CN103463643B - 人血清白蛋白-钌无机药物复合物的制备及其应用 - Google Patents
人血清白蛋白-钌无机药物复合物的制备及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103463643B CN103463643B CN201310371485.0A CN201310371485A CN103463643B CN 103463643 B CN103463643 B CN 103463643B CN 201310371485 A CN201310371485 A CN 201310371485A CN 103463643 B CN103463643 B CN 103463643B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- human serum
- serum albumin
- ruthenium inorganic
- ruthenium
- drug
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一种人血清白蛋白-钌无机药物复合物的制备及其应用，它是将钌无机药物与人血清白蛋白进行孵育后，浓缩其混合物，再用二次去离子水洗涤反复洗涤至DMSO含量＜0.01%，浓缩，制得人血清白蛋白-钌无机药物复合物，再将该复合物制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂，用于治疗乳腺癌、胃癌、肺癌、结肠癌或肝癌疾病。本发明复合物具有高的血管通透性和截留率，药物选择性聚集在肿瘤细胞中，对正常细胞没有任何影响，明显提高了钌无机药物的靶向性，大大降低了毒性。
Description
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物，具体是人血清白蛋白-钌无机药物复合物的制备及其应用。
背景技术
近年来，钌配合物作为新型抗癌药物被人们广泛的研究。钌配合物由于具有独特的物理和化学性质，国际上普遍认为钌配合物属于低毒性，容易吸收并在体内很快排泄。目前已有上百种钌配合物被合成出来，且NAMI-A和KP1019已完成I期临床试验，正在进入II期临床阶段研究。然而，我们不得不面临一个现实：抗肿瘤无机药物仍然是一把双刃剑，在治疗疾病的同时，不可避免地产生许多副作用，本文中的NAMI-A和KP1019虽然已完成临床一期，但仍具有很大毒副作用。显而易见，如何提高抗肿瘤药物的智能性是人们真正急需攻克的难题。与正常组织相比，肿瘤组织的血管丰富、结构特殊，一个重要的表现就是血管内皮间隙较大，这是病变情况下大分子可透过肿瘤组织血管壁的原因。白蛋白符合大分子物质在肿瘤组织的透过性增强及滞留(enhancedpermeabilityandretention，EPR)效应，所以白蛋白作为药物载体已经在临床上测试扮有日益重要的角色。
发明内容
本发明的目的是提供白蛋白与三种钌无机药物（KP1090、NAMI-A和RIC）复合物的制备、结构以及该复合物在提高肿瘤药物的药效和靶向性方面的应用。
实现本发明目的的技术方案是：
人血清白蛋白-钌无机药物复合物，它是将人血清白蛋白作为钌无机药物靶向生物载体，其制备包括如下步骤：
（1）将钌无机药物与人血清白蛋白孵育；
（2）浓缩；
（3）用二次去离子水洗涤反复洗涤，制得人血清白蛋白-钌无机药物复合物的制备及其应用。
本发明所述钌无机药物的结构式为：
其中：(A)NAMI-A；(B)Ru(ind)；(C)KP1019
所述的孵育过程如下：称取已制备的药物，用DMSO配置成溶液，将药物的DMSO溶液与HSA的水溶液两者按物质的量为1:1混合，DMSO的含量不超过5%，在4℃静置，使两者反应24小时。
本发明人血清白蛋白-钌无机药物复合物的整体结构是心型，六个脂肪酸分子和两个钌无机药物分子不对称的贯穿其中。在人血清白蛋白的IB亚域，三种钌无机药物完全暴露在水环境中，与组氨酸-146配位结合。在IIA亚域，三种钌无机药物结合在大疏水腔中。KP1019和Ru(ind)中的钌离子（III）与赖氨酸-199和组氨酸-242形成配位键。NAMI-A中的氧原子与组氨酸-242形成氢键。
本发明人血清白蛋白-钌无机药物复合物在抗肿瘤中的应用，是将人血清白蛋白-钌无机药物复合物制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂，用于治疗乳腺癌、胃癌、肺癌、结肠癌、肝癌等疾病，其剂量为：60-100μM/L。
通过体外细胞实验，证明本发明的白蛋白-钌无机药物复合物对肿瘤细胞具有抑制作用，且抑制率相比钌无机药物有明显的提高，且对正常细胞的抑制率明显下降。白蛋白-钌无机药物复合物对肿瘤细胞的凋亡和周期比钌无机药物有明显的促进作用。
本发明的优点是：本发明首先将人血清白蛋白开发为钌无机药物的靶向生物载体，使钌无机药物复合物具有高的血管通透性和截留率，药物选择性聚集在肿瘤细胞中，对正常细胞没有任何影响，明显提高了钌无机药物的靶向性，大大降低了毒性。
附图说明
图1为人血清白蛋白-钌无机药物复合物的电子云密度图：(1)NAMI-A[A：IB亚域；D：IIA亚域];(2)RIC[B：IB亚域；E：IIA亚域](3)KP1090[C：IB亚域；F：IIA亚域].绿色表示氯原子，黄色表示硫离子，蓝色表示氮原子，红色表示氧原子。
图2为人血清白蛋白-钌无机药物复合物的整体结构.(A)NAMI-A(B)Ru(ind)(C)KP1090；
图3为钌无机药物在白蛋白与的结合位点和结合腔室.A和D：IB亚域；B和C：IIA亚域
图4为AO/EB双染的细胞形态图：(A)对照组（细胞未加药物）(B)细胞中加入80μM的KP1019(C)细胞中加入80μM的白蛋白-KP1019复合物(D)细胞中加入80μM的Ru(ind)(E)细胞中加入80μM的白蛋白-Ru(ind)复合物.
图5:AnnexinV/propidiumiodide双染法定量检测药物处理24小时候的细胞凋亡(A)对照组（细胞未加药物）(B)细胞中加入80μM的KP1019(C)细胞中加入80μM的白蛋白-KP1019(D)细胞中加入80μM的Ru(ind)(E)细胞中加入80μM的白蛋白-Ru(ind).
图6:流式细胞仪定量检测药物处理48小时候的细胞周期变化(A)对照组（细胞未加药物）(B)细胞中加入80μM的KP1019(C)细胞中加入80μM的白蛋白-KP1019(D)细胞中加入80μM的Ru(ind)(E)细胞中加入80μM的白蛋白-Ru(ind)。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：人血清白蛋白-NAMI-A钌无机药物复合物的制备
NAMI-A根据文献制备：1gRuCl3加入到30ml的乙醇中，回流3小时得到暗绿色溶液，过滤、浓缩至十分之一的初始体积，然后加入1ml浓盐酸和2ml的DMSO中，在80℃中保持15分钟，得到明亮的橙色溶液。冷却溶液至室温，加入10ml丙酮，得橙红色晶体，加入乙醚几滴，加速其结晶，过滤收集。用冷的丙酮20ml洗涤，然后用乙醚洗涤10ml，真空干燥，得1.5g，产率72%。将1.0g的上述产物悬浮在20ml丙酮中，加入0.49g咪唑，搅拌4小时，颜色由橙色变成砖红色，用10ml丙酮和10ml乙醚洗涤，产物在60℃干燥。称取已制备的NAMI-A药物，用DMSO配置成400mM的溶液，将NAMI-A的DMSO溶液与HSA的水溶液两者按物质的量为1:1混合，DMSO的含量不超过5%，在4℃孵育24小时。浓缩HSA与钌无机抗癌药物的混合物，反复用二次去离子水洗涤，使DMSO的含量不超过0.01%，再浓缩至所需体积，即得橙色的白蛋白-钌无机药物复合物。
实施例2：人血清白蛋白-Ru(ind)钌无机药物复合物的制备
Ru(ind)根据文献制备：60-70℃时0.2g,1.7mmol的吲唑溶解在1ml的2NHCl，2ml的Ru(Ⅲ)溶液加入到热的溶液中，立刻出现红棕色的固体。过滤，乙醇和乙醚洗涤，真空干燥，产物1.82g，产率50%。称取已制备的RIC药物，用DMSO配置成100mM的溶液，人血清白蛋白（HSA）用二次去离子水配制成1.5mM的溶液。将RIC的DMSO溶液与HSA的水溶液两者按物质的量为1:1混合，DMSO的含量不超过5%，在4℃孵育24小时。浓缩HSA与钌无机抗癌药物的混合物，反复用二次去离子水洗涤，使DMSO的含量不超过0.01%，再浓缩至所需体积，即得深红色的白蛋白载体钌无机药物。
实施例3：人血清白蛋白-KP1019钌无机药物复合物的制备
KP1019根据文献制备：70℃时吲唑(0.6g;5.1mmol)溶解在8ml的12NHCl中，2ml的Ru(Ⅲ)溶液加入到热的溶液中，在80-90℃时搅拌15分钟，立刻出现赭石色的物质出现，继续搅拌以除去HCl残基，过滤，乙醇和乙醚洗涤，真空干燥得产物0.296g，产率87%。称取已制备的NAMI-A药物，用DMSO配置成400mM的溶液，人血清白蛋白（HSA）用二次去离子水配制成1.5mM的溶液。称取已制备的KP1019药物，用DMSO配置成100mM的溶液，人血清白蛋白（HSA）用二次去离子水配制成1.5mM的溶液。将KP1019的DMSO溶液与HSA的水溶液两者按物质的量为1:1混合，DMSO的含量不超过5%，在4℃孵育24小时。浓缩HSA与钌无机抗癌药物的混合物，反复用二次去离子水洗涤，使DMSO的含量不超过0.01%，再浓缩至所需体积，即得深绿色的白蛋白载体钌无机药物。
实施例4：人血清白蛋白-钌无机药物复合物的结构测定
将HSA(1.5mM,100μL)、饱和十六脂肪酸（2.5mM,960μL)、药物(100mM,1.5μL)混合，孵育24小时，离心去除沉淀，然后浓缩，并用二次去离子水反复洗涤，最后浓缩至100μL，在坐滴板中，通过气相扩散法（26-30%的PEG3350、5%的甘油、5%的2-甲基-1,3-丙二醇）培养适合X－射线衍射的白蛋白-脂肪酸-金属药物复合物晶体。利用上海同步辐射光源收集晶体数据。用HKL2000对数据进行处理后，采用ccp4的molrep程序，以蛋白质数据库中与该蛋白氨基酸序列同源性强的蛋白作为模板，快速旋转和平移函数的寻找适合的模板，并进行整合。如果现有蛋白质数据库中没有同源性强的蛋白能够作为模板，将采用浸泡重原子的方法确定实验相角，从而建立结构模型。获得电子密度图和合适的坐标文件后,将使用Coot,0等程序对结构进行修正。获得适合的模型后,采用Refmac，Phenix，CNS等程序对结构进行精修。
人血清白蛋白-KP1019、Ru(ind)和NAMI-A的复合物的整体结构是心型，六个脂肪酸分子和两个钌无机药物分子不对称的贯穿其中（图2）。在人血清白蛋白的IB亚域，三种钌无机药物完全暴露在水环境中，与组氨酸-146配位结合。在IIA亚域，三种钌无机药物结合在大疏水腔中。KP1019和Ru(ind)中的钌离子（III）与赖氨酸-199和组氨酸-242形成配位键（图1和3）。NAMI-A中的氧原子与组氨酸-242形成氢键。
实施例5：钌无机药物/人血清白蛋白-钌无机药物复合物体外对肿瘤细胞增殖的影响
用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中，用加样器在平底96孔板中间十列的各孔中加入200μl细胞悬液，每孔加0.5×103-10×103个细胞，将培养板放至CO2培养箱中，于37℃湿润环境中温育，待细胞贴壁，肿瘤细胞中加入上述制备的不同浓度的钌无机药物和白蛋白载体钌无机药物处理48小时后，加入MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐），继续培养4h后，弃上清，加入100ml的DMSO，于酶标仪570nm处测光密度值。连续重复3次。得到钌无机药物和白蛋白载体钌无机药物对细胞的半数抑制率值，即IC50。表1显示：相比钌无机药物，白蛋白-钌无机药物复合物对肿瘤细胞的半数抑制率值降低了2-5倍，而对正常细胞HL-7702的半数抑制率值没有影响。
表1：白蛋白-钌无机药物复合物对癌细胞和正常细胞的IC50值
| Drugs/HSA-drugs | MGC-803 | HCT-15 | SKOV-3 | MDA-MB-231 | HL-7702 |
| KP1019 | 158.6±5.9 | 159.3±4.6 | 146.5±7.2 | 110.4±6.3 | 171.6±1.3 |
| KP1019-HSA | 35.3±2.6 | 63.1±5.6 | 50.5±1.7 | 49.4±2.2 | 255.2±1.8 |
| Ru(ind) | 162.9±1.4 | 119.8±3.7 | 124.3±3.9 | 95.1±3.4 | 203.3±2.9 |
| Ru(ind)-HSA | 30.1±3.2 | 65.9±1.2 | 59.2±4.1 | 70.5±5.5 | 245.2±4.7 |
| NAMI-A | — | — | — | — | — |
| NAMI-A-HSA | — | — | — | — | — |
实施例6：钌无机药物/人血清白蛋白-钌无机药物复合物诱导肿瘤细胞凋亡的影响
（1）用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中，用加样器在平底6孔板的各孔中加入2ml细胞悬液，每孔加5×103-100×103个细胞，将培养板放至CO2培养箱中，于37℃湿润环境中温育，待细胞贴壁，肿瘤细胞中加入上述制备的同样浓度的钌无机药物和白蛋白白蛋白载体钌无机药物处理后，以吖啶橙和溴化乙锭联合对细胞进行染色，利用荧光倒置显微镜，定性检测钌无机药物和白蛋白-钌无机药物诱导肿瘤细胞的凋亡情况。图中对照组（图4A）为绿色，凋亡后为黄绿色，有凋亡小体出现。图4C和4E显示：钌无机药物制成白蛋白载体药物后，图5C和5E，细胞凋亡明显比裸药（图4B和4D）增多；
（2）按上述方法处理细胞以FITC-PI双染，采用流式细胞仪，定量检测在不同浓度和孵化时间下，钌无机药物和白蛋白-钌无机药物对肿瘤细胞早期凋亡情况情况。图5显示：白蛋白有助于药物促使细胞凋亡。当浓度均为80μM时，钌无机药物对癌细胞的凋亡率为12.3%（图5B和5D），而白蛋白-钌无机药物复合物对癌细胞的凋亡率增加到22.7%（图5C和5E）。
实施例7：钌无机药物/白蛋白-钌无机药物诱导肿瘤细胞增殖周期的影响
按上述方法处理细胞后，以碘化丙啶（PropidiumIodide，PI）为探针，采用流式细胞仪，定量检测在不同浓度和孵化时间下，无机药物/白蛋白-无机药物对肿瘤细胞周期的抑制情况。图6显示:药物和白蛋白-药物复合物对细胞的阻滞期在G2期。白蛋白-药物复合物（图6C和6E）对G2期的阻滞明显比裸药（图6B和6D）增强。白蛋白更能促进药物阻止或延迟细胞的复制。
Claims (2)
1.人血清白蛋白-钌无机药物复合物的制备方法，其特征是：它是将人血清白蛋白作为钌无机药物的靶向生物载体，其制备方法包括如下步骤：
（1）将钌无机药物与人血清白蛋白孵育：称取钌无机药物，用DMSO配置成溶液，将药物的DMSO溶液与HSA的水溶液两者按物质的量为1:1混合，DMSO的含量不超过5%，在4℃静置，使两者反应24小时，得DMSO与HAS混合物；
（2）浓缩混合物；
（3）用二次去离子水洗涤反复洗涤至DMSO含量＜0.01%，制得人血清白蛋白-钌无机药物复合物；
所述人血清白蛋白钌无机药物复合物呈心型结构，六个脂肪酸分子和两个钌无机药物分子不对称的贯穿其中，在人血清白蛋白的IB亚域，钌无机药物完全暴露在水环境中，与组氨酸-146配位结合，在IIA亚域，钌无机药物结合在大疏水腔中。
2.权利要求1所述人血清白蛋白-钌无机药物复合物在制备治疗乳腺癌、胃癌、肺癌、结肠癌或肝癌疾病的药物中的应用，其特征是：人血清白蛋白-钌无机药物复合物的剂量为60~100μM/L，以抑制肿瘤细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310371485.0A CN103463643B (zh) | 2013-08-23 | 2013-08-23 | 人血清白蛋白-钌无机药物复合物的制备及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310371485.0A CN103463643B (zh) | 2013-08-23 | 2013-08-23 | 人血清白蛋白-钌无机药物复合物的制备及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103463643A CN103463643A (zh) | 2013-12-25 |
| CN103463643B true CN103463643B (zh) | 2015-11-18 |
Family
ID=49788829
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310371485.0A Expired - Fee Related CN103463643B (zh) | 2013-08-23 | 2013-08-23 | 人血清白蛋白-钌无机药物复合物的制备及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103463643B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2020241340A1 (zh) * | 2019-05-24 | 2020-12-03 | ||
| CN113248547B (zh) * | 2021-04-27 | 2022-03-18 | 山西大学 | 一种亚硝酰钌配合物、亚硝酰钌配合物与血清蛋白的复合物及其制备方法和应用 |
-
2013
- 2013-08-23 CN CN201310371485.0A patent/CN103463643B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| A spectroscopic study of the reaction of NAMI, a novel ruthenium(III) anti-neoplastic complex, with bovine serum albumin;Messori,et al;《Eur.J.Biochem》;20001231;第267卷;第1206-1213页 * |
| Characterization of the binding sites of the anticancer ruthenium(III) complexes KP1019 and KP1339 on human serum albumin via competition studies;Orsolya,et al;《J Biol Inorg Chem》;20121018;第18卷;第9-17页 * |
| Control of ligand-exchange processes and the oxidation state of the antimetastatic Ru(III) complex NAMI-A by interactions with human serum albumin;Michael I,et al;《Dalton Trans》;20111231;第40卷;第1322-1331页 * |
| 荧光光谱法研究新型碳硼烷金属有机衍生物与牛血清白蛋白的相互作用;吴春惠等;《光谱学与光谱分析》;20130131;第33卷(第1期);第120-125页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103463643A (zh) | 2013-12-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105452265B (zh) | 用于治疗肿瘤性疾病尤其具有高her2蛋白水平的肿瘤性疾病的他莫昔芬衍生物 | |
| US20190224238A1 (en) | Tumor therapeutic drug | |
| He et al. | Spatiotemporally controlled O 2 and singlet oxygen self-sufficient nanophotosensitizers enable the in vivo high-yield synthesis of drugs and efficient hypoxic tumor therapy | |
| CN103463097A (zh) | 人血清白蛋白-钌无机药物复合物的制备及其应用 | |
| CN103463643B (zh) | 人血清白蛋白-钌无机药物复合物的制备及其应用 | |
| CN109568299A (zh) | 氨溴索在制备肿瘤化疗药物增效制剂中用途 | |
| CN104910196B (zh) | 一种手性四核铜基有机金属框架及其制备方法和应用 | |
| CN102657674B (zh) | 一种具有抗癌活性拟康氏木霉胞外多糖的应用 | |
| JP2021505574A (ja) | 植物由来の環状ペプチドを有効成分とする腫瘍細胞異常脂質代謝阻害剤およびその使用 | |
| CN103463641B (zh) | 人血清白蛋白-钌无机药物复合物的制备及其应用 | |
| CN107213145A (zh) | 细锥香茶菜乙素在制备抑制食管鳞癌细胞增殖的产品中的应用 | |
| CN104058946B (zh) | 具有抗肿瘤活性的大黄素过渡金属配合物、制备方法及其应用 | |
| CN103463642B (zh) | 人血清白蛋白-钌无机药物复合物的制备及其应用 | |
| CN116650474A (zh) | 苍耳亭的医药新用途 | |
| CN109810113A (zh) | 一种生物碱化合物及其制备方法与应用 | |
| CN108690090A (zh) | 一种钌的Schiff碱配合物的制备方法及其抗肿瘤的应用 | |
| CN113117078B (zh) | 一种肿瘤治疗新药物AuNCs@GTTN及其制备方法和应用 | |
| CN100556404C (zh) | Tagalsin C及其同系物在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
| CN104306373B (zh) | 一种苯基恶唑类化合物在制备治疗癌症的药中的应用 | |
| CN103751210B (zh) | 一种天然多种形态砷的提取液的应用 | |
| CN102503892A (zh) | 含钴夹心杂多酸及其合成方法和应用 | |
| CN106565849B (zh) | 一种景天三七多糖的制备方法及其应用 | |
| CN104974214A (zh) | 商陆皂苷元氨基胍衍生物Hu-17及其制备方法 | |
| CN109251224A (zh) | 同时具有化疗和光疗抗肿瘤作用的铱配合物及其制备方法和应用 | |
| CN101569619B (zh) | 乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物的用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Yang Feng Inventor after: Zhang Yao Inventor after: Liang Hong Inventor after: Li Mei Inventor before: Yang Feng Inventor before: Liang Hong Inventor before: Li Mei Inventor before: Zhang Yao |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20151118 Termination date: 20190823 |