させるための別の手段としては、例えば、タンパク質の疎水性ポケット内またはその近位に存在するシステインまたはリジンの側鎖官能基（それぞれチオール基およびアミノ基）に対して、マレイミドまたはスクシンイミドを作用させて活性化し、触媒と共有結合させる手法を挙げることができる。
　タンパク質の疎水性スポットに触媒を収容させるためのさらに別の手段としては、疎水性ポケットを構成するアミノ酸配列の特定の位置に突然変異を導入して二重結合またはアジドを導入し、メタセシスやクリック反応を行って、触媒と共有結合させる手法を挙げることができる（Ｙｏｕｎｇ　ＴＳ，Ａｈｍａｄ　Ｉ，Ｂｒｏｃｋ　Ａ，Ｓｃｈｕｌｔｚ　ＰＧ．，Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｙｅａｓｔ　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００９．４８（１２）：２６４３－５３．；Ｗａｎｇ　Ｌ，Ｓｃｈｕｌｔｚ　ＰＧ．，Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｃｏｄｅ．，Ａｎｇｅｗ　Ｃｈｅｍ　Ｉｎｔ　Ｅｄ　Ｅｎｇｌ．２００４．　４４（１）：３４－６６．）。この場合、触媒（例えば金属触媒）として、ペプチドまたはＰＥＧなどのリンカーを有する触媒を使用することができる。
　一実施形態において、本発明の複合体は、生体内の標的部位と相互作用するように修飾される。これにより、本発明の複合体が生体内の所望の部位に誘導される／または所望の部位を標的化することができる。この関連で、「生体内の標的部位と相互作用する」とは、生体内の他の部位と比較して、有意に強い指向性で標的部位に集積または典型的には結合することを意味し得る。本発明において、標的部位は、特定の臓器もしくは器官、または特定の細胞腫などであり得る。
　そのような修飾として、例えば、糖鎖修飾を挙げることができる。例えば、アスパラギン結合型糖鎖（Ｎ－結合型糖鎖）は、タンパク質修飾に用いることで、その糖鎖のクラスターおよび／または結合数に応じて、特定の臓器への指向性が変化することが知られている（Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４９，８１９５－８２００（２０１０）；Ｌａｔｙｐｏｖａ，Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．，Ａｄｖ．Ｓｃｉ．，１６００３９４（２０１７）；Ｏｇｕｒａ，Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，５４，８６９３－８６９６（２０１８）；Ｔａｉｃｈｉ，Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ａｄｖ．Ｓｃｉ．，１７００１４７（２０１７））。例えば、末端にシアル酸を有する糖鎖は肝臓に、または末端にガラクトースを有する糖鎖は腸管に速やかに到達することが知られている。したがって、選択された生体内標的部位に応じて、適切な糖鎖構造および糖鎖数で本発明の複合体を修飾することで、前記標的部位への指向性が高められた複合体とすることができる。
　一実施形態において、糖鎖修飾として、例えば、様々な種類のがんに相互作用するシアル酸、ガラクトサミン、ガラクトース、またはマンノースを非還元末端に有する糖鎖を複数個（例えば５～３０個）用いることができる。代替的な実施形態において、糖鎖修飾として、フコースを有する糖鎖を用いることができる。当該実施形態において、修飾する複数個の糖鎖は同種類であっても複数種類であってもよく、各糖鎖のサイズは、１糖から２５糖の範囲とすることができる。
　別の実施形態において、糖鎖修飾として、例えば、肝臓、膵臓、腸管、胆嚢、膀胱、または脳内などの特定の臓器に選択的に移行するシアル酸、ガラクトサミン、ガラクトース、またはマンノースを非還元末端に有する糖鎖を複数個（例えば５～３０個）用いることができる。当該実施形態において、修飾する複数個の糖鎖は同種類であっても複数種類であってもよく、であってもよく、各糖鎖のサイズは、１糖から２５糖の範囲とすることができる。
　修飾部位は、典型的には、前記複合体のタンパク質表面である。タンパク質表面の特定部位を糖鎖修飾する方法は、当業者に公知であり、いずれの方法を用いて行ってもよい。本発明においては、例えば、国際公開第２００８／０９６７６０号、日本国特許第６３２７５４７号、国際公開第２０１７／００２９１８号などに記載されるクリック反応によって、タンパク質表面に糖鎖修飾を導入することができる。
　別の実施形態において、本発明の複合体は、生体内の標的部位と相互作用する部分をさらに含む。この関連で、「標的部位と相互作用する」とは、他の部位と比較して、有意に強い指向性で標的部位に集積または典型的には結合することを意味し得る。本発明において、標的部位は、特定の臓器もしくは器官、または特定の細胞腫などであり得る。
　本発明において、「生体内の標的部位と相互作用する部分」は、抗体またはそのフラグメント、ペプチドリガンドまたはその断片、ＤＮＡやＲＮＡ、あるいはｐＮＡ（ペプチド核酸）またはその断片などであり得る。この関連で、「生体内の標的部位と相互作用する部分」は、例えば、複合体に用いられるタンパク質との融合タンパク質として製造してもよいし、複合体に用いられるタンパク質と「生体内の標的部位と相互作用する部分」とを別々に調製し、当業者に公知の手段によって結合（例えば共有結合）させてもよい。
　具体的な実施形態において、本発明は、タンパク質と金属触媒との複合体である人工金属酵素（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｍｅｔａｌｌｏｅｎｚｙｍｅ；ＡｒＭ）に関する。好ましい実施形態において、本発明のＡｒＭは、ＨＳＡと金属触媒との複合体であって、前記複合体は、金属触媒が親水性環境に暴露されないまたは実質的に暴露されないように、金属触媒をＨＳＡの疎水性スポットに収容することを特徴とする。
　この実施形態において、ＨＳＡと共に使用される金属触媒は、例えば活性化の対象となるプロドラッグの種類などに応じて、当業者が適宜選択することができる。本発明の一実施形態において、ＨＳＡと共に使用される金属触媒はルテニウムである。
　この実施形態において、金属触媒を収容するＨＳＡの疎水性スポットは、特に制限されず、１つの疎水性スポットが金属触媒を収容してもよいし、複数の疎水性スポットが金属触媒を収容してもよい。ＨＳＡの疎水性スポットとしては、アルブミン薬物結合サイトＩおよびアルブミン薬物結合サイトＩＩを挙げることができる。一実施形態において、本発明の複合体は、ＨＳＡのアルブミン薬物結合サイトＩに金属触媒を収容する。
　この実施形態においては、金属触媒とＨＳＡに対するリガンドとを連結し、前記リガンドを介して疎水性スポット内に金属触媒を結合させることによって、ＨＳＡの疎水性スポットに金属触媒を収容させることができる。この目的に使用することができるリガンドは、金属触媒を収容する疎水性スポットに応じて変化しうる。例えば、ＨＳＡのアルブミン薬物結合サイトＩに金属触媒を収容させる場合には、前記リガンドとして、ワルファリン、アザプロパゾン、アセノクマロール、フェニルブタゾン、サリチル酸塩、インドメタシン、フェニトイン、トルブタミド、クロルプロパミド、イオフェノキサート、ヨジパミド、スルファジメトキシン、フェノプロクソモン、グリベンクラミド、スルファチアゾール、テノキシカム、カンプトテシン、バルジデンデアジ、アンデレラタン、ジアデレアル、アンデレラタン、ジアデレアル、アンデレラタン、ジアデレアルタン、プロダン、ビリルビン、エイコサノイド、およびカルボキシ－メチル－プロピル－フランプロパノエート（尿毒症毒素）、およびクマリンから選択することができる。あるいは、ＨＳＡのアルブミン薬物結合サイトＩＩに金属触媒を収容させる場合には、前記リガンドとして、ジアゼパム、ケトプロフェン、クロフィブレート（ｃｈｌｏｆｉｂｒａｔｅ）、イブプロフェン、イオパノエート（ｉｏｐａｎｏａｔｅ）、アジドデオキシチミジン、フルフェナメート（ｆｌｕｆｅｎａｍａｔｅ）、エタクリネート（ｅｔｈａｃｒｙｎａｔｅ）、ナプロキセン、フルルビプロフェン、シクロプロフェン、ベノキサプロフェン、フルクロキサシリン、クロロチアジド、ピルプロフェン、プロポフォール、イソフルラン、ダンシルサルコシン、ダンシルグリシン、アルキルアミノクマリン酢酸、ヒドロキシフラボン、Ｌ－トリプトファン、中鎖脂肪酸アニオン（例えばオクタノエート）、Ｌ－チロキシン、クロライドイオン、ヨード酢酸、硫酸インドキシル、および馬尿酸（尿毒素）から選択することができる。本発明の一実施形態において、ＨＳＡの疎水性スポットは薬物結合サイトＩであり、当該サイトにルテニウムを収容するために、リガンドとしてクマリン誘導体、例えば７－ジメチルアミノクマリンが使用される。
　金属触媒と前記リガンドとの連結は、リンカーを介して行ってもよい。この目的に使用できるリンカーは、典型的には、両末端にアミノ基およびカルボキシ基を有するアリキル鎖やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖などを用いることができる。具体的に、アルキル鎖リンカーとしては、例えば、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｘ－ＣＯ－（式中、ｘは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、例えば１～１５の整数とすることができる。）、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ－ＣＨ２－ＣＯ－（式中、ｙは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、例えば１～１５の整数とすることができる。）、または－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｚ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯ－（式中、ｚは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、例えば１～１５の整数とすることができる。）等を挙げることができる。
　金属触媒と前記リガンドとの連結にリンカーを用いる場合には、使用するリンカーの長さは、金属触媒がＨＳＡの疎水性スポット内に収容され、親水性環境に暴露されないまたは実質的に暴露されない長さとする点に留意するべきである。例えば、リガンドとしてクマリンまたはその誘導体（例えば７－ジメチルアミノクマリン、７－ジエチルアミノクマリン（ＤＥＡＣ））を用いてＨＳＡのアルブミン薬物結合サイトＩにルテニウムを収容する場合、「親水性環境に実質的に暴露されない」は、親水性環境に対するルテニウムの露出面積が、ルテニウムの表面積全体の４０％以下、好ましくは３５％以下であり得る。あるいは、「親水性環境に実質的に暴露されない」は、ＨＳＡのアルブミン薬物結合サイトＩに収容された際のルテニウムのＳＡＳＡが、３．０以下、好ましくは１．０以下であり得る。また、その際に使用される例示的なリンカーは、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ－ＣＨ２－ＣＯ－であり、その際、ｙは１から６の整数、好ましくは１から３の整数であり得る。
　ＨＳＡと金属触媒との複合体である本発明のＡｒＭは、一実施形態において、ＨＳＡの表面が糖鎖で修飾されている。糖鎖修飾の内容は、生体内の標的に応じて変化し得る。ＨＳＡ表面上の修飾位置は、糖鎖の導入が可能であれば特に制限されず、例示的にはＨＳＡ表面にある３０位のリジン残基を挙げることができる。
　本発明の複合体は、当該複合体に収容された触媒の種類に応じて、生体内でプロドラッグを活性化することができる。好ましくは、本発明の複合体は、当該複合体に収容された触媒の種類に応じて、生体内の特定の位置に集積し、当該位置選択的にプロドラッグを活性化することができる。
　したがって、本発明は、別の態様において、本発明の複合体を含む組成物に関する。
　本発明の組成物は、一実施形態において、本発明の複合体によって活性化され得るプロドラッグと組み合わせて使用される医薬組成物である。当該実施形態において、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体、および場合により、本発明の複合体によって活性化され得るプロドラッグをさらに含む単剤形態であってもよい。本発明において使用することができる、本発明の複合体によって活性化され得るプロドラッグとしては、例えば各種抗がん剤を挙げることができ、これに限定されるものではないが、具体的にマイトマイシンＣ、ドキソルビシン、タキソール、エンドキシフェンなどを例示することができる。
　本発明の医薬組成物は、別の実施形態において、本発明の複合体と当該複合体によって活性化され得るプロドラッグとが別々の薬剤として提供される組み合わせ医薬の形態である。本発明の組み合わせ医薬において、本発明の複合体を含む第１の薬剤と、当該複合体によって活性化され得るプロドラッグを含む第２の薬剤とは、同時または異時に対象に投与することができる。
　本発明の組成物は、別の態様において、本発明の複合体によって活性化され得るプロドラッグおよび任意の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関し、当該医薬組成物は、本発明の複合体と組み合わせて使用されることによって特徴付けることができる。
　本発明の医薬組成物は、一実施形態において、生体内にある特定の細胞を選択的にタギングするために用いることができる。本発明において、「タギング」とは、内在するまたは外的に投与し得る、細胞機能を破壊することができる（例えば接着阻害剤）または免疫学的応答を誘発することができる非毒性の化学物質を用いて、標的の細胞にタグ付けすることをいう。そのような化学物質は、任意の金属触媒によって非活性型から活性型に変換される生体内または生体外化学物質や、任意の金属触媒によってその機能が強化される生体内または生体外化学物質であり得る。治療用途におけるこのような手法は、選択的細胞タギング（ＳｅＣＴ）と称され、細胞毒性の高い薬剤を用いて癌細胞を直接除去する従来の化学療法とは対照的に、周囲の組織を著しく傷つけることなく、間接的に標的細胞（例えば癌細胞）の死を導くことができることが期待される。例えば、本願実施例においては、がん細胞表面上に発現されたインテグリンに対するｃＲＧＤ－ｐｒｏｐａｒｇｙｌ　ｅｓｔｅｒ（ｃＲＧＤ－ＰＥ）の結合性が本発明の複合体によって増強され、転移を阻害できる可能性が示されている。
　本発明の組成物は、別の実施形態において、バイオセンサーとして用いることができる。具体的に、本発明の複合体において、金属触媒と、それ自体蛍光性を有するおよび／またはアルブミン等タンパク質との結合によって蛍光性が増強されるリンカー（例えばクマリン誘導体）と、金属触媒と検出対象物質との反応によって離脱し得るクエンチャーとを用いることによって、検出対象物質の種類に応じた適切なバイオセンサーとして、本発明の複合体または組成物を設計することができる。本発明の具体的な実施形態において、本発明の組成物は、植物中のエチレンを検出するためのバイオセンサーとして用いられる。
　なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
　また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
　異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語および科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書および関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、または、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
　第１の、第２のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられる場合があるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第１の要素を第２の要素と記し、同様に、第１の要素は第２の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、しかしながら、本発明はいろいろな形態により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
［実施例１］ａｌｂ－Ｒｕの製造
　金属触媒の溶媒中への暴露を防止することができる（結合ポケットを有する）生体適合性人工金属酵素（ＡｒＭ）の設計のために、アルブミンの薬物結合サイトＩ（ｄｒｕｇ　ｓｉｔｅ　Ｉ）（偽活性部位としての疎水性結合ポケット）を利用した。その目標を達成するために、クマリン誘導体（ワルファリンなど）の結合（相互作用）が知られている薬物結合サイトＩに、金属触媒を固定した（Ｇｈｕｍａｎ，Ｊ．；Ｚｕｎｓｚａｉｎ，Ｐ．Ａ．；Ｐｅｔｉｔｐａｓ，Ｉ．；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ａ．Ａ．；Ｏｔａｇｉｒｉ，Ｍ．；Ｃｕｒｒｙ，Ｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５，３５３，３８－５２）。金属触媒の固定には、異なるＰＥＧリンカー長を有するクマリン－Ｒｕ錯体Ｒｕ１～３、６を用いた。
１．クマリン－Ｒｕ錯体の調製
１－１．一般手順Ｂ
　下記の反応スキームにしたがって、クマリン結合ルテニウム錯体Ｒｕ１～３，６を合成することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　ルテニウム錯体ＩＩＩは公知技術（Ｌｏ，Ｃ．；Ｒｉｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｒ．；Ｇｎａｎｄｔ，Ｄ．；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｙ．；Ｗａｒｄ，Ｔ．Ｒ．ＣｈｅｍＣｏｍｍ　２０１１，４７，１２０６５－１２０６７；Ｋａｊｅｔａｎｏｗｉｃｚ，Ａ．；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ａ．；Ｒｅｕｔｅｒ，Ｒ．；Ｗａｒｄ，Ｔ．Ｒ．Ｃａｔａｌ．Ｌｅｔｔ．２０１４，１４４，３７３－３７９；Ｚｈａｏ，Ｊ．；Ｋａｊｅｔａｎｏｗｉｃｚ，Ａ．；Ｗａｒｄ，Ｔ．Ｒ．Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１５，１３，５６５２－５６５５）に従って調製される。ジクロロメタン（３ｍＬ）中のルテニウム錯体ＩＩＩ（８０．０ｍｇ、０．１０６ｍｍｏｌ）の溶液に２５℃で塩酸ガスをバブリングする。塩酸ガスは、塩化アンモニウムに濃硫酸を滴下することで調製される。４５分間撹拌した後、ジクロロメタン（１ｍＬ）を注射器で反応物に加え、同じ温度で撹拌する。さらに１５分後、反応物を減圧濃縮してアミンＩＶを得て、これを精製することなく次の反応に使用する。
　別のフラスコで、ジクロロメタン（１ｍＬ）に溶かしたカルボン酸ＩＩａ（１．１当量）およびカップリング剤ＨＣＴＵ（１．３当量）の溶液を２５℃で３０分間撹拌する。この反応物に、ジクロロメタン（１ｍＬ）に溶かしたアミンＩＶ（１当量）、続いて同じ温度でＮ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１０当量）を加えた。６時間撹拌した後、１Ｍ　ＨＣｌ水溶液を加えることによって反応を停止させる。生成物をジクロロメタンで３回抽出し、合わせた有機抽出層を飽和重曹水およびでブライン洗浄し、乾燥し（硫酸ナトリウムによる）、そして減圧濃縮する。濃縮残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、クマリン－Ｒｕ錯体Ｒｕ１～３，６を得ることができる。
１－２．クマリン－Ｒｕ錯体Ｒｕ１の調製
　一般手順Ｂに従って、ルテニウム錯体ＩＩＩ（８０．１ｍｇ、０．１０６ｍｍｏｌ）、カルボン酸ＩＩａ（４２．４ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）、ＨＣＴＵ（５７．６ｍｇ、０．１３９ｍｍｏｌ）およびＮ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１３７ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）から得られる反応物を、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ／ＥｔＯＡｃ／ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝４０／４０／１５／５）による精製後に、目的のクマリン－Ｒｕ錯体Ｒｕ１（３７．７ｍｇ、３５．６％）を緑色固体として得る。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）１．２４－１．２７（ｍ，１２Ｈ），２．３７－２．５１（ｂｒ　ｍ，１８Ｈ），３．４７（ｑ，４Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），３．５３－３．７１（ｍ，６Ｈ），３．７９（ｍ，１Ｈ），３．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ），３．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ），４．０５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝Ｊ２＝１０．０Ｈｚ），４．３３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝Ｊ２＝１０．０Ｈｚ），４．７５－４．８４（ｂｒ　ｍ，１Ｈ），４．８９（ｓｅｐｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），６．５０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），６．６６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝２．３Ｈｚ，Ｊ２＝９．１Ｈｚ），６．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），６．８５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝Ｊ２＝７．７Ｈｚ），６．９１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝１．７Ｈｚ，Ｊ２＝７．７Ｈｚ），７．０２（ｓ，ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ，２Ｈ），７．０４（ｓ，１Ｈ），７．０７（ｓ，１Ｈ），７．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），７．４８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝１．７Ｈｚ，Ｊ２＝Ｊ３＝７．７Ｈｚ），８．６７（ｓ，１Ｈ），９．０９（ｓ，１Ｈ），１６．５０（ｓ．１Ｈ）；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ　９６４．３３５５（９６４．３３５９　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ５０Ｈ６１ＣｌＮ５Ｏ６Ｒｕ，［Ｍ－Ｃｌ］＋）．
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
１－３．クマリン－Ｒｕ錯体Ｒｕ２の調製
　一般手順Ｂに従って、ルテニウム錯体ＩＩＩ（８０．１ｍｇ、０．１０６ｍｍｏｌ）、カルボン酸ＩＩｂ（４７．４ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）、ＨＣＴＵ（５７．１ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ）およびＮ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１３７ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）から得られる反応物を、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ／ＥｔＯＡｃ／ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝４０／４０／１５／５）による精製後、目的のクマリン－Ｒｕ錯体Ｒｕ２（２７．９ｍｇ、２５．２％）を緑色固体として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）１．２２－１．２６（ｍ，１２Ｈ），２．２６－２．４６（ｂｒ　ｍ，１８Ｈ），３．３８－３．５４（ｍ，４Ｈ），３．６１－３．７０（ｍ，１０Ｈ），３．７４－３．８２（ｍ，１Ｈ），３．９７（ｓ，２Ｈ），４．１１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝Ｊ２＝１０．３Ｈｚ），４．２８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝Ｊ２＝１０．３Ｈｚ），４．６６－４．７５（ｂｒ　ｍ，１Ｈ），４．８８（ｓｅｐｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），６．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），６．６５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝２．３Ｈｚ，Ｊ２＝９．０Ｈｚ），６．７７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝Ｊ２＝７．６Ｈｚ），６．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝１．９Ｈｚ，Ｊ２＝７．６Ｈｚ），６．９８－７．０１（ｂｒ　ｍ，４Ｈ），７．４３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．４７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝１．９Ｈｚ，Ｊ２＝Ｊ３＝７．６Ｈｚ），８．６７（ｓ，１Ｈ），９．０５（ｓ，１Ｈ），１６．４７（ｓ．１Ｈ）；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　１００８．３６１３（１００８．３６２２　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ５２Ｈ６５ＣｌＮ５Ｏ７Ｒｕ，　［Ｍ-Ｃｌ］＋）．
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
１－４．クマリン－Ｒｕ錯体Ｒｕ３の調製
　一般手順Ｂに従って、ルテニウム錯体ＩＩＩ（２８．８ｍｇ、３８．１μｍｏｌ）、カルボン酸ＩＩｃ（１８．９ｍｇ、４２．０μｍｏｌ）、ＨＣＴＵ（２１．３ｍｇ、５１．５μｍｏｌ）およびＮ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（４９．７μｇ、３８５μｍｏｌ）から得られる反応物を、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ／ＥｔＯＡｃ／ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝４０／４０／１５／５）による精製後、目的のクマリン－Ｒｕ錯体Ｒｕ３（１２．０ｍｇ、２８．９％）を緑色の固体として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）１．２２－１．２８（ｍ，１２Ｈ），２．３４-２．４４（ｂｒ　ｍ，１８Ｈ），３．４６（ｑ，４Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），３．５５－３．７０（ｍ，１４Ｈ），３．７１－３．８０（ｍ，１Ｈ），３．９５（ｓ，２Ｈ），４．０４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝Ｊ２＝１０．７Ｈｚ），４．２７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝Ｊ２＝１０．７Ｈｚ），４．５７－４．６５（ｍ，１Ｈ），４．８９（ｓｅｐｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），６．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），６．６５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝２．３Ｈｚ，Ｊ２＝８．８Ｈｚ），６．７９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），６．８４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝Ｊ２＝７．６Ｈｚ），６．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝１．９Ｈｚ，Ｊ２＝７．６Ｈｚ），７．０１－７．０５（ｂｒ　ｍ，４Ｈ），７．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．４７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝１．９Ｈｚ，Ｊ２＝Ｊ３＝７．６Ｈｚ），８．６７（ｓ，１Ｈ），８．９８（ｓ，１Ｈ），１６．４７（ｓ．１Ｈ）；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　１０８８．３６６１（１０８８．３６４８　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ５４Ｈ７０Ｃｌ２Ｎ５Ｏ８Ｒｕ，［Ｍ＋Ｈ］＋）．
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
１－５．クマリン－Ｒｕ錯体Ｒｕ６の調製
　一般手順Ｂに従って、ルテニウム錯体ＩＩＩ（８０．４ｍｇ、０．１０６ｍｍｏｌ）、カルボン酸ＩＩｄ（６９．９ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）、ＨＣＴＵ（５７．５ｍｇ、０．１３９ｍｍｏｌ）およびＮ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１３７ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）　シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ／ＥｔＯＡｃ／ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝２０／２０／５５／５）による精製後、目的のクマリン－Ｒｕ錯体Ｒｕ６（３４．４ｍｇ、２６．３％）を緑色の固体として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）１．２１－１．３０（ｍ，１２Ｈ），２．３７-２．４５（ｂｒ　ｍ，１８Ｈ），３．４５（ｑ，４Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），３．５６－３．６８（ｍ，３１Ｈ），３．９９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝Ｊ２＝１０．５Ｈｚ），４．２５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝Ｊ２＝１０．５Ｈｚ），４．５３－４．６２（ｂｒ　ｍ，１Ｈ），４．９１（ｓｅｐｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），６．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），６．６４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝２．３Ｈｚ，Ｊ２＝８．８Ｈｚ），６．８０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．９０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝１．９Ｈｚ，Ｊ２＝７．６Ｈｚ），７．０３－７．０７（ｂｒ　ｍ，４Ｈ），７．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．４８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝１．９Ｈｚ，Ｊ２＝Ｊ３＝７．６Ｈｚ），８．６８（ｓ，１Ｈ），９．００（ｓ，１Ｈ），１６．４７（ｓ．１Ｈ）；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　１２３４．４６０３（１２３４．４５９３　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ６１Ｈ８４Ｃｌ２Ｎ５Ｏ１１Ｒｕ，［Ｍ＋Ｈ］＋）．
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
２．ａｌｂ－Ｒｕの製造
　ａｌｂ－Ｒｕの製造は、ルテニウム触媒Ｒｕ１－３、６と、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）とを反応して、ａｌｂ－Ｒｕ錯体を形成することによって行った。
　反応液の組成は、３０μＭのヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡとする。５０ｎｍｏｌ、３００μＭストック溶液（水溶液）を１６７μＬ使用）と、様々な濃度の触媒（Ｒｕ１－３、６）を含んだ。触媒は、例えば、３７μＭのＲｕ１（６２ｎｍｏｌ、３７０μＭストック溶液（ジオキサン溶液）を１６７μＬ使用）を使用した。総反応容量は、１０％ジオキサンを含むＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で１６７０μＬとした。ＨＳＡ添加による反応開始後、反応混合物は穏やかに混合し、３７℃で１時間インキュベートした。そして、反応溶液は、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）の超遠心フィルター（３０ｋＤａ）を用いて、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、濃縮した。次いで、濃縮したａｌｂ－Ｒｕ溶液はＰＢＳ緩衝液で希釈し、５０μＭストック溶液として、１０００μＬを得た。
　Ａｌｂ－Ｒｕ錯体形成の確認は、クマリン系分子は溶媒の極性に敏感であるという事実に依拠する蛍光アッセイを用いた。Ｒｕ１－３，６を用い、リガンド－アルブミンの１：１の反応で得られた蛍光強度（測定値）を図１に示す。
　対照（リガンドのみ、あるいはＨＳＡのみ）と比較し、ａｌｂ－Ｒｕ複合体形成の指標と考えられる、有意に高い蛍光レベルが検出された。
　また、Ｒｕ１－３，６の結合部位を間接的に確定するために、ＨＳＡの溶液を２当量のいずれかの結合リガンド（ワルファリン、イブプロフェン）と共に３７℃で１時間プレインキュベートした。その後、アルブミンと結合リガンドの混合物を用いて、Ｒｕ１－３，６の飽和結合曲線を作成した（図２）。
　図２の結果から、Ｒｕ１－３，６の結合はイブプロフェンの存在下で影響を受けないが、ワルファリンの存在下で有意に減少することが明らかとなった。この結果は、ＨＳＡの薬物結合サイトＩがこれらの化合物の主な結合部位であることを強く示唆している。
［実施例２］ａｌｂ－Ｒｕの反応性の検証
　次に、ａｌｂ－Ｒｕ複合体の、オレフィン１ａ～１ｄおよびエンイン１ｅの閉環メタセシス（ＲＣＭ）を触媒する能力を調べた（図３）。また、ａｌｂ－Ｒｕ１～３、６は、異なるＰＥＧリンカー長を有するため、併せて、疎水性結合ポケットの有効サイズおよび適合性も検証した。
　反応液は基本的には、１：９のジオキサン：ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中に、基質としての１ａ－ｅとａｌｂ－Ｒｕ複合体（すなわちＲｕ１～３，６）を含んだ。反応は、３７℃で２時間のインキュベート後、ドデカンチオールでクエンチし、さらにメタノールで希釈し、サンプルはフィルター濾過し、ＨＰＬＣ分析を行い、それぞれの生成物２ａ－ｅへの代謝回転（ＴＯＮ）を算出した。対照として、液中フリーのルテニウム触媒（ｆｒｅｅ－ｉｎ－ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、Ｒｕ１－３，６を用いる反応も同様の条件下で実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　この実験での最初の観察の１つは、（クマリンアンカーとルテニウム触媒の間の）ＰＥＧリンカーの長さの増加と、活性の減少との間の相関関係であった。例えば、基質４，４－ビス（（ベンゾイルオキシ）メチル）－１，６－ヘプタジエン１ｄ（エントリー７）の代謝回転は、ａｌｂ－Ｒｕ１（１９．７）の存在下で最も高く、ａｌｂ－Ｒｕ２（２．８）の存在下で急激に低下し、ａｌｂ－Ｒｕ６（０．５）の存在下でごくわずかなレベルを示した。用いたすべてのリンカー長で、液中フリーのルテニウム触媒、Ｒｕ１を使用して得られた代謝回転（ＴＯＮ）が一般に２８～３５の範囲内（エントリー８）に留まることを考えると、この観察結果は、疎水性結合ポケットが、長いリンカーを有するクマリンアンカー－触媒複合体を収容できないことを示唆する。
［実施例３］ａｌｂ－Ｒｕの生体適合性の検証
　ａｌｂ－Ｒｕ複合体が閉環メタセシス、およびエンイン交差メタセシスを触媒する活性を示すことを確認した後、次いで、グルタチオンの作用を評価することによって、生体適合性の証明を目指した。この研究のために、化合物１ｄをモデル基質として選択した。
　この研究での重要な実験の１つは、グルタチオンに対するａｌｂ－Ｒｕ１の触媒保護能力を調べることであった。下記に示すように、１ｍｏｌ％のａｌｂ－Ｒｕ１を用いて、基質１ｄを様々な濃度のＧＳＨ添加と共に反応させた。なお、ａｌｂ－Ｒｕ１の濃度に応じて、グルタチオンは等量数を加えた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　その結果、２０ｍＭ　ＧＳＨ（ａｌｂ－Ｒｕに対して１０００当量のＧＳＨ）まで、（算出した）ＴＯＮの変化は見られなかった。１００ｍＭおよび２００ｍＭのＧＳＨ添加で、最終的に対照と比較してそれぞれ６０％および８２％のＴＯＮ減少が認められた。
　次の検討では、ＧＳＨ保護能力の閾値上限を知るため、金属触媒保護の持続時間を評価した。具体的には、ａｌｂ－Ｒｕ１を、ＧＳＨ、ドデカンチオール、またはＰＢＳ緩衝液（ブランクとして）のいずれかと共に様々な時間にわたってプレインキュベートした後、基質１ｄを反応液に添加し、そして反応１時間の後にＴＯＮ値を算出した。図４には、生理学的に適切なＧＳＨ濃度（２００μＭ、ａｌｂ－Ｒｕ１に対して１０当量）で行った実験を示している。
　ＧＳＨと６時間プレインキュベーション後に測定されたＴＯＮ値は、一般的に、ブランク（ＰＢＳ緩衝液）と比較してわずかな減少しか示さなかった。対照的に、閾値上限のＧＳＨ（２０ｍＭ、ａｌｂ－Ｒｕ１に対して１０００当量）を用いた実験では、反応性に対して著名な（はるかに大きな）効果を示した（図５）。
　この場合、ＧＳＨと１時間プレインキュベーション後では、活性の約５０％の減少が観察され、一方で、４時間のプレインキュベーションでは、活性はほぼ消失した。
　Ａｌｂ－Ｒｕ複合体の生体適合性をさらに評価するために、基質１ｄを、１０ｍｏｌ％のａｌｂ－Ｒｕ１複合体と３７℃で２時間インキュベートした。２ｄの生成収率は、１：８：１ウシ胎児血清／ＤＭＥＭ培地／ジオキサンで約２％であり、そして１：８：１正常ラット血清／ＰＢＳ緩衝液／ジオキサンで約１％であった。しかしながら、回収した出発物質１ｄがそれぞれおよそ８％および３％であったので、低い生成収率は、血清中に通常、存在するタンパク質による基質の捕捉あるいは分解に起因する可能性が高い。
　ＡｒＭ活性（人工金属酵素活性）に関して、ＧＳＨの添加有りと添加無しで、基質１ａ－ｅのミカエリス－メンテンのカイネティック（速度論的）パラメーターを算出した（図６）。
　その結果、ＧＳＨ添加の有無にかかわらず、ＡｒＭ活性において、１ａ－１ｅで測定されたカイネティック数値はわずかな変化（誤差内）のみであった。ただし、特に重要であったのは、これらの基質の間で観測された触媒効率（ｋｃａｔ／ＫＭ）の違いである。特に、基質１ｅは約３×１０３　Ｍ－１　ｓ－１のｋｃａｔ／ＫＭ値を示し、この値は天然酵素の反応性（ｋｃａｔ／ＫＭ　～１０８　Ｍ－１　ｓ－１）と比べると見劣りがするが、この結果から非天然金属のＡｒＭが、天然酵素と同等の反応性に達する可能性があることが強調される。
［実施例４］グルタチオン耐性のメカニズム
　アルブミンの薬物結合サイトＩの疎水性結合ポケットにおける侵入および立体配座の程度を予測するために、ＡｕｔｏＤｏｃｋＴｏｏｌｓのＧＵＩインタフェースでＡｕｔｏｄｏｃｋ　４．２（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｍ．；Ｈｕｅｙ，Ｒ．；Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，Ｗ．；Ｓａｎｎｅｒ，Ｍ．Ｆ．；Ｂｅｌｅｗ，Ｒ．Ｋ．；Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．；Ｏｌｓｏｎ，Ａ．Ｊ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．２００９，３０，２７８５－２７９１．）を用いて、化合物Ｒｕ１－３，６を、ヒト血清アルブミン（ＰＤＢ：１Ｈ９Ｚ）にドッキングする分子モデリングの研究を行った。その結果は、アルブミンの薬物結合サイトＩの結合ポケットが、比較的短いＰＥＧリンカー長を有するクマリン－ルテニウム触媒（例えば、Ｒｕ１）の結合を収容するのに十分な深さであるという根本的仮説を裏づける。しかしながら、図７に示されるように、ＰＥＧリンカー長が徐々に長くなると（例えば、Ｒｕ６）、結合ポケットの外側にルテニウム部分が押し出され、溶液中の生体分子へのその露出を増加させる。
　この理論は、ドッキングするリガンドのルテニウム原子の、相対溶媒接近可能表面積（ＳＡＳＡ）の計算によっても、より長いＰＥＧリンカーとの相関が増加するという事実でさらに支持された。なお、図７において、ゼロ値は溶媒に露出していない原子を示している。
［実施例５］人工金属酵素のターゲティング
　治療用ＡｒＭの開発を推進させるために考慮すべきもう１つの側面は、体内の特定の臓器／細胞への局在化を促進するためのターゲティング方法論の必要性である。
　成功すれば、プロドラッグ療法への適応が可能になり、それは細胞傷害性分子に基づく抗がん療法など、副作用リスクのある医薬品候補の開発に特に有益である。
　異なる真核細胞の表面を包むグリコカリックスの複雑さは変化していることから、特定の複合型Ｎ－グリカン集合体を結合したグリコアルブミンが、異なる癌細胞間で、異なる認識能や結合性を発揮できることが見出されている。これらのグリコアルブミンがｉｎ　ｖｉｖｏ担体として作用する能力があるかを試験することを目的とした重要な研究では、プロパルギルエステルを基にしたタンパク質ラベリングに関して、金触媒を含むグリコアルブミンがそのＮ－グリカン構造によって生きたマウスの特定の臓器に局在化し、ｉｎ　ｖｉｖｏ触媒活性を示した（Ｔｓｕｂｏｋｕｒａ，Ｋ．；Ｖｏｎｇ，Ｋ．Ｋ．Ｈ．；Ｐｒａｄｉｐｔａ，Ａ．Ｒ．；Ｏｇｕｒａ，Ａ．；Ｕｒａｎｏ，Ｓ．；Ｔａｈａｒａ，Ｔ．；Ｎｏｚａｋｉ，Ｓ．；Ｏｎｏｅ，Ｈ．；Ｎａｋａｏ，Ｙ．；Ｓｉｂｇａｔｕｌｌｉｎａ，Ｒ．；Ｋｕｒｂａｎｇａｌｉｅｖａ，Ａ．；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．；Ｔａｎａｋａ，Ｋ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２０１７，５６，３５７９－３５８４．）。
　癌に対する適応性を開発検討するために、標的基として、シアル酸α（２，３）結合末端のＮ－グリカンの均一な集合体を選択した。この選択は、シアル酸α（２，３）結合を有するグリコアルブミン（２，３－Ｓｉａ）がＳＷ６２０ヒト結腸腺癌細胞に優先的に蓄積することができ、またＡ５４９ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞およびＨｅＬａヒト子宮頸癌由来細胞に対しても中等度の結合を示した、以前の研究に基づいてなされた（Ｏｇｕｒａ，Ａ．；Ｕｒａｎｏ，Ｓ．；Ｔａｈａｒａ，Ｔ．；Ｎｏｚａｋｉ，Ｓ．；Ｓｉｂｇａｔｕｌｌｉｎａ，Ｒ．；Ｖｏｎｇ，Ｋ．；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．；Ｄｏｈｍａｅ，Ｎ．；Ｋｕｒｂａｎｇａｌｉｅｖａ，Ａ．；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．；Ｔａｎａｋａ，Ｋ．ＣｈｅｍＣｏｍｍ　２０１８，５４，８６９３－８６９６．）。この効果は、α（２，３）結合シアル酸の既知の受容体と知られているガレクチン－８の過剰発現によって起こされる可能性が高い（Ｌａｈｍ，Ｈ．；Ａｎｄｒｅ，Ｓ．；Ｈｏｅｆｌｉｃｈ，Ａ．；Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｒ．；Ｓｏｒｄａｔ，Ｂ．；Ｋａｌｔｎｅｒ，Ｈ．；Ｗｏｌｆ，Ｅ．；Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．－Ｊ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　Ｃｌｉｎ．　Ｏｎｃｏｌ．２００１，１２７，３７５－３８６；Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｓ．；Ｏｂｅｒｇ，Ｃ．Ｔ．；Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．；Ｓｕｎｄｉｎ，Ａ．；Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｕ．Ｊ．；Ｓｍｉｔｈ，　Ｄ．；Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒ．Ｄ．；Ａｌｍｋｖｉｓｔ，Ｊ．；Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ａ．；Ｌｅｆｆｌｅｒ，Ｈ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ　２００７，１７，６６３－６７６．）。
　初めに、ルテニウム触媒Ｒｕ１を固定したグルコシル化ＡｒＭ（ＧＡｒＭ）－Ｒｕ１（２，３－Ｓｉａ）を調製した後、ＳＷ６２０ヒト結腸腺癌細胞へのターゲティング能（標的化能）を結合実験にて評価した。ＧＡｒＭ－Ｒｕ１（２，３－Ｓｉａ）の癌細胞への特異的結合を評価するために、癌細胞は９６ウェルの透明底プレートに１０４細胞／ｗｅｌｌの密度で播種し、一晩培養した。その後、培地を除去し、［１］ＧＡｒＭ－Ｒｕ１（２，３－Ｓｉａ）、［２］ａｌｂ－Ｒｕ、［３］ＧＡ（２，３－Ｓｉａ）、または［４］Ｒｕ１をいずれも最終濃度１０μＭとなるように添加した。細胞を３７℃で３時間インキュベートした後、培地を除去し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し（３回）、ホルムアルデヒド試薬を用いてプレートに固定した。細胞観察はキーエンス社製ＢＺ－Ｘ７１０　Ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（登録商標）を用いて行い、蛍光画像と明視野画像を記録した。クマリン由来蛍光の検出には、ＥＴ－ＥＢＦＰ２／Ｃｏｕｍａｒｉｎ／Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ＤＡＰＩ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｓｅｔ　Ｃａｔ＃４９０２１（Ｃｈｒｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏｒｐ．，Ｖｅｒｍｏｎｔ，ＵＳＡ）を用いた。イメージ画像は２０倍の倍率で撮り、ＢＺ－Ｘアナライザー（キーエンス社）ソフトウェアを用いて解析した。
　結果を図８に示す。ＨＳＡに結合したクマリンの蛍光発光を利用した細胞イメージングによって、ＧＡｒＭ－Ｒｕ１（２，３－Ｓｉａ）とインキュベートしたＳＷ６２０ヒト結腸腺癌細胞において、その対照と比較して、より強い蛍光蓄積が認められた。
　追加試験として、ＨｅＬａヒト子宮頸癌由来細胞およびＡ５４９ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞を用いて同様の実験も行った。以前の報告と一致して、ＧＡｒＭ－Ｒｕ１（２，３－Ｓｉａ）のＳＷ６２０ヒト結腸腺癌細胞への蓄積は、ＨｅＬａヒト子宮頸癌由来細胞およびＡ５４９ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞のそれより高いことが観察された（図９）。
［実施例６］プロドラッグ療法
　次いで、ＧＡｒＭ－Ｒｕ複合体の標的化抗癌治療への適応性を検討した。閉環メタセシスによって活性化される薬物候補の初期検討として、ウンベリプレニン（２ｈ）を選択した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　フェルラ属植物から抽出される天然物として知られているウンベリプレニンは、様々な癌細胞株に対して細胞傷害活性が示されていた（Ｓｈａｋｅｒｉ，Ａ．；Ｉｒａｎｓｈａｈｙ，Ｍ．；Ｉｒａｎｓｈａｈｉ，Ｍ．Ｊ．Ａｓｉａｎ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｓ．２０１４，１６，８８４－８８９；Ｒａｓｈｉｄｉ，Ｍ．；Ｋｈａｌｉｌｎｅｚｈａｄ，Ａ．；Ａｍａｎｉ，Ｄ．；Ｊａｍｓｈｉｄｉ，Ｈ．；Ｍｕｈａｍｍａｄｎｅｊａｄ，Ａ．；Ｂａｚｉ，Ａ．；Ｚｉａｉ，Ｓ．Ａ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１８，２３３，８９０８－８９１８；Ｊｕｎ，Ｍ．；Ｂａｃａｙ，Ａ．Ｆ．；Ｍｏｙｅｒ，Ｊ．；Ｗｅｂｂ，Ａ．；Ｃａｒｒｉｃｏ－Ｍｏｎｉｚ，Ｄ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０１４，２４，４６５４－４６５８．）。その細胞毒性のメカニズムは、細胞をＧ１期に停止させ、さらにカスパーゼ－８および９の活性化、Ｂｃｌ－２およびＭｃｌ－１のダウンレギュレーションによってアポトーシスを誘導することが示されている（Ｂａｒｔｈｏｍｅｕｆ，Ｃ．；Ｌｉｍ，Ｓ．；Ｉｒａｎｓｈａｈｉ，Ｍ．；Ｃｈｏｌｌｅｔ，Ｐ．Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ　２００８，１５，１０３－１１１；Ｇｈｏｌａｍｉ，Ｏ．；Ｊｅｄｄｉ－Ｔｅｈｒａｎｉ，Ｍ．；Ｉｒａｎｓｈａｈｉ，Ｍ．；Ｚａｒｎａｎｉ，Ａ．Ｈ．；Ｚｉａｉ，Ｓ．Ａ．Ｉｒａｎ　Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０１３，１２，３７１－３７６；Ｇｈｏｌａｍｉ，Ｏ．；Ｊｅｄｄｉ－Ｔｅｈｒａｎｉ，Ｍ．；Ｉｒａｎｓｈａｈｉ，Ｍ．；Ｚａｒｎａｎｉ，Ａ．Ｈ．；Ｚｉａｉ，Ｓ．Ａ．Ｉｒａｎ　Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０１４，１３，１３８７－１３９２．）。その非常に高い疎水性（主にファルネシル部分によって付与される）のため、ウンベリプレニンのプロドラッグ（１ｈ）はアルブミンベースのＡｒＭに対して理想的な基質であると理論づけた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　これを検証するため、単純化したクマリン誘導体１ｇおよびウンベリプレニンのプロドラッグ１ｈの両方を用いて速度論的実験を行った（図１０）。
　クマリン前駆体は通常、水性条件下でＲＣＭ反応性が劣ることが知られているが、クマリン誘導体１ｇのごく僅かな反応性（ｋｃａｔ／ＫＭ＜１）は予想外であった。この説明として、前駆体１ｇがアルブミンに対して非常に低い結合親和性（ＫＤ　約１２９μＭ）を有するという結合実験の結果が示している。一方、疎水性のプロドラッグ１ｈの有意に高い活性（１ｇと比較して少なくとも１５００倍高いｋｃａｔ／ＫＭ）は、疎水性結合ポケットへの進入を促進する１ｈの長いアルキル鎖部分におそらく起因する。
　次に、ＧＡｒＭに基づく抗癌アプローチの、ｉｎ　ｃｅｌｌｕｌｏ活性を評価するための一連の実験を行った。
　設定した特定の濃度（ＳＷ６２０ヒト結腸腺癌細胞では３２μＭ；ＨｅＬａヒト子宮頸癌由来細胞およびＡ５４９ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞では６４μＭ）のプロドラッグ１ｈを使用し、添加するＧＡｒＭ－Ｒｕ１の量を変化させることで、細胞傷害性試験を行った。
　細胞生存率測定は、プロメガ社、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ　９６（登録商標）　Ａｑｕｅｏｕｓ　Ｏｎｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　（ＭＴＳ）を用いて行った。培養細胞は、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）の９６穴マイクロプレートに、約１０３細胞／ｗｅｌｌの密度で播種し、一晩培養した。その後、培地を除去し、様々な濃度の化合物を添加した。化合物を溶解するためにＤＭＳＯを使用し、細胞への添加の際には、ＤＭＳＯ濃度は１％とした。９６時間インキュベーションした後、細胞の培養液を、新鮮な培地８５μＬに置換した。その後、１５μＬのＭＴＳ試薬を添加し、３７℃で２．５時間のインキュベートした後、４９０ｎｍで吸光度を測定した。対照とした１％ＤＭＳＯを添加した細胞の吸光度を１００％とし、細胞生存率を算出した。
　糖鎖によるターゲティング効果を説明するために、対照として、糖鎖のないａｌｂ－Ｒｕ１を用いて、同様な条件下での実験を行った。これらの結果から、３つの癌細胞株すべてにおいて、プロドラッグ１ｈとＧＡｒＭ－Ｒｕ１の混合物は、細胞増殖を有意に減少（＜５％）し、その効果はプロドラッグ１ｈとＧＡｒＭ－Ｒｕ１の対応する濃度での効果を超えていた（図１１）。別の重要な観察は、プロドラッグ１ｈとａｌｂ－Ｒｕ１の混合物の細胞傷害活性は、はるかに有効性が低いことであった。このことは、糖鎖によるターゲティング（標的化）が、細胞表面や細胞内への金属触媒の局在化に重要であることを示唆する。
［実施例７］　エチレンを検出する人工メタロエンザイム（ＡｒＭ）（ＡｒＭエチレンプローブ；ＡＥＰ）の合成
　図１２は、ＡｒＭエチレンプローブ（ＡＥＰ）の合成スキームを記載する。
　７－ジエチルアミノクマリン（ＤＥＡＣ）自体が発する蛍光は、周囲の溶媒の極性に高い感受性を有しており、ＤＥＡＣ－Ｒｕの量子収率は、極性環境下（１０％ジオキサン／水）から非極性環境下（６０％ジオキサン／水）への変化により、約２０倍に増加する。そこで、本合成では、オレフィンを含むＤＡＢＣＹＬ失活剤（クエンチャー）と、ａｌｂ－Ｒｕとの反応に基づいて、ＡＥＰを合成した。
７－１．ＡＥＰの調製
　３０μＭ　ＨＳＡ溶液（５０ｎｍｏｌ、３００μＭ水溶液から１６７μＬ）と３７μＭ　ＤＥＡＣ－Ｒｕ溶液（６２ｎｍｏｌ、３７０μＭジオキサン溶液から１６７μＬ）を混合させることにより、ａｌｂ－Ｒｕを調製した。反応溶液は１０％ジオキサンを含むｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝溶液で、全量を１６７０μＬとした。ＨＳＡ添加による反応開始後、反応溶液を穏やかに撹拌し、３７度で１時間インキュベートした。続いてアミコンウルトラ遠心式フィルター（３０ｋＤａ）を用いて反応溶液を濃縮し、ＰＢＳ緩衝溶液で３回洗浄した。濃縮したａｌｂ－Ｒｕ溶液に水を加えて５０μＬに薄め、１ｍＭのストック溶液を得た。ＡＥＰ溶液を調製するために、１００μＭ　ａｌｂ－Ｒｕ溶液（５０ｎｍｏｌ、１μＭ水溶液から５０μＬ）と５００μＭ　ＤＡＢＣＹＬクエンチャー溶液（２５０ｎｍｏｌ、５５５μＭのＤＭＳＯ：水＝１：８溶液から４５０μＬ）の混合溶液を作製した。反応溶液を穏やかに撹拌し、３７度で５分間インキュベートした。続いてアミコンウルトラ遠心式フィルター（３０ｋＤａ）を用いて反応溶液を濃縮し、ＰＢＳ緩衝溶液で３回洗浄した。濃縮したＡＥＰ溶液に水を加えて５００μＬに薄め、１００μＭのストック溶液を得た。
　タンパク質複合体（ａｌｂ－Ｒｕ、ＡＥＰ）の蛍光強度は、ＪＡＳＣＯ　ＦＭＰ－９６３　ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒの付いたＪＡＳＣＯ　ＦＰ－６５００　Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。サンプルを準備するため、ａｌｂ－ＲｕとＡＥＰの両方を１０μＭの濃度の水溶液に調製した。そしてサンプルを９６ウェルマイクロプレートにアリコート（１００μＬ）し、λＥＸ＝４２０ｎｍ／λＥＭ＝４６３ｎｍで測定した。全ての測定は３回行った。
　また、この研究で用いたタンパク質複合体（ａｌｂ－Ｒｕ、ＡＥＰ）の主な構造変化を見分けるため、円偏光二色性（ＣＤ）分析を行った。ＣＤスペクトルは０．１ｃｍのセルを使い、Ｊ－１５００　Ｃｉｒｃｕｌａｒ　Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＪＡＳＣＯ）を用いて測定した。１０％ジオキサンの水溶液をブランクとして使い、これをスキャン中に自動的にサンプルから差し引いた。データは２００－２５０ｎｍを１００ｎｍ／ｍｉｎのスキャン速度で記録した。各タンパク質複合体の濃度は２．３μＭに保った。
［結果］
　アルブミンの結合ポケットの中に存在するＲｕＱ複合体（ＤＥＡＣ－Ｒｕ－ＤＡＢＣＹＬ　ｃｏｍｐｌｅｘ）は、クエンチャーのため蛍光強度は著しく低く、これは図１３でａｌｂ－ＲｕとＡＥＰプローブの蛍光強度を比較しても明らかである。さらに、これらの円偏光二色性（ＣＤ）が完全に重なったことから、タンパク質の大きな構造変性は見られないことが確認された（図１４）。
７－２．ＡＥＰによるエチレンの検出
　ＡＥＰによるエチレンの検出メカニズムは、エチレンをＡＥＰ中のルテニウム触媒と反応させることにより、ＤＡＢＣＹＬクエンチャーに置き換えて、蛍光シグナルに活性化することによる。そこで、本実施例では、果物および植物におけるエチレンの検出にＡＥＰを用いた。
［キウイフルーツのイメージング］
　未熟な、あるいは熟成したキウイフルーツは食料品店で購入した。外側の果皮や子房室、柱軸を含む断片を得るため、キウイフルーツをキッチンナイフでおよそ２．０ｃｍ　ｘ　４．５ｃｍの大きさに切ることにより、キウイフルーツの断片を準備した。エチレン生産を追跡するため、１０ｃｍのシャーレの中心に１７０μＬのＡＥＰ（４００μＭ溶液）を注いだ。続いて、サンプルをＡＥＰ溶液の上に作用させた。サンプルを室温でインキュベートして、イメージングを特定の時間（１、２４時間後）に行った。イメージングでは、ＥＴ－ＥＢＦＰ２／Ｃｏｕｍａｒｉｎ／Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ＤＡＰＩ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｓｅｔ　Ｃａｔ＃４９０２１（Ｃｈｒｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏｒｐ．）を備えたＫｅｙｅｎｃｅ　ＢＺ－Ｘ７１０　Ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（登録商標）を用いた。明視野像（カラー）は２５分の１秒、蛍光画像は３．５分の１秒の露出設定で得られた。複数のイメージング画像は４倍率で得て、画像結合と分析はＢＺ－Ｘ　Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いて行った。
［シロイヌナズナのイメージング］
　シロイヌナズナは２３度の土で８５μｍｏｌ　ｍ－２ｓ－１の光強度で育てた。１０時間明るく、１４時間暗くする光周性を適用した。エチレン生産を追跡するため、まず４－６週間の植物から葉を取り入れた。続いて鉗子を用いて、葉から透明な表皮の皮を剥がし、９６ウェルの透明底プレートに置いた。水（１００μＬ）を加えた後、傷のストレスの効果を除外するために室温で１２時間、サンプルをインキュベートした。実験の条件により、１ｍＭのＡＣＣ溶液（５５ｍＭの水溶液を２μＬ）、４．８μＭのｆｌｇ２２、あるいはｅｌｆ１８溶液（５μＭ、１００μＭの水溶液）、ＯＤ６００＝０．０２のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌溶液（２μＬのＯＤ６００＝１．０の標準溶液）など、様々な溶液を必要に応じて添加した。ＡＣＣとＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌を含む実験では、室温で１２時間のインキュベートを適用した。一方で、ＰＡＭＰを含む実験では室温で６時間のインキュベートを行なった。続いて、これらの溶液を表皮の皮のサンプルから完全に取り除き、１００μＭのＡＥＰ溶液（ストック溶液から５０μＬ）を添加した。３０分後、溶液を完全に取り除いて水で洗浄後、ＥＴ－ＥＢＦＰ２／Ｃｏｕｍａｒｉｎ／Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ＤＡＰＩ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｓｅｔ　Ｃａｔ＃４９０２１（Ｃｈｒｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏｒｐ．）を取り付けたＫｅｙｅｎｃｅ　ＢＺ－Ｘ７１０　Ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（登録商標）を用いてイメージングを行った。イメージング画像は２０倍率、４０倍率で得られ、明視野像（モノクロ）は４００分の１秒、蛍光画像は３０分の１秒の露出設定で得られた。複数のイメージング画像は４倍率で得て、分析はＢＺ－Ｘ　Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いて行った。
［結果］
果物でのエチレンの空間的検出
　一般的にクリマクテリック型果実は、熟成の過程において自己触媒型エチレン（システム２）の生産が進む。傷によるストレスや病原体感染などの外的な刺激も同様である。この研究ではまず初めに、内因性のエチレンをＡＥＰプローブによって調べた。熟成の間、キウイフルーツでは外側の果皮でＡＣＳアイソジーンのアップレギュレーションを介してエチレン生産量が増加することが報告されている。ＡＥＰを用いたキウイフルーツのイメージング実験では、異なる発達段階（未熟成と熟成）における様々な小器官（外側の果皮や子房室、柱軸）に発現するエチレン生産量の変化を観測することに焦点を当てた。図１５にまとめているように、果実が未熟成から熟成するにつれ、外側の果皮に著しい蛍光強度の増大が観測された。一方、キウイフルーツの子房室と柱軸における蛍光強度の変化はそれほど観測されなかった。これらの結果より、果物の熟成と熟成期間におけるエチレンの発現を検出するのにＡＥＰの使用は有望な手段であることが明らかにされた。
植物中のエチレン検出
　植物中のＡＥＰ検出の効果を調査するために、小さな顕花植物であるシロイヌナズナ（アブラナ科）をモデル植物として選んだ。ＡＥＰによりエチレンの発生を検出できることを確実に示すため、エチレン生成を制御することが知られている低分子とエチレン生成に携わる様々な植物変異体を用いて比較実験を行った。
　この研究では、野生型のモデル植物としてシロイヌナズナのＣｏｌ－０エコタイプを使用した。さらに、ａｃｓ１／２／６／４／５／９／７／１１やｅｔｏ１－１など、広範囲にわたる様々な植物変異体も使用した。変異体ａｃｓ１／２／６／４／５／９／７／１１は８つのＡＣＳ遺伝子をノックアウトした変異体であり、病原体が侵入した際でも、エチレン量が増加しない。これは、ＡＣＳがエチレンの生合成経路に関わる重要な役割を担うからである。さらにもう１つの変異体として、エチレンを過剰生産するｅｔｏ１－１を用いた。ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１（ＥＴＯ１）の発現を通して、プロテアソーム依存的な分解が抑制され、ＡＣＳ活性は正に制御される。これは、タイプＩＩ　ＡＣＳのＣ末端とＥＴＯ１の間の相互作用に基づいている。
　ＡＥＰを添加、あるいは添加せずに、室温にてインキュベートしたＣｏｌ－０のイメージング画像を、図１６に示した。図１７で定量したように、著しい蛍光強度の増大が観測され、それによってシロイヌナズナの表皮の皮におけるエチレン検出にＡＥＰが利用できることが確認された。ポジティブコントロールとして、ＡＣＣによって外因的に刺激されたＣｏｌ－０（のエチレン生産物）と比較した。予想通り、野生型Ｃｏｌ－０に比べてより高い蛍光強度の増大を示した。
［実施例８］　グルコシル化ＡｒＭによるがん細胞に対するｃＲＧＤの選択的タギング
　多くの研究において、環状Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ｃＲＧＤ）ペンタペプチドが、がん細胞表面上に過剰発現されたαｖβ３およびαｖβ５インテグリンを阻害し、細胞外マトリックスへの接着を防止するのに効果的であることが報告されている（Ｊ．Ｓ．Ｄｅｓｇｒｏｓｅｌｌｉｅｒ，　Ｄ．Ａ．Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ　ｉｎ　ｃａｎｃｅｒ：　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．　　Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ　１０，９－２２（２０１０）．；Ｍ．Ｐｆａｆｆ，　Ｋ．Ｔａｎｇｅｍａｎｎ，　Ｂ．Ｍｕｌｌｅｒ，　Ｍ．Ｇｕｒｒａｔｈ，　Ｇ．Ｍｕｌｌｅｒ，　Ｈ．Ｋｅｓｓｌｅｒ，　Ｒ．Ｔｉｍｐｌ，　Ｊ．Ｅｎｇｅｌ，　 Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙｃｌｉｃ　ＲＧＤ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｏｆ　ＮＭＲ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｂｙ　αＩＩｂβ３，αｖβ３，ａｎｄ　α５β１　ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．　　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２０２３３－２０２３８（１９９４）．；およびＭ．Ａｕｍａｉｌｌｅｙ，　Ｍ．Ｇｕｒｒａｔｈ，　Ｇ．Ｍｕｌｌｅｒ，　　Ｊ．Ｃａｌｖｅｔｅ，Ｒ．Ｔｉｍｐｌ，Ｈ．Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ａｒｇ－Ｇｌｙ－６５５　Ａｓｐ　ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ　ｗｉｔｈｉｎ　ｃｙｃｌｉｃ　ｐｅｎｔａｐｅｐｔｉｄｅｓ．　　Ｓｔｒｏｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　６５６　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｔｏ　ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ　ａｎｄ　ｌａｍｉｎｉｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｐ１．　　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．２９１，５０－５４　６５７（１９９１）．）。また、血管内皮細胞上に発現されたインテグリンに対するＲＧＤベースのアンタゴニストが、血管新生の阻害によって腫瘍の退行を促進することが示されている（Ｐ．Ｃ．Ｂｒｏｏｋｓ，　Ａ．Ｍ．Ｐ．Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，　Ｍ．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，　Ｒ．Ａ．Ｒｅｉｓｆｅｌｄ，　Ｔ．Ｈｕ，Ｇ．Ｋｌｉｅｒ，　Ｄ．Ａ．Ｃｈｅｒｅｓｈ，　Ｉｎｔｅｇｒｉｎ　αｖβ３　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｔｕｍｏｒ　ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ　　ｂｌｏｏｄ　ｖｅｓｓｅｌｓ．Ｃｅｌｌ　７９，１１５７－１１６４（１９９４）．；およびＤ．Ｇ．Ｓｔｕｐａｃｋ，　Ｄ．Ａ．Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ　ａｎｄ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．６４，２０７－２３８（２００４）．）。
　本実施例では、グルコシル化ＡｒＭ（ＧＡｒＭ）が、微小転移の播種プロセスを模倣する、単一細胞レベルでのがん細胞の接着を破壊するための選択的細胞タギング（ＳｅＣＴ）療法に使用し得るかを検討した。具体的に、ＨｅＬａを標的とするＧＡｒＭ複合体を癌細胞に選択的に蓄積した後、表面タンパク質にｃＲＧＤを選択的にタグ付けすることで、できるかについて検証した。
８－１．ｃＲＧＤ－ＰＥの調製
　ｃＲＧＤ－ＰＥの調製に用いたスキームは下記のとおりであった：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
（化合物Ｉの調製）
　標準的な固相ペプチド合成手法によって合成した。固相担体から切り離した後、混合物を直接、４０分間にわたる２０－８０％アセトニトリル水溶液（０．１％ＴＦＡ）の線形勾配条件の逆相ＨＰＬＣにより精製した。収量：２．９２ｇ，８９％，ＥＳＩ－ＨＲＭＳ　ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ５３Ｈ８３Ｎ９Ｏ１４Ｓ（［Ｍ＋Ｈ］＋）１１０２．５８５３，ｆｏｕｎｄ　１１０２．５８５９．
（化合物ＩＩの調製）
　化合物Ｉ（９０．１ｍｇ，０．０８３３ｍｍｏｌ）とＥＤＣ（１７．６ｍｇ，０．０９１６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（０．５ｍＬ）に溶かした。続いて溶液を室温で３．５時間撹拌した。ワークアップのため、塩化メチレンを加えて有機層を水／飽和食塩水で洗浄、硫化マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた残渣の質量分析により、目的物の生成を確認した。ＥＳＩ－ＨＲＭＳ　ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ５３Ｈ８１Ｎ９Ｏ１３Ｓ　（［Ｍ＋Ｈ］＋）１０８４．５７４７，ｆｏｕｎｄ　１０８４．５７４４．
　続いてこの得られた保護されたペプチドをＴＦＡ／塩化メチレン（１：１）の溶液に２時間溶かすことにより、脱保護を行った。混合物を減圧下で濃縮し、直接、４０分間にわたる２０－８０％アセトニトリル水溶液（０．１％ＴＦＡ）の線形勾配条件の逆相ＨＰＬＣにより精製した。収量：５４．５ｍｇ，７７％（２工程収率）．ＥＳＩ－ＨＲＭＳ　ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ２７Ｈ４１Ｎ９Ｏ８（［Ｍ＋Ｈ］＋）６２０．３１５１，ｆｏｕｎｄ　６２０．３１６９．
（化合物ＩＩＩの調製）
　アジピン酸（１．０ｇ，６．８４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液を撹拌し、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（３．０ｇ，２７．４ｍｍｏｌ）とＥＤＣ（５．１４ｇ，２７．４ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で２４時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮し、粗生成物を２００ｍＬのアセトンに溶かして２５０ｍＬの１Ｍ塩酸水溶液を滴下した。２時間後、白色沈殿物を濾取し、水とアセトンで洗浄して目的物を得た（１．７５ｇ，７７％）。１Ｈ　ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，２５℃）　δ２．８４（ｓ，４Ｈ），２．８３（ｓ，４Ｈ），２．６７（ｔ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，４Ｈ），１．８９（ｔ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，４Ｈ）；１３Ｃ　ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，２５℃）　１６９．４，１６８．４，３０．７，２５．９，２３．９．ＥＳＩ－ＨＲＭＳ　ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１４Ｈ１７Ｎ２Ｏ８（［Ｍ＋Ｈ］＋）３４１．０９７９，ｆｏｕｎｄ　３４１．０９７３．
（化合物ＩＶの調製）
　化合物ＩＩ（２８．８ｍｇ，０．０３４ｍｍｏｌ）と化合物ＩＩＩ（２３．２ｍｇ，０．０６８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６８０ｍＬ）溶液を撹拌し、ＤＩＥＡ（１６．８μＬ，０．１０ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で２４時間撹拌した後、混合物を直接、化合物Ｉの調製に用いたものと同じ条件の逆相ＨＰＬＣで精製し、目的化合物を得た（１４．０ｍｇ，４３％）。１Ｈ　ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２５℃）　δ７．００（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），６．６８（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），４．７４（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），４．４１（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），４．２６－４．３０（ｍ，２Ｈ），３．９１－３．８６（ｍ，１Ｈ），３．２２－３．１８（ｍ，１Ｈ），３．１４－３．１０（ｍ，１Ｈ），３．０９（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９１－２．８５（ｍ，２Ｈ），２．８４－２．７８（ｍ，５Ｈ），２．５９（ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，２Ｈ），２．６４－２．６０（ｍ，１Ｈ），２．５８（ｄｄ，Ｊ＝１６．５，９．０Ｈｚ，１Ｈ），２．１９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．２２（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．９２－１．８２（ｍ，１Ｈ），１．７４－１．６０（ｍ，６Ｈ），１．５７－１．４４（ｍ，３Ｈ），１．４４－１．３２（ｍ，２Ｈ），１．０９－０．９０（ｍ，２Ｈ）；ＥＳＩ－ＨＲＭＳ　ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ３７Ｈ５３Ｎ１０Ｏ１３　（［Ｍ＋Ｈ］＋）８４５．３７８８，ｆｏｕｎｄ　８４５．３７６９．
（ｃＲＧＤ－ＰＥの調製）
　化合物ＩＶ（４．２ｍｇ，３．９μｍｏｌ）と化合物Ｖ（１．１ｍｇ，７．８μｍｏｌ）のＤＭＦ（２００μＬ）溶液を撹拌し、ＤＩＥＡ（３．３μＬ，１９．６μｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で２４時間撹拌した後、混合物を直接、化合物Ｉの調製に用いたものと同じ条件の逆相ＨＰＬＣで精製し、ｃＲＧＤ－ＰＥを得た（３．２ｍｇ，８５％）。δ１Ｈ　ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，２５℃）　７．０２（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），６．７１（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），４．７６（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），４．７５（ｓ，２Ｈ），４．４４（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），４．２９－４．２０（ｍ，２Ｈ），３．９８（ｓ，２Ｈ），３．９１（ｄｄ，Ｊ＝９．５，３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．２５－３．２０（ｍ，１Ｈ），３．１８－３．１１（ｍ，１Ｈ），３．１１（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．９６（ｓ，１Ｈ），２．８８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），２．８５（ｄｄ，Ｊ＝１６．５，８．０Ｈｚ，１Ｈ），２．５８（ｄｄ，Ｊ＝１６．５，８．０Ｈｚ，１Ｈ），２．２９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．２２（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．９２－１．８４（ｍ，１Ｈ），１．７４－１．６０（ｍ，６Ｈ），１．５９－１．４２（ｍ，３Ｈ），１．４１（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），１．０９－０．８０（ｍ，２Ｈ）；ＥＳＩ－ＨＲＭＳ　ｍ／ｚ　ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ３８Ｈ５５Ｎ１０Ｏ１２（［Ｍ＋Ｈ］＋）８４３．３９９５，ｆｏｕｎｄ　８４３．４００６．
８－２．ＧＡｒＭ複合体の調製
　以前に報告された手法を用いて、末端がα（２，３）－シアル酸の糖鎖－アルデヒドプローブ（Ｒ．Ｓｉｂｇａｔｕｌｌｉｎａ，　Ｋ．Ｆｕｊｉｋｉ，　Ｔ．Ｍｕｒａｓｅ，　Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，　Ｔ．Ｓｈｉｍｏｄａ，　Ａ．Ｋｕｒｂａｎｇａｌｉｅｖａ，　Ｋ．Ｔａｎａｋａ，　　Ｈｉｇｈｌｙ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　“ＲＩＫＥＮ　ｃｌｉｃｋ”　ｐｒｏｂｅ　ｆｏｒ　ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｌｙｓｉｎｅｓ．　　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．５８，１９２９－１９３３　（２０１７）．）、およびクマリンに結合した金触媒（Ｋ．Ｔｓｕｂｏｋｕｒａ，　Ｋ．Ｋ．Ｖｏｎｇ，　Ａ．Ｒ．Ｐｒａｄｉｐｔａ，　Ａ．Ｏｇｕｒａ，　Ｓ．Ｕｒａｎｏ，　Ｔ．Ｔａｈａｒａ，　Ｓ．Ｎｏｚａｋｉ，　Ｈ．Ｏｎｏｅ，　Ｙ．Ｎａｋａｏ，　Ｒ．Ｓｉｂｇａｔｕｌｌｉｎａ，　Ａ．Ｋｕｒｂａｎｇａｌｉｅｖａ，　Ｙ．Ｗａｔａｎａｂｅ，　Ｋ．Ｔａｎａｋａ，　　Ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｇｏｌｄ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｃａｔａｌｙｓｉｓ　ｗｉｔｈｉｎ　ｌｉｖｅ　ｍｉｃｅ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．５６，３５７９－３５８４（２０１７）．）を合成した。
　ヒト血清アルブミン（５．３ｍＬの水溶液、６６．７ｎｍｏｌ）溶液に末端α（２，３）－シアル酸の糖鎖－アルデヒドプローブのＤＭＳＯ溶液（３．８ｍＭのストック溶液から１μｍｏｌ、１５当量、２６０μＬ）を大気下で加えた。溶液を穏やかに撹拌し、３７℃で一晩インキュベートした。続いて溶液をアミコンウルトラ遠心式フィルター（３０ｋＤａ）を用いて濃縮し、水で洗浄した。不溶性の副生成物をデュラポアメンブレン（Ｄｕｒａｐｏｒｅ　ＰＶＤＦ　０．４５μｍ（登録商標））を用いて除去した後、水を加えて希釈し、糖鎖アルブミンの１．０ｍＭストック溶液を得た。結合した糖鎖数の確認は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｍｏｄｅ）を用いて行い、これにより１分子のアルブミン当たり６．２分子の糖鎖が結合した糖鎖アルブミンの分子量（８５．８ｋＤａ）を検出した。プロトコルの次の工程では、糖鎖アルブミン溶液（６６．７ｎｍｏｌ）のＰＢＳ緩衝溶液（６０．６μＬ、ｐＨ７．４）に、クマリン－金複合体（６６．７ｎｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液（６．１μＬ）を加えた。溶液を穏やかに撹拌し、３７度で１時間インキュベートした後、溶液をアミコンウルトラ遠心式フィルター（３０ｋＤａ）を用いて濃縮し、ＰＢＳ緩衝溶液で洗浄することにより、目的のＧＡｒＭ複合体を得た。
（細胞）
　ＨｅＬａ癌細胞は、ＲＧＤ特異的なインテグリン（α５β１、αｖβ３、αｖβ５）を過剰発現していることが知られているため、本研究において、ＨｅＬａ細胞をモデルとして選択した。ＨｅＬａ細胞は、理化学研究所の細胞培養開発室から提供されたものを用いた。
　ＨｅＬａ細胞は、１０％の熱不活性ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＨｅＬａ－Ｌｕｃ細胞株は、１０％ＦＢＳ、および０．０１％ピューロマイシンを含むＤＭＥＭで培養したホタルルシフェラーゼとピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼによるＨｅＬａ細胞の安定なトランスフェクションにより作製した。ＨｅＬａ－Ｖ細胞株は、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、および０．８％ジェネティシンを含むＤＭＥＭで培養したホタルルシフェラーゼとＶｅｎｕｓ（Ｖ）によるＨｅＬａ細胞の安定なトランスフェクションにより作製した。全ての細胞株は５％二酸化炭素を含む３７℃のインキュベーターで増殖させた。マウスマクロファージは既に記載されているように（Ａ．Ｒａｙ，　Ｂ．Ｎ．Ｄｉｔｔｅｌ，　　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｃａｖｉｔｙ　ｃｅｌｌｓ．　　ＪｏＶＥ，ｅ１４８８　７２３（２０１０）．）、０．９％生理食塩水（６ｍＬ）を投与したＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウスの腹腔から採取した。
８－３．ＧＡｒＭのＨｅＬａ細胞への選択性の検証
　ＧＡｒＭがＨｅＬａ細胞に対し、より選択的にターゲティングできるかを確かめるために、一連のフローサイトメトリー研究を行った。クマリン誘導体の蛍光強度はアルブミンに結合すると増加することが知られているので、フローサイトメトリーにおけるλＥｘ＝４０５ｎｍ／λＥｍ＝４７０ｎｍで測定した蛍光強度は、クマリンを結合したＧＡｒＭ複合体が細胞に結合したかどうかの指標となる。
　フローサイトメトリーおよびセルソーティングは、Ｓｏｎｙ　ＳＨ８００　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｅｒ（ソニー株式会社）を用いて、一般的な手法により行った。フローサイトメーターには４０５、４８８、５６１、６３８ｎｍのレーザーが装備されており、ＧＡｒＭ検出の場合にはλＥｘ＝４０５ｎｍ／λＥｍ＝４７０ｎｍ、Ｖｅｎｕｓ（Ｖ）検出の場合にはλＥｘ＝５１５ｎｍ／λＥｍ＝５２８ｎｍの励起／発行波長のゲートをそれぞれ用い、結果はＳｏｎｙ　ＳＨ８００ソフトウェアを用いて解析した。
　まず、細胞培養系で、ＧＡｒＭで処理したＨｅＬａ細胞と処理しなかったＨｅＬａ細胞では、フローサイトメトリーでの明らかなピークの違いがみられた（図１８）。ＧＡｒＭ処理ＨｅＬａ細胞と未処理ＨｅＬａ細胞を混合することにより、この特徴はより強調され、明確に２つとして定義されるピークが見られた。
　次に、コントロール実験として、マウスの腹腔から抽出したマクロファージを用い、ＧＡｒＭの結合能力を調べた。フローサイトメトリーのヒストグラム（図１９）を比較すると、ＧＡｒＭを添加した場合と添加しなかった場合のマクロファージの間にはわずかな違いしか観測されず、これは予想通り、結合性は皆無かそれに近いことを示唆している。
　選択性を検証する最終テストでは、ＧＡｒＭの添加または無添加でインキュベートしたマクロファージとＨｅＬａ細胞の組み合わせを観測した（図２０）。この実験では、ＨｅＬａ細胞とマクロファージを区別して観測するために、Ｖｅｎｕｓ（Ｖ）黄色蛍光タンパク質を発現するＨｅＬａ－Ｖ細胞株を使用した。フローサイトメトリーのプロファイルから、Ｖｅｎｕｓ発現ＨｅＬａ細胞とマクロファージは明確に区別できる。ＧＡｒＭを添加すると、ＨｅＬａ－Ｖ細胞の大部分がＧＡｒＭ結合を表す右上の部分に移動することが分かった。一方、マクロファージではこのような変化は見られなかった。結果として、このデータは、ＧＡｒＭが細胞レベルで優先的にＨｅＬａ癌細胞に結合できることを強く示している。
８－４．細胞接着アッセイ
　インテグリンに基づく細胞接着を妨害するＳｅＣＴ標識試薬（ＧＡｒＭ／ｃＲＧＤ－ＰＥ）の能力は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの細胞接着アッセイにより確認した。細胞接着アッセイは、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍ（ミネアポリス、アメリカ合衆国）から購入したヒト由来フィブロネクチンコーティング９６ウェルマイクロプレート（Ｈｕｍａｎ　Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　Ｃｏａｔｅｄ　９６－Ｗｅｌｌ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ）を用いて行った。
　付着した細胞は、市販のＭＴＳアッセイであるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ　９６　Ａｑｕｅｏｕｓ　Ｏｎｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて定量した。本実験に用いたＨｅＬａ細胞は、増殖培地をＤＭＥＭ（無血清）に交換することにより、実験の１６時間前に血清フリーとした。続いて、細胞を６ｘ１０５　ｃａｌｌ／ｍＬのストック溶液の濃度まで継代培養し、さらなる遠心分離によって残ったトリプシンを除去した。次にＨｅＬａ細胞（細胞ストック溶液から３６０μＬ）、ｃＲＧＤ－ＰＥ（０、１６０、３２０、６４０、１２８０、２５６０、５１２０、１０２４０μＭのストック水溶液から４５μＬ）、そしてＧＡｒＭ（４００μＭのＰＢＳ緩衝溶液から４５μＬ）を用いて、エッペンドルフチューブに混合溶液を調製した。並行して、ＧＡｒＭを４５μＬのＰＢＳ緩衝溶液のみに置き換え、コントロール溶液も準備した。ロッキングシェーカーを用いて室温で１時間、インキュベーションを行った。次に、細胞をスピンダウン（０．８ｐｐｍで４分間）して上澄み液を除いた後、４５０μＬのＤＭＥＭのみ（無血清）に再懸濁する洗浄工程を２回行った。フィブロネクチンコーティング９６ウェルマイクロプレートに、１３０μＬの標識化したＨｅＬａ細胞混合物を各ウェルに添加し、続いてこのプレートを３７℃で１０分間インキュベートした。培地を除去した後、付着した細胞をＰＢＳ緩衝溶液で３～４回洗浄した。非特異的結合細胞を除去するため、断続的にＰＢＳ緩衝溶液を上下にピペッティングした。最後の工程では、１００μＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン－ストレプトマイシン）と２０μＬのＭＴＳ試薬を添加した。３７℃で４時間インキュベートした後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ　ｉＤ３　ｍｕｌｔ－ｍｏｄｅ　ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｓｅｓ、アメリカ合衆国）を用いて４９０ｎｍでの終点の吸光度を得た。
　結果を図２１に示す。フィブロネクチンでコーティングされたプレート上での細胞接着は、予想通り、ＳｅＣＴ標識試薬（ＧＡｒＭ／ｃＲＧＤ－ＰＥ）で処理したＨｅＬａ細胞で著しい違いが観察された。これらの違いは特にｃＲＧＤ－ＰＥの処置濃度が高いと、より明白であり、これは、細胞表面上に触媒的に結合したｃＲＧＤがより高い濃度であることを示している。

Claims (27)

  1. 　タンパク質と金属触媒または有機触媒から選択される触媒との複合体であって、
    　前記タンパク質は、その立体構造内に疎水性スポットを有するタンパク質であり、
    　前記複合体は、前記触媒が親水性環境に暴露されないまたは実質的に暴露されないように、前記触媒を前記疎水性スポット内に収容する、
    複合体。
  2. 　請求項１に記載の複合体であって、
    　前記タンパク質は、天然のまたは人工のタンパク質である、
    複合体。
  3. 　請求項１または２に記載の複合体であって、
    　前記タンパク質は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、トランスフェリン、アンチトリプシン、ハプトグロビン、α１－酸性糖タンパク質、ミオフェルリン（Ｍｙｏｆｅｒｌｉｎ）、Ｔｒｋ受容体、エストロゲン受容体、および葉酸受容体からなる群より選択される、
    複合体。
  4. 　請求項１から３のいずれか１項に記載の複合体であって、
    　前記金属触媒は、ホウ素触媒、マグネシウム触媒、アルミニウム触媒、ケイ素触媒、カルシウム触媒、スカンジウム触媒、チタン触媒、バナジウム触媒、クロム触媒、マンガン触媒、鉄触媒、コバルト触媒、ニッケル触媒、銅触媒、亜鉛触媒、イットリウム触媒、ジルコニウム触媒、ニオブ触媒、モリブデン触媒、ルテニウム触媒、ロジウム触媒、パラジウム触媒、銀触媒、インジウム触媒、スズ触媒、バリウム触媒、ハフニウム触媒、タングステン触媒、レニウム触媒、オスミウム触媒、イリジウム触媒、白金触媒、金触媒、およびランタノイドルイス酸触媒からなる群より選択される、
    複合体。
  5. 　請求項４に記載の複合体であって、
    　前記ランタノイドルイス酸触媒は、イットリビユム触媒、ランタン触媒、セリウム触媒、サマリウム触媒、ユーロピウム触媒、ガドリニウム触媒、テルビウム触媒、ツリウム触媒、およびルテチウム触媒からなる群より選択される、
    複合体。
  6. 　請求項１から５のいずれか１項に記載の複合体であって、
    　前記タンパク質は、ヒト血清アルブミンであり、
    　前記触媒が金属触媒である、
    複合体。
  7. 　請求項６に記載の複合体であって、
    　前記金属触媒は、ルテニウム触媒である、
    複合体。
  8. 　請求項６または７に記載の複合体であって、
    　前記ヒト血清アルブミンの疎水性スポットは、アルブミン薬物結合サイトＩ（ｄｒｕｇ　ｓｉｔｅ　Ｉ）である、
    複合体。
  9. 　請求項６から８のいずれか１項に記載の複合体であって、
    　前記金属触媒は、ヒト血清アルブミンに対するリガンドを介して前記疎水性スポットに結合している、
    複合体。
  10. 　請求項９に記載の複合体であって、
    　前記リガンドは、ワルファリン、アザプロパゾン、アセノクマロール、フェニルブタゾン、サリチル酸塩、インドメタシン、フェニトイン、トルブタミド、クロルプロパミド、イオフェノキサート、ヨジパミド、スルファジメトキシン、フェノプロクソモン、グリベンクラミド、スルファチアゾール、テノキシカム、カンプトテシン、バルジデンデアジ、アンデレラタン、ジアデレアル、アンデレラタン、ジアデレアル、アンデレラタン、ジアデレアルタン、プロダン、ビリルビン、エイコサノイド、およびカルボキシ－メチル－プロピル－フランプロパノエート（尿毒症毒素）、およびクマリンからなる群より選択される、
    複合体。
  11. 　請求項９または１０に記載の複合体であって、
    　前記金属触媒は、前記リガンドに結合したリンカーを介して前記疎水性スポットに結合している、
    複合体。
  12. 　請求項１１に記載の複合体であって、
    　前記リンカーは、両末端にアミノ基およびカルボキシル基を有する、アルキル鎖またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である、
    複合体。
  13. 　請求項１２に記載の複合体であって、
    　前記リンカーは、Ｃ１～Ｃ３アルキルである
    複合体。
  14. 　請求項１から１３のいずれか１項に記載の複合体であって、
    　前記タンパク質の表面が生体内の標的部位と相互作用するように修飾される、
    複合体。
  15. 　請求項１４に記載の複合体であって、
    　前記修飾は、糖鎖による修飾である、
    複合体。
  16. 　請求項１から１３のいずれか１項に記載の複合体であって、
    　前記タンパク質が、生体内の標的部位と相互作用する部分をさらに含む、
    複合体。
  17. 　請求項１４または１５に記載の複合体であって、
    　前記タンパク質は、ヒト血清アルブミンである、
    複合体。
  18. 　請求項１から１７のいずれか１項に記載の複合体を含む組成物。
  19. 　薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物である、請求項１８に記載の組成物。
  20. 　請求項１９に記載の組成物であって、
    　前記複合体によって活性化され得るプロドラッグと組み合わせて使用される、
    組成物。
  21. 　請求項１９に記載の組成物であって、
    　前記複合体によって活性化され得るプロドラッグをさらに含む、
    組成物。
  22. 　請求項１９に記載の組成物であって、
    　特定の細胞を選択的にタギングするために用いられる、
    組成物。
  23. 　請求項２２に記載の組成物であって、
    　前記細胞にタギングされる化学物質と組み合わせて投与される、
    組成物。
  24. 　請求項１８に記載の組成物であって、
    　バイオセンサーとして使用される、
    組成物。
  25. 　請求項１８に記載の組成物であって、
    　エチレンを検出するためのバイオセンサーとして使用される、
    組成物。
  26. 　プロドラッグを含む医薬組成物であって、
    　前記プロドラッグは、請求項１から１７のいずれか１項に記載の複合体によって活性化され得るものであり、
    　前記医薬組成物は、請求項１から１７のいずれか１項に記載の複合体と組み合わせて使用される、
    医薬組成物。
  27. 　組み合わせ医薬であって、
    　請求項１から１７のいずれか１項に記載の複合体を含む第１の薬剤と、
    　前記複合体によって活性化され得るプロドラッグを含む第２の薬剤と
    を含む、組み合わせ医薬。
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