CN1079967A - 制备糖类化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备含序列GaLAcβ(1-4)(Fucα (1-3)GlcAc的寡糖的肽的方法。该方法为在适合 于表达的条件下孵化表达能够糖基化的肽的人体肾 293细胞，然后从细胞或细胞培养上清液中回收该 肽。本发明还包括从在293细胞内制备的肽中进一 步游离新的寡糖的方法。如此制备的肽和/或寡糖 能用作某些细胞粘连受体的高亲合力配体，所述的肽 和/或寡糖可以用来防止或减少细胞粘连及炎症。

Description

本发明涉及分子生物学，更具体地说，本发明涉及在人体肾293细胞内制备新结构的糖类化合物的方法。这种新结构的糖能用于治疗炎症，还能用于减少细胞粘连。
人体肾293细胞是用于制备重组蛋白的腺病毒变异细胞。该细胞被发现对于制备血液蛋白制品如人体蛋白C，人体蛋白S和血小板调节剂（thrombomodulin）以及组织纤维蛋白溶酶原活化剂，人体蛋白C的各种衍生物和血管紧张肽原酶是特别有用的。在293细胞内产生的人体蛋白C表明了一种和在血浆得到的人体蛋白C上发现的糖基化模型明显不同的糖基化模型。本发明涉及下述事实，即现在已经证明在293细胞内制备的人体蛋白C分子含有新的N-连接的寡糖，该寡糖含有未还原的末端分支GalNAcβ（1-4）（Fucα（1-3））GlcNAc。这种结构能以高亲合力粘接某些选择素（selectins），后者是人体免疫系统的细胞粘连受体。这种特殊配体的亲合力说明，用293细胞制备的新的寡糖可用于减低细胞粘连及组织发炎。
对于本发明来说，在本申请的公开中及权利要求中，下述术语定义如下：
Asn-天（门）冬酰胺
Gal-半乳糖
Fuc-岩藻糖
GalNAc-N-乙酰基半乳糖胺
GlcNAc-N-乙酰基葡糖胺
Man-甘露糖
NeuAc-N-乙酰基神经氨（糖）酸
图1是在293细胞内产生的人体蛋白C分子上发现的主要的糖的色谱图。说明这些糖结构的主峰用数字标示。
本发明包括，在适合于肽表达的条件下，通过孵化表达能够糖基化的肽的人体肾293细胞，制备含有带有结构GalNacβ（1-4）（Fucα（1-3））GlcNAc的寡糖的肽，然后从细胞或细胞培养上清液中回收这种肽在293细胞内产生的人体蛋白C分子在N-连接的寡糖的未还原未端分支上含有这种结构。本发明还包括从在293细胞内产生的肽中进一步分离新的寡糖的方法。如此制备的肽和/或寡糖能被用作某些细胞粘连受体的高亲合力配体。这种配体的特殊性表明，上述肽及新的寡糖可用于防止或减少细胞粘连并因之能防止或减少组织发炎。
人体肾293细胞（ATCC  CRL  1573）是变异的主要的初期人体肾细胞，它含有并表达腺病毒5的转移基因。这种细胞已经用于表达某些重要的基因产品并且被学术界及工业界的许多不同的实验室所使用。例如USP4，981，952（Yan）和USP4，992，373（Bang  et.al）都公开了使用293细胞系制备人体蛋白C。目前已经发现：293细胞系含有能够在该细胞系产生的肽上产生新的和有用的寡糖的酶机构。这种新的寡糖，制备和使用它们的方法均属于本发明的范围。
人体蛋白C（HPC）作为丝氨酸蛋白酶的酶原在血浆中循环。蛋白C以和内皮细胞表面受体，血小板调节剂结合的方式被凝血酶活化，活化形式的人体蛋白C（aPC）由于其对不活化因子Ⅴa及Ⅷa的专效使其具有有效的抗凝结活性。对于本发明公开而言，术语“人体蛋白C”是指酶原和该分子的活化形式两者。蛋白C在调节凝血酶的产生中起很重要的作用，并且在治疗许多凝血酶病症方面可能是有效的。人体蛋白C是在转译后在分子的四个位置上被修饰，特别是在轻链的位置ASn97及重链的位置ASn248，ASn313，ASn329。虽然血浆得到的HPC的完整的糖结构还未报道过，但在293细胞内重组产生的HPC（rHPC）上发现的寡糖十分不同于在血浆得到的HPC上发现的寡糖。例如，rHPC比血浆得到的HPC有五倍高的岩藻糖含量及两倍低的NeuAc含量。除此，每摩尔rHPC有2.6摩尔GalNAc，而血浆得到的HPC不含GalNAc。
本发明不限于在Asn残基上连接到肽上的特殊的寡糖。寡糖可以通过N-糖基化或O-糖基化连接到肽上。寡糖可以在糖脂和蛋白聚糖内被发现并且可通过glypiation加到膜束缚的蛋白质上。对于本发明，术语“能糖基化”并不限于Asn残基的N-糖基化，宁愿包括肽或（类）脂在体内被糖基化的全部机制。
图1是在293细胞内产生的rHPC上发现的主要寡糖的Dionex  HPAE-PAD体系的肽链谱图。相应于主峰1的寡糖是带两个触角的天然双触角寡糖，它含有连接到岩藻糖基化壳二糖-三甘露糖核的结构GalNAcβ（1-4）（Fucα（1-3））GlcNAcα（1-2）-，本申请所研究并公开的其它十个寡糖显示了具有含GalNAc的新的N-连接的结构。所预期的峰2，7和11的寡糖的结构至少在岩藻糖基化的壳二糖-三甘露糖核的一个分支上也含有这种新结构。另外，峰15、20和23的寡糖结构在1-4链内含GalNAc残基。这种新的寡糖结构能用293细胞系制备，这是因为该细胞含制备这种酶解物的所必须的特殊的酶。
人体肾293细胞看来具有α（2-3）和α（2-6）两种唾液酸转移酶。α（2-6）唾液酸转移酶对唾液酸化GalNAc残基是特异的，而α（2-3）唾液酸转移酶对唾液酸Gal残基是特异的。被293细胞表达的α（1-3）岩藻糖转移酶也能作用在含GalNAc的酶解物上。α（2-6）唾液酸转移酶的α（1-3）岩藻糖转移酶在寡糖的任何个别分支上的作用看来是互相排斥的，因之一旦GalNAc被唾液酸化，相同触角内GalNAc残基的α（1-3）岩藻糖基化作用将被阻止。相反，一旦GalNAc被岩藻糖基化，在相同触角上的相同GalNAc残基就不能被α（2-6）唾液酸转移酶唾液酸化。
293细胞产生在分子的糖部分内带较少异质性的重组糖蛋白，这是因为293细胞表达最高水平的α（1-6）岩藻糖转移酶活性。对从rHPC游离出来的全部25个寡糖峰的链分析仅揭示了带还原未端的4-6-连接的GalNAc。未检知出带还原未端的4-连接的GlcNAc。因此很明显，所有N-连接的寡糖的壳二糖核实际上100%被岩藻糖基化对在293细胞得到的rHPC上的11个主要寡糖的解释说明了rHPC的不寻常的糖基含量，这正如Yan等人所报道的那样（BioTechnology，8∶655-660）。该分子的高的岩藻糖含量可被下述事实说明：所有N-连接的寡糖的壳二糖核都被岩藻糖基化以及11个主要的N-连接的寡糖中的4个在触角内的GalNAc残基全被岩藻糖基化。除了峰2发现的寡糖以外，在rHPC中的GalNAc残基全都在N-糖基化的寡糖中被发现，并且仅仅处在触角的位置，在此处仅有Gal在N-连接的结合型寡糖内被发现。对于本发明，术语触角和分支可能包括许多触角及分支，或者相反。
在293细胞内发现的岩藻糖转移酶的作用以及在该细胞系内制备的寡糖的GlcNAc残基的所产生的α（1-3）岩藻糖基化作用还说明了本发明的另一方面。含α（1-3）岩藻糖基化的GlcNAc的结构对于结合选择素是一种有用的配体。选择素是免疫系统中一种类型的粘连受体。白细胞对内皮衬里的粘连在炎症答应中是一个完整的步骤。两种选择素，CD62和ELAM-1（内皮-白细胞粘连分子-1）被含α（1-3）岩藻糖基化的GlcNAc的寡糖束缚。细胞粘连实验说明，加入含有这种新的寡糖的肽（或仅加入寡糖）能结合选择素，因之能减少或防止细胞粘连。假如细胞粘连减少或防止了，那么炎症反应也能减少或防止。
发现293细胞含产生这种选择素认可的配体所必需的酶机制为医疗界治疗与细胞粘连及炎症反应有关的疾病提供了重要并有用的工具。由于上述发现，在293细胞内产生的糖蛋白和寡糖可以用于治疗炎症或细胞粘连。使用rHPC治疗各种健康失调的方法公开在US4，775，624中（Bang等）。用293细胞产生的新的糖的蛋白不限于是用重组的方法产生的蛋白，某些用构成的方法通过293细胞产生的糖蛋白也展示了新的结构。而且，本发明不限于使用糖蛋白防止或减少细胞粘连及炎症。本领域的技术人员知道，通过各种公知的方法能从糖蛋白中移出寡糖，然后再把寡糖放到药学上可接受的稀释剂中并对患细胞粘连或炎症的患者用药。
本领域的技术人员明白，本发明不限于在293细胞内制备人体蛋白C的寡糖。能被糖基化的任何肽都能转变成293细胞并使用本领域公知的技术表达。一系列这种肽包括，但不限于是人体蛋白S，人体血小板调节剂，人体蛋白C的衍生物，组织纤维蛋白溶酶原活化剂及血管紧张肽原酶。US4，981，952（Yan）公开了在293细胞内制备人体蛋白S的方法。EPA  No  91301450.2公开了人体蛋白C的基因编码的某些衍生物。EPA  No  90308826.8和Wen等人（Biochemistry  26∶4350  1987）公开了天然的及衍生物形式的基因编码的人体血小板调节剂。任何这种基因均能转变成在适于基因表达和制备肽/寡糖的条件下能被培养的293细胞。
下述实施例提供了阐明本发明的方法，但不构成对本发明的限制。
实施例1
在293细胞内制备人体蛋白C
重组人体蛋白C（rHPC）通过本领域技术人员公知的技术（US4，981，952，Yan）在人体肾293细胞内被制备。US4，775，624（Bang等人）公开了并请求保护基因编码的人体蛋白C。用来表达293细胞内的人体蛋白C的质粒是质粒pLPC，US4，922，373（Bang等人）公开了这种质粒。质粒pLPC的结构也在EPA0，445，939及BioTechnology，5∶1189-1192（Grinnell等人，1987）中被描述。简要地说，这种质粒可转变成293细胞，然后鉴定这种稳定转化细胞并进行继代培养。然后，显示最高表达水平的克隆在-2核Opticell酶内用增殖细胞固定模型生长。所有发酵过程均采用无血清培养基。为制备无血清培养基，将下列成份溶解在100升高质量水中：
Dulbecoo改性的Eagle培养基  1350g
（＃200-2010）
Ham′s  F12培养基  478g
（＃63N3085）
碳酸氢钠  432g
右旋糖  468g
乙醇胺  55ml
硒酸钠0.5M  180ml
维他命K（1%）  180ml
L-谷氨酰胺  81g
将溶液冲稀至180升，用3N  Hcl调PH值至7.2。于37℃发酵后，用US4，981，952（Yan）所述技术能将人体蛋白C从培养液中分离出来。如此制备的人体蛋白C能以未活化的酶原形式被使用，并能按本技术领域公知的方法被活化。
实施例2
在293细胞内制备的rHPC的寡糖结构
Yan等人描述了用以说明在293细胞内制备的rHPC的新的结构的许多方法（BioTechnology  8∶655-651，1990）经脱盐并冷冻干燥后的rHPC首先在含2mM EDTA和6M胍HCl的0.2M缓血酸胺缓冲液（PH8.6）中被还原并被羧甲基化，然后将该溶液对着50mM碳酸氢铵充分渗析，再冷冻干燥。将变性的rHPC重新悬浮于磷酸钠缓冲液中（PH8.6），每8-9mgrHPC加12单位N-聚糖酶（Genzyme）。该溶液于37℃下孵化72小时，然后从脱糖基化的rHPC中分离出用酶法释放出的N-连接的寡糖，采用以50mM碳酸氢铵平衡的Bio-gelP6柱。含脱糖基化的rHPC的级份用OD280nm鉴测。
含寡糖的级份用糖基组合物分析方法鉴定。收集并冻干。寡糖在Dione×HPAE-PADⅡ体系中，用AS6柱（4.6×250mm）分离，同时采用20mM乙酸钠及100mM  NaOH平衡的AG6防护柱。3分钟以后，在20分钟内将乙酸钠增加到60mM，120分钟内增加到200mM，再于40分钟内增加到400mM，5分钟内增加到800mM，NaOH浓度维持在100mM，柱流速为1ml/分。其后用0.3M  NaOH以0.5ml/分流过柱子。
将阴离子微膜抑制器放在PAD检测器后面，30mM硫酸以9ml/分流过该阴离子微膜抑制器并充分中和，部分脱盐来自AG6-AS6柱的洗脱液。每个寡糖峰进一步用按照制造商指南方法制备的OnGuard  H药筒（Dionex）脱盐。
约1-10μg脱盐的寡糖被用来作为制备链分析用的PMAA的原料。这种寡糖于室温下在1M MH4OH中用25微升10mg/ml的NaBH4预还原2小时，用20微升冰醋酸停止反应，然后于氮气氛下用10%乙酸/乙醇进行反复共蒸发除去硼酸盐。被还原的寡糖用Ciucanu和Kerek改进的方法使全甲基化（CarbohydrRes，131∶209-217，1984），如Costello和Vath所述（Meth.Enzymol，193∶738-755，1990）。全甲基化的寡糖于100℃在2M TFA中水解2小时，然后用旋转蒸发器干燥。再于40℃于1M NH4OH中加浓度为20mg/ml的NaBD4氘还原1.5小时，用冰醋酸中和以停止反应，于氮气氛下用10%乙酸/乙醇共蒸发除去硼酸盐。乙酰化反应于室温下用乙酸酐保温30分钟完成。寡糖的最终的PMAA衍生物用二氯甲烷提取，于氮气氛下干燥浓缩再溶于10-20微升乙酸乙酯中。
使用Hewlett  Packard  GC5890-MSD进行气相色谱-质谱（GC-MS）分析。进针前将PMAA衍生物溶于乙酸乙酯中，采用DB-5柱（0.25mm×30mJ  &  W  Scientific）氮气流速为1ml/1分钟。试样进针时柱温为80℃并保持2分钟。然后以30℃/分升至150℃，再以2℃/分钟，从150℃升至240℃，于240℃保持10分钟。质谱仪是EI四极质谱仪，GC-MS洗脱时间用标准进行标定。
峰1的寡糖结构可用糖基组合物，链分析及1H-NMR来说明，其它十个主要糖的结构可根据糖基组合物及链分析预见。如此明析的寡糖结构如下述：
Figure 93104040X_IMG6
Figure 93104040X_IMG7
Figure 93104040X_IMG8
实施例3
试管内细胞粘连试验
人体脐静脉内皮细胞（HUVEC）或人体主动脉内皮（HAE）从克隆Clonetis）（San  Diego）得到并于被克隆补充的EBM介质中生长。细胞放于96穴密度的平皿中，得到融合的单细胞层，随后于37℃孵化过夜。在于总体积为100-150微升中进行粘连试验前，单细胞层与20纳克仲瘤坏死因子（TNF）一起孵化4-6小时，也可以不用TNF。为了测定抑制粘连，将蛋白C或其被游离的糖的试样加到三个穴中，其在磷酸盐缓冲盐水（PBS）或水中的体积至多为20微升，再孵化20-25分钟。孵化后，加入氚标记的U937细胞，50微升中每穴1-3×10（6）细胞。U937通过加入3H-胸苷被氚标记，最终浓度为每毫升1微居里，随后孵化18-20小时，使用前用PBS洗细胞以便除去过量的标记。标记的U937细胞和内皮细胞一起孵化20分钟后，将穴抽吸并用含钙的PBS洗四次。单细胞层及附着的U937细胞通过加入0.25%SDS/0.1N  NaOH被加溶需5分钟并搅拌。粘连程度通过计算加溶细胞的闪烁现象来确定。
表1
实验 aPC μg/ml、 抑制%a
1(HUVECS)b32 无
1(HUVECS) 120 70(12)c
2(HAE)  120  无
2(HAE)  240  77(30)
3(HAE)  120  54(18)
a：在有和无用TNF预处理内皮细胞的U937的粘连之间，100%抑制是不同的。
b：细胞系
c：括号中数字是标准误差。
表Ⅱ
实验 寡糖(μm) 抑制%a
1(HAE)b5.75 无
1(HAE) 11.5 22(0.5)c
1(HAE)  23  16(4)
2(HUVECS) 17.25 19d
2(HUVECS)  34.5  63
a：在有和无用TNF预处理内皮细胞的U937的粘连之间，100%抑制是不同的。
b：细胞系
c：括号中数字是标准误差
d：单点测定未计算误差。

Claims (5)

1、一种寡糖，其结构为：
Figure 93104040X_IMG2
2、一种寡糖，其结构为：
Figure 93104040X_IMG3
3、一种寡糖，其结构为：
Figure 93104040X_IMG4
4、一种寡糖，其结构为：
Figure 93104040X_IMG5
5、一种药物制剂，它包括作为活性成分的权利要求1-4中任何一项中的寡糖，一种或多种药学上可接受的载体，赋形剂或稀释剂。
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