JP3171506B2 - オリゴ糖およびそれを含有する抗炎症剤 - Google Patents

オリゴ糖およびそれを含有する抗炎症剤

Info

Publication number
JP3171506B2
JP3171506B2 JP05056193A JP5056193A JP3171506B2 JP 3171506 B2 JP3171506 B2 JP 3171506B2 JP 05056193 A JP05056193 A JP 05056193A JP 5056193 A JP5056193 A JP 5056193A JP 3171506 B2 JP3171506 B2 JP 3171506B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
oligosaccharides
oligosaccharide
produced
human protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP05056193A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH0625302A (ja
Inventor
ソー−チー・ベティ・ヤン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eli Lilly and Co
Original Assignee
Eli Lilly and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eli Lilly and Co filed Critical Eli Lilly and Co
Publication of JPH0625302A publication Critical patent/JPH0625302A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3171506B2 publication Critical patent/JP3171506B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6464—Protein C (3.4.21.69)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
  • Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
  • Amplifiers (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は分子生物学に分野に属し、具体的
には新規炭水化物構造をヒト腎２９３細胞中で生産する
方法に関する。これらの新規炭水化物構造物は炎症の治
療に使用することができ、また細胞接着を軽減するため
に使用することもできる。
【０００２】ヒト腎２９３細胞はアデノウイルスで形質
転換された細胞であって、組換えタンパク質の生産に有
用である。この細胞は、ヒトプロテインＣ、ヒトプロテ
インＳおよびトロンボモジュリン(thrombomodulin)、あ
るいは組織プラスミノーゲン活性化因子、レニンおよび
ヒトプロテインＣの様々な誘導体などといった血液タン
パク質産物の生産にとりわけ有用であることがわかって
いる。２９３細胞中で生産されるヒトプロテインＣは、
血漿由来のヒトプロテインＣ上に認められるグリコシル
化様式とは著しく異なるグリコシル化様式を示す。本発
明は、２９３細胞中で生産されるヒトプロテインＣ分子
が、ＧalＮＡcβ(１-４)(Ｆucα(１-３))ＧlcＮＡcとい
う非還元末端分枝を含有する新規Ｎ-結合型オリゴ糖を
含むことが新たに明らかにされたという事実に関連す
る。これらの構造は、ヒト免疫系の細胞接着受容体であ
るいくつかのセレクチン(selectin)に高い親和性で結合
することができる。この特異的リガンド(配位子)親和性
は、２９３細胞によって生産されるこれらの新規オリゴ
糖が細胞接着および組織炎症の軽減に有用であることを
示している。
【０００３】本明細書で使用する用語を以下に定義す
る。 Ａsn：アスパラギン Ｇal：ガラクトース Ｆuc：フコース ＧalＮＡc：Ｎ-アセチルガラクトサミン ＧlcＮＡc：Ｎ-アセチルグルコサミン Ｍan：マンノース ＮeuＡc：Ｎ-アセチルノイラミン酸
【０００４】本発明は、そのペプチドの発現に適した条
件下でグリコシル化され得るペプチドをヒト腎２９３細
胞をインキュベートして発現させ、次いでその細胞また
は細胞培養上清からそのペプチドを回収することによっ
て、ＧalＮＡcβ(１-４)(Ｆucα(１-３))ＧlcＮＡcとい
う構造を伴うオリゴ糖を含有するペプチドを生産する方
法を包含する。２９３細胞中で生産されるヒトプロテイ
ンＣ分子はＮ-結合型オリゴ糖の非還元末端にこれらの
構造を含有する。また本発明は、２９３細胞中で生産さ
れた上記ペプチドからこれらの新規オリゴ糖をさらに単
離する方法をも包含する。このようにして生産されるペ
プチドおよび／またはオリゴ糖を用いて、ある種の細胞
接着受容体の高親和性リガンドとして作用させることが
できる。このようなリガンド特異性は、細胞接着を防止
または軽減することによって組織炎症を防止または軽減
するために、上記のペプチドおよび新規オリゴ糖を使用
することができるということを示している。
【０００５】ヒト腎２９３細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５
７３)は、アデノウイルス５の形質転換遺伝子を保持し
これを発現させる、形質転換された初期胚ヒト腎細胞で
ある。これらの細胞は数種の重要な遺伝子産物を発現さ
せるために使用されており、またいくつかの異なる学術
的研究所および工業的研究所によって使用されている。
例えばＹan,米国特許第４９８１９５２号とＢangら,米
国特許第４９９２３７３号は共に、ヒトプロテインＣを
生産するための上記２９３細胞系の使用を開示してい
る。２９３細胞にはこの細胞系中で生産されるペプチド
上に新規かつ有用なオリゴ糖を創出するための酵素機構
が含まれていることを新たに発見した。これらの新規オ
リゴ糖は、それらの製造法および使用法と共に本発明に
包含される。
【０００６】ヒトプロテインＣ(ＨＰＣ)はセリンプロテ
アーゼのチモーゲン(酵素前駆体)として血漿中を循環す
る。プロテインＣは、内皮細胞表面受容体トロンボモジ
ュリンとの複合下にあるトロンビンによって活性化され
る。活性型ヒトプロテインＣ(ａＰＣ)は因子Ｖａおよび
ＶIIIａを不活化することができるので強力な抗凝固活
性を有する。本明細書において用語「ヒトプロテイン
Ｃ」はこの分子の上記チモーゲン型と活性型の両方を意
味する。プロテインＣはトロンビン生成の調節に決定的
な役割を果たし、いくつかの血栓症の治療に効果的であ
り得る。ヒトプロテインＣはこの分子上の４部位(具体
的には軽鎖上の位置Ａsn９７および重鎖上の位置Ａsn２
４８、Ａsn３１３およびＡsn３２９)でのＮ-グリコシル
化によって翻訳後修飾される。血漿由来のＨＰＣの完全
な炭水化物構造はまだ報告されていないが、２９３細胞
中で組換え生産されたＨＰＣ(ｒＨＰＣ)上に認められる
オリゴ糖は血漿由来のＨＰＣ上に認められるものとは著
しく異なっている。例えば、ｒＨＰＣは血漿由来のＨＰ
Ｃと比較してフコース含量が５倍高く、ＮeuＡc含量が
２倍低い。さらにｒＨＰＣは１モルあたり２.６モルの
ＧalＮＡcを含有するが、血漿由来のＨＰＣはＧalＮＡc
を含有しない。
【０００７】本発明はペプチドのＡsn残基に結合した特
定のオリゴ糖に限定されない。オリゴ糖はＮ-グリコシ
ル化を介してペプチドに結合していることもあるし、Ｏ
-グリコシル化を介してペプチドに結合していているこ
ともある。オリゴ糖は糖脂質やプロテオグリカン内にも
認められ、グリピエーション(glypiation)を介して膜結
合タンパク質に付加され得る。本明細書において、「グ
リコシル化され得る」という用語はＡsn残基のＮ-グリ
コシル化に限定されるのではなく、ペプチドや脂質が生
体内でグリコシル化されるすべての機構を包含する。
【０００８】２９３細胞中で生産されたｒＨＰＣ上に認
められる主なオリゴ糖をディオネックス(Ｄionex)ＨＰ
ＡＥ-ＰＡＤ系での指紋法にかけると図１に記載の特性
図を示す。主要ピーク１に対応するオリゴ糖は天然の二
分岐オリゴ糖であり、両分枝共に、フコシル化されたキ
トビオース-トリマンノシル核に結合したＧａｌＮＡｃ
β(１-４)(Ｆucα(１-３))ＧlcＮＡcα(１-２)−という
構造を含む。検討しここに開示した他の１０種のオリゴ
糖のうちの数種はやはり、ＧalＮＡcを含有する新規Ｎ-
結合型構造を示す。ピーク２、７および１１のオリゴ糖
の予測構造も、フルコシル化されたキトビオース-トリ
マンノシル核の少なくとも１つの分枝上に新規構造を含
有する。さらに、ピーク１５、２０および２３のオリゴ
糖の構造は１-４結合したＧalＮＡc残基を含有する。２
９３細胞はこれらの基質の生産に必要な特異的酵素を含
有しているので、これらの新規オリゴ糖構造が２９３細
胞系によって生産されるのである。
【０００９】ヒト腎２９３細胞はα(２-３)シアリルト
ランスフェラーゼとα(２-６)シアリルトランスフェラ
ーゼの両方を持っているようである。上記α(２-６)シ
アリルトランスフェラーゼはＧalＮＡc残基のシアリル
化に関して特異的であるの対して、上記α(２-３)シア
リルトランスフェラーゼはＧal残基のシアリル化に関し
て特異的である。２９３細胞によって発現されるα(１-
３)フコシルトランスフェラーゼはＧalＮＡcを含有する
基質に作用することができる。上記α(２-６)シアリル
トランスフェラーゼと上記α(１-３)フコシルトランス
フェラーゼの作用はオリゴ糖の個々の分枝のいずれにつ
いても互いに排他的であり、それゆえに一旦ＧalＮＡc
がシアリル化されると、同じ分枝中のＧalＮＡc残基の
α(１-３)フコシル化が妨げられるようである。逆に、
一旦ＧalＮＡcがフコシル化されると、同じ分枝上の同
じＧalＮＡc残基は上記α(２-６)シアリルトランスフェ
ラーゼによってシアリル化されることができない。
【００１０】２９３細胞は極めて高いレベルのα(１-
６)フコシルトランスフェラーゼ活性を発現されるの
で、２９３細胞は炭水化物部分の不均質性がかなり低い
組換え糖タンパク質分子を生産する。ｒＨＰＣから単離
された２５個のオリゴ糖ピークすべての結合分析では、
還元末端を伴う４,６-結合したＧlcＮＡcのみが認めら
れた。還元末端を伴う４-結合したＧlcＮＡcは全く検出
されなかった。このことから、すべての上記Ｎ-結合型
オリゴ糖のキトビース核が実質上１００％フコシル化さ
れていたことは明らかである。２９３細胞由来のｒＨＰ
Ｃ上の１１種の主要オリゴ糖の解明によって、Ｙanら,1
990,BioTechnology 8:655-660が報告したｒＨＰＣの異
常なグリコシル含量が説明される。この分子の高フコー
ス含量は、すべてのＮ-結合型オリゴ糖のキトビオース
核がフコシル化されるという事実および上記１１種のＮ
-結合型オリゴ糖のうちの４種の分枝中のＧlcＮＡc残基
がフコシル化されているという事実によって説明するこ
とができる。ピーク２中に認められるオリゴ糖を除い
て、ｒＨＰＣ中のＧalＮＡc残基はすべてＮ-グリコシル
化されたオリゴ糖中に認められ、通常はＮ-結合複合型
オリゴ糖中にＧalのみが認められる分枝位置中にのみ認
められる。本明細書において、分枝および分岐という用
語は複数の分枝および分岐を包含し、その逆もまた同じ
である。
【００１１】２９３細胞中に認められる上記フコシルト
ランスフェラーゼの作用と、その結果としてこの細胞系
中でなされるオリゴ糖のＧlcＮＡc残基のα(１-３)フコ
シル化は、本発明のもう１つの側面を明らかにする。α
(１-３)フコシル化されたＧlcＮＡcを含有する構造はセ
レクチンの結合に関して有用なリガンド(配位子)であ
る。セレクチンは免疫系の接着受容体の一種である。内
皮内層に対する白血球の接着は炎症応答における不可欠
の段階である。α(１-３)フコシル化されたＧlcＮＡcを
含有するオリゴ糖は、２種類のセレクチン、即ちＣＤ６
２とＥＬＡＭ-１(内皮-白血球接着分子１)に結合する。
細胞接着検定は、このような新規オリゴ糖を含有するペ
プチドの添加(もしくはそのオリゴ糖単独の添加)が上記
セレクチンを結合することによって細胞接着を軽減また
は防止し得ることを示している。細胞接着が軽減または
防止されるのであれば、炎症応答も軽減または防止され
得る。
【００１２】このようなセレクチン認識リガンドを生産
するために必要な酵素機構を２９３細胞が持っていると
いう発見は、炎症応答と細胞接着に関連する病状の治療
にとって重要かつ有用な手段を医学界に提供することに
なる。２９３細胞中で生産される糖タンパク質およびオ
リゴ糖は、この発見ゆえに、炎症または細胞接着の治療
に用いることができる。様々な健康障害を治療するため
にｒＨＰＣを使用する方法はＢangら,米国特許第４７７
５６２４号に開示されている。２９３細胞が構成的に生
産する幾つかの糖タンパク質も新規な構造を示し得るの
で、２９３細胞によって生産される新規糖タンパク質は
組換え生産されるタンパク質に限定されない。さらに、
本発明は細胞接着と炎症を防止または軽減するために糖
ペプチドを使用することに限定されない。よく知られて
いる様々な手法で糖タンパク質からそのオリゴ糖を取り
出し得ることは、当業者には理解されるであろう。次い
でそのオリゴ糖を医薬的に許容される希釈剤に入れて、
細胞接着または炎症を被っている患者に投与することが
できる。
【００１３】本発明が２９３細胞中でのヒトプロテイン
Ｃのオリゴ糖の生産に限定されないことは、当業者には
理解されるであろう。グリコシル化され得るペプチドは
いずれも、当該技術分野でよく知られている技術を使っ
て２９３細胞中に形質転換し、これを発現させることが
できる。そのようなペプチドの例にはヒトプロテイン
Ｓ、ヒトトロンボモジュリン、組織プラスミノーゲン活
性化因子、レニンおよびヒトプロテインＣの誘導体が含
まれるがこれらに限定されない。２９３細胞におけるヒ
トプロテインＳの生産はＹan,米国特許第４９８１９５
２号に開示されている。ヒトプロテインＣの数種の誘導
体をコード化する遺伝子は欧州特許出願第９１３０１４
５０.２号に開示されている。ヒトトロンボモジュリン
の天然型と誘導体型をコード化する遺伝子は欧州特許出
願第９０３０８８２６.８号とＷenら,1987,Biochemistr
y 26:4350に開示されている。これらの遺伝子はいずれ
も２９３細胞中に形質転換することができ、その細胞を
遺伝子発現とペプチド／オリゴ糖生産に適した条件下で
培養することができる。
【００１４】以下の実施例は本発明を例示するために記
載するのであって、本発明を限定するものであると見な
してはならない。
【００１５】
【実施例】実施例１ ：２９３細胞におけるヒトプロテインＣの生産 当業者によく知られている技術(例えばＹan,米国特許第
４９８１９５２号に説明されている技術など)を用い
て、ヒト腎２９３細胞中で組換えヒトプロテインＣ(ｒ
ＨＰＣ)を生産した。ヒトプロテインＣをコード化する
遺伝子はＢangら,米国特許第４７７５６２４号に開示さ
れ、特許請求されている。２９３細胞中でヒトプロテイ
ンＣを発現させるために使用したプラスミドは、Ｂang
ら,米国特許第４９９２３７３号に開示されているプラ
スミドｐＬＰＣである。プラスミドｐＬＰＣの構築につ
いても欧州特許公開第０ ４４５ ９３９号とＧrinnell
ら,1987,BioTechnology 5:1189-1192に記述されてい
る。簡単に述べると、このプラスミドを２９３細胞中に
トランスフェクトし、次いで安定な形質転換体を同定
し、継代培養した。次に、最も高い発現レベルを示した
クローンを２核オプチセル発酵槽(2 core Ｏpticell fe
rmenter)中で足場依存的に生育させた。すべての発酵に
血清非含有培地を使用した。血清非含有培地を調製する
ために、下記の成分を高純度水１００リットルに溶解し
た。 ダルベッコ変法イーグル培地(＃２００−２０１０) １３５０ｇ ハムＦ１２培地(＃６３Ｎ３０８５) ４７８ｇ 重炭酸ナトリウム ４３２ｇ デキストロース ４６８ｇ エタノールアミン ５５ml 亜セレン酸ナトリウム ０.５Ｍ １８０ml ビタミンＫ（１％） １８０ml Ｌ-グルタミン ８１ｇ この溶液を１８０リットルにし、３Ｎ ＨＣｌを用いて
ｐＨを７.２に調節した。３７℃での発酵の後、Ｙan,米
国特許第４９８１９５２号の技術によってヒトプロテイ
ンＣを培養液から分離することができる。このように生
産されたヒトプロテインＣは不活化されたチモーゲン型
で使用することができるし、あるいは当業者によく知ら
れている手法でこれを活性化することもできる。
【００１６】実施例２：２９３細胞中で生産されたｒＨ
ＰＣのオリゴ糖構造 ２９３細胞中で生産されたｒＨＰＣの新規構造を解明す
るために使用した手法の多くはＹanら,1990,BioTechnol
ogy 8:655-651に記述されている。脱塩し凍結乾燥した
ｒＨＰＣをまず２ｍＭ ＥＤＴＡと６Ｍ グアニジン塩酸
塩を含有する０.２Ｍ トリス緩衝液(ｐＨ８.６)中で還
元し、カルボキシメチル化した。この溶液を５０ｍＭ
重炭酸アンモニウムに対して充分に透析した後、凍結乾
燥した。この変性したｒＨＰＣをリン酸ナトリウム緩衝
液(ｐＨ８.６)中に再懸濁した後、Ｎ-グリカナーゼ(Ｇe
nzyme)をｒＨＰＣ８〜９ｍｇあたり１２単位の割合で加
えた。この溶液を３７℃で７２時間インキュベートした
後、５０ｍＭ 重炭酸アンモニウムで平衡化したバイオ
ゲル(Bio-gel)Ｐ６カラム上で、酵素的に放出されたＮ-
結合型オリゴ糖を脱グリコシル化されたｒＨＰＣから分
離した。脱グリコシル化されたｒＨＰＣを含有する分画
をＯＤ280nmで監視した。
【００１７】グリコシル組成分析によって監視したオリ
ゴ糖を含有する分画を集めて凍結乾燥した。２０ｍＭ
酢酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＯＨで平衡化したＡ
Ｇ６保護カラム付きＡＳ６カラム(４.６×２５０mm)を
用いるディオネックス(Ｄionex)ＨＰＡＥ-ＰＡＤ II系
で、上記オリゴ糖を分離した。３分後、酢酸ナトリウム
を２０分間で６０ｍＭに増大させ、さらに１２０分間で
２００ｍＭに増大させ、４０分間で４００ｍＭに増大さ
せ、再び５分間で８００ｍＭに増大させた。ＮａＯＨ濃
度を１００ｍＭ一定に保ち、カラム流速を１ｍｌ／分と
した。カラム後０.３Ｍ ＮａＯＨを０.５ｍｌ／分の流
量で流した。
【００１８】ＰＡＤ検出器の後ろにアニオン微小膜抑制
器(anion micromembrane suppressor)を取り付けた。こ
のアニオン微小膜抑制器に９ｍｌ／分で３０ｍＭ 硫酸
を流すと、ＡＧ６-ＡＳ６カラムからの溶出物を中和
し、部分的に脱塩するのに充分であった。各オリゴ糖ピ
ークを、製造者の指示に従って調製したオンガード(Ｏn
Guard)Ｈカートリッジ(Ｄionex)でさらに脱塩した。
【００１９】脱塩したオリゴ糖約１〜１０μｇを、結合
分析のためのＰＭＭＡ誘導体を調製する際の出発物質と
して使用した。１Ｍ ＮＨ4ＯＨ中の１０ｍｇ／ｍｌ Ｎ
ａＢＨ4 ２５μｌを用いて、オリゴ糖を室温で２時間予
備還元した。氷酢酸２０μｌを用いてこの反応を停止さ
せた後、窒素下でメタノール中の１０％酢酸との同時留
去を繰り返すことによってホウ酸塩を除去した。還元さ
れたオリゴ糖を、Ｃostello及びＶath,1990,Ｍeth.Enzy
mol.193:738-755に記述されているＣiucanu及びＫerek,
1984,Carabohydr.Res.131:209-217の改良法で過メチル
化(パーメチル化)した。過メチル化したオリゴ糖を２Ｍ
ＴＦＡ中１００℃で２時間加水分解し、次いで回転留
去(ロータリーエバポレーション)で乾燥した。１Ｍ Ｎ
Ｈ4ＯＨ中２０ｍｇ／ｍｌ濃度のＮａＢＤ4を４０℃で
１.５時間加えることによって重水素還元を達成した。
氷酢酸で中和することによってこの反応を停止させた。
窒素下でメタノール中の１０％酢酸と同時留去すること
によってホウ酸塩を除去した。酢酸無水物と共に室温で
３０分間インキュベートすることによってアセチル化を
行った。オリゴ糖の最終的なＰＭＡＡ誘導体を塩化メチ
レンで抽出し、窒素下で乾燥することによって濃縮し、
酢酸エチル１０〜２０μｌに再溶解した。
【００２０】ヒューレット・パッカード(Hewlett Packa
rd)ＧＣ５８９０−ＭＳＤを用いて気相クロマトグラフ
ィー−質量分析(ＧＣ-ＭＳ)を行った。上記ＰＭＡＡ誘
導体を酢酸エチルに溶解した後、１ｍｌ／分のヘリウム
流量でＤＢ-５カラム(０.２５ｍｍ×３０ｍ，Ｊ ＆ Ｗ
Ｓcientific)に注入した。試料を８０℃のカラム温度で
注入し、この温度を２分間維持した後、３０℃／分の速
度で１５０℃まで上昇させ、次いで再び２℃／分の速度
で１５０℃から２４０℃まで上昇させ、２４０℃を１０
分間維持した。ＥＩ四重極モードで上記質量分析装置を
使用した。このＧＣ-ＭＳを溶出時間に関して標品を用
いて較正した。
【００２１】ピーク１のオリゴ糖の構造をグリコシル組
成結合分析および1Ｈ-ＮＭＲによって解明した。他の１
０種の主要オリゴ糖の構造をグリコシル組成および結合
分析に基づいて予測した。このようにして解明されたオ
リゴ糖構造を以下に記載する。
【００２２】ピーク番号１の炭水化物構造
【化５】
【００２３】ピーク番号２の炭水化物構造
【化６】
【００２４】ピーク番号７の炭水化物構造
【化７】
【００２５】ピーク番号９の炭水化物構造
【化８】
【００２６】ピーク番号１１の炭水化物構造
【化９】
【００２７】ピーク番号１５の炭水化物構造
【化１０】
【００２８】ピーク番号１９の炭水化物構造
【化１１】
【００２９】ピーク番号２０の炭水化物構造
【化１２】
【００３０】ピーク番号２３の炭水化物構造
【化１３】
【００３１】ピーク番号２４の炭水化物構造
【化１４】
【００３２】ピーク番号２５の炭水化物構造
【化１５】
【００３３】実施例３：インビトロ細胞接着検定 ヒト臍静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)またはヒト大動脈内皮
(ＨＡＥ)をクローンティックス(Ｃlonetics,サンジエ
ゴ)から入手し、クローンティックスから供給されたＥ
ＢＭ培地中で生育させた。３７℃で終夜インキュベート
した後に全面成長単層が得られる密度で、細胞を９６穴
プレートに接種した。総体積１００〜１５０μｌ中での
結合検定に先立って、単層を腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)２０
ｎｇの存在下または非存在下で４〜６時間インキュベー
トした。結合の阻害について調べるために、プロテイン
Ｃまたは単離したその炭水化物の試料を、リン酸緩衝化
食塩水(ＰＢＳ)または水中２０μｌまでの体積で３つの
ウェルに加えた後、さらに２０〜２５分間インキュベー
トした。インキュベーション後、三重水素でラベルした
Ｕ９３７細胞を１ウェルあたり１〜３×１０(６)細胞の
割合で５０μｌの体積で加えた。上記Ｕ９３７細胞は、
3Ｈ-チミジンを最終濃度１μＣｉ／ｍｌになるように添
加した後１８〜２０時間インキュベートすることによっ
て三重水素ラベルした。細胞を使用する前に過剰のラベ
ルを除去するべくＰＢＳで洗浄した。上記内皮細胞と共
にラベルしたＵ９３７細胞を２０分間インキュベートし
た後、ウェルを吸引し、カルシウム含有ＰＢＳで４回洗
浄した。０.２５％ＳＤＳ／０.１Ｎ ＮａＯＨを撹拌し
ながら５分間添加することによって、単層および接着し
たＵ９３７細胞を可溶化した。可溶化した細胞のシンチ
レーション計数によって結合のレベルを決定した。
【表１】 実験番号 ａＰＣ(μg／ml) 阻害率(％)a １(ＨＵＶＥＣＳ)b ３２ なし １(ＨＵＶＥＣＳ) １２０ ７０(１２)c ２(ＨＡＥ) １２０ なし ２(ＨＡＥ) ２４０ ７７(３０) ３(ＨＡＥ) １２０ ５４(１８) a ＴＮＦによる内皮細胞予備処理の有無間のＵ９３７細
胞結合の差を１００％阻害とする。b 細胞系。c 確固内の数字は標準誤差を示す。
【表２】 実験番号 オリゴ糖(μＭ) 阻害率(％)a １(ＨＡＥ)b ５.７５ なし １(ＨＡＥ) １１.５ ２２(０.５)ｃ １(ＨＡＥ) ２３ １６(４) ２(ＨＵＶＥＣＳ) １７.２５ １９d ２(ＨＵＶＥＣＳ) ３４.５ ６３ a ＴＮＦによる内皮細胞予備処理の有無間のＵ９３７細
胞結合の差を１００％阻害とする。b 細胞系。c 確固内の数字は標準誤差を示す。d 一点測定からは誤差が計算されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ２９３細胞中で生産されたヒトプロテインＣ
分子上に認められる主な炭水化物のクロマトグラフ。炭
水化物構造が解明された主要ピークに数字を付してあ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C08B 37/00 A61K 31/715 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記構造式で表されるオリゴ糖。 【化１】
  2. 【請求項２】 下記構造式で表されるオリゴ糖。 【化２】
  3. 【請求項３】 下記構造式で表されるオリゴ糖。 【化３】
  4. 【請求項４】 下記構造式で表されるオリゴ糖。 【化４】
  5. 【請求項５】 請求項１、２、３または４に記載のオリ
    ゴ糖を活性成分とし、１または複数の医薬的に許容され
    る担体、賦形剤または希釈剤を伴ってなる抗炎症剤。
JP05056193A 1992-03-12 1993-03-11 オリゴ糖およびそれを含有する抗炎症剤 Expired - Fee Related JP3171506B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US84986892A 1992-03-12 1992-03-12
US849868 1992-03-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH0625302A JPH0625302A (ja) 1994-02-01
JP3171506B2 true JP3171506B2 (ja) 2001-05-28

Family

ID=25306715

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP05056193A Expired - Fee Related JP3171506B2 (ja) 1992-03-12 1993-03-11 オリゴ糖およびそれを含有する抗炎症剤

Country Status (23)

Country Link
EP (1) EP0565241B1 (ja)
JP (1) JP3171506B2 (ja)
KR (1) KR930019696A (ja)
CN (1) CN1079967A (ja)
AT (1) ATE137241T1 (ja)
AU (1) AU661762B2 (ja)
BR (1) BR9301136A (ja)
CA (1) CA2091521A1 (ja)
CY (1) CY1947A (ja)
CZ (1) CZ39093A3 (ja)
DE (1) DE69302317T2 (ja)
DK (1) DK0565241T3 (ja)
ES (1) ES2088227T3 (ja)
FI (1) FI931086A (ja)
GR (1) GR3020406T3 (ja)
HK (1) HK132396A (ja)
HU (1) HUT69613A (ja)
IL (1) IL105018A0 (ja)
MX (1) MX9301344A (ja)
NO (1) NO930890L (ja)
NZ (1) NZ247105A (ja)
YU (1) YU16993A (ja)
ZA (1) ZA931723B (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE456664T1 (de) * 2001-04-02 2010-02-15 Glycomedics Inc Verfahren zur herstellung von oligosaccharidketten
FI20011664A (fi) 2001-08-17 2003-02-18 Carbion Oy Syöpäpesifiset oligoskkaridisekvenssit ja niiden käyttö
US7943763B2 (en) * 2002-07-05 2011-05-17 Otsuka Chemical Holdings Co., Ltd. Process for preparing glycopeptides having asparagine-linked oligosaccharides, and the glycopeptides
WO2004058824A1 (ja) * 2002-12-26 2004-07-15 Otsuka Chemical Co., Ltd. ３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体、該糖鎖アスパラギン、該糖鎖およびそれらの製造方法
JP3884725B2 (ja) 2003-06-03 2007-02-21 三菱電機株式会社 導波管装置

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5009889A (en) * 1987-12-31 1991-04-23 Oklahoma Medical Research Foundation Treatment of dysfunctional vascular endothelium using activated protein C

Also Published As

Publication number Publication date
EP0565241B1 (en) 1996-04-24
EP0565241A1 (en) 1993-10-13
AU661762B2 (en) 1995-08-03
ES2088227T3 (es) 1996-08-01
YU16993A (sh) 1996-02-19
GR3020406T3 (en) 1996-09-30
BR9301136A (pt) 1993-09-28
HK132396A (en) 1996-07-26
MX9301344A (es) 1993-09-01
HU9300687D0 (en) 1993-05-28
CA2091521A1 (en) 1993-09-13
DK0565241T3 (da) 1996-05-28
DE69302317T2 (de) 1996-09-19
IL105018A0 (en) 1993-07-08
ATE137241T1 (de) 1996-05-15
CN1079967A (zh) 1993-12-29
JPH0625302A (ja) 1994-02-01
CY1947A (en) 1993-03-12
ZA931723B (en) 1994-09-10
NZ247105A (en) 1994-11-25
DE69302317D1 (de) 1996-05-30
FI931086A (fi) 1993-09-13
NO930890L (no) 1993-09-13
HUT69613A (en) 1995-09-28
AU3519993A (en) 1993-09-16
NO930890D0 (no) 1993-03-11
FI931086A0 (fi) 1993-03-11
CZ39093A3 (en) 1994-03-16
KR930019696A (ko) 1993-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100861470B1 (ko) 인자 ⅶ 글리코형
Markwell et al. Sendai virus utilizes specific sialyloligosaccharides as host cell receptor determinants.
US4751084A (en) Tissue plasminogen activator from normal human colon cells
JPH05504047A (ja) ヘパラナーゼを含む創傷治癒用組成物
AU2001291652A1 (en) Factor VII glycoforms
ZA200601643B (en) Polysaccharides derivatives with high antithromboitic activity in plasma
JP3171506B2 (ja) オリゴ糖およびそれを含有する抗炎症剤
Bergwerff et al. Primary structure of N‐linked carbohydrate chains of a human chimeric plasminogen activator K2tu‐PA expressed in Chinese hamster ovary cells
KR20160122158A (ko) 인자 vii 컨쥬게이트
US4851517A (en) Tissue plasminogen activator oligosaccharide from normal human colon cells
Heaney-Kleras et al. Glycosaminoglycans synthesized by tumorigenic and nontumorigenic mouse melanoma cells in culture
EP0236289A2 (en) Tissue plasminogen activator from normal human colon cells
Marcum et al. The biochemistry and physiology of anticoagulantly active heparin-like molecules
US20170035890A1 (en) Coagulation Factor IX Conjugates
JPS62282581A (ja) ヒト正常結腸細胞由来組織プラスミノ−ゲン活性化因子
JP4377987B2 (ja) ガラクトース転移酵素及びそれをコードするｄｎａ
JPH06281650A (ja) 血漿由来製剤

Legal Events

Date Code Title Description
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20010227

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees