CN101569619B - 乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物的新用途。该新用途为乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物或此类化合物的盐或溶剂合物在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物对多种肿瘤细胞具有很强杀伤作用，且呈明显的剂量-效应关系和时间-效应关系。因此，本发明为肿瘤治疗和/或预防复发的实践及研究提供了新的途径，还可作为试剂(工具药)用于与细胞周期、细胞增殖、凋亡及一些信号通路调控相关的实验研究，本发明将在肿瘤的治疗和复发的预防中会有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物或其盐或其溶剂合物的新用途。
背景技术
恶性肿瘤(通称癌症)，是危害人类健康的最重要的疾病之一。据WHO最新报告，全球每年肿瘤新发病人口已达1000万，死亡600万，且呈上升趋势。预期到2020年每年新发病人数将达2000万。据最新流行病学调查，我国自2003年恶性肿瘤死亡人数无论在城市或农村均已居各种死亡的首位，成为对人民健康的最大威胁。2000年癌症发病人数180～200万，死亡140～150万。我国肝癌(hepatoma)占世界发病人口的50～55％，在我国各种癌症死因中占第二位，而且复发率和病死率均高，被称为“癌中之王”。肝癌包括肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，肝内胆管癌和发生在儿童的肝母细胞瘤(hepatoblastoma)。肝癌中绝大部分是HCC，而且与乙肝病毒(HBV)或/和丙肝病毒(HCV)感染相关。
癌症属于细胞的遗传性疾病，具有抵抗凋亡、增殖失控、分化异常、迁移/侵袭增强等恶性表型，主要由一系列癌基因活化和抑癌基因失活以及发挥调控作用的microRNA表达异常等所致。许多癌基因如ras、c-myc、c-jun、bcl-2、wnt、cyclin D1、cyclin E和AKT等和抑癌基因如Rb、p53、p27、p16、bax、bak、pten等在多种肿瘤细胞中发生突变、扩增或表达异常，导致肿瘤的发生、发展和转移。例如，抑癌基因p53在约50％的恶性肿瘤发生突变或功能缺失，其中47～62％的肝癌、50～70％的结直肠癌、50～80％的膀胱癌和卵巢癌、60～70％的黑色素瘤、25～75％的肺癌、15～50％的乳腺癌都存在p53基因突变。而人体恶性肿瘤大约有50％与ras基因突变有关，如90％胰腺癌、50％结肠癌，40％肺癌、膀胱癌和甲状腺癌都有ras基因突变。c-myc与多种癌症的发生有关，如乳腺癌、结肠癌、小细胞肺癌、宫颈癌、骨肉瘤、黑色素瘤和髓系白血病等，而且与肿瘤的侵袭性和低分化有关。cyclinD1过表达见于B细胞淋巴瘤、甲状旁腺癌、胃癌、喉癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、食管癌、乳腺癌等，其中乳腺癌、直肠癌和头颈部鳞癌的过表达率分别高达60％、40％、40％，而且头颈部鳞癌的cyciinD1过表达与颈部淋巴结转移及临床分期有关。再者，体内实验证实Bcl-2抑制剂具有明显的抗肿瘤活性，可作为新药发现和临床试验的靶点。凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2相互拮抗，许多抗癌药物通过降低Bcl-2/Bax比值来杀伤肿瘤细胞。此外，PI3K/AKT、Ras/ERK、Wnt/β-catenin等信号途径在多种 恶性肿瘤因过度活化而参与肿瘤的发生、发展和转移。例如，PI3K/AKT信号通路可调节细胞的存活、增殖、迁移和代谢。PI3K由p110催化亚单位和p85α调节亚单位组成。卵巢癌有p110的扩增、p85α的突变；乳腺癌有AKT的扩增、过表达和活性增加；肝癌、前列腺癌等有AKT的过表达。这些在PI3K和AKT基因结构、表达水平和磷酸化修饰上的改变都可引起PI3K/AKT信号通路的过度活化，导致细胞抵抗凋亡、加速增殖、增强迁移，参与肿瘤生成和转移。因而指向PI3K/AKT信号途径的靶向小分子药物已成为一个重要的抗肿瘤治疗策略。Ras/ERK和Wnt/β-catenin等信号通路也如此。
各国每年投入大量的人力、物力和财力研究和开发新的抗癌药物和方法，但至今能广谱治愈多种癌症的理想药物和方法尚且十分匮乏。传统的细胞毒性化疗药物副作用多、毒性大，常常难以坚持使用或产生多药耐药性。随着分子生物学的发展和人类基因组计划的完成，人们在不断改进和优化传统疗法的同时，又开发了许多靶向性新药及新技术方法。生物工程药物给肿瘤患者带来了新的希望，但技术上尚未成熟，仍存在许多问题需要解决。首先生物工程药物临床疗效常与理论预期效果不符甚至相去甚远，其次是生物工程药物的体内靶向性并不理想，而且肿瘤仍易复发，有些药物毒副作用仍然比较大；再次是生物工程药物还存在着免疫清除和排斥作用，基因工程药物由于改变了遗传物质因而有引发其他新肿瘤的风险，故而生物工程药物尚在探索研究之中，还不能广泛应用于临床。针对特定肿瘤之一定靶标的靶向性小分子抗癌化合物具有特异性强、低毒、高效的特点，因此筛选靶向性小分子抗癌化合物是当前发现新抗癌药物的重要途径。小分子化合物也可作为“弹头”与抗体结合用做生物工程药物。总之，筛选小分子抗癌药物是十分必要和迫切的。药物的筛选是发现新抗癌药物的前提和基础。小分子抗癌化合物可来源于天然物的分离、提取或以其为先导化合物经过加工改造增效或化学合成。
LAPTM4B(lysosomal protein transmembrane 4 beta，曾用名lysosomal-associa tedprotein transmembrane 4 beta，中译名“溶酶体4次穿膜蛋白B”)基因(专利号ZL02158110.X)是在人类肿瘤的发生、发展和转移中具有关键性作用，在肿瘤的诊断和治疗中具有实用价值的新基因。其在NCBI database中的RefSeq(确认序列)为NM_018407，Gene ID为55353。LAPTM4B基因定位于染色体8q22.1，编码一个全长35kDa的蛋白质和一个N端截短了91个氨基酸序列的24kDa蛋白质，分别命名为LAPTM4B-35和LAPTM4B-24。它们具有四个穿膜区，两个胞外区(EC1和EC2)，N-端和C-端序列(尾)位于胞质中。EC1有一个N糖基化位点，N-端尾具有脯氨酸富集结构域(Pro-rich domain)和PPRP基序，C-端尾具有多个溶酶体定位信号和唯一的酪氨酸残基(Tyr285)磷酸化位点，两端的尾部有多个丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)残基磷酸化位点。Northern Blot检测显示LAPTM4B mRNA在多种癌组织以高频率出现显著的表达上调，包括87.3％HCC、88％人肺癌、50.9％乳腺癌、68％子宫癌、67％结肠癌和68％的卵巢癌。免疫组化分析显示，LAPTM4B-35蛋白同样在多种恶性肿瘤中表达显著升高，已知的包括85％肝癌、72％肝外胆管癌、76％胆囊癌和63.5％卵巢癌。通过Western Blot和免疫组化分析证明，LAPTM4B-35蛋白在前列腺癌、肾癌、膀胱癌的表达也显著升高；在多种体外培养的人类恶性肿瘤细胞系中也高表达，包括肝癌细胞系BEL7402、QGY-7701、SMMC-7721、HLE、Huh7和HepG2肝母细胞瘤、宫颈癌细胞系HeLa、前列腺癌细胞系PC-3M、肺巨细胞癌细胞系BE1及分泌ACTH的垂体腺瘤细胞系等，其在L02人肝细胞系及胎肝细胞系(FLC)表达水平较低。体外实验证明，LAPTM4B基因及其编码的LAPTM4B-35蛋白的过表达可促进细胞存活(抵抗凋亡)、增殖、迁移和侵袭，即促进细胞的恶性转化和增强癌细胞的转移潜能。动物体内实验证明，转染LAPTM4BcDNA而致LAPTM4B-35蛋白过表达可使来自于正常人肝的L02细胞系在裸鼠体内成瘤；并增强人肝癌细胞系HepG2和BEL7402细胞在裸鼠体内之移植瘤的生长速度和远处(包括肺和淋巴结)转移。反之，通过siRNA干扰技术敲低LAPTM4B基因及其编码的LAPTM4B-35蛋白的表达则抑制肿瘤细胞的上述恶性表型以及裸鼠移植瘤在体内的生长速度和远处转移。而LAPTM4B-24的功能则与LAPTM4B-35相反，上调其表达可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，抑制癌细胞的迁移和侵袭，并使癌细胞丧失成瘤性。过表达的LAPTM4B基因及其编码的LAPTM4B-35蛋白促进恶性转化、肿瘤生成和转移的作用机制涉及其对多条信号通路的活化以及活化后的分子效应，包括PI3K-AKT(PKB)、ECM-integrin-FAK和RTK-Ras-ERK/MAPK等信号通路，以及因之上调的癌基因和存活相关基因，如c-fos、c-myc、cyclinD1、bcl-2等，和下调的抑癌基因和凋亡相关基因，如p27、p53、bak、bax等。以上事实说明，LAPTM4B基因及其编码的LAPTM4B-35蛋白可作为多种肿瘤治疗中的关键性靶基因。乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物目前主要用于抗寄生虫、抗病毒方面的研究和治疗。如，乙二醛基双缩氨硫脲类似物酞丁安已用于抗疱疹病毒的临床治疗。至今未见关于乙二醛双缩氨基硫脲类化合物靶向抑制人类肿瘤的研究报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物或其盐或其溶剂合物的新用途。
本发明所提供的乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物或其盐或其溶剂合物的新用途为其在制备抗肿瘤药物中的应用；
所述乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物的结构式如式I所示：
其中，R1和R2可为如下1)或2)所述：
1)R1可选自C1-6烷基、烷氧基取代C1-6烷基、腈基取代C1-6烷基、苯基取代C1-6烷基、环烷基取代C1-6烷基、芳基取代C1-6烷基或杂环基取代C1-6烷基；其中，所述芳基是未被取代的芳基或是被下述至少一种基团取代的芳基：C1-6烷基、C1-6烷氧基、硝基、氨基、卤素、腈基；所述杂环基是未被取代的杂环基或是被下述至少一种基团取代的杂环基：C1-6烷基、C1-6烷氧基、硝基、氨基、卤素、腈基；
R2可选自氢、烷基、烷氧基取代烷基、苯基取代烷基、卤素取代烷基和杂环基取代烷基；
2)R1和R2稠合成五元或六元脂环。
所述乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物具体为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(R1为乙基，R2为氢)、3-甲氧基-2-氧代丁醛双缩氨硫脲(R1为α-甲氧基乙基，R2为氢)、丙酮醛双缩氨基硫脲(R1为甲基，R2为氢)、3-乙氧基-2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(R1为α-乙氧基乙基，R2为氢)或3-氧代丁酮双缩氨基硫脲(R1为甲基，R2为甲基)。
所述乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物的盐是指其在药学上可接受的盐，包括各种无机酸盐或有机酸盐(如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、扁桃酸盐和草酸盐)，各种无机碱盐或有机碱盐(如钠盐、钙盐和N-甲基-葡萄糖胺盐)。
本发明的乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物也可以溶剂合物(包括水合物)的形式存在。例如：在重结晶时这些化合物与一个或若干个单位的水或其它溶剂分子形成结晶。
所述肿瘤可为LAPTM4B-35蛋白和/或其编码基因过表达的，或LAPTM4B-35蛋白所介导的信号通路过度活化的肿瘤。
所述肿瘤具体可为各种肝癌(包括肝细胞癌、肝母细胞瘤、肝内胆管癌)、肺癌、乳腺癌、子宫体癌、子宫颈癌、卵巢癌、结肠癌、肝外胆管癌、胆囊癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、胃癌或食管癌。
所述肝癌的细胞系为肝癌BEL7402、HepG2或HLE细胞系；所述子宫颈癌的细胞系为 HeLa；所述乳腺癌细胞系为MCF-7；所述前列腺癌细胞系为PC-3；所述食管癌细胞系为TE-1细胞；所述胃癌的细胞为AGS。
所述LAPTM4B-35蛋白介导的信号通路具体可为PI3K-AKT(PKB)信号通路、ECM-integrin-FAK信号通路或RTK-Ras-ERK/MAPK信号通路。
本发明的另一个目的是提供一组抗肿瘤药物。
本发明所提供的抗肿瘤药物，其活性成份为乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物和/或其盐和/或其溶剂合物；其中，所述乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物的结构式及其中R1取代基团、R2取代基团的组成均如上所述。
所述乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物具体为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(R1为乙基，R2为氢)、3-甲氧基-2-氧代丁醛双缩氨硫脲(R1为α-甲氧基乙基，R2为氢)、丙酮醛双缩氨基硫脲(R1为甲基，R2为氢)、3-乙氧基-2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(R1为α-乙氧基乙基，R2为氢)或3-氧代丁酮双缩氨基硫脲(R1为甲基，R2为甲基)。
所述化合物盐及所述化合物的溶剂合物也如上。所述肿瘤的种类也如上。
本发明药物由上述活性成分与可药用载体或赋形剂组成。可制成片剂、胶囊剂、缓释剂、口服液、注射剂等；一般通过肠道或肠道外途径给药。
乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物或其盐或其溶剂合物在制备催化LAPTM4B-35或AKT磷酸化的激酶抑制剂中的应用也属于本发明的保护范围。所述化合物盐及所述化合物的溶剂合物也如上。所述肿瘤的种类也如上。
本发明的实验证明，乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物对多种肿瘤细胞具有很强的杀伤作用，且呈明显的剂量-效应和时间-效应关系，杀伤效果也相仿，例如2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)对HepG2肝癌细胞的半数杀伤浓度(LC50)为0.5μmol/L，对BEL7402肝癌细胞的半数杀伤浓度(LC50)为0.6μmol/L。本发明的新用途揭示了乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物可以抑制人类肿瘤的裸鼠移植瘤和小鼠肿瘤在体内的生长和转移，延长荷瘤小鼠的寿命。
本发明还证明，2-氧代丁醛双缩氨基硫脲对肿瘤细胞的杀伤作用与顺铂、阿霉素等细胞毒抗肿瘤药物不同，其杀伤作用依赖于LAPTM4B基因及其编码的LAPTM4B-35蛋白的高表达；并可降低LAPTM4B-35蛋白分子中唯一的一个可发生磷酸化的酪氨酸残基(Tyr285)的磷酸化水平，可能是催化LAPTM4B-35酪氨酸残基(Tyr285)磷酸化作用之磷酸激酶的抑制剂或脱磷酸作用之磷酸酶的激动剂。LAPTM4B-35蛋白的磷酸化是其所介导的信号途径的启动步骤。IMMLG-597还可降低AKT的磷酸化水平，可能也是催化AKT磷酸化之激酶的抑制剂，也可能是通过抑制LAPTM4B-35酪氨酸残基磷酸化从而抑制了 PI3K/AKT通路的活化(磷酸化)。总之，以2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)为代表的乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物对人类肿瘤细胞的杀伤作用是以LAPTM4B基因及其编码的LAPTM4B-35蛋白为靶标的靶向性抗肿瘤小化合物。本发明人曾公布LAPTM4B-35蛋白在多种人类肿瘤和体外培养的肿瘤细胞过表达，并通过激活PI3K/AKT等信号通路而促进肿瘤细胞抵抗凋亡和失控增殖。2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)的作用在肿瘤细胞所产生的效果表现为抑制AKT的磷酸化(即抑制PI3K/AKT通路的活化)、促进细胞凋亡、抑制细胞增殖。再者，2-氧代丁醛双缩氨基硫脲类化合物可引起肿瘤细胞中一系列与凋亡和增殖相关之蛋白质水平的改变；而且这些蛋白质分子(包括磷酸化p53，磷酸化AKT，caspase 3，Bcl-2，Bax，c-Myc，cyclinD1等)在2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)的作用下发生改变的方向(上调或下调)刚好与LAPTM4B-35蛋白过表达所致肿瘤细胞中之蛋白质水平的改变方向相反。故而，2-氧代丁醛双缩氨基硫脲所致的上述这些在细胞和分子水平的表型改变都与LAPTM4B-35过表达所产生的后续效应相悖，从而为LAPTM4B-35蛋白作为乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物杀伤肿瘤的靶标提供了进一步的佐证。
本发明的发明人突破现有的思维，通过大量的实验，发现乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物或乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物的盐或其溶剂合物对LAPTM4B-35蛋白和/或其编码基因过表达的、或LAPTM4B-35蛋白介导的信号通路过度活化的肿瘤具有很强的杀伤作用，且呈明显的剂量-效应关系和时间-效应关系。体外细胞试验表明，2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)、3-甲氧基-2-氧代丁醛双缩氨硫脲(WL-07-5)、丙酮醛双缩氨基硫脲(WL-07-19)、3-乙氧基-2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(WL-07-21)和3-氧代丁酮双缩氨基硫脲(WL-07-23)对BEL7402肝癌细胞的半数杀伤浓度(LC50)分别为：0.6μmol/L(IMMLG-597)、1.2μmol/L(WL-07-5)、0.5μmol/L(WL-07-19)、0.45μmol/L(WL-07-21)和36.9μmol/L。本发明前4种化合物的LC50都比顺铂(8.12μmol/L)等细胞毒抗肿瘤药低，而且毒性也低。
本发明化合物以LAPTM4B-35蛋白或LAPTM4B-35蛋白介导的信号通路为靶点，能杀伤多种人类肿瘤，且杀伤力强，撤药后不发生逆转，毒副作用低。
因此，本发明公布了一个肿瘤治疗的新靶标和一组治疗肿瘤的新化合物，为治疗肿瘤和/或预防肿瘤复发及转移的实践及研究提供了新的途径，还可作为试剂(工具药)用于与细胞周期、细胞增殖、凋亡及一些信号通路调控相关的实验研究，本发明将在肿瘤的治疗和复发/转移的预防中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)的合成图。
图2为几种2-氧代丁醛双缩氨基硫脲类化合物对BEL7402细胞的显著杀伤作用。
图3为2.0μM 2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)杀伤人类恶性肿瘤HepG2细胞的荧光双染图。A为给药组，可见死亡细胞(红染细胞)增多；B为对照组。
图4为25.0μM IMMLG-597对人类FLC胎肝细胞没有显示杀伤作用(荧光双染图)。A为给药组，未见死亡细胞(红染细胞)增多；B为对照组。(1)显示活细胞，(2)显示死细胞，(3)显示二者的叠加图。
图5为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)对多种人类肿瘤细胞的杀伤作用。5A为IMMLG-597对人类BEL7402肝细胞癌、HepG2肝母细胞瘤、HLE肝癌、HeLa宫颈癌等细胞的剂量依赖性杀伤作用(1.FLC细胞；2.HepG2细胞；3.BEL7402细胞；4.HLE细胞；5.HeLa细胞)；图5B为IMMLG-597对人类乳腺癌、食管癌、肝癌、前列腺癌和胃癌细胞的剂量依赖性杀伤作用(1.MCF7细胞(人乳腺癌)；2.TE-1细胞(人食管癌)；3.HepG2细胞(人肝癌)；4.PC3细胞(人前列腺癌)；5.AGS细胞(人胃癌))。
图6为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)对小鼠H22肝癌细胞具有显著的杀伤作用。
图7为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)浓度递增200倍依然未见对人类正常胎肝细胞有不利于存活和增殖的影响。
图8为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)对人类恶性肿瘤的杀伤作用具有剂量-效应关系。
图9为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)对人类恶性肿瘤的杀伤作用具有时间-效应关系。
图10为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)对人类肿瘤细胞的杀伤作用不因撤除药物而逆转。
图11为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)对肿瘤细胞的体外杀伤作用的有效浓度低于细胞毒类的抗肿瘤药物顺铂、阿霉素、丝裂霉素和5-氟尿嘧啶(1.5-氟脲嘧啶；2.IMMLG-597；3.阿霉素；4.顺铂；5.丝裂霉素)。
图12为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)可延长腹水型H22肝癌荷瘤小鼠的寿命。
图13为不同剂量2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)及顺铂(2mg/kg)、丝裂霉素(2mg/kg)对人肝癌裸鼠移植瘤的生长抑制曲线(1.溶剂对照；2.空白对照；3.IMMLG-597小剂量组(5mg/kg)；4.IMMLG-597中剂量组(15mg/kg)；5.顺铂(2mg/kg)；6.丝裂霉素 (2mg/kg)；7.IMMLG-597大剂量组(45mg/kg))。
图14为不同剂量2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)及顺铂(2mg/kg)、丝裂霉素(2mg/kg)对人肝癌裸鼠移植瘤的生长具有显著抑制作用。
图15为人肝癌裸鼠移植瘤的病理学鉴定图(×100)。
图16为人肝癌裸鼠移植瘤的淋巴结转移灶病理学鉴定图(×100)。
图17为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)对人肝癌裸鼠移植瘤之淋巴结转移的抑制效果。
图18为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)在治疗剂量所致荷人肝癌裸鼠的体重下降(消瘦)低于临床常用的细胞毒抗癌药。
图19为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)引起人肝癌HepG2细胞凋亡。
图20为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)增加人肝癌细胞中磷酸化(稳定型)的p53蛋白。
图21为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)增加人肝癌细胞中促凋亡的Bax蛋白。
图22为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)减少人肝癌细胞中c-Myc蛋白的时间-效应关系。
图23为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)减少人肝癌细胞中c-Myc蛋白的剂量-效应关系。
图24为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)减少人肝癌细胞中cyclin D1的时间-效应关系。
图25为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)减少人肝癌细胞中抗凋亡的Bcl-2蛋白。
图26为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)减少人肝癌细胞中磷酸化(活化)的AKT。
图27为敲低LAPTM4B基因的表达可致2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)对HepG2细胞的杀伤作用减弱。(药物作用时间48小时)。(1.HepG2-RNAi；2.HepG2-MOCK；3.HepG-母本)
图28为敲低LAPTM4B基因的表达不影响阿霉素和顺铂对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用。A为阿霉素对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用，B为顺铂对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用。(1.HepG2-MOCK；2.HepG2-RNAi)
图29为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)显著减少酪氨酸磷酸化的 LAPTM4B-35蛋白，并随作用时间的延长而加剧。
图30为2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)不影响LAPTM4B-35蛋白的表达水平，但显著减少酪氨酸磷酸化的LAPTM4B-35蛋白。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所使用的统计方法采用t检验和单因素方差分析。
LCR/JCL小鼠(4-6周龄)购自北京大学医学部实验动物部；BALB\c-nude小鼠(4-6周龄)购自北京维通利华实验动物技术有限公司；人肝母细胞瘤细胞系HepG2(Nagamine T，et al.，Nutr Cancer.2009；61：340-7)；人肝细胞癌细胞系BEL7402(GZ Shao et al.，Oncogene，2003，22：5060-9.购自中科院细胞所)；人子宫颈癌细胞系HeLa(LIU XR etal.，World J Gestroenterology，2004，10(11)：1555-9)；人低度恶性肝癌细胞系HLE(GZ Shao et al.，Oncogene，2003，22：5060-9)，人胚胎肝细胞系FLC(购自医科院基础医学研究所，产品目录号为CCC-HEL-1)，人HepG2-shRNA和HepG2-Mock细胞系(周柔丽，杨华，熊富霞等，第9届全国细胞生物学学术会议摘要p.52，2007，广州)，小鼠肝癌细胞系H22(GZ Shao et al.，Oncogene，2003，22：5060-9)；乳腺癌的细胞MCF-7细胞(Thomadaki H et al.，Biol Chem.2006；387(8)：1081-1086)；前列腺癌的细胞PC-3细胞(Feng S et al.，Ann N Y Acad Sci.2009；1160：379-380)；食管癌的细胞TE-1细胞(Arai M et al.，Oncol Rep.2008；20：405-412)；胃癌的细胞GAS细胞(Chang HJet al.，Anticancer Res.2007；27(5A)：3411-3417).
实施例1、化合物及其制备
一、2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)及其制备
(一)制备方法：制备过程如图1所示。
步骤1：2-氧代丁醛的合成：在250mL圆底烧瓶中，加入等摩尔量的2-丁酮和二氧化硒(0.25mol)，再加入180mL二氧六环和12mL去离子水。加热回流6小时(至析出接近理论量的硒为止)。趁热过滤除去硒，蒸除溶剂后，油泵减压蒸馏，得到金黄色液体2-氧代丁醛6.4g，收率30％。步骤2：2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)的合成：在50mL圆底烧瓶中加入2.2mol氨基硫脲和10mL 5％冰醋酸-95％乙醇(v/v)溶液，控制反应温度为50℃，在30～40min内，加入1mol 2-氧代丁醛的5mL乙醇溶液；加料完成后，25℃搅拌12小时，过滤得粗品。用10mL甲醇-水重结晶，得黄色粉末150mg，收率65％。
M.p.：232～236℃。1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)：δ0.910(t，3H，J＝7.5Hz，CH3)，2.768(m，2H，J＝7.5Hz，CH2)，7.568(s，1H，NH2)，7.818(s，1H，NH2)，7.883(s，1H，NH2)，8.292(s，1H，NH2)，8.360(s，1H，NH2)，10.536(s，1H，NH)，11.630(s，1H，NH)。13C-NMR(125MHz，DMSO-d6)：δ10.633，16.736，141.800，151.397，178.113，178.860。MW：232，ESI-MS：255(M+Na+)。鉴定，2-氧代丁醛双缩氨硫脲的化学结构式如式II所示。
二、3-甲氧基-2-氧代丁醛双缩氨硫脲(WL-07-5)的合成：
步骤1：3-甲氧基-2-氧代丁醛的合成：在250mL两口瓶中加入40mL巴豆醛，加热至回流。将22g SeO2的40mL MeOH溶液通过滴液漏斗滴加至两口瓶中，加热回流2.5h。趁热过滤除去硒，蒸除溶剂后，油泵减压蒸馏，得到浅黄色液体3-甲氧基-2-氧代丁醛。步骤2：3-甲氧基-2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(WL-07-5)的合成：在50mL圆底烧瓶中加入2.2mol氨基硫脲和10mL 5％冰醋酸-乙醇(v/v)溶液。控制反应温度为50℃，在30～40min内，加入1mol 3-甲氧基-2-氧代丁醛的5mL乙醇溶液。加料完成后，室温搅拌12小时，过滤得粗品。用10mL甲醇重结晶，得黄色粉末138mg，收率53％。M.p.：212～214℃。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ1.07(s，3H，CH3)，3.00(m，1H，CH2)，3.30(s，3H，CH3)，7.50(s，1H，CH)，7.75(s，4H，NH2)，11.29(s，2H，NH)。IR(KBr)：1600(C＝S)cm-1.MW：262，FAB-MS：263(M+H+)。WL-07-5的化学结构式如式III所示。
三、丙酮醛双缩氨基硫脲(WL-07-19)的合成：
在50mL圆底烧瓶中加入2.2mol氨基硫脲和10mL 5％冰醋酸-乙醇(v/v)溶液。控制反应温度为50℃，在30～40min内，加入1mol丙酮醛的5mL乙醇溶液。加料完成后，室温搅拌12小时，过滤得粗品。用10mL甲醇-水重结晶，得黄色粉末137mg，收率63％。M.p.：248～249℃。1H-NMR(90MHz，DMSO-d6)：δ2.15(s，3H，CH3)，7.65(s，1H，CH)，7.7-7.9(broad，4H，NH2)8.1-8.3(broad，2H，NH)。IR(KBr)：1600(C＝S)cm-1.MW：218，FAB-MS：219(M+H+)。WL-07-19的化学结构式如式IV所示。
四、3-乙氧基-2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(WL-07-21)的合成
步骤1：3-乙氧基-2-氧代丁醛的合成：在250mL两口瓶中加入40mL巴豆醛，加热至回流。将22g SeO2的40mL EtOH溶液通过滴液漏斗滴加至两口瓶中，加热回流2.5h。趁热过滤除去硒，蒸除溶剂后，油泵减压蒸馏，得到浅黄色液体3-乙氧基-2-氧代丁醛。步骤2：3-乙氧基-2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(WL-07-21)的合成：在50mL圆底烧瓶中加入2.2mol氨基硫脲和10mL 5％冰醋酸-乙醇(v/v)溶液。控制反应温度 为50℃，在30～40min内，加入1mol 3-乙氧基-2-氧代丁醛的5mL乙醇溶液。加料完成后，室温搅拌12小时，过滤得粗品。用10mL甲醇重结晶，得黄色粉末168mg，收率61％。M.p.：202～204℃。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ1.16(t，3H，J＝7.2Hz，CH3)，1.28(d，3H，J＝6.4Hz，CH3)，3.29(m，1H，CH2)，3.52(m，1H，CH2)，5.23(m，1H，CH)，7.56(s，1H，CH)，8.02(s，1H，NH2)，8.07(s，1H，NH2)，8.34(s，1H，NH2)，8.62(s，1H，NH2)，10.96(s，1H，NH)，11.58(s，1H，NH)。IR(KBr)：1600(C＝S)cm-1.MW：276，FAB-MS：277(M+H+)。WL-07-21的化学结构式如式V所示。
五、3-氧代丁酮双缩氨基硫脲的合成(WL-07-23)
在50mL圆底烧瓶中加入2.2mol氨基硫脲和10mL 5％冰醋酸-乙醇(v/v)溶液。控制反应温度为50℃，在30～40min内，加入1mol 2，3-丁二酮的5mL乙醇溶液。加料完成后，室温搅拌12小时，过滤得粗品。用10mL乙醇-甲醇重结晶，得黄色粉末162mg，收率70％。M.p.：228～230℃。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ2.151(s，6H，CH3)，7.834(s，2H，NH2)，8.394(s，2H，NH2)，10.196(s，2H，NH)。MW：232，ESI-MS：233(M+H+)。WL-07-23的化学结构式如式VI所示。
式II 式III 式IV
式V 式VI
实施例2、五种化合物对肿瘤细胞的抑制活性
用过表达LAPTM4B基因及其编码的LAPTM4B-35蛋白的BEL7402肝癌细胞和HepG2肝癌细胞对组合化学库中的1697种小化合物进行癌细胞杀伤作用的筛选。以低表达LAPTM4B基因及其编码的LAPTM4B-35蛋白的正常人胎肝细胞系做对照。采用酸性磷酸酶分析(Acidphosphatase assay，APA)测定活细胞率，以检测各化合物对肿瘤细胞的抑制/杀伤活性。
待测细胞用含10％新生牛血清(胎肝细胞用10％胎牛血清)的DMEM培养基，于饱和湿度、37℃、5％CO2恒温箱中进行培养。以体外培养的对数生长期细胞通过0.25％粗胰酶消化 制成单细胞悬液(将细胞浓度调整为3×104/ml，胎肝细胞为5×104/ml)，按每孔100μl接种于96孔板，于37℃、5％CO2及饱和湿度恒温培养箱中培养24小时，细胞完全贴壁之后，加入不同浓度的化合物[用微量DMSO溶解，PBS稀释]，化合物浓度范围在0μmol/L~200μmol/L之间。空白对照组加入等体积的含相同浓度DMSO的溶液。每种药物设1~8个浓度/剂量，每个剂量设3个平行样。培养24~72小时取出培养板，倒掉培养液，用PBS轻轻漂洗细胞两次，加入10mol/L磷酸酶底物(对硝基苯磷酸盐溶液)100μl，于37℃保温2小时，加入5mol/L NaOH 10μl终止反应，室温避光放置10分钟。用多孔酶标仪于405nm波长下检测吸光值。按下式计算细胞存活抑制率和活细胞率：
细胞存活抑制率＝1-(OD试验组-OD空白)/(OD对照组-OD空白)x100％
活细胞率＝(OD试验组-OD空白)/(OD对照组-OD空白)x100％
结果表明，IMMLG-597、WL-07-5、WL-07-19、WL-07-21、WL-07-23对HepG2和BEL7402细胞具有显著的杀伤作用。五种化合物对BEL7402细胞的半数杀伤浓度(LC50)分别为：0.65μmol/L(IMMLG-597)、1.2μmol/L(WL-07-5)、0.5μmol/L(WL-07-19)、0.45μmol/L(WL-07-21)、36.9μmol/L。前四种化合物对肿瘤细胞的杀伤效果好，半数杀伤浓度均远低于10μmol/L。
对筛选出的有抗癌活性的化合物(IMMLG-597、WL-07-5、WL-07-19、WL-07-21和WL-07-23)作进一步的剂量-效应杀伤试验。检测五种化合物在不同浓度下对BEL7402肝癌细胞作用48小时的杀伤效果。每种药物设7个浓度/剂量，每个剂量设3个平行样。
结果如图2所示，2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(IMMLG-597)、3-甲氧基-2-氧代丁醛双缩氨硫脲(WL-07-5)、丙酮醛双缩氨基硫脲(WL-07-19)、3-乙氧基-2-氧代丁醛双缩氨基硫脲(WL-07-21)和3-氧代丁酮双缩氨基硫脲(WL-07-23)对BEL7402肝癌细胞的半数杀伤浓度(LC50)分别为：0.6μmol/L(IMMLG-597)、1.2μmol/L(WL-07-5)、0.5μmol/L(WL-07-19)、0.45μmol/L(WL-07-21)，和36.9μmol/L(WL-07-23)。
实施例3、IMMLG-597化合物对肿瘤细胞的体外杀伤作用和体内抑制肿瘤作用
一、IMMLG-597的体外杀伤肿瘤细胞活性
1、Calcein AM/EthD-1荧光双染同时检测死细胞(红色荧光)和活细胞(绿色荧光)及进入中/晚期凋亡的细胞(红色荧光)：
以HepG2肝癌细胞系和FLC胎肝细胞系为实验细胞。将对数生长期的上述细胞经0.25％粗胰酶消化，PBS洗涤后以含10％新生牛血清的DMEM培养基制成单细胞悬液，调整细胞密度(按不同细胞类型可在3~6×104细胞/ml之间)接种于96孔板中(3~6×103细胞/100μl/孔)；正常人类胎肝FLC细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养。待测细胞于5％CO2、 37℃恒温培养箱中培养24小时后，向HepG2肝母细胞瘤细胞和胎肝细胞分别加入2μM和25μM IMMLG-597，每个剂量设3个平行样。对照组加入等体积的含同样浓度溶剂(DMSO)的溶液。孵育24或48小时后弃掉培养基，用PBS轻轻漂洗细胞两次，然后每孔加入CalceinAM(1μM)/EthD-1(2μM)30μl，置37℃孵育30min，荧光显微镜下观察，细胞质呈绿染的为活细胞，细胞核红染的为已死的或进入中晚期凋亡的细胞。
结果表明，2μM IMMLG-597作用于HepG2细胞24h出现少量红染的死亡细胞，作用48h几乎全部均为红染的死亡细胞，仅存极少数绿染的活细胞；而溶剂对照组未见死亡的红染细胞，全部为绿染的活细胞(图3)；25μM IMMLG-597作用于FLC细胞48小时与未给药的对照组相似均未见红染的死亡细胞(图4)。实验重复3次，结果一致。
2、采用酸性磷酸酶法定量测定活细胞数，计算细胞活率或细胞杀伤率，检测IMMLG-597对HepG2、BEL7402、HLE、HeLa、MCF-7、TE-1、PC-3、GAS、FLC、H22等细胞的杀伤作用。
以HepG2、BEL7402、HLE、HeLa、MCF-7、TE-1、PC-3、GAS、FLC和H22细胞系为实验细胞。检测IMMLG-597对于HepG2、BEL7402、HLE、HeLa、MCF-7、A594、PC-3、GAS、FLC和H22细胞的作用，设如下不同的浓度：0、0.25、0.5、1、2、4μM，每种浓度设3个平行样。鉴于小鼠H22细胞的LAPTM4B-35表达水平较低，检测IMMLG-597对于H22细胞的作用设如下不同的浓度：0、0.2、0.8、3.1、12.5、50μM，每种浓度设3个平行样。实验方法同实施例2中所述一致。以上每个实验重复至少三次，取平均值计算细胞活率，绘制杀伤曲线。
结果显示IMMLG-597对过表达LAPTM4B的人类肝癌HepG2、BEL7402和HLE细胞、宫颈癌HeLa细胞、乳腺癌MCF-7细胞、食管癌TE-1细胞、胃癌GAS细胞、前列腺癌PC-3细胞和胃癌GAS细胞等均具有剂量依赖性杀伤作用(图5A和5B)；对小鼠H22细胞(图6)也具有显著的杀伤作用，且呈现明显的剂量-效应关系。对以上细胞的LC50分别如下：HepG2 0.5μmol/L，BEL7402 0.6μmol/L，HLE 0.9μmol/L，HeLa 0.5μmol/L，MCF-7 8.9μM，TE-1 0.24μM，PC3 0.37μM，GAS 0.19μM，H22 1.2μmol/L；即LC50的范围在0.19μmol/L~8.9μmol/L之间。而对于低表达LAPTM4B-35的人类正常胎肝细胞(FLC)，在IMMLG-597浓度递增到200μmol/L作用48小时细胞活率也未见降低(图7)，指明不具有杀伤作用。上述结果说明IMMLG-597是一种高效、广谱、特异的杀伤LAPTM4B基因及其编码的LAPTM4B-35蛋白过表达之肿瘤细胞的化合物。
3、通过时间-效应曲线和撤药后继续孵育下细胞活率的检测，进一步研究IMMLG-597对HepG2细胞杀伤作用的特点和影响因素。
(1)时间-效应曲线的测定
固定药物浓度，通过改变药物作用时间来检测IMMLG-597对HepG2细胞杀伤作用的时间依赖性。测定撤药后再经不同时间孵育后的活细胞数，探讨IMMLG-597对癌细胞杀伤效果的持久性。将HepG2细胞按同上方法接种于96孔板中，加入不同浓度的化合物后培养不同时间(24、48、72小时)，然后撤除药物(即更换为无药的正常培养基)，继续在37℃、5％CO2孵箱中进行孵育，若有残存的活细胞则会继续增殖，于撤药后的24、48、72、96小时及第6天和第12天分别测定活细胞数。每个实验重复至少3次。
结果显示：在相同的作用时间IMMLG-597对HepG2细胞的杀伤率随药物浓度的增加而增加(图8)；在相同的浓度IMMLG-597对HepG2细胞的杀伤率随药物作用时间的延长而增加(图9)。
撤药后的活细胞检测实验表明，IMMLG-597持续作用48h后撤除药物再继续孵育，在药物浓度极低(小于0.063μmol/L)的条件下，可见残存活细胞的增殖；当药物浓度增加到1.25μmol/L以上作用48小时后，用APA法检测不到存活癌细胞数的增加，撤出药物后再继续孵育至6天(图10)和12天也都未出现细胞数增多的指征，这说明IMMLG-597在1.25μmol/L这一较低的浓度下作用48小时即不再出现HepG2肝癌细胞的增殖，撤药后对肿瘤细胞的杀伤无逆转，从而可以预料停药后肿瘤复发的机率很低。
4、与现有技术中顺铂、阿霉素、丝裂霉素及5-氟尿嘧啶等临床常用抗癌药的体外杀伤肿瘤细胞活性的比较
以HepG2细胞为实验细胞；所用药物种类：IMMLG-597、顺铂、丝裂霉素、阿霉素；每种药物的浓度依次为：0、0.4、0.8、1.6、3.1、6.3、12.5、25、50μM；采用酸性磷酸酶法测定活细胞数，计算存活抑制率或细胞活率。每种药物的每个浓度均设3个平行样。
结果表明，IMMLG-597、顺铂、丝裂霉素、阿霉素的半数杀伤浓度(LC50)分别为0.60、8.12、5.52、8.50μmol/L(分别相当于0.14、2.40、1.85、4.93mg/L)，5-氟尿嘧啶的LC50大于100μmol/L；表明IMMLG-597对HepG2细胞的杀伤作用明显强于顺铂、丝裂霉素、阿霉素(图11)。
综合以上实验结果，IMMLG-597对于高表达LAPTM4B基因及其编码的LAPTM4B-35蛋白的人类HepG2、BEL7402、HLE、HeLa、MCF-7、A594、PC-3、GAS细胞和鼠类H22细胞等均具有显著杀伤作用，半数杀伤浓度(LC50)分别：HepG2 0.5μmol/L，BEL7402 0.6μmol/L，HLE 0.9μmol/L，HeLa 0.5μmol/L，MCF-7 8.9μM，TE-1 0.24μM，PC3 0.37μM，GAS 0.19μM，H22 1.2μmol/L；然而IMMLG-597对于低表达LAPTM4B基因及其编码的LAPTM4B-35蛋白的人类正常胎肝细胞(FLC)没有显示杀伤作用。在相同浓度和作用时间的条件下，IMMLG-597对HepG2细胞的杀伤作用明显强于顺铂、丝裂霉素、阿霉素，以上 各种药物的半数杀伤浓度(LC50)分别为IMMLG-5970.60μmol/L、顺铂8.12μmol/L、丝裂霉素5.52μmol/L、阿霉素8.50μmol/L。
二、IMMLG-597抑制小鼠H22肝癌的体内试验
1.IMMLG-597对小鼠腹水型H22肝癌的体内抑制试验
选用健康LCR小鼠40只，于腹膜腔接种小鼠肝癌H22细胞(1x106/只)。接种后将小鼠随机分为4组，分别为IMMLG-597大剂量组、小剂量组、顺铂组(阳性对照)和阴性对照组(以药物的溶剂代替药物)，每组10只，雌雄各半。自接种H22细胞后第3天开始给药(接种当天计作第1天)，隔日腹膜腔注射药物1次。为尽量保证小鼠腹膜腔内药物浓度一致，每次按照腹水量(以腹围为据)适当调整给药剂量。大剂量组每次注射IMMLG-597约3.0mg/kg，小剂量组每次注射约1.0mg/kg。对照组腹膜腔注射等量溶剂。每4天测量一次小鼠腹围和体重。
结果显示，IMMLG-597对腹水型小鼠肝癌(H22)具有显著的抑制作用，可显著延长荷瘤小鼠的寿命，大剂量组小鼠寿命延长率74.2％(P＜0.05)，小剂量组小鼠寿命延长率为23.2％(图12)。寿命延长率的计算公式：
寿命延长率＝(给药组平均生存时间/对照组平均生存时间-1)×100％。
2.IMMLG-597对小鼠实体型H22肝癌的体内抑制试验
选用4~6周龄健康LCR小鼠50只，于右腋后部皮下接种H22细胞1.5x106/只。接种后将小鼠随机分为5组，分别为大剂量组(20mg/kg/次)、中剂量组(10mg/kg/次)、小剂量组(5mg/kg/次)、阳性对照组(顺铂2.5mg/kg/次)和溶剂对照组，每组10只，雌雄各半。自接种H22细胞后第3天开始隔日肌肉注射给药(接种当天计作第1天)。共观察4周，最后在乙醚麻醉下处死小鼠，解剖、分离肿瘤，并测量瘤重、体重及无瘤体重。
肿瘤抑制率＝(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％
以平均抑瘤率≥30％且经统计学处理P＜0.05视为有效。
肿瘤消退率＝肿瘤消退动物数/荷瘤动物总数
成瘤率＝成瘤动物数/接种动物总数
实验结果(表1.1)，IMMLG-597在20、10、5mg/kg/次三个剂量组肿瘤抑制率分别为81.1％、71.4％、64.2％；肿瘤消退率分别为60％、40％、20％；成瘤率分别为40％、60％、80％；对照组成瘤率100％，肿瘤消退率为0。这些结果说明，给药组小鼠实体型H22肝癌的成瘤率明显降低，肿瘤生长明显减慢，部分小鼠肿瘤出现消退。小鼠带瘤体重的测定结果表明，给予顺铂组小鼠的去瘤体重显著低于给予IMMLG-597各组的小鼠的去瘤体重，表明在治疗剂量范围内IMMLG-597不引起小鼠的明显消瘦、毒副作用低于顺铂(表1.2)。
表1.1各组小鼠的成瘤率、肿瘤抑制率、肿瘤消退率
| 组别 | n | 肿瘤体积 (X±S)cm3 | 成瘤率 (％) | 肿瘤抑制 率(％) | 肿瘤消 退率(％) |
| IMMLG-597 20mg/kg | 10 | 3.0±4.31** | 40 | 81.1 | 60 |
| IMMLG-597 10mg/kg | 10 | 4.0±5.60** | 60 | 71.4 | 40 |
| IMMLG-597 5mg/kg | 10 | 6.1±6.93** | 80 | 64.2 | 20 |
| 顺铂 | 10 | 1.5±1.85** | 70 | 92.3 | 30 |
| 对照 | 10 | 16.7±15.49 | 100 | 0 | 0 |
**与对照组比较P＜0.01。
表1.2小鼠体重(克)的变化
| 带瘤体重 | 去瘤体重 | 瘤重 | |
| 顺铂(2.5mg/kg) | 26.7 | 25.5 | 1.2 |
| IMMLG-597 20mg/kg | 36.3 | 33.4 | 2.9 |
| IMMLG-597 10mg/kg | 37.4 | 33.1 | 4.3 |
| IMMLG-597 5mg/kg | 41.6 | 36.1 | 5.5 |
| 对照 | 49.3 | 15.2 | 34.1 |
3、IMMLG-597对人类肝癌细胞(BEL7402)裸鼠皮下移植瘤的抑瘤试验
选用健康雌性BALB\c-nude小鼠84只，于颈背部皮下接种人肝癌BEL7402细胞1x106/只。肿瘤长出后挑选在接种后同一时间肿瘤大小一致的裸鼠随机分为7组，每组8只。分别为大剂量组、中剂量组、小剂量组、顺铂组、丝裂霉素组、溶剂对照组和不给药的空白对照组。IMMLG-597大剂量组给药45mg/kg/次，中剂量组给药15mg/kg/次，小剂量组给药5mg/kg/次，顺铂组给予顺铂2.0mg/kg/次，丝裂霉素组给药2.0mg/kg/次，溶剂对照组给予等量的药物溶剂，空白对照组给予等体积生理盐水，各组均隔日腹腔注射1次。每周测量肿瘤最大直径、最小直径(以计算肿瘤体积)和体重一次，根据肿瘤体积计算肿瘤抑制率，绘制肿瘤生长曲线(图13)。于接种肿瘤细胞的第42天在乙醚麻醉下处死小鼠，解剖、分离肿瘤、拍照(图14)并测量瘤重和带瘤体重，计算无瘤体重。
肿瘤体积＝(肿瘤最大直径X肿瘤最小直径2)/2
相对肿瘤增殖率＝实验组平均相对肿瘤体积/溶剂对照组平均相对肿瘤体积×100％
肿瘤抑制率＝(溶剂对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/溶剂对照组平均瘤重×100％
取对照组和中剂量给药组的肿瘤和淋巴结以多聚甲醛进行固定、石蜡包埋、切片、HE染色，经病理观察证实裸鼠体内生长的外移植物为恶性癌瘤组织(图15)，肿大淋巴结为癌转移灶(图16)。
表2、IMMLG-597对人类肝癌裸鼠移植瘤的生长和淋巴结转移的抑制作用
| 组别 | n | 瘤重(X±s) | 肿瘤抑 制率 | 肿瘤相对 增殖率 | 平均淋巴结转 移数(X±s) |
| 空白对照 | 8 | 1.96±0.133 | 0 | - | 3.3±0.89 |
| 溶剂对照组 | 8 | 2.073±0.118 | 0 | 100％ | 3.5±1.07 |
| IMMLG-597 (5mg/kg) | 8 | 1.276±0.104* | 38.4％ | 58.5％ | 2.8±0.71 |
| IMMLG-597 (15mg/kg) | 8 | 0.794±0.090** | 61.7％ | 52.6％ | 1.8±0.71 |
| IMMLG-597 (45mg/kg) | 8 | 0.485±0.123** | 76.6％ | 31.7％ | 0.8±0.71 |
| 丝裂霉素 (2mg/kg) | 8 | 0.673±0.119** | 67.5％ | 38.9％ | 0.9±0.83 |
| 顺铂 (2mg/kg) | 8 | 0.734±0.098** | 64.6％ | 41.9％ | 1.0±0.76 |
IMMLG-597各剂量组肿瘤抑制率、相对肿瘤增殖率、瘤重及平均淋巴结转移数与对照组比较均具有显著性差异*P＜0.05；**P＜0.01。
结果如表2所示。从表2以及图13，14证明，IMMLG-597对人类肝癌(BEL7402)裸鼠皮下移植瘤的生长具有显著的抑制作用，大、中、小三个剂量组肿瘤抑制率分别达到76.6％、61.7％、38.4％(P＜0.05)；同时，IMMLG-597使荷瘤裸鼠转移淋巴结数量明显减少(图17)。此外，与对照组相比给药6周顺铂组和丝裂霉素组裸鼠体重平均下降26.2％以上，而给予IMMLG-597大、中剂量组小鼠体重分别只降低了16.2％和9.5％，再次表明在治疗剂量范围内IMMLG-597不引起小鼠的明显消瘦(图18)，毒副作用低于顺铂和丝裂霉素。
实施例4.IMMLG-597杀伤肿瘤细胞的机制
1.以流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测IMMLG-597促进细胞凋亡
培养的HepG2细胞加入IMMLG-597(0.2μmol/L~10μmol/L)诱导凋亡，8~36小时后测定细胞凋亡率。各组收集悬浮和贴壁的全部细胞，1000rpm离心10分钟，弃上清，用PBS小心洗细胞3次，最后用200μl Loading buffer将细胞悬浮，轻轻吹匀，加入10μl FITC标记的Annexin-V，室温避光放置15分钟，上机之前加入试剂盒提供的PI溶液5μl，补加Loading buffer 300μl，立即上机检测。实验重复3次。结果显示IMMLG-597能明显诱导HepG2细胞凋亡，浓度为2μm/L的IMMLG-597药物作用0、8、16、24、36小时的早期加中晚期总凋亡细胞百分率分别为4.6％、10.1％、15.8％、29.1％、63.0％(图19)。
2.IMMLG-597对HepG2细胞基因表达谱的影响(基因芯片分析)
培养的HepG2细胞达到70％汇合度时加入IMMLG-597，使终浓度为2μmol/L，继续培 养24小时后收获细胞，弃去培养基，用PBS轻轻漂洗细胞两遍，加入Trizol细胞裂解液1ml，轻轻吹打，使细胞脱落裂解。将细胞裂解液回收、转移至冻存管中，于-80℃冻存待测。以未加药的同样处理的HepG2细胞为对照。由上海晶泰生物技术有限公司用美国Affymetrix Inc公司的“GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0”基因芯片分析测定基因表达谱。基因芯片分析结果显示，在IMMLG-597作用下c-myc、cyclinE、cyclinD1、cyclinG和Bcl-2等促进增殖的基因和抵抗凋亡的基因表达下调，而p53、bak、bax、bid、fadd、tnfr等促进凋亡的基因表达上调，说明IMMLG-597对于阻滞细胞周期、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡相关基因的表达具有上调作用。此外，IMMLG-597还对肿瘤细胞DNA转录、翻译相关的基因、细胞信号转导和蛋白质转运、修饰相关的基因具有下调作用。
3.蛋白质免疫印迹分析(Immunobloting，Western Bloting analyses)
以HepG2细胞为实验细胞。
①细胞裂解液的制备和总蛋白质的提取：取对数生长期且长势良好的细胞，用PBS漂洗2次，经0.25％粗胰酶消化、收获细胞。PBS漂洗细胞2次，离心，弃上清液，在细胞沉淀中加入适量预冷的RIPA细胞裂解液(美国Pierce公司的RIPA裂解液，按照厂家说明书进行操作)。为防止蛋白质降解，加入蛋白酶抑制剂(瑞士Roche公司的复合蛋白酶抑制剂片剂1片/50ml)；如测定磷酸化的蛋白质，需同时加入磷酸酶抑制剂(Roche公司的复合磷酸酶抑制剂片剂1片/10ml)，以阻止磷酸根水解。混匀后置于冰上裂解30~60分钟，期间吹打、混摇数次。然后将裂解混合物放入杯式超声仪中，于功率1200W、冰水浴中进行间断超声处理共1min，即每次超声持续2秒，间隔2秒，共30次(检测LAPTM4B蛋白质样品需间断超声60次以上)。裂解完的样品在台式冷冻离心机上于4℃，13000rpm离心20分钟，以去除未完全裂解的细胞碎片。将上清转入新的Ep管中，即为总蛋白，冻存于-80℃备用。②聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：制备的细胞裂解液在含2％SDS的Loading Buffer中，水浴煮沸3分钟，每条泳道上样80mg蛋白质样品。电泳采用10~15％的分离胶，恒压80V/120V。电泳后的凝胶转移至硝酸纤维素(NC)膜，采用300mA恒流，持续3小时。转膜后用5％脱脂奶粉室温下封闭NC膜40分钟。一抗以3％牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)按1∶200~4000稀释，与NC膜保温。封膜后于室温下轻摇2小时或4℃冰箱过夜。以TBS或TBST洗膜后加二抗(以5％脱脂奶粉按1∶1000~6000稀释)，封膜后于室温轻摇至少1小时或4℃冰箱过夜。用TBS(T)洗膜3次，每次5~10分钟。用ECL化学发光试剂盒(Pierce)按照厂家说明书操作，依次进行化学发光、曝光、显影。检测磷酸化AKT(PKB)和MAPK等一般分对照组和IMMLG-597给药组，每组又分别设血清饥饿后加血清刺激和血清饥饿而不予血清刺激两种条件。具体操作为，细胞在加入 IMMLG-597(0.5μmol/L~10μmol/L)8小时后换无血清培养基培养16小时，再换含20％胎牛血清的培养液刺激10~20分钟。然后收集细胞进行裂解。细胞裂解液中需含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(同前)。Western Blot检测的蛋白质主要有LAPTM4B-35、BcL-2、Bax、caspase3、c-Myc、CyclinD1、磷酸化p53、磷酸化和非磷酸化AKT以及磷酸化和非磷酸化LAPTM4B-35等。Western Blot分析结果证明，IMMLG-597可显著增加抑癌的磷酸化p53蛋白——p53蛋白的稳定形式(图20)和促凋亡的Bax蛋白(图21)，同时减少促进增殖和抵抗凋亡之基因编码的产物，如c-Myc(图22和23)、CyclinD1(图24)、Bcl-2(图25)等，指明IMMLG-597可增加肿瘤细胞中抑制肿瘤细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡的蛋白质水平。上述这些分子的改变(上调或下调)均与LAPTM4B-35过表达所导致的分子改变的方向相悖，进一步指明了IMMLG-597对肿瘤细胞的杀伤作用与LAPTM4B-35过表达的相关性。特别是，IMMLG-597虽不降低AKT总蛋白却可降低磷酸化AKT(PKB)的水平(图26)，指明其对于肿瘤细胞中被LAPTM4B-35过度活化的PI3K/AKT信号通路具有抑制作用，从而对肿瘤细胞实施抑制存活、增殖和迁移的调控作用，阻碍肿瘤的生长和转移，或者对催化AKT磷酸化的激酶具有直接抑制作用。
4.LAPTM4B基因表达水平对IMMLG-597抗癌作用的影响
采用经转染LAPTM4B-shRNA质粒而敲低LAPTM4B-35蛋白过表达的HepG2-shRNA细胞系和转染空载体质粒的HepG2-Mock细胞(对照组1)，观察IMMLG-597对肿瘤细胞之杀伤作用对LAPTM4B-35表达水平的依赖性。实验分别以HepG2-shRNA细胞(实验组)和HepG2-Mock细胞(对照组1)、HepG2母本细胞(对照组2)为实验细胞；设5个药物剂量(浓度分别为0.12、0.25、0.5、1.0、2.0μmol/L)，每个剂量设3个平行样。采用酸性磷酸酶法测定活细胞数，计算存活抑制率或细胞活率。
结果表明，IMMLG-597对于敲低了LAPTM4B基因及其编码的LAPTM4B-35蛋白表达的HepG2-shRNA细胞系的杀伤作用明显减弱(药物作用时间48h)(图27)；反之，细胞毒类抗癌药顺铂和阿霉素对于敲低LAPTM4B基因及其编码的LAPTM4B-35蛋白表达的HepG2-shRNA细胞系的杀伤作用未见减弱，甚至还略有增强(图28)。指明IMMLG-597对HepG2细胞系的杀伤作用依赖于LAPTM4B基因及其编码的LAPTM4B-35蛋白的高表达。
5.IMMLG-597对LAPTM4B-35蛋白酪氨酸残基磷酸化的抑制作用
在6孔培养板中接种等量的HepG2细胞，细胞贴壁后加入IMMLG-597(2μmol/L)，对照组加入等体积含等浓度DMSO的溶液。8小时后以含药的无血清培养基代替含血清的培养基孵育16小时，以使细胞处于无生长刺激因子的血清饥饿状态，然后以20％胎牛血清(含生长刺激因子)刺激细胞10~15分钟。收集细胞进行裂解。裂解液组成：Tris.HCl(pH7. 4)50mM，NaCl 150mM，EDTA 1mM，TritonX-1001％，脱氧胆酸钠0.5％，蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(同实施例4中的3)。以特异性针对LAPTM4B-35蛋白的LAPTM4B-N10-pAb抗体将裂解液中的LAPTM4B-35蛋白进行免疫沉淀，再用Protein A/G沉淀抗原-抗体复合物捕获LAPTM4B-35蛋白，加入含1％SDS的Loading Buffer，经煮沸后上样进行SDS-PAGE电泳，然后转移至NC膜，最后用针对磷酸化酪氨酸残基的抗体进行免疫印记。实验重复3次。
结果证明，IMMLG-597在2μmol/L浓度下对HepG2肝癌细胞分别作用4、8、16和24小时，均可致LAPTM4B-35酪氨酸残基(Tyr285)的磷酸化受到递增的显著抑制，而对于LAPTM4B-35蛋白和actin蛋白的表达总量在相同的剂量和作用时间范围内并没有显著影响，(图29代表IMMLG-597对LAPTM4B-35酪氨酸残基磷酸化的抑制作用随药物作用时间的延长而增强，图30代表在血清饥饿条件下在有或无血清刺激下IMMLG-597对LAPTM4B-35酪氨酸残基磷酸化具有显著的抑制作用)；灰度扫描定量的结果表明，LAPTM4B-35Tyr285磷酸化最大抑制程度达到74.1％。这说明IMMLG-597确可对LAPTM4B-35酪氨酸残基(Tyr285)的磷酸化产生抑制作用。同时，通过台盼兰(Trypan Blue)拒染、MTT和APA三种方法检测细胞活率的实验结果一致表明，在剂量和作用时间相同的条件下，IMMLG-597对HepG2细胞的杀伤最高不足30％。这些结果都证明，LAPTM4B-35是IMMLG-597杀伤肿瘤细胞的靶标，LAPTM4B-35酪氨酸残基(Tyr285)的磷酸化是IMMLG-597作用的靶点；IMMLG-597是以LAPTM4B-35为靶标的靶向性抗肿瘤小化合物。再者，鉴于细胞内的磷酸化作用都是在磷酸激酶的催化下进行的，IMMLG-597对LAPTM4B-35蛋白磷酸化作用的抑制可能是其对催化LAPTM4B-35酪氨酸残基(Tyr285)磷酸化作用之激酶产生抑制的结果，因此可能是酪氨酸磷酸激酶的抑制剂；此外，磷酸化水平的降低也可能是催化脱磷酸作用的磷酸酶被激活的结果，因此IMMLG-597也可能是LAPTM4B-35酪氨酸磷酸酶的激动剂。
实施例5.急性毒性试验
采用改良寇氏法，选用健康LCR小鼠50只，随机分为5组，药物剂量分别为4640mg/kg组、2150mg/kg组、1000mg/kg组、464mg/kg组和阴性对照组，每组10只，雌雄各半。将IMMLG-597用玉米油溶解后，一次性灌胃给药。观察中毒症状和体征，根据死亡情况、死亡率和存活率计算小鼠半数致死量(LD50)和95％可信限。结果显示，IMMLG-597经口给药的LD50为2329.9mg/kg，95％可信限为1846.7~2939.0mg/kg。表明IMMLG-597是低毒或微毒化合物。
Claims (2)
1.乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物或其盐在制备抗肿瘤药物中的应用；
所述乙二醛基双缩氨基硫脲类化合物的结构式如式I所示：
其中，R1选自乙基，所述R2选自氢；R1选自甲基，所述R2选自氢或甲基；
所述肿瘤为LAPTM4B-35蛋白介导的信号通路过度活化的如下肿瘤：肝癌、乳腺癌、子宫颈癌、前列腺癌、胃癌或食管癌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肝癌的细胞为BEL7402细胞、HepG2细胞或HLE细胞；所述子宫颈癌的细胞为HeLa细胞；所述乳腺癌的细胞为MCF-7细胞；所述前列腺癌的细胞为PC-3细胞；所述食管癌的细胞为TE-1细胞；所述胃癌的细胞为GAS细胞。
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