JPH06281650A - 血漿由来製剤 - Google Patents
血漿由来製剤Info
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- JPH06281650A JPH06281650A JP4103824A JP10382492A JPH06281650A JP H06281650 A JPH06281650 A JP H06281650A JP 4103824 A JP4103824 A JP 4103824A JP 10382492 A JP10382492 A JP 10382492A JP H06281650 A JPH06281650 A JP H06281650A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 臨床使用上、安全な、管理された血漿成分を
含有する血漿由来制剤を提供する。 【構成】 血漿由来製剤において、ａ）Ａ型糖鎖抗原及
びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原、ｂ）Ｂ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）
型糖鎖抗原、ｃ）Ａ型糖鎖抗原、Ｂ型糖鎖抗原、及びＨ
（Ｏ）型糖鎖抗原、ｄ）Ｈ（Ｏ）型糖鎖抗原より成る群
より選択される糖鎖抗原を実質上一種含有する血漿成分
を有効成分とする血漿由来製剤。また血漿中のＡ型糖鎖
抗原及びＢ型糖鎖抗原を除去した血漿成分を有効成分と
する血漿由来製剤。 【効果】 血友病、ｖＷ病等の治療、血漿由来成分の輸
血等において安全な製剤として有用である。
含有する血漿由来制剤を提供する。 【構成】 血漿由来製剤において、ａ）Ａ型糖鎖抗原及
びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原、ｂ）Ｂ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）
型糖鎖抗原、ｃ）Ａ型糖鎖抗原、Ｂ型糖鎖抗原、及びＨ
（Ｏ）型糖鎖抗原、ｄ）Ｈ（Ｏ）型糖鎖抗原より成る群
より選択される糖鎖抗原を実質上一種含有する血漿成分
を有効成分とする血漿由来製剤。また血漿中のＡ型糖鎖
抗原及びＢ型糖鎖抗原を除去した血漿成分を有効成分と
する血漿由来製剤。 【効果】 血友病、ｖＷ病等の治療、血漿由来成分の輸
血等において安全な製剤として有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は糖鎖抗原の特定された血
漿成分を含有する血漿由来製剤に関する。
漿成分を含有する血漿由来製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】通常輸血に際し、ＡＢＯ式血液型の判定
は必須であり、その不適合は輸血そのものに危険をもた
らし、臨床症状としては軽度のアレルギー反応から、シ
ョック、腎不全、播種性血管内凝固など重篤な症状を呈
することもまれではない。ＡＢＯ式血液型は赤血球の表
面にあるＡＢＨ（Ｏ）糖鎖抗原の違いによって決定され
る。一方、血漿成分採取装置の開発に伴い、血漿成分
は、成分輸血や、血友病や感染症の治療薬の原料として
使用されるようになってきた。遺伝的血液病である血友
病は血液凝固因子のうち、先天的に第VIII因子、又は第
IX因子活性が低下しているため出血性素因をもたらす伴
性劣性遺伝疾患であり、第VIII因子欠乏による血友病Ａ
の場合は第VIII因子濃縮製剤の、第IX因子欠乏による血
友病Ｂの場合にはプロトロンビン複合製剤の補充療法が
行われている。また、皮膚、粘膜出血を特徴とし、出血
時間の延長と第VIII因子活性の低下を示す男女両性に出
現する常染色体優性の遺伝的出血症であるフォンビルブ
ランド（ｖＷ）病の場合は、血漿中のフォンビルブラン
ド因子（ｖＷＦ）の量的あるいは質的異常のため、血小
板による一次止血が障害され、その治療として、新鮮血
漿の補充療法が行われている。このｖＷＦは、血小板の
内皮下組織粘着に大きな役割を果すことで知られている
血漿糖タンパク質で、血液凝固第VIII因子のキャリアー
である〔チタニ（ Titani ) ら、トレンズ イン バイ
オケミカル サイエンシーズ（Ｔ．Ｉ．Ｂ．Ｓ．）、第
１３巻、第９４〜９７頁（１９８８）、ギルマ（ Girma
)ら、ブラッド（ Blood )、第７０巻、第６０５〜６１
１頁（１９８７）〕。またｖＷＦは、分子量０．５〜２
０×１０6 Ｄａのマルチマーとして循環し、２７０ｋＤ
ａのサブユニットから成る〔前出Ｔ．Ｉ．Ｂ．Ｓ．、チ
ョペック（ Chopek ) ら、バイオケミストリー（ Bioch
emistry ) 、第２５巻、第３１４６〜３１５５頁（１９
８６）〕。成熟サブユニットの完全なアミノ酸配列は明
らかにされ〔チタニら、バイオケミストリー、第２５
巻、第３１７１〜３１８４頁（１９８６）〕、また糖タ
ンパク質の限定タンパク分解によって得た断片や、各ド
メインに特異的な抗体を使用して、ヘパリン〔フジムラ
（ Fujimura ) ら、ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（ J.Biol.Chem.)、第２６２巻、第１７
３４〜１７３９頁（１９８７）〕、血小板膜糖タンパク
質〔プロウ（ Plow ) ら、プロシーディングス オブ
ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ
オブ ザＵＳＡ（ Proc.Natl.Acad.Sci.USA)、第８２
巻、第８０５７〜８０６１頁（１９８５）、アンドリュ
ース（ Andrews )ら、バイオケミストリー、第２８巻、
第８３２６〜８３３６頁（１９８９）〕、コラーゲン
〔タカギ（ Takagi ) ら、ジャーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー、第２６４巻、第６０１７〜６０
２０頁（１９８９）〕、血液凝固第VIII因子〔ホスター
（ Foster ) ら、ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー、第２６２巻、第８４４３〜８４４６頁
（１９８７）〕等への結合ドメインがそれぞれ同定され
ている。
は必須であり、その不適合は輸血そのものに危険をもた
らし、臨床症状としては軽度のアレルギー反応から、シ
ョック、腎不全、播種性血管内凝固など重篤な症状を呈
することもまれではない。ＡＢＯ式血液型は赤血球の表
面にあるＡＢＨ（Ｏ）糖鎖抗原の違いによって決定され
る。一方、血漿成分採取装置の開発に伴い、血漿成分
は、成分輸血や、血友病や感染症の治療薬の原料として
使用されるようになってきた。遺伝的血液病である血友
病は血液凝固因子のうち、先天的に第VIII因子、又は第
IX因子活性が低下しているため出血性素因をもたらす伴
性劣性遺伝疾患であり、第VIII因子欠乏による血友病Ａ
の場合は第VIII因子濃縮製剤の、第IX因子欠乏による血
友病Ｂの場合にはプロトロンビン複合製剤の補充療法が
行われている。また、皮膚、粘膜出血を特徴とし、出血
時間の延長と第VIII因子活性の低下を示す男女両性に出
現する常染色体優性の遺伝的出血症であるフォンビルブ
ランド（ｖＷ）病の場合は、血漿中のフォンビルブラン
ド因子（ｖＷＦ）の量的あるいは質的異常のため、血小
板による一次止血が障害され、その治療として、新鮮血
漿の補充療法が行われている。このｖＷＦは、血小板の
内皮下組織粘着に大きな役割を果すことで知られている
血漿糖タンパク質で、血液凝固第VIII因子のキャリアー
である〔チタニ（ Titani ) ら、トレンズ イン バイ
オケミカル サイエンシーズ（Ｔ．Ｉ．Ｂ．Ｓ．）、第
１３巻、第９４〜９７頁（１９８８）、ギルマ（ Girma
)ら、ブラッド（ Blood )、第７０巻、第６０５〜６１
１頁（１９８７）〕。またｖＷＦは、分子量０．５〜２
０×１０6 Ｄａのマルチマーとして循環し、２７０ｋＤ
ａのサブユニットから成る〔前出Ｔ．Ｉ．Ｂ．Ｓ．、チ
ョペック（ Chopek ) ら、バイオケミストリー（ Bioch
emistry ) 、第２５巻、第３１４６〜３１５５頁（１９
８６）〕。成熟サブユニットの完全なアミノ酸配列は明
らかにされ〔チタニら、バイオケミストリー、第２５
巻、第３１７１〜３１８４頁（１９８６）〕、また糖タ
ンパク質の限定タンパク分解によって得た断片や、各ド
メインに特異的な抗体を使用して、ヘパリン〔フジムラ
（ Fujimura ) ら、ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（ J.Biol.Chem.)、第２６２巻、第１７
３４〜１７３９頁（１９８７）〕、血小板膜糖タンパク
質〔プロウ（ Plow ) ら、プロシーディングス オブ
ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ
オブ ザＵＳＡ（ Proc.Natl.Acad.Sci.USA)、第８２
巻、第８０５７〜８０６１頁（１９８５）、アンドリュ
ース（ Andrews )ら、バイオケミストリー、第２８巻、
第８３２６〜８３３６頁（１９８９）〕、コラーゲン
〔タカギ（ Takagi ) ら、ジャーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー、第２６４巻、第６０１７〜６０
２０頁（１９８９）〕、血液凝固第VIII因子〔ホスター
（ Foster ) ら、ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー、第２６２巻、第８４４３〜８４４６頁
（１９８７）〕等への結合ドメインがそれぞれ同定され
ている。
【０００３】本発明者らは先にｖＷＦは、サブユニット
当り１２個のＮ結合オリゴ糖鎖と１０個のＯ結合オリゴ
糖鎖を有し、これは全重量の約１５％に相当することを
報告した〔前出バイオケミストリー、第２５巻、第３１
７１〜３１８４頁（１９８６）〕。ｖＷＦの糖鎖部分の
機能的役割はいまだ未解明であるが、タンパク質分解酵
素に対する耐性〔フェデリシ（ Federici ) ら、ジャー
ナル オブ クリニカル インベスチゲーション（ J.C
lin.Invest.)、第７４巻、第２０４９〜２０５５頁（１
９８４）〕、マルチマー化〔ワグナー（ Wagner ) ら、
ジャーナル オブ セル バイオロジー（ J.Cell.Bio
l.)、第１０２巻、第１３２０〜１３２４頁（１９８
６）〕、血小板〔ソデツ（ Sodetz ) ら、ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー、第２５３巻、第
７２０２〜７２０６頁（１９７８）、ゴウデマンド（ G
oudemand )ら、スロンボシス ヘモスタス（ Thrombos.
Haemostas)、第５３巻、第３９０〜３９５頁（１９８
５）、フェデリシら、ブラッド、第７１巻、第９４７〜
９５２頁（１９８８）〕、あるいはコラーゲン〔ケスラ
ー（ Kessler) ら、スロンボシス リサーチ（ Thrombo
s.Res. )、第５７巻、第５９〜７６頁（１９９０）〕と
の相互作用に関与すると示唆されている。またアシアロ
ｖＷＦがリストセチンのような補助因子の存在しないと
ころで血小板凝集を誘因するところから、ｖＷＦの糖鎖
部分は、糖タンパク質のコンホメーションに影響すると
考えられる〔デ マルコ（ De Maro )ら、ジャーナル
オブ クリニカル インベスチゲーション、第６８巻、
第３２１〜３２８頁（１９８１）〕。更にある種のｖＷ
病において、活性の無い糖鎖欠損ｖＷＦが報告されてい
る〔グラルニク（ Gralnick ) ら、サイエンス（ Scien
ce )、第１９２巻、第５６〜５９頁（１９７６）〕。
当り１２個のＮ結合オリゴ糖鎖と１０個のＯ結合オリゴ
糖鎖を有し、これは全重量の約１５％に相当することを
報告した〔前出バイオケミストリー、第２５巻、第３１
７１〜３１８４頁（１９８６）〕。ｖＷＦの糖鎖部分の
機能的役割はいまだ未解明であるが、タンパク質分解酵
素に対する耐性〔フェデリシ（ Federici ) ら、ジャー
ナル オブ クリニカル インベスチゲーション（ J.C
lin.Invest.)、第７４巻、第２０４９〜２０５５頁（１
９８４）〕、マルチマー化〔ワグナー（ Wagner ) ら、
ジャーナル オブ セル バイオロジー（ J.Cell.Bio
l.)、第１０２巻、第１３２０〜１３２４頁（１９８
６）〕、血小板〔ソデツ（ Sodetz ) ら、ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー、第２５３巻、第
７２０２〜７２０６頁（１９７８）、ゴウデマンド（ G
oudemand )ら、スロンボシス ヘモスタス（ Thrombos.
Haemostas)、第５３巻、第３９０〜３９５頁（１９８
５）、フェデリシら、ブラッド、第７１巻、第９４７〜
９５２頁（１９８８）〕、あるいはコラーゲン〔ケスラ
ー（ Kessler) ら、スロンボシス リサーチ（ Thrombo
s.Res. )、第５７巻、第５９〜７６頁（１９９０）〕と
の相互作用に関与すると示唆されている。またアシアロ
ｖＷＦがリストセチンのような補助因子の存在しないと
ころで血小板凝集を誘因するところから、ｖＷＦの糖鎖
部分は、糖タンパク質のコンホメーションに影響すると
考えられる〔デ マルコ（ De Maro )ら、ジャーナル
オブ クリニカル インベスチゲーション、第６８巻、
第３２１〜３２８頁（１９８１）〕。更にある種のｖＷ
病において、活性の無い糖鎖欠損ｖＷＦが報告されてい
る〔グラルニク（ Gralnick ) ら、サイエンス（ Scien
ce )、第１９２巻、第５６〜５９頁（１９７６）〕。
【０００４】ｖＷＦの糖鎖構造の詳細については明らか
では無く、今までのところ、その９０％がｖＷＦであ
る、ヒト血液凝固第VIII因子／ｖＷＦ複合体において、
二本鎖及び四本鎖複合型Ｎ結合糖鎖が２種、Ｏ結合糖鎖
が一種決定されているのみである〔デベイレ（ Debeire
)ら、フェブス レターズ（ＦＥＢＳ Lett. ) 、第１
５１巻、第２２〜２６頁（１９８３）、サモル（ Samor
)ら、ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミス
トリー（ Eur.J.Biochem. ) 、第１５８巻、第２９５〜
２９８頁（１９８６）、サモルら、グリココンジュゲー
ト ジャーナル（Glycoconjugate J. ) 、第６巻、第２
６３〜２７０頁（１９８９）〕。本発明者らは、先に西
洋ワサビのパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合レクチンを
使用した一連の研究で、表１に示す様に、市販の第VIII
因子濃縮物より、精製したｖＷＦが、ハリエニシダ（ U
lex europaeus ) アグルチニンＩ（ＵＥＡ−Ｉ）と結合
活性を有することを見出した〔マツイ（ Matsui ) ら、
バイオケミカルアンド バイオフィジカル リサーチ
コミュニケーションズ（ Biochem.Biophys.Res.Commun.
)、第１７８巻、第１２５３〜１２５９頁（１９９
１）〕。
では無く、今までのところ、その９０％がｖＷＦであ
る、ヒト血液凝固第VIII因子／ｖＷＦ複合体において、
二本鎖及び四本鎖複合型Ｎ結合糖鎖が２種、Ｏ結合糖鎖
が一種決定されているのみである〔デベイレ（ Debeire
)ら、フェブス レターズ（ＦＥＢＳ Lett. ) 、第１
５１巻、第２２〜２６頁（１９８３）、サモル（ Samor
)ら、ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミス
トリー（ Eur.J.Biochem. ) 、第１５８巻、第２９５〜
２９８頁（１９８６）、サモルら、グリココンジュゲー
ト ジャーナル（Glycoconjugate J. ) 、第６巻、第２
６３〜２７０頁（１９８９）〕。本発明者らは、先に西
洋ワサビのパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合レクチンを
使用した一連の研究で、表１に示す様に、市販の第VIII
因子濃縮物より、精製したｖＷＦが、ハリエニシダ（ U
lex europaeus ) アグルチニンＩ（ＵＥＡ−Ｉ）と結合
活性を有することを見出した〔マツイ（ Matsui ) ら、
バイオケミカルアンド バイオフィジカル リサーチ
コミュニケーションズ（ Biochem.Biophys.Res.Commun.
)、第１７８巻、第１２５３〜１２５９頁（１９９
１）〕。
【０００５】
【表１】
【０００６】なお、ＣｏｎＡはコンカナバリンＡ、ＷＧ
Ａは麦芽（ Wheat germ ) 凝集素、ＲＣＡ120 はトウゴ
マ（ Ricinus communis ) 凝集素、ＰＮＡはピーナッツ
凝集素を示し、表１中ではＨＲＰ結合物を意味する。
Ａは麦芽（ Wheat germ ) 凝集素、ＲＣＡ120 はトウゴ
マ（ Ricinus communis ) 凝集素、ＰＮＡはピーナッツ
凝集素を示し、表１中ではＨＲＰ結合物を意味する。
【０００７】約１０μｇの各糖タンパク質、約３μｇの
ｖＷＦを各ＨＲＰ−レクチンのドットブロットアッセイ
に使用し、＋はＨＲＰ−レクチン結合性有、−は結合性
無を示す。ＵＥＡ−Ｉは血液型Ｈ（Ｏ）型構造のオリゴ
糖に強い親和性を示すことが知られており、ｖＷＦは下
記式（化１）の糖鎖を有することが示唆される。
ｖＷＦを各ＨＲＰ−レクチンのドットブロットアッセイ
に使用し、＋はＨＲＰ−レクチン結合性有、−は結合性
無を示す。ＵＥＡ−Ｉは血液型Ｈ（Ｏ）型構造のオリゴ
糖に強い親和性を示すことが知られており、ｖＷＦは下
記式（化１）の糖鎖を有することが示唆される。
【０００８】
【化１】Ｆα１ → ２Ｇβ１ → ４ＧＮβ１ →
【０００９】（なお以下の各化学式中Ｆはフコース、Ｇ
はガラクトース、ＧＮはＮ−アセチルグルコサミンを示
す）
はガラクトース、ＧＮはＮ−アセチルグルコサミンを示
す）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らが明らかと
した血漿成分中の血液型Ｈ（Ｏ）型糖鎖抗原の存在の可
能性は、血漿成分の臨床使用上、重要な問題を提起する
ものであり、そのため、該抗原の構造を特定する必要が
ある。本発明の目的は上記現状にかんがみ、血漿成分の
血液型糖鎖抗原を特定し、臨床使用上、安全な、管理さ
れた血漿成分を含有する血漿由来製剤を提供することに
ある。
した血漿成分中の血液型Ｈ（Ｏ）型糖鎖抗原の存在の可
能性は、血漿成分の臨床使用上、重要な問題を提起する
ものであり、そのため、該抗原の構造を特定する必要が
ある。本発明の目的は上記現状にかんがみ、血漿成分の
血液型糖鎖抗原を特定し、臨床使用上、安全な、管理さ
れた血漿成分を含有する血漿由来製剤を提供することに
ある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は血漿由来製剤に関し、血漿由来製剤
において、ａ）Ａ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原、
ｂ）Ｂ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原、ｃ）Ａ型糖
鎖抗原、Ｂ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原、ｄ）Ｈ
（Ｏ）型抗原より成る群より選択される糖鎖抗原を実質
上一種含有する血漿成分を有効成分とすることを特徴と
する。また、本発明の第２の発明も血漿由来製剤に関
し、血漿由来製剤において、血漿中のＡ型糖鎖抗原及び
Ｂ型糖鎖抗原を除去した血漿成分を有効成分とすること
を特徴とする。
発明の第１の発明は血漿由来製剤に関し、血漿由来製剤
において、ａ）Ａ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原、
ｂ）Ｂ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原、ｃ）Ａ型糖
鎖抗原、Ｂ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原、ｄ）Ｈ
（Ｏ）型抗原より成る群より選択される糖鎖抗原を実質
上一種含有する血漿成分を有効成分とすることを特徴と
する。また、本発明の第２の発明も血漿由来製剤に関
し、血漿由来製剤において、血漿中のＡ型糖鎖抗原及び
Ｂ型糖鎖抗原を除去した血漿成分を有効成分とすること
を特徴とする。
【００１２】血漿成分、例えばｖＷＦは、市販の第VIII
因子濃縮物より、前出バイオケミストリー、第２５巻、
第３１４６〜３１５５頁（１９８６）記載の方法によ
り、セファロース（ Sepharose )ＣＬ−４Ｂ、ゼラチン
−セファロース（ gelatin-Sepharose )、アグマチン−
セファロース（ agmatine-Sepharose ) 、高濃度Ｃａ++
下でのセファロースＣＬ−４Ｂ等を用い高度に精製する
ことができる。次に該精製物のヒドラジン分解を行い、
ｖＷＦのＮ結合糖鎖をポリペプチド部分から定量的に分
離することができる。分離した糖鎖のＮ−アセチル化
後、例えばＮａＢ3Ｈ4 を用い、該糖鎖の標識化を行
う。標識化Ｎ結合糖鎖のｐＨ５．４での高圧ろ紙電気泳
動により、図１に示す様にｖＷＦのＮ結合糖鎖は中性分
画（Ｎ）、２酸性成分（Ａ−１及びＡ−２）に分離され
る。なお図１はｖＷＦのＮ結合糖鎖の電気泳動図であ
り、横軸は泳動距離、縦軸は放射活性を示す。Ｎ、Ａ−
１、Ａ−２の量比は１４：５６：３０であり、Ａ−１は
１シアル酸、Ａ−２は２シアル酸を含有する。
因子濃縮物より、前出バイオケミストリー、第２５巻、
第３１４６〜３１５５頁（１９８６）記載の方法によ
り、セファロース（ Sepharose )ＣＬ−４Ｂ、ゼラチン
−セファロース（ gelatin-Sepharose )、アグマチン−
セファロース（ agmatine-Sepharose ) 、高濃度Ｃａ++
下でのセファロースＣＬ−４Ｂ等を用い高度に精製する
ことができる。次に該精製物のヒドラジン分解を行い、
ｖＷＦのＮ結合糖鎖をポリペプチド部分から定量的に分
離することができる。分離した糖鎖のＮ−アセチル化
後、例えばＮａＢ3Ｈ4 を用い、該糖鎖の標識化を行
う。標識化Ｎ結合糖鎖のｐＨ５．４での高圧ろ紙電気泳
動により、図１に示す様にｖＷＦのＮ結合糖鎖は中性分
画（Ｎ）、２酸性成分（Ａ−１及びＡ−２）に分離され
る。なお図１はｖＷＦのＮ結合糖鎖の電気泳動図であ
り、横軸は泳動距離、縦軸は放射活性を示す。Ｎ、Ａ−
１、Ａ−２の量比は１４：５６：３０であり、Ａ−１は
１シアル酸、Ａ−２は２シアル酸を含有する。
【００１３】Ｎ結合糖鎖構造は、例えば次の様にして決
定することができる。すなわち、Ｎ結合糖鎖標識物をシ
アリダーゼ処理し、アシアロ糖鎖を調製し、次いで該調
製物をレクチン結合カラム、例えばＣｏｎＡカラム、イ
ンゲン豆（ Phaseolus vulgaris ) のエリスロフィトヘ
マグルチニン（Ｅ−ＰＨＡ）カラム、ヨウシュチョウセ
ンアサガオ（ Datura stramonium )凝集素（ＤＳＡ）カ
ラム、ＲＣＡ120 カラム、ＵＥＡ−Ｉカラム等で処理す
ることにより、糖鎖構造に応じ、図２に示すＡ〜Ｌの成
分に分画することができる。すなわち、図２はアシアロ
糖鎖より各種レクチンカラムを用いて、Ｎ結合糖鎖を分
別した経過を示す図であり、図中α−ｍＧはα−メチル
グルコシド、α−ｍＭはα−メチルマンノシド、Ｌａｃ
はラクトース、ＧＮ2 はジ−Ｎ−アセチルキトビオース
を示す。Ａ〜Ｌのモル比は２．８：６．９：５９．９：
０．８：０．８：１．１：５．２：０．８：１．５：
２．９：６．３：１１．０であり、Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｌ
についてはバイオ−ゲルＰ−４カラムにより、それぞれ
Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｄ１〜Ｄ４、Ｅ１、Ｅ２、Ｌ
１〜Ｌ３に分別される。
定することができる。すなわち、Ｎ結合糖鎖標識物をシ
アリダーゼ処理し、アシアロ糖鎖を調製し、次いで該調
製物をレクチン結合カラム、例えばＣｏｎＡカラム、イ
ンゲン豆（ Phaseolus vulgaris ) のエリスロフィトヘ
マグルチニン（Ｅ−ＰＨＡ）カラム、ヨウシュチョウセ
ンアサガオ（ Datura stramonium )凝集素（ＤＳＡ）カ
ラム、ＲＣＡ120 カラム、ＵＥＡ−Ｉカラム等で処理す
ることにより、糖鎖構造に応じ、図２に示すＡ〜Ｌの成
分に分画することができる。すなわち、図２はアシアロ
糖鎖より各種レクチンカラムを用いて、Ｎ結合糖鎖を分
別した経過を示す図であり、図中α−ｍＧはα−メチル
グルコシド、α−ｍＭはα−メチルマンノシド、Ｌａｃ
はラクトース、ＧＮ2 はジ−Ｎ−アセチルキトビオース
を示す。Ａ〜Ｌのモル比は２．８：６．９：５９．９：
０．８：０．８：１．１：５．２：０．８：１．５：
２．９：６．３：１１．０であり、Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｌ
についてはバイオ−ゲルＰ−４カラムにより、それぞれ
Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｄ１〜Ｄ４、Ｅ１、Ｅ２、Ｌ
１〜Ｌ３に分別される。
【００１４】図３はアシアロ糖鎖及びＡ〜Ｌのバイオ−
ゲルＰ−４カラムによる溶出パターンであり、縦軸は放
射活性、横軸は溶出時間を示し、図中の矢印はグルコー
スオリゴマーの溶出位置を示す。
ゲルＰ−４カラムによる溶出パターンであり、縦軸は放
射活性、横軸は溶出時間を示し、図中の矢印はグルコー
スオリゴマーの溶出位置を示す。
【００１５】次に、各種のエキソグリコシダーゼ、例え
ばα−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−
Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルグ
ルコサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダ
ーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、α−
Ｌ−フコシダーゼ、α１→２−Ｌ−フコシダーゼ等によ
る分画されたＮ結合糖鎖の逐次分解分析、及び各フラク
ションのメチル化分析により各Ｎ結合糖鎖の構造が決定
される。
ばα−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−
Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルグ
ルコサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダ
ーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、α−
Ｌ−フコシダーゼ、α１→２−Ｌ−フコシダーゼ等によ
る分画されたＮ結合糖鎖の逐次分解分析、及び各フラク
ションのメチル化分析により各Ｎ結合糖鎖の構造が決定
される。
【００１６】下記式（化２）にＡ１の構造を示す。Ａ１
のモル比％は全体の２．２％であり、Ｈ（Ｏ）型構造を
有する。なお以下の各化学式中Ｍはマンノース、ＧＮOT
はＮ−〔 3Ｈ〕アセチルグルコサミニトール、±は残基
が糖鎖中の７０％以上に存在することを示す。
のモル比％は全体の２．２％であり、Ｈ（Ｏ）型構造を
有する。なお以下の各化学式中Ｍはマンノース、ＧＮOT
はＮ−〔 3Ｈ〕アセチルグルコサミニトール、±は残基
が糖鎖中の７０％以上に存在することを示す。
【００１７】
【化２】
【００１８】下記の式（化３）、（化４）にＡ２中の２
成分、Ａ２−１、Ａ２−２の構造を示す。（化３）はＡ
２−１の構造であり、Ａ２−１のモル比％は全体の０．
５％であり、Ａ型構造を有する。なお以下の各化学式中
ＧａＮはＮ−アセチルガラクトサミンを示す。
成分、Ａ２−１、Ａ２−２の構造を示す。（化３）はＡ
２−１の構造であり、Ａ２−１のモル比％は全体の０．
５％であり、Ａ型構造を有する。なお以下の各化学式中
ＧａＮはＮ−アセチルガラクトサミンを示す。
【００１９】
【化３】
【００２０】下記式（化４）はＡ２−２の構造であり、
Ａ２−２のモル比％は全体の０．１％であり、Ｂ型構造
を有する。
Ａ２−２のモル比％は全体の０．１％であり、Ｂ型構造
を有する。
【００２１】
【化４】
【００２２】下記式（化５）にＢ１の構造を示す。Ｂ１
のモル比％は全体の５．５％であり、Ｈ（Ｏ）型構造を
有する。
のモル比％は全体の５．５％であり、Ｈ（Ｏ）型構造を
有する。
【００２３】
【化５】
【００２４】下記の式（化６）、（化７）にＢ２中の２
成分、Ｂ２−１、Ｂ２−２の構造を示す。（化６）はＢ
２−１の構造であり、Ｂ２−１のモル比％は全体の１．
２％であり、Ａ型構造を有する。
成分、Ｂ２−１、Ｂ２−２の構造を示す。（化６）はＢ
２−１の構造であり、Ｂ２−１のモル比％は全体の１．
２％であり、Ａ型構造を有する。
【００２５】
【化６】
【００２６】下記式（化７）はＢ２−２の構造であり、
Ｂ２−２のモル比％は全体の０．２％であり、Ｂ型構造
を有する。
Ｂ２−２のモル比％は全体の０．２％であり、Ｂ型構造
を有する。
【００２７】
【化７】
【００２８】下記式（化８）にＣの構造を示す。Ｃのモ
ル比％は全体の５９．９％であり、前出フェブス レタ
ーズ、第１５１巻、第２２〜２６頁（１９８３）に報告
の構造と一致する。
ル比％は全体の５９．９％であり、前出フェブス レタ
ーズ、第１５１巻、第２２〜２６頁（１９８３）に報告
の構造と一致する。
【００２９】
【化８】
【００３０】下記式（化９）にＤ１〜Ｄ４の一般構造式
を示す。Ｄ１はｎ＝１で、モル比％は全体の０．３％で
あり、Ｄ２はｎ＝２で、モル比％は全体の０．２％であ
り、Ｄ３はｎ＝３で、モル比％は全体の０．２％であ
り、Ｄ４はｎ＝４で、モル比％は全体の０．１％であ
る。
を示す。Ｄ１はｎ＝１で、モル比％は全体の０．３％で
あり、Ｄ２はｎ＝２で、モル比％は全体の０．２％であ
り、Ｄ３はｎ＝３で、モル比％は全体の０．２％であ
り、Ｄ４はｎ＝４で、モル比％は全体の０．１％であ
る。
【００３１】
【化９】
【００３２】下記式（化１０）にＥ１の構造を示す。Ｅ
１のモル比％は全体の０．４％である。
１のモル比％は全体の０．４％である。
【００３３】
【化１０】
【００３４】下記式（化１１）にＥ２の構造を示す。Ｅ
２のモル比％は全体の０．４％である。
２のモル比％は全体の０．４％である。
【００３５】
【化１１】
【００３６】下記式（化１２）にＦの構造を示す。Ｆの
モル比％は全体の１．１％であり、Ｈ（Ｏ）型の構造を
有する。
モル比％は全体の１．１％であり、Ｈ（Ｏ）型の構造を
有する。
【００３７】
【化１２】
【００３８】下記式（化１３）にＧの構造を示す。Ｇの
モル比％は全体の５．２％である。
モル比％は全体の５．２％である。
【００３９】
【化１３】
【００４０】下記式（化１４）にＨの構造を示す。Ｈの
モル比％は全体の０．４％であり、Ｈ（Ｏ）型の構造を
有する。
モル比％は全体の０．４％であり、Ｈ（Ｏ）型の構造を
有する。
【００４１】
【化１４】
【００４２】下記の式（化１５）、（化１６）にＩ中の
２成分、Ｉ１、Ｉ２の構造を示す。Ｉ１のモル比％は全
体の１．１％であり、Ｈ（Ｏ）型の構造を有する。Ｉ２
のモル比％は全体の０．４％である。
２成分、Ｉ１、Ｉ２の構造を示す。Ｉ１のモル比％は全
体の１．１％であり、Ｈ（Ｏ）型の構造を有する。Ｉ２
のモル比％は全体の０．４％である。
【００４３】
【化１５】
【００４４】
【化１６】
【００４５】下記の式（化１７）、（化１８）にＫ中の
２成分、Ｋ１、Ｋ２の構造を示す。Ｋ１のモル比％は全
体の４．３％である。Ｋ２のモル比％は全体の１．４％
であり、Ｈ（Ｏ）型の構造を有する。
２成分、Ｋ１、Ｋ２の構造を示す。Ｋ１のモル比％は全
体の４．３％である。Ｋ２のモル比％は全体の１．４％
であり、Ｈ（Ｏ）型の構造を有する。
【００４６】
【化１７】
【００４７】
【化１８】
【００４８】下記式（化１９）にＬ１の構造を示す。Ｌ
１のモル比％は全体の５．１％である。
１のモル比％は全体の５．１％である。
【００４９】
【化１９】
【００５０】下記の式（化２０）、（化２１）にＬ２中
の２成分Ｌ２−１、Ｌ２−２の構造を示す。Ｌ２−１の
モル比％は全体の２．１％であり、前出ヨーロピアン
ジャーナル オブ バイオケミストリー、第１５８巻、
第２９５〜２９８頁（１９８６）に報告の構造と一致す
る。Ｌ２−２のモル比％は全体の０．９％である。
の２成分Ｌ２−１、Ｌ２−２の構造を示す。Ｌ２−１の
モル比％は全体の２．１％であり、前出ヨーロピアン
ジャーナル オブ バイオケミストリー、第１５８巻、
第２９５〜２９８頁（１９８６）に報告の構造と一致す
る。Ｌ２−２のモル比％は全体の０．９％である。
【００５１】
【化２０】
【００５２】
【化２１】
【００５３】下記の式（化２２）、（化２３）にＬ３中
の２成分Ｌ３−１、Ｌ３−２の構造を示す。Ｌ３−１の
モル比％は全体の０．６％であり、Ｌ３−２のモル比％
は全体の０．２％である。
の２成分Ｌ３−１、Ｌ３−２の構造を示す。Ｌ３−１の
モル比％は全体の０．６％であり、Ｌ３−２のモル比％
は全体の０．２％である。
【００５４】
【化２２】
【００５５】
【化２３】
【００５６】以上、市販の血漿製剤より精製されたｖＷ
ＦのアシアロＮ結合糖鎖の構造が決定される。これらの
うち（化１）のＨ（Ｏ）型糖鎖構造を有するＮ結合糖鎖
のモル比％は全体の１１．７％であり、本発明者らが先
に見出していたＵＥＡ−ＩのｖＷＦへの結合は、これら
の糖鎖構造によるものである。また下記の式（化２
４）、（化２５）のＡ型、Ｂ型糖鎖構造を有するＮ結合
糖鎖が血漿糖タンパク質の糖鎖として初めて見出され、
（化２４）のＡ型糖鎖構造を有するＮ結合糖鎖のモモ比
は全体の１．７％、（化２５）のＢ型糖鎖構造を有する
Ｎ結合糖鎖のモル比は全体の０．３％である。
ＦのアシアロＮ結合糖鎖の構造が決定される。これらの
うち（化１）のＨ（Ｏ）型糖鎖構造を有するＮ結合糖鎖
のモル比％は全体の１１．７％であり、本発明者らが先
に見出していたＵＥＡ−ＩのｖＷＦへの結合は、これら
の糖鎖構造によるものである。また下記の式（化２
４）、（化２５）のＡ型、Ｂ型糖鎖構造を有するＮ結合
糖鎖が血漿糖タンパク質の糖鎖として初めて見出され、
（化２４）のＡ型糖鎖構造を有するＮ結合糖鎖のモモ比
は全体の１．７％、（化２５）のＢ型糖鎖構造を有する
Ｎ結合糖鎖のモル比は全体の０．３％である。
【００５７】
【化２４】
【００５８】
【化２５】
【００５９】また、この精製ｖＷＦをＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写した場
合、該ｖＷＦは抗Ａ血清、抗Ｂ血清、抗ＨレクチンのＵ
ＥＡ−Ｉと、それぞれ反応性を示す。なお、該ＰＶＤＦ
膜を有機溶媒で脱脂処理しても反応性は消失しないが、
前もってエンドグリコシダーゼＦで処理したｖＷＦが転
写されている場合、該ｖＷＦは反応性を失っていた。
リルアミドゲル電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写した場
合、該ｖＷＦは抗Ａ血清、抗Ｂ血清、抗ＨレクチンのＵ
ＥＡ−Ｉと、それぞれ反応性を示す。なお、該ＰＶＤＦ
膜を有機溶媒で脱脂処理しても反応性は消失しないが、
前もってエンドグリコシダーゼＦで処理したｖＷＦが転
写されている場合、該ｖＷＦは反応性を失っていた。
【００６０】Ａ、Ｂ、Ｏ、ＡＢ型ドナー由来血漿に抗ｖ
ＷＦ抗体を加え、ｖＷＦを免疫沈降させ、該ｖＷＦをＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ＰＶＤＦ膜
に転写した場合の、各ドナー由来ｖＷＦの抗Ａモノクロ
ーナル抗体、抗Ｂモノクローナル抗体、抗Ｈレクチンの
ＵＥＡ−Ｉとの反応性を表２に示す。
ＷＦ抗体を加え、ｖＷＦを免疫沈降させ、該ｖＷＦをＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ＰＶＤＦ膜
に転写した場合の、各ドナー由来ｖＷＦの抗Ａモノクロ
ーナル抗体、抗Ｂモノクローナル抗体、抗Ｈレクチンの
ＵＥＡ−Ｉとの反応性を表２に示す。
【００６１】
【表２】 表 ２ ─────────────────────────────────── 血漿ドナー 抗Ａモノクローナル 抗Ｂモノクローナル ＵＥＡ−Ｉ 血液型 抗体 抗体 ─────────────────────────────────── Ａ ＋ − ＋ Ｂ − ＋ ＋ Ｏ − − ＋ ＡＢ ＋ ＋ ＋ ───────────────────────────────────
【００６２】（表中＋は反応性有、−は反応性無を示
す） Ａ型ドナーの血漿からは、Ａ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型
糖鎖抗原を有するｖＷＦ、Ｂ型ドナーの血漿からは、Ｂ
型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原を有するｖＷＦ、Ｏ
型ドナーの血漿からは、Ｈ（Ｏ）型糖鎖抗原を有するｖ
ＷＦ、ＡＢ型ドナーの血漿からはＡ型糖鎖抗原、Ｂ型糖
鎖抗原、Ｈ（Ｏ）型糖鎖抗原を有するｖＷＦが得られ
る。
す） Ａ型ドナーの血漿からは、Ａ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型
糖鎖抗原を有するｖＷＦ、Ｂ型ドナーの血漿からは、Ｂ
型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原を有するｖＷＦ、Ｏ
型ドナーの血漿からは、Ｈ（Ｏ）型糖鎖抗原を有するｖ
ＷＦ、ＡＢ型ドナーの血漿からはＡ型糖鎖抗原、Ｂ型糖
鎖抗原、Ｈ（Ｏ）型糖鎖抗原を有するｖＷＦが得られ
る。
【００６３】以上、本発明により、糖鎖抗原の特定され
た、血漿由来製剤が提供される。該血漿由来製剤中に
は、糖鎖抗原の特定された血漿成分、例えばｖＷＦ、α
2 −マクログロブリン等の血漿糖タンパク質が少なくと
も１種含有されている。ＡＢＨ（Ｏ）糖鎖抗原の特定さ
れた血漿成分は、例えば各血液型ドナー由来血漿の混合
物、該混合物より調製された血漿製剤等より、例えば抗
Ａ、抗Ｂ抗体固定カラム、レクチン固定カラム等を用い
て調製することができる。また、各血液型ドナー血漿別
に適宜、調製してもよい。調製された糖鎖抗原の特定さ
れた血漿成分は、必要に応じて、賦形剤や担体と共に、
常法により製剤化し、使用することができる。
た、血漿由来製剤が提供される。該血漿由来製剤中に
は、糖鎖抗原の特定された血漿成分、例えばｖＷＦ、α
2 −マクログロブリン等の血漿糖タンパク質が少なくと
も１種含有されている。ＡＢＨ（Ｏ）糖鎖抗原の特定さ
れた血漿成分は、例えば各血液型ドナー由来血漿の混合
物、該混合物より調製された血漿製剤等より、例えば抗
Ａ、抗Ｂ抗体固定カラム、レクチン固定カラム等を用い
て調製することができる。また、各血液型ドナー血漿別
に適宜、調製してもよい。調製された糖鎖抗原の特定さ
れた血漿成分は、必要に応じて、賦形剤や担体と共に、
常法により製剤化し、使用することができる。
【００６４】以上、詳細に説明したように、本発明によ
り、血液型に留意した血漿由来製剤が提供される。該製
剤は血液凝固因子が血液型別に管理されており、長期
間、反復使用時においても副作用の危険がなく安全な、
また、輸血時の半減期の問題も改善された血漿由来製剤
が提供される。
り、血液型に留意した血漿由来製剤が提供される。該製
剤は血液凝固因子が血液型別に管理されており、長期
間、反復使用時においても副作用の危険がなく安全な、
また、輸血時の半減期の問題も改善された血漿由来製剤
が提供される。
【００６５】
【実施例】以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明
は、これら実施例に限定されるものではない。
は、これら実施例に限定されるものではない。
【００６６】実施例１ （１）精製ｖＷＦよりのＮ結合糖鎖の調製及び放射標識
化 市販の第VIII因子濃縮物（ハイランドセラピューティク
ス製）より、前出バイオケミストリー、第２５巻、第３
１４６〜３１５５頁（１９８６）に記載の方法に準じ、
ヒトｖＷＦを精製した。次に該ｖＷＦ３７．９ｍｇを無
水ヒドラジン１ｍｌに懸濁し、９時間のヒドラジン分解
を行った後、Ｎ−アセチル化を行い、定量的にＮ結合糖
鎖を遊離した。次に該糖鎖の１／６量を、０．０５Ｎ
ＮａＯＨ ０．８ｍｌ中で、３０℃、４時間、ＮａＢ3
Ｈ4 （１６０ＭＢｑ）で還元し、糖鎖のトリチウム標識
を行い、その後ＮａＢＨ4 を６ｍｇ溶解した０．０５Ｎ
ＮａＯＨ ０．３ｍｌを加えて、反応を更に２時間続
けて、反応を終了した。結合した放射活性は９．８×１
０6 ｃｐｍであった。また残りの５／６量の糖鎖は０．
０５Ｎ ＮａＯＨ １．５ｍｌ中、３０℃、４時間、Ｎ
ａＢ2 Ｈ4 ３０ｍｇで還元し、メチル化分析用の 2Ｈ標
識物を調製した。
化 市販の第VIII因子濃縮物（ハイランドセラピューティク
ス製）より、前出バイオケミストリー、第２５巻、第３
１４６〜３１５５頁（１９８６）に記載の方法に準じ、
ヒトｖＷＦを精製した。次に該ｖＷＦ３７．９ｍｇを無
水ヒドラジン１ｍｌに懸濁し、９時間のヒドラジン分解
を行った後、Ｎ−アセチル化を行い、定量的にＮ結合糖
鎖を遊離した。次に該糖鎖の１／６量を、０．０５Ｎ
ＮａＯＨ ０．８ｍｌ中で、３０℃、４時間、ＮａＢ3
Ｈ4 （１６０ＭＢｑ）で還元し、糖鎖のトリチウム標識
を行い、その後ＮａＢＨ4 を６ｍｇ溶解した０．０５Ｎ
ＮａＯＨ ０．３ｍｌを加えて、反応を更に２時間続
けて、反応を終了した。結合した放射活性は９．８×１
０6 ｃｐｍであった。また残りの５／６量の糖鎖は０．
０５Ｎ ＮａＯＨ １．５ｍｌ中、３０℃、４時間、Ｎ
ａＢ2 Ｈ4 ３０ｍｇで還元し、メチル化分析用の 2Ｈ標
識物を調製した。
【００６７】（２）アシアロ糖鎖の調製及びレクチンカ
ラムによる分画 標識化糖鎖のｐＨ５．４での高圧ろ紙電気泳動図を図１
に示す。Ｎは中性画分、Ａ−１は１シアル酸結合物、Ａ
−２は２シアル酸結合物であり、図中、矢印１、２、３
は標準物質、ラクチトール、シアリルラクチトール、ブ
ロモフェノールブルーのそれぞれの泳動位置を示す。な
お図１において、横軸は泳動距離（ｃｍ）、縦軸は放射
活性を示す。次にレクチンカラム分画に供するため、糖
鎖のシアリダーゼ〔アルスロバクター ウレアファシエ
ンス（ Arthrobacter ureafaciens ) 由来：ナカライテ
スク社製〕処理を行い、アシアロ糖鎖を調製した。なお
酵素反応は０．１５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．
０）中、３７℃、２０時間行った。
ラムによる分画 標識化糖鎖のｐＨ５．４での高圧ろ紙電気泳動図を図１
に示す。Ｎは中性画分、Ａ−１は１シアル酸結合物、Ａ
−２は２シアル酸結合物であり、図中、矢印１、２、３
は標準物質、ラクチトール、シアリルラクチトール、ブ
ロモフェノールブルーのそれぞれの泳動位置を示す。な
お図１において、横軸は泳動距離（ｃｍ）、縦軸は放射
活性を示す。次にレクチンカラム分画に供するため、糖
鎖のシアリダーゼ〔アルスロバクター ウレアファシエ
ンス（ Arthrobacter ureafaciens ) 由来：ナカライテ
スク社製〕処理を行い、アシアロ糖鎖を調製した。なお
酵素反応は０．１５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．
０）中、３７℃、２０時間行った。
【００６８】レクチン アフィニティ クロマトグラフ
ィーは以下のように行った。ＣｏｎＡ−セファロースカ
ラム（ファルマシア社製）（０．７×１３ｃｍ）は３０
ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ
７．４を用い、流速１２ｍｌ／ｈｒで平衡化を行い、２
５℃中保持した。糖鎖の試料は緩衝液１５ｍｌで洗浄し
たカラムへアプライした。その後、溶出液を１０ｍＭα
−メチルグルコシドを含む緩衝液１５ｍｌとした後、１
００ｍＭα−メチルマンノシドを含む緩衝液１５ｍｌで
溶出した。Ｅ−ＰＨＡ−アガロースカラム（Ｅ−Ｙラボ
ラトリーズ社製）（０．７×１５ｃｍ）は０．１５Ｍ
ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
７．２（ＰＢＳ）を用いて流速１２ｍｌ／ｈｒで平衡化
を行い、２５℃中保持した。糖鎖試料をアプライした
後、ＰＢＳ３０ｍｌで溶出した。ＤＳＡ−アガロースカ
ラム（Ｅ−Ｙラボラトリーズ社製）（０．７×１８ｃ
ｍ）は３０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス塩酸緩
衝液ｐＨ７．４を用いて、流速６ｍｌ／ｈｒで平衡化
し、４℃中保持した。糖鎖試料をアプライした後、緩衝
液２０ｍｌで溶出を行い、ジ−Ｎ−アセチルキトビオー
スを含む（２ｍｇ／ｍｌ）緩衝液５ｍｌで溶出した。Ｕ
ＥＡ−Ｉ−アガロース（Ｅ−Ｙラボラトリーズ社製）カ
ラム（０．５×１０ｃｍ）は流速６ｍｌ／ｈｒでＰＢＳ
によって平衡化し、４℃中保持した。糖鎖試料をアプラ
イした後溶出は６ｍｌのＰＢＳで行った後、５０ｍＭ
Ｌ−フコシダーゼを含むＰＢＳ５ｍｌで行った。レクチ
ン（ＲＣＡ１２０）アフィニティカラム（ホーネン社
製）ＨＰＬＣは、アーカイブズ オブ バイオケミスト
リー アンド バイオフィジクス（ Arch.Biochem.Biop
hys. )第２５７巻、第３８７〜３９４頁（１９８７）に
報告の本発明者らの方法で行った。
ィーは以下のように行った。ＣｏｎＡ−セファロースカ
ラム（ファルマシア社製）（０．７×１３ｃｍ）は３０
ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ
７．４を用い、流速１２ｍｌ／ｈｒで平衡化を行い、２
５℃中保持した。糖鎖の試料は緩衝液１５ｍｌで洗浄し
たカラムへアプライした。その後、溶出液を１０ｍＭα
−メチルグルコシドを含む緩衝液１５ｍｌとした後、１
００ｍＭα−メチルマンノシドを含む緩衝液１５ｍｌで
溶出した。Ｅ−ＰＨＡ−アガロースカラム（Ｅ−Ｙラボ
ラトリーズ社製）（０．７×１５ｃｍ）は０．１５Ｍ
ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
７．２（ＰＢＳ）を用いて流速１２ｍｌ／ｈｒで平衡化
を行い、２５℃中保持した。糖鎖試料をアプライした
後、ＰＢＳ３０ｍｌで溶出した。ＤＳＡ−アガロースカ
ラム（Ｅ−Ｙラボラトリーズ社製）（０．７×１８ｃ
ｍ）は３０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス塩酸緩
衝液ｐＨ７．４を用いて、流速６ｍｌ／ｈｒで平衡化
し、４℃中保持した。糖鎖試料をアプライした後、緩衝
液２０ｍｌで溶出を行い、ジ−Ｎ−アセチルキトビオー
スを含む（２ｍｇ／ｍｌ）緩衝液５ｍｌで溶出した。Ｕ
ＥＡ−Ｉ−アガロース（Ｅ−Ｙラボラトリーズ社製）カ
ラム（０．５×１０ｃｍ）は流速６ｍｌ／ｈｒでＰＢＳ
によって平衡化し、４℃中保持した。糖鎖試料をアプラ
イした後溶出は６ｍｌのＰＢＳで行った後、５０ｍＭ
Ｌ−フコシダーゼを含むＰＢＳ５ｍｌで行った。レクチ
ン（ＲＣＡ１２０）アフィニティカラム（ホーネン社
製）ＨＰＬＣは、アーカイブズ オブ バイオケミスト
リー アンド バイオフィジクス（ Arch.Biochem.Biop
hys. )第２５７巻、第３８７〜３９４頁（１９８７）に
報告の本発明者らの方法で行った。
【００６９】ヒトｖＷＦより得られた全アシアロ糖鎖の
約７１％が、ＣｏｎＡ−セファロースカラムに吸着し
た。このうち約９８％が１０ｍＭα−メチルグルコシド
を含む緩衝液で溶出し約２％が１００ｍＭα−メチルマ
ンノシドを含む緩衝液で溶出した。これらはレクチン
（ＲＣＡ１２０）アフィニティＨＰＬＣによって３つ
（Ａ、Ｂ、Ｃ）と２つ（Ｄ、Ｅ）の画分に分けられた
（図２）。更に画分Ａはバイオ−ゲルＰ−４カラムによ
ってＡ１、Ａ２、画分Ｂはバイオ−ゲルＰ−４カラムに
よってＢ１、Ｂ２に分けられた（図３）。ラクトースを
含む緩衝液でＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣから溶出されてき
た画分Ｃは全アシアロ糖鎖の５９．９％の割合であった
（図２）。全アシアロ糖鎖の０．８％の割合の画分Ｄは
ＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムを素通りし（図２）、更
にバイオ−ゲルＰ−４カラムによって約３：２：２：１
の割合でＤ１〜Ｄ４のピークに分けられた（図３）。全
アシアロ糖鎖の０．８％の割合である画分ＥはＲＣＡ１
２０−ＨＰＬＣカラムに結合しなかったが、遅れて溶出
した（図２）。この画分は更にバイオ−ゲルＰ−４カラ
ムによりＥ１とＥ２に分けられた（図３）。ＣｏｎＡ−
セファロースカラムを素通りするアシアロ糖鎖の約６．
３％はＥ−ＰＨＡ−アガロースカラムから溶出が遅れ
（図２）たが、このカラムはＲ1 、Ｒ2 がＨか糖である
ような下記式（化２６）に示す糖鎖にアフィニティーが
あり、溶出が遅れた糖鎖は次のＤＳＡ−アガロースカラ
ムに吸着しなかったけれど、その次のＲＣＡ１２０−Ｈ
ＰＬＣによって約１７：８３の割合で２つの画分ＦとＧ
に分けられた（図２）。
約７１％が、ＣｏｎＡ−セファロースカラムに吸着し
た。このうち約９８％が１０ｍＭα−メチルグルコシド
を含む緩衝液で溶出し約２％が１００ｍＭα−メチルマ
ンノシドを含む緩衝液で溶出した。これらはレクチン
（ＲＣＡ１２０）アフィニティＨＰＬＣによって３つ
（Ａ、Ｂ、Ｃ）と２つ（Ｄ、Ｅ）の画分に分けられた
（図２）。更に画分Ａはバイオ−ゲルＰ−４カラムによ
ってＡ１、Ａ２、画分Ｂはバイオ−ゲルＰ−４カラムに
よってＢ１、Ｂ２に分けられた（図３）。ラクトースを
含む緩衝液でＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣから溶出されてき
た画分Ｃは全アシアロ糖鎖の５９．９％の割合であった
（図２）。全アシアロ糖鎖の０．８％の割合の画分Ｄは
ＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムを素通りし（図２）、更
にバイオ−ゲルＰ−４カラムによって約３：２：２：１
の割合でＤ１〜Ｄ４のピークに分けられた（図３）。全
アシアロ糖鎖の０．８％の割合である画分ＥはＲＣＡ１
２０−ＨＰＬＣカラムに結合しなかったが、遅れて溶出
した（図２）。この画分は更にバイオ−ゲルＰ−４カラ
ムによりＥ１とＥ２に分けられた（図３）。ＣｏｎＡ−
セファロースカラムを素通りするアシアロ糖鎖の約６．
３％はＥ−ＰＨＡ−アガロースカラムから溶出が遅れ
（図２）たが、このカラムはＲ1 、Ｒ2 がＨか糖である
ような下記式（化２６）に示す糖鎖にアフィニティーが
あり、溶出が遅れた糖鎖は次のＤＳＡ−アガロースカラ
ムに吸着しなかったけれど、その次のＲＣＡ１２０−Ｈ
ＰＬＣによって約１７：８３の割合で２つの画分ＦとＧ
に分けられた（図２）。
【００７０】
【化２６】Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ
１→４）〔Ｒ1 →４（Ｒ2 →４ＧＮβ１→２）Ｍα１→
３〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→
１→４）〔Ｒ1 →４（Ｒ2 →４ＧＮβ１→２）Ｍα１→
３〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→
【００７１】また、アシアロ糖鎖の１．１％を占める分
画Ｆは、バイオ−ゲルＰ−４カラムにより約１５．５グ
ルコースユニットに相当する位置に溶出した（図３）。
画分ＧはＥ−ＰＨＡ−アガロースカラムで遅れて溶出し
てきた糖鎖の主成分であり、アシアロ糖鎖の５．２％の
割合を占め、ＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに結合し
た。この画分はラクトースを含む緩衝液で溶出した（図
２）。分画Ｈはアシアロ糖鎖の０．８％の割合であり、
ＣｏｎＡ−セファロース、Ｅ−ＰＨＡ−アガロース、Ｄ
ＳＡ−アガロースを素通りし、更にＲＣＡ１２０−ＨＰ
ＬＣカラムも同様に素通りした（図２）。アシアロ糖鎖
の１．５％の割合を占めＣｏｎＡ−セファロース、Ｅ−
ＰＨＡ−アガロース、ＤＳＡ−アガロースカラムを素通
りする分画ＩはＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムから遅れ
て溶出された（図２）。アシアロ糖鎖の２．９％の割合
を占めＣｏｎＡ−セファロース、Ｅ−ＰＨＡ−アガロー
ス、ＤＳＡ−アガロースカラムを素通りした分画ＪはＲ
ＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに結合しラクトースを含む
緩衝液で溶出した（図２）。アシアロ糖鎖の６．３％の
割合の画分ＫはＣｏｎＡ−セファロースとＥ−ＰＨＡ−
アガロースを素通りし、ＤＳＡ−アガロースカラムから
は遅れて溶出されたがＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに
は吸着してラクトースを含む緩衝液で溶出された（図
２）。この画分のＤＳＡ−アガロースカラムへのアフィ
ニティによって、画分Ｋの糖鎖には下記式（化２７）の
構造が含まれる。
画Ｆは、バイオ−ゲルＰ−４カラムにより約１５．５グ
ルコースユニットに相当する位置に溶出した（図３）。
画分ＧはＥ−ＰＨＡ−アガロースカラムで遅れて溶出し
てきた糖鎖の主成分であり、アシアロ糖鎖の５．２％の
割合を占め、ＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに結合し
た。この画分はラクトースを含む緩衝液で溶出した（図
２）。分画Ｈはアシアロ糖鎖の０．８％の割合であり、
ＣｏｎＡ−セファロース、Ｅ−ＰＨＡ−アガロース、Ｄ
ＳＡ−アガロースを素通りし、更にＲＣＡ１２０−ＨＰ
ＬＣカラムも同様に素通りした（図２）。アシアロ糖鎖
の１．５％の割合を占めＣｏｎＡ−セファロース、Ｅ−
ＰＨＡ−アガロース、ＤＳＡ−アガロースカラムを素通
りする分画ＩはＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムから遅れ
て溶出された（図２）。アシアロ糖鎖の２．９％の割合
を占めＣｏｎＡ−セファロース、Ｅ−ＰＨＡ−アガロー
ス、ＤＳＡ−アガロースカラムを素通りした分画ＪはＲ
ＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに結合しラクトースを含む
緩衝液で溶出した（図２）。アシアロ糖鎖の６．３％の
割合の画分ＫはＣｏｎＡ−セファロースとＥ−ＰＨＡ−
アガロースを素通りし、ＤＳＡ−アガロースカラムから
は遅れて溶出されたがＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに
は吸着してラクトースを含む緩衝液で溶出された（図
２）。この画分のＤＳＡ−アガロースカラムへのアフィ
ニティによって、画分Ｋの糖鎖には下記式（化２７）の
構造が含まれる。
【００７２】
【化２７】 Ｇβ１→４ＧＮβ１→４（Ｇβ１→４ＧＮβ１→２）Ｍ
【００７３】アシアロ糖鎖の１７％の割合を占め、Ｃｏ
ｎＡ−セファロースとＥ−ＰＨＡ−アガロースカラムを
素通りする画分ＬはＤＳＡ−アガロースカラムとＲＣＡ
１２０−ＨＰＬＣカラムに吸着しそれぞれジ−Ｎ−アセ
チルキトビオース、ラクトースを含む緩衝液で溶出した
（図２）。この画分はバイオ−ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）
Ｐ−４カラムで、その外側の鎖の部分に３、４、５つの
Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃユニットをもつ、複合型糖
鎖の領域に、それぞれ４６：４３：１１の割合で３つの
画分Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３に分かれた（図３）。
ｎＡ−セファロースとＥ−ＰＨＡ−アガロースカラムを
素通りする画分ＬはＤＳＡ−アガロースカラムとＲＣＡ
１２０−ＨＰＬＣカラムに吸着しそれぞれジ−Ｎ−アセ
チルキトビオース、ラクトースを含む緩衝液で溶出した
（図２）。この画分はバイオ−ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）
Ｐ−４カラムで、その外側の鎖の部分に３、４、５つの
Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃユニットをもつ、複合型糖
鎖の領域に、それぞれ４６：４３：１１の割合で３つの
画分Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３に分かれた（図３）。
【００７４】 （３）メチル化分析及びグリコシダーゼ処理 Ｎ結合糖鎖、Ａ１〜Ｅ２のＣｏｎＡ吸着分画（分画
１）、Ｆ、ＧのＥ−ＰＨＡ吸着分画（分画２）、Ｈ〜Ｌ
３のＣｏｎＡ、Ｅ−ＰＨＡ非吸着分画（分画３）のメチ
ル化分析を行った。結果を表３〜表５に示す。
１）、Ｆ、ＧのＥ−ＰＨＡ吸着分画（分画２）、Ｈ〜Ｌ
３のＣｏｎＡ、Ｅ−ＰＨＡ非吸着分画（分画３）のメチ
ル化分析を行った。結果を表３〜表５に示す。
【００７５】
【表３】 表 ３ ─────────────────────────────────── モ ル 比 メ チ ル 化 糖 ────────────────── Ｎ結合鎖 分画１ 分画２ 分画３ ─────────────────────────────────── フシトール ２，３，４−トリ−Ｏ−メチル 1.0 0.8 0.9 1.0 （１，５−ジ−Ｏ−アセチル） ガラクチトール ２，３，４，６−テトラ−Ｏ− 1.0 1.8 1.8 2.8 メチル（１，５−ジ−Ｏ−ア セチル） ２，４，６−トリ−Ｏ−メチル <0.05 0 0 <0.05 （１，３，５−トリ−Ｏ−ア セチル） ３，４，６−トリ−Ｏ−メチル 0.2 0.2 0.2 0.1 （１，２，５−トリ−Ｏ−ア セチル） ２，３，４−トリ−Ｏ−メチル 1.2 0 0 0 （１，５，６−トリ−Ｏ−ア セチル） ４，６−ジ−Ｏ−メチル（１， <0.05 <0.05 0 0 ２，３，５−テトラ−Ｏ−ア セチル）
【００７６】
【表４】 表 ４ ─────────────────────────────────── モ ル 比 ────────────────── Ｎ結合鎖 分画１ 分画２ 分画３ ─────────────────────────────────── マンニトール ２，３，４，６−テトラ−Ｏ− <0.05 <0.05 0 0 メチル（１，５−ジ−Ｏ−ア セチル） ３，４，６−トリ−Ｏ−メチル 2.0 2.1 2.0 1.0 （１，２，５−トリ−Ｏ−ア セチル） ２，４−ジ−Ｏ−メチル（１， 1.0 1.0 0 1.0 ３，５，６−テトラ−Ｏ−ア セチル） ３，４−ジ−Ｏ−メチル（１， 0.3 0 0 0.4 ２，５，６−テトラ−Ｏ−ア セチル） ３，６−ジ−Ｏ−メチル（１， 0.4 0 0 0.5 ２，４，５−テトラ−Ｏ−ア セチル） ２−モノ−Ｏ−メチル（１，３， <0.05 0 1.0 0 ４，５，６−ペンタ−Ｏ−ア セチル） ───────────────────────────────────
【００７７】
【表５】 表 ５ ─────────────────────────────────── モ ル 比 メ チ ル 化 糖 ────────────────── Ｎ結合糖鎖 分画１ 分画２ 分画３ ─────────────────────────────────── ２−Ｎ−メチルアセトアミド−２− デオキシグルチトール １，３，５，６−テトラ−Ｏ− 0.2 0.2 0.1 0.1 メチル（４−モノ−Ｏ−アセ チル） １，３，５−トリ−Ｏ−メチル 0.8 0.7 0.7 0.8 （４，６−ジ−Ｏ−アセチル） ３，４，６−トリ−Ｏ−メチル <0.05 <0.05 0.6 0 （１，５−ジ−Ｏ−アセチル） ３，６−ジ−Ｏ−メチル（１， 3.1 2.5 2.6 3.5 ４，５−トリ−Ｏ−アセチル） ２−Ｎ−メチルアセトアミド−２− デオキシガラクチトール ３，４，６−トリ−Ｏ−メチル <0.05 <0.05 0 0 （１，５−ジ−Ｏ−アセチル） ───────────────────────────────────
【００７８】表３〜表５の結果より、Ｃ−４，６位が置
換されているＧｌｃＮＡｃ残基は主たる還元末端残基で
あり、Ｇａｌ、Ｆｕｃ、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、
Ｍａｎ残基は非還元末端にも存在する。また、Ｆｕｃ残
基をもつトリマンノシルコア構造が主要であり、糖鎖内
部のＧａｌ残基はＣ−２，３、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−６
位に置換がある。Ｎ結合糖鎖では検出された２，３，４
−トリ−Ｏ−メチルガラクチトールがアシアロ糖鎖では
検出されないこと、２，３，４，６−Ｏ−メチルガラク
チトールがアシアロ糖鎖では増加していることにより、
Ｎ結合糖鎖のシアル酸残基はＧａｌ残基のＣ−６位に主
に結合している。Ｍａｎ残基は分画１の糖鎖ではＣ−
２、Ｃ−３，６位に置換があり、分画２の糖鎖ではＣ−
２、Ｃ−３，４，６位に置換がある。更に、分画３の糖
鎖ではＣ−２、Ｃ−３，６、Ｃ−２，６、Ｃ−２，４位
に置換がある。また、非還元末端のＧａｌＮＡｃ残基
と、Ｃ−２，３位に置換があるＧａｌ残基は分画１に検
出された。また、糖鎖内部のＧｌｃＮＡｃ残基はＣ−４
位に限って置換がある。
換されているＧｌｃＮＡｃ残基は主たる還元末端残基で
あり、Ｇａｌ、Ｆｕｃ、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、
Ｍａｎ残基は非還元末端にも存在する。また、Ｆｕｃ残
基をもつトリマンノシルコア構造が主要であり、糖鎖内
部のＧａｌ残基はＣ−２，３、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−６
位に置換がある。Ｎ結合糖鎖では検出された２，３，４
−トリ−Ｏ−メチルガラクチトールがアシアロ糖鎖では
検出されないこと、２，３，４，６−Ｏ−メチルガラク
チトールがアシアロ糖鎖では増加していることにより、
Ｎ結合糖鎖のシアル酸残基はＧａｌ残基のＣ−６位に主
に結合している。Ｍａｎ残基は分画１の糖鎖ではＣ−
２、Ｃ−３，６位に置換があり、分画２の糖鎖ではＣ−
２、Ｃ−３，４，６位に置換がある。更に、分画３の糖
鎖ではＣ−２、Ｃ−３，６、Ｃ−２，６、Ｃ−２，４位
に置換がある。また、非還元末端のＧａｌＮＡｃ残基
と、Ｃ−２，３位に置換があるＧａｌ残基は分画１に検
出された。また、糖鎖内部のＧｌｃＮＡｃ残基はＣ−４
位に限って置換がある。
【００７９】グリコシダーゼによる放射活性をもつ糖鎖
（０．５〜１００×１０4 ｃｐｍ）の消化は次の酵素を
用い行った。アルスロバクター ウレアファシエンス由
来シアリダーゼは、ナカライテスク社より購入した。α
−マンノシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−ア
セチルヘキソサミニダーゼは、リー（ Li ) らの方法
〔メソッズ イン エンザイモロシー（ Methods Enzym
ol. ) 第２８巻、第７０２〜７１３頁（１９７２）〕に
従って、タチナタマメのひきわりより精製した。Ｍａｎ
α１→２Ｍａｎ結合を特異的に切断するアスペルギルス
サイトーイ（ Aspergillus saitoi ) 由来α−マンノ
シダーゼ〔ヤマシタ（ Yamashita )ら、バイオケミカル
アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケー
ションズ、第９６巻、第１３３５〜１３４２頁（１９８
０）〕はバイオキミカ エ バイオフィジカ アクタ
（ Biochim.Biophys.Acta ) 、第６５８巻、第４５〜５
３頁（１９８１）、ジャーナル オブ バイオケミスト
リー（ J.Biochem )、第９９巻、第１６４５〜１６５４
頁（１９８６）に記載の方法に従って、モルシン（盛進
製薬社製）より、精製した。
（０．５〜１００×１０4 ｃｐｍ）の消化は次の酵素を
用い行った。アルスロバクター ウレアファシエンス由
来シアリダーゼは、ナカライテスク社より購入した。α
−マンノシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−ア
セチルヘキソサミニダーゼは、リー（ Li ) らの方法
〔メソッズ イン エンザイモロシー（ Methods Enzym
ol. ) 第２８巻、第７０２〜７１３頁（１９７２）〕に
従って、タチナタマメのひきわりより精製した。Ｍａｎ
α１→２Ｍａｎ結合を特異的に切断するアスペルギルス
サイトーイ（ Aspergillus saitoi ) 由来α−マンノ
シダーゼ〔ヤマシタ（ Yamashita )ら、バイオケミカル
アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケー
ションズ、第９６巻、第１３３５〜１３４２頁（１９８
０）〕はバイオキミカ エ バイオフィジカ アクタ
（ Biochim.Biophys.Acta ) 、第６５８巻、第４５〜５
３頁（１９８１）、ジャーナル オブ バイオケミスト
リー（ J.Biochem )、第９９巻、第１６４５〜１６５４
頁（１９８６）に記載の方法に従って、モルシン（盛進
製薬社製）より、精製した。
【００８０】Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ結合は水解す
るが、Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃ結合や、Ｇａｌβ１
→６ＧｌｃＮＡｃ結合は水解しないディプロコッカル
（ Diplococcal )β−ガラクトシダーゼ〔ポールソン
（ Paulson )ら、ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー、第２５３巻、第５６１７〜５６２４頁
（１９７８）〕とＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎ結合は水
解するが、ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＭａｎやＧｌｃＮＡｃ
β１→６Ｍａｎ結合は水解しない。
るが、Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃ結合や、Ｇａｌβ１
→６ＧｌｃＮＡｃ結合は水解しないディプロコッカル
（ Diplococcal )β−ガラクトシダーゼ〔ポールソン
（ Paulson )ら、ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー、第２５３巻、第５６１７〜５６２４頁
（１９７８）〕とＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎ結合は水
解するが、ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＭａｎやＧｌｃＮＡｃ
β１→６Ｍａｎ結合は水解しない。
【００８１】β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ〔ヤ
マシタ（ Yamashita )ら、バイオケミカル アンド バ
イオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ、第
１００巻、第２２６〜２３２頁（１９８１）〕はジャー
ナル オブ バイオロジカルケミストリー、第２５２
巻、第８６１５〜８６２３頁（１９７７）に記載の方法
によって精製した。アチャティナ フリカ（ Achatina
fulica )より精製したかたつむりのβ−マンノシダーゼ
と、アクレモニウム エスピー（ Acremoniumsp. ) 由
来α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、生化学工
業社より購入した。グリーンコーヒー豆由来α−ガラク
トシダーゼと牛副こう丸α−Ｌ−フコシダーゼは、シグ
マ社より購入した。Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→よりＦ
ｕｃ残基を遊離するがＧａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→
３）ＧｌｃＮＡｃβ１→と、Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα
１→４）ＧｌｃＮＡｃβ１→からは遊離しないコリネバ
クテリウム（ Corynebacterium )のα１→２−Ｌ−フコ
シダーゼは宝酒造社より購入した。
マシタ（ Yamashita )ら、バイオケミカル アンド バ
イオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ、第
１００巻、第２２６〜２３２頁（１９８１）〕はジャー
ナル オブ バイオロジカルケミストリー、第２５２
巻、第８６１５〜８６２３頁（１９７７）に記載の方法
によって精製した。アチャティナ フリカ（ Achatina
fulica )より精製したかたつむりのβ−マンノシダーゼ
と、アクレモニウム エスピー（ Acremoniumsp. ) 由
来α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、生化学工
業社より購入した。グリーンコーヒー豆由来α−ガラク
トシダーゼと牛副こう丸α−Ｌ−フコシダーゼは、シグ
マ社より購入した。Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→よりＦ
ｕｃ残基を遊離するがＧａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→
３）ＧｌｃＮＡｃβ１→と、Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα
１→４）ＧｌｃＮＡｃβ１→からは遊離しないコリネバ
クテリウム（ Corynebacterium )のα１→２−Ｌ−フコ
シダーゼは宝酒造社より購入した。
【００８２】酵素消化は通常、３７℃、２０時間トルエ
ン存在下、下記の条件で行った。タチナタ豆β−ガラク
トシダーゼ消化：０．２Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）４０μｌ中、酵素５ミリユニット。α−ガラ
クトシダーゼ消化：０．２Ｍクエン酸−リン酸緩衝液
（ｐＨ６．５）８０μｌ中、２５℃、酵素０．１ユニッ
ト。タチナタ豆β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消
化：０．２Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５
０μｌ中酵素０．５ユニット。ディプロコッカルβ−Ｎ
−アセチルグルコサミニダーゼ消化：０．２Ｍクエン酸
−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）４０μｌ中、酵素５ミリ
ユニット。ディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼとデ
ィプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの
混合した酵素による消化：０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ５．０）６０μｌ中、各酵素５ミリユニット。
α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ消化：０．２Ｍ
クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．５）６０μｌ中酵素
０．１ユニット ４５時間。タチナタマメα−マンノシ
ダーゼ消化：０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．
５）５０μｌ中酵素１ユニット。かたつむりβ−マンノ
シダーゼ消化：０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ４．０）５０μｌ中酵素１０ミリユニット。牛副こう
丸α−Ｌ−フコシダーゼ消化：０．１Ｍクエン酸−リン
酸緩衝液（ｐＨ６．０）４０μｌ中、酵素２０ミリユニ
ット。コリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼ
消化：０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）
３０μｌ中、３３℃ ４５時間、酵素０．１ユニット。
なお、コリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼ
消化の反応液は複合型糖鎖の還元末端のＧｌｃＮＡｃに
α１→６結合しているフコース残基を遊離しなかった。
これらの酵素反応後、各反応液は沸騰水浴中で３分間加
熱して反応を停止した。
ン存在下、下記の条件で行った。タチナタ豆β−ガラク
トシダーゼ消化：０．２Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）４０μｌ中、酵素５ミリユニット。α−ガラ
クトシダーゼ消化：０．２Ｍクエン酸−リン酸緩衝液
（ｐＨ６．５）８０μｌ中、２５℃、酵素０．１ユニッ
ト。タチナタ豆β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消
化：０．２Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５
０μｌ中酵素０．５ユニット。ディプロコッカルβ−Ｎ
−アセチルグルコサミニダーゼ消化：０．２Ｍクエン酸
−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）４０μｌ中、酵素５ミリ
ユニット。ディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼとデ
ィプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの
混合した酵素による消化：０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ５．０）６０μｌ中、各酵素５ミリユニット。
α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ消化：０．２Ｍ
クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．５）６０μｌ中酵素
０．１ユニット ４５時間。タチナタマメα−マンノシ
ダーゼ消化：０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．
５）５０μｌ中酵素１ユニット。かたつむりβ−マンノ
シダーゼ消化：０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ４．０）５０μｌ中酵素１０ミリユニット。牛副こう
丸α−Ｌ−フコシダーゼ消化：０．１Ｍクエン酸−リン
酸緩衝液（ｐＨ６．０）４０μｌ中、酵素２０ミリユニ
ット。コリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼ
消化：０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）
３０μｌ中、３３℃ ４５時間、酵素０．１ユニット。
なお、コリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼ
消化の反応液は複合型糖鎖の還元末端のＧｌｃＮＡｃに
α１→６結合しているフコース残基を遊離しなかった。
これらの酵素反応後、各反応液は沸騰水浴中で３分間加
熱して反応を停止した。
【００８３】図５〜図８にアシアロ糖鎖、及び酵素処理
物のバイオ−ゲルＰ−４溶出パターンをそれぞれ示す。
なおバイオ−ゲルＰ−４はエキストラファインを使用
し、各図中の縦軸は放射活性、横軸は溶出時間を示し、
図中の矢印はグルコース オリゴマーの溶出位置を示
す。
物のバイオ−ゲルＰ−４溶出パターンをそれぞれ示す。
なおバイオ−ゲルＰ−４はエキストラファインを使用
し、各図中の縦軸は放射活性、横軸は溶出時間を示し、
図中の矢印はグルコース オリゴマーの溶出位置を示
す。
【００８４】（４）糖鎖構造の決定 画分Ａ１はタチナタマメβ−ガラクトシダーゼと、その
後のタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ
の逐次分解で１つのＧａｌ残基（図４ｂ実線）と、その
後、１つのＧｌｃＮＡｃ残基（図４ｂ点線）を遊離させ
ることでより小さな糖鎖に変った。同様の結果がディプ
ロコッカルの酵素を使用することで得られた。更に、画
分Ａ１はコリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダー
ゼで消化した時、約０．５グルコースユニット溶出位置
が移動し、この放射活性のピークは、標準物質の下記式
（化２８）と同じ位置である約１４．５グルコースユニ
ットに相当する位置に溶出した（図４ｃ）。
後のタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ
の逐次分解で１つのＧａｌ残基（図４ｂ実線）と、その
後、１つのＧｌｃＮＡｃ残基（図４ｂ点線）を遊離させ
ることでより小さな糖鎖に変った。同様の結果がディプ
ロコッカルの酵素を使用することで得られた。更に、画
分Ａ１はコリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダー
ゼで消化した時、約０．５グルコースユニット溶出位置
が移動し、この放射活性のピークは、標準物質の下記式
（化２８）と同じ位置である約１４．５グルコースユニ
ットに相当する位置に溶出した（図４ｃ）。
【００８５】
【化２８】Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（Ｇβ１
→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４
（Ｆα１→６）ＧＮ0T
→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４
（Ｆα１→６）ＧＮ0T
【００８６】更に、この放射活性のある糖鎖は、ディプ
ロコッカルβ−ガラクトシダーゼとディプロコッカルβ
−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによる逐次分解で、
２つのＧａｌ残基（図４ｄ実線）と、その後、２つのＧ
ｌｃＮＡｃ残基（図４ｄ点線）を遊離し標準物質のトリ
マンノシル糖鎖下記の式（化２９）、（化３０）と同じ
位置である約８と７グルコースユニットに相当する位置
に各約９：１の割合で溶出して主たるピークと小さいピ
ークを与えた（図４ｄ点線）。
ロコッカルβ−ガラクトシダーゼとディプロコッカルβ
−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによる逐次分解で、
２つのＧａｌ残基（図４ｄ実線）と、その後、２つのＧ
ｌｃＮＡｃ残基（図４ｄ点線）を遊離し標準物質のトリ
マンノシル糖鎖下記の式（化２９）、（化３０）と同じ
位置である約８と７グルコースユニットに相当する位置
に各約９：１の割合で溶出して主たるピークと小さいピ
ークを与えた（図４ｄ点線）。
【００８７】
【化２９】Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ
１→４（Ｆα１→６）ＧＮ0T
１→４（Ｆα１→６）ＧＮ0T
【００８８】
【化３０】Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ
１→４ＧＮ0T
１→４ＧＮ0T
【００８９】更に、この図４ｄ（点線）に示した放射活
性のある糖鎖は更にタチナタマメα−マンノシダーゼ、
β−マンノシダーゼ、タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘ
キソサミニダーゼ、牛副こう丸α−フコシダーゼを用い
た逐次分解によってトリマンノシルコアの構造と同定さ
れた。
性のある糖鎖は更にタチナタマメα−マンノシダーゼ、
β−マンノシダーゼ、タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘ
キソサミニダーゼ、牛副こう丸α−フコシダーゼを用い
た逐次分解によってトリマンノシルコアの構造と同定さ
れた。
【００９０】ＣｏｎＡ−セファロースに吸着する糖鎖
は、Ｃ−３、Ｃ−４、Ｃ−６位に置換のないα−マンノ
ース残基が少なくとも２つ存在する必要があること、デ
ィプロコッカルβ−ガラクトシダーゼはＧａｌβ１→４
ＧｌｃＮＡｃ結合は水解するが、Ｇａｌβ１→３Ｇｌｃ
ＮＡｃとＧａｌβ１→６ＧｌｃＮＡｃ結合は水解しない
こと、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニ
ダーゼがＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎ結合は水解するが
ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＭａｎとＧｌｃＮＡｃβ１→６Ｍ
ａｎ結合は水解しないことより、図４ｃの放射活性のあ
る糖鎖は下記式（化３１）の二本鎖複合型糖鎖構造をも
つことが示された。
は、Ｃ−３、Ｃ−４、Ｃ−６位に置換のないα−マンノ
ース残基が少なくとも２つ存在する必要があること、デ
ィプロコッカルβ−ガラクトシダーゼはＧａｌβ１→４
ＧｌｃＮＡｃ結合は水解するが、Ｇａｌβ１→３Ｇｌｃ
ＮＡｃとＧａｌβ１→６ＧｌｃＮＡｃ結合は水解しない
こと、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニ
ダーゼがＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎ結合は水解するが
ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＭａｎとＧｌｃＮＡｃβ１→６Ｍ
ａｎ結合は水解しないことより、図４ｃの放射活性のあ
る糖鎖は下記式（化３１）の二本鎖複合型糖鎖構造をも
つことが示された。
【００９１】
【化３１】Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（Ｇβ１
→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４
（±Ｆα１→６）ＧＮ0T
→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４
（±Ｆα１→６）ＧＮ0T
【００９２】更に、コリネバクテリウムα１→２−Ｌ−
フコシダーゼはＦｕｃα１→２Ｇａｌ→結合よりフコー
ス残基を遊離するが、Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→
３）ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１
→４）ＧｌｃＮＡｃβ１→、還元末端のＧｌｃＮＡｃ残
基のＣ−６位に結合したフコース残基をもつ二本鎖複合
型糖鎖からは遊離しないこと、画分Ａ１はＲＣＡ１２０
−ＨＰＬＣカラムに結合しない（図２）けれども、酵素
消化によってその画分から得られた図４ｃの放射活性の
ある糖鎖は吸着し、ラクトースを含む緩衝液で溶出する
こと、該ＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムには、非還元末
端のＧａｌ残基を２つもつ二本鎖複合型糖鎖が吸着し、
ラクトースを含む緩衝液で溶出すること、その上、画分
Ａ１の糖鎖は血液型のＨ（Ｏ）構造、すなわち式（化
１）の糖鎖に高い親和性があるＵＥＡ−Ｉ−アガロース
カラムに吸着し、５０ｍＭ Ｌ−フコースを含む緩衝液
によって溶出したこと等により、Ｆｕｃ残基は、二本鎖
糖鎖の２つの非還元末端Ｇａｌ残基のうち１つのＣ−２
位に結合しており、β−ガラクトシダーゼとβ−Ｎ−ア
セチルグルコサミニダーゼの逐次分解からＧａｌβ１→
４ＧｌｃＮＡｃβ１→の外側の二本鎖のうち一本を保護
していると決定された。これはＣｏｎＡ−セファロース
に結合した糖鎖画分のメチル化分析（表３〜表５）よ
り、糖鎖内部の糖の誘導体として、３，４，６−トリ−
Ｏ−メチルガラクチトール、３，４，６−トリ−Ｏ−メ
チルマンニトール、２，４−ジ−Ｏ−メチルマンニトー
ル、３，６−ジ−Ｏ−メチル２−Ｎ−メチルアセトアミ
ド−２−デオキシグルチトールが検出されることと合致
した。これらの結果より、画分Ａ１は式（化２）に示し
たように血液型のＨ（Ｏ）構造、式（化１）をもつ二本
鎖複合型糖鎖を含むと決定した。血液型Ｈ（Ｏ）構造が
画分Ａ１中の糖鎖のＭａｎα１→３側にのみ位置してい
るという事実は以下のようにタチナタマメα−マンノシ
ダーゼの特異性に基づいて確認した。すなわち、タチナ
タマメβ−ガラクトシダーゼとタチナタマメβ−Ｎ−ア
セチルヘキソサミニダーゼによる消化により、画分Ａ１
から得られた放射活性のある糖鎖（図４ｂ点線）をタチ
ナタマメα−マンノシダーゼ消化した時、マンノースは
遊離しなかった。この放射活性のある糖鎖は下記の式
（化３２）、又は（化３３）の構造をもつこと、タチナ
タマメのα−マンノシダーゼは下記式（化３４）からＭ
ａｎ残基を１つ遊離するが下記式（化３５）からは遊離
しないことより血液型Ｈ構造は式（化２）のように二本
鎖のＭａｎα１→３の側に存在することが決定された。
フコシダーゼはＦｕｃα１→２Ｇａｌ→結合よりフコー
ス残基を遊離するが、Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→
３）ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１
→４）ＧｌｃＮＡｃβ１→、還元末端のＧｌｃＮＡｃ残
基のＣ−６位に結合したフコース残基をもつ二本鎖複合
型糖鎖からは遊離しないこと、画分Ａ１はＲＣＡ１２０
−ＨＰＬＣカラムに結合しない（図２）けれども、酵素
消化によってその画分から得られた図４ｃの放射活性の
ある糖鎖は吸着し、ラクトースを含む緩衝液で溶出する
こと、該ＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムには、非還元末
端のＧａｌ残基を２つもつ二本鎖複合型糖鎖が吸着し、
ラクトースを含む緩衝液で溶出すること、その上、画分
Ａ１の糖鎖は血液型のＨ（Ｏ）構造、すなわち式（化
１）の糖鎖に高い親和性があるＵＥＡ−Ｉ−アガロース
カラムに吸着し、５０ｍＭ Ｌ−フコースを含む緩衝液
によって溶出したこと等により、Ｆｕｃ残基は、二本鎖
糖鎖の２つの非還元末端Ｇａｌ残基のうち１つのＣ−２
位に結合しており、β−ガラクトシダーゼとβ−Ｎ−ア
セチルグルコサミニダーゼの逐次分解からＧａｌβ１→
４ＧｌｃＮＡｃβ１→の外側の二本鎖のうち一本を保護
していると決定された。これはＣｏｎＡ−セファロース
に結合した糖鎖画分のメチル化分析（表３〜表５）よ
り、糖鎖内部の糖の誘導体として、３，４，６−トリ−
Ｏ−メチルガラクチトール、３，４，６−トリ−Ｏ−メ
チルマンニトール、２，４−ジ−Ｏ−メチルマンニトー
ル、３，６−ジ−Ｏ−メチル２−Ｎ−メチルアセトアミ
ド−２−デオキシグルチトールが検出されることと合致
した。これらの結果より、画分Ａ１は式（化２）に示し
たように血液型のＨ（Ｏ）構造、式（化１）をもつ二本
鎖複合型糖鎖を含むと決定した。血液型Ｈ（Ｏ）構造が
画分Ａ１中の糖鎖のＭａｎα１→３側にのみ位置してい
るという事実は以下のようにタチナタマメα−マンノシ
ダーゼの特異性に基づいて確認した。すなわち、タチナ
タマメβ−ガラクトシダーゼとタチナタマメβ−Ｎ−ア
セチルヘキソサミニダーゼによる消化により、画分Ａ１
から得られた放射活性のある糖鎖（図４ｂ点線）をタチ
ナタマメα−マンノシダーゼ消化した時、マンノースは
遊離しなかった。この放射活性のある糖鎖は下記の式
（化３２）、又は（化３３）の構造をもつこと、タチナ
タマメのα−マンノシダーゼは下記式（化３４）からＭ
ａｎ残基を１つ遊離するが下記式（化３５）からは遊離
しないことより血液型Ｈ構造は式（化２）のように二本
鎖のＭａｎα１→３の側に存在することが決定された。
【００９３】
【化３２】Ｆα１→２Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→
６（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→
６）ＧＮ0T
６（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→
６）ＧＮ0T
【００９４】
【化３３】Ｆα１→２Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→
３（Ｍα１→６）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→
６）ＧＮ0T
３（Ｍα１→６）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→
６）ＧＮ0T
【００９５】
【化３４】Ｒ１→２Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍβ１→
４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ0T
４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ0T
【００９６】
【化３５】Ｍα１→６（Ｒ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→
４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ0T
４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ0T
【００９７】画分Ｂ１は図３Ｂの下線で示されている
が、画分Ａ１から得られた図４ｂ（点線）に相当する、
放射活性をもつＢ１の酵素処理糖鎖を、タチナタマメα
−マンノシダーゼで消化したとき、１つのＭａｎ残基が
遊離されたことを除いて画分Ｂ１からは画分Ａ１から得
られたのと同様の結果を得た。したがって、画分Ｂ１に
は式（化５）に示すようにＭａｎα１→６側に血液型の
Ｈ（Ｏ）型構造をもつ二本鎖複合型糖鎖が含まれる。ま
た、バイセクトＧｌｃＮＡｃ残基をもたないで、Ｍａｎ
α１→６側に非還元末端のＧａｌβ１→残基をもつ二本
鎖複合型糖鎖は、Ｍａｎα１→３側にこの構造をもつ糖
鎖よりもＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムよりはやく溶出
するので、画分Ａ１とＢ１がそれぞれ二本鎖のＭａｎα
１→３側とＭａｎα１→６側にＨ（Ｏ）型構造をもつと
いうことはそれらのＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムの挙
動とも合致する。
が、画分Ａ１から得られた図４ｂ（点線）に相当する、
放射活性をもつＢ１の酵素処理糖鎖を、タチナタマメα
−マンノシダーゼで消化したとき、１つのＭａｎ残基が
遊離されたことを除いて画分Ｂ１からは画分Ａ１から得
られたのと同様の結果を得た。したがって、画分Ｂ１に
は式（化５）に示すようにＭａｎα１→６側に血液型の
Ｈ（Ｏ）型構造をもつ二本鎖複合型糖鎖が含まれる。ま
た、バイセクトＧｌｃＮＡｃ残基をもたないで、Ｍａｎ
α１→６側に非還元末端のＧａｌβ１→残基をもつ二本
鎖複合型糖鎖は、Ｍａｎα１→３側にこの構造をもつ糖
鎖よりもＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムよりはやく溶出
するので、画分Ａ１とＢ１がそれぞれ二本鎖のＭａｎα
１→３側とＭａｎα１→６側にＨ（Ｏ）型構造をもつと
いうことはそれらのＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムの挙
動とも合致する。
【００９８】画分Ａ２は図３Ａに下線で示されているが
タチナタマメβ−ガラクトシダーゼとその後のタチナタ
マメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼによる逐次分
解によって、１つのＧａｌ残基（図４ｅ実線）と、１つ
のＧｌｃＮＡｃ残基（図４ｅ点線）を遊離することで、
より小さな糖鎖へ移行した。同じ結果がディプロコッカ
ルの酵素を用いても得られた。また、画分Ａ２をα−Ｎ
−アセチルガラクトサミニダーゼで消化した時、バイオ
−ゲルＰ−４の溶出において、１つのＧａｌＮＡｃ残基
の遊離に相当する約２グルコースユニット分の移動があ
った（図４ｆ実線）。また、コリネバクテリウムα１→
２−Ｌ−フコシダーゼでの消化によって図４ｆの実線で
示された一部の糖鎖からＦｕｃ残基を遊離したことを示
す、溶出パターンの移動があった（図４ｆ点線）。図４
ｆの点線で示される放射活性をもつ物質の約８５％が、
図４ｃ中の画分Ａ１から得られた放射活性をもつ糖鎖か
ら得た結果と同じ結果を示した。すなわち、ディプロコ
ッカルβ−ガラクトシダーゼと、その後のディプロコッ
カルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの逐次分解
で、２つのＧａｌ残基とその後２つのＧｌｃＮＡｃ残基
を遊離し（図４ｇの主ピーク及び図４ｈ実線）、生成物
は約９：１の割合で約８と７のグルコースユニットに相
当する位置に溶出した。これらはそれぞれＦｕｃ残基の
あるトリマンノシルコアの糖鎖と、ないものであり図４
ｄ（点線）の糖鎖に一致した。
タチナタマメβ−ガラクトシダーゼとその後のタチナタ
マメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼによる逐次分
解によって、１つのＧａｌ残基（図４ｅ実線）と、１つ
のＧｌｃＮＡｃ残基（図４ｅ点線）を遊離することで、
より小さな糖鎖へ移行した。同じ結果がディプロコッカ
ルの酵素を用いても得られた。また、画分Ａ２をα−Ｎ
−アセチルガラクトサミニダーゼで消化した時、バイオ
−ゲルＰ−４の溶出において、１つのＧａｌＮＡｃ残基
の遊離に相当する約２グルコースユニット分の移動があ
った（図４ｆ実線）。また、コリネバクテリウムα１→
２−Ｌ−フコシダーゼでの消化によって図４ｆの実線で
示された一部の糖鎖からＦｕｃ残基を遊離したことを示
す、溶出パターンの移動があった（図４ｆ点線）。図４
ｆの点線で示される放射活性をもつ物質の約８５％が、
図４ｃ中の画分Ａ１から得られた放射活性をもつ糖鎖か
ら得た結果と同じ結果を示した。すなわち、ディプロコ
ッカルβ−ガラクトシダーゼと、その後のディプロコッ
カルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの逐次分解
で、２つのＧａｌ残基とその後２つのＧｌｃＮＡｃ残基
を遊離し（図４ｇの主ピーク及び図４ｈ実線）、生成物
は約９：１の割合で約８と７のグルコースユニットに相
当する位置に溶出した。これらはそれぞれＦｕｃ残基の
あるトリマンノシルコアの糖鎖と、ないものであり図４
ｄ（点線）の糖鎖に一致した。
【００９９】一方、図４ｆ中点線で示された放射活性を
もつ物質の残り１５％からはディプロコッカルの酵素の
逐次分解によって１つのＧａｌ残基とその後１つのＧｌ
ｃＮＡｃ残基を遊離した（図４ｇの小さいピーク及び図
４ｈ点線）。この生成物（図４ｈ点線）はα−ガラクト
シダーゼ消化によって１つのＧａｌ残基を遊離した（図
４ｉ）。図４ｉ中の放射活性のもつ生成物はコリネバク
テリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼ、ディプロコッカ
ルβ−ガラクトシダーゼ、ディプロコッカルβ−Ｎ−ア
セチルグルコサミニダーゼの逐次分解によって約９：１
の割合でＦｕｃ残基のあるものとないものの、トリマン
ノシルコア構造にまで移行した（図４ｊ）。また、画物
Ａ２の放射活性をもつ糖鎖はＵＥＡ−Ｉ−アガロースカ
ラムに吸着しないけれども、α−Ｎ−アセチルガラクト
サミニダーゼとα−ガラクトシダーゼによる逐次分解の
後では、カラムに吸着し、フコースを含む緩衝液で溶出
した。
もつ物質の残り１５％からはディプロコッカルの酵素の
逐次分解によって１つのＧａｌ残基とその後１つのＧｌ
ｃＮＡｃ残基を遊離した（図４ｇの小さいピーク及び図
４ｈ点線）。この生成物（図４ｈ点線）はα−ガラクト
シダーゼ消化によって１つのＧａｌ残基を遊離した（図
４ｉ）。図４ｉ中の放射活性のもつ生成物はコリネバク
テリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼ、ディプロコッカ
ルβ−ガラクトシダーゼ、ディプロコッカルβ−Ｎ−ア
セチルグルコサミニダーゼの逐次分解によって約９：１
の割合でＦｕｃ残基のあるものとないものの、トリマン
ノシルコア構造にまで移行した（図４ｊ）。また、画物
Ａ２の放射活性をもつ糖鎖はＵＥＡ−Ｉ−アガロースカ
ラムに吸着しないけれども、α−Ｎ−アセチルガラクト
サミニダーゼとα−ガラクトシダーゼによる逐次分解の
後では、カラムに吸着し、フコースを含む緩衝液で溶出
した。
【０１００】以上の結果と、メチル化分析（表３〜表
５）より、画分Ａ２の糖鎖は、下記式（化３６）という
糖鎖のフコースの付いたＧａｌ残基にそれぞれ８５％と
１５％の割合でα配位結合したＧａｌＮＡｃ残基とＧａ
ｌ残基を含み、２つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１
→グループのうち１つがβ−ガラクトシダーゼとβ−Ｎ
−アセチルグルコサミニダーゼの逐次分解を受けること
が解明された。
５）より、画分Ａ２の糖鎖は、下記式（化３６）という
糖鎖のフコースの付いたＧａｌ残基にそれぞれ８５％と
１５％の割合でα配位結合したＧａｌＮＡｃ残基とＧａ
ｌ残基を含み、２つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１
→グループのうち１つがβ−ガラクトシダーゼとβ−Ｎ
−アセチルグルコサミニダーゼの逐次分解を受けること
が解明された。
【０１０１】
【化３６】Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（Ｆα１
→２Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４Ｇ
Ｎβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ0T
→２Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４Ｇ
Ｎβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ0T
【０１０２】また、ＣｏｎＡ−セファロースに結合した
糖鎖分画のメチル化分析より、４，６−ジ−Ｏ−メチル
ガラクチトールのみが他の糖によって２箇所置換されて
いるＧａｌ残基の誘導体として検出されたことから画分
Ａ２は式（化２４）、（化２５）の血液型のＡ型構造、
Ｂ型構造をそれぞれもつ式（化３）、（化４）の二本鎖
複合型糖鎖（Ａ２−１、及びＡ２−２）と決定された。
糖鎖分画のメチル化分析より、４，６−ジ−Ｏ−メチル
ガラクチトールのみが他の糖によって２箇所置換されて
いるＧａｌ残基の誘導体として検出されたことから画分
Ａ２は式（化２４）、（化２５）の血液型のＡ型構造、
Ｂ型構造をそれぞれもつ式（化３）、（化４）の二本鎖
複合型糖鎖（Ａ２−１、及びＡ２−２）と決定された。
【０１０３】画分Ｂ２は、図３Ｂの下線で示されている
が、画分Ａ１とＢ１の糖鎖の解析の場合において、画分
Ａ２で得られた解析結果を同様の結果が得られた。した
がって、画分Ｂ２は式（化６）、（化７）に示すように
血液型Ａ型、Ｂ型構造をもつ二本鎖複合型糖鎖（Ｂ２−
１、及びＢ２−２）と決定された。なお画分Ａ２、Ｂ２
において、血液型構造が二本鎖のＭａｎα１→３側とＭ
ａｎα１→６側に結合していることは、既述の場合と同
様に、ＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムへの挙動により決
定した。
が、画分Ａ１とＢ１の糖鎖の解析の場合において、画分
Ａ２で得られた解析結果を同様の結果が得られた。した
がって、画分Ｂ２は式（化６）、（化７）に示すように
血液型Ａ型、Ｂ型構造をもつ二本鎖複合型糖鎖（Ｂ２−
１、及びＢ２−２）と決定された。なお画分Ａ２、Ｂ２
において、血液型構造が二本鎖のＭａｎα１→３側とＭ
ａｎα１→６側に結合していることは、既述の場合と同
様に、ＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムへの挙動により決
定した。
【０１０４】ラクトースを含む緩衝液でＲＣＡ１２０−
ＨＰＬＣから溶出されてきた画分Ｃは全アシアロ糖鎖の
５９．９％の割合であり、図４ｃの放射活性のある糖鎖
と標準物質の下記式（化３７）と同じ位置、つまり約１
４．５グルコースユニットに相当する位置（図３Ｃ）に
バイオ−ゲルＰ−４カラムより溶出した。
ＨＰＬＣから溶出されてきた画分Ｃは全アシアロ糖鎖の
５９．９％の割合であり、図４ｃの放射活性のある糖鎖
と標準物質の下記式（化３７）と同じ位置、つまり約１
４．５グルコースユニットに相当する位置（図３Ｃ）に
バイオ−ゲルＰ−４カラムより溶出した。
【０１０５】
【化３７】Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（Ｇβ１
→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４
（Ｆα１→６）ＧＮ0T
→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４
（Ｆα１→６）ＧＮ0T
【０１０６】画分Ｃの解析からは、画分Ａ１から得られ
た図４ｃに示す放射活性をもつ糖鎖について先に述べた
結果と同一の結果が得られた。したがってメチル化分析
のデータ（表３〜表５）を合せ、画分Ｃ中の糖鎖を式
（化８）のＧａｌが２つ付加した二本鎖複合型糖鎖と決
定した。
た図４ｃに示す放射活性をもつ糖鎖について先に述べた
結果と同一の結果が得られた。したがってメチル化分析
のデータ（表３〜表５）を合せ、画分Ｃ中の糖鎖を式
（化８）のＧａｌが２つ付加した二本鎖複合型糖鎖と決
定した。
【０１０７】全アシアロ糖鎖の０．８％の割合の画分Ｄ
はＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムを素通りし（図２）、
バイオ−ゲルＰ−４カラムによって約３：２：２：１の
割合で、Ｄ１からＤ４の４つのピークに分けられた（図
３Ｄ）。ピークＤ１〜Ｄ４は以下のような結果から、ハ
イマンノース型糖鎖の式（化９）のｎ＝１：Ｍａｎ6Ｇ
ｌｃＮＡｃ2 、ｎ＝２：Ｍａｎ7 ＧｌｃＮＡｃ2 、ｎ＝
３：Ｍａｎ8 ＧｌｃＮＡｃ2 、ｎ＝４：Ｍａｎ9 Ｇｌｃ
ＮＡｃ2 とそれぞれ同定した。
はＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムを素通りし（図２）、
バイオ−ゲルＰ−４カラムによって約３：２：２：１の
割合で、Ｄ１からＤ４の４つのピークに分けられた（図
３Ｄ）。ピークＤ１〜Ｄ４は以下のような結果から、ハ
イマンノース型糖鎖の式（化９）のｎ＝１：Ｍａｎ6Ｇ
ｌｃＮＡｃ2 、ｎ＝２：Ｍａｎ7 ＧｌｃＮＡｃ2 、ｎ＝
３：Ｍａｎ8 ＧｌｃＮＡｃ2 、ｎ＝４：Ｍａｎ9 Ｇｌｃ
ＮＡｃ2 とそれぞれ同定した。
【０１０８】まず、第一に、β−ガラクトシドに特異的
なＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムを素通りした。第二
に、バイオ−ゲルＰ−４カラムからの溶出位置（図５
ｋ）は、それぞれの標準物質の位置と同じであった。第
三に、Ｍａｎα１→２結合を特異的に切断するアスペル
ギルス サイトーイα−マンノシダーゼ消化によって消
化物はすべて各４、３、２、１個のマンノース残基を遊
離して、約９グルコースユニットに相当する位置で標準
物質の下記式（化３８）と同一位置にバイオ−ゲルＰ−
４カラムから溶出した（図５のｌ実線）。
なＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムを素通りした。第二
に、バイオ−ゲルＰ−４カラムからの溶出位置（図５
ｋ）は、それぞれの標準物質の位置と同じであった。第
三に、Ｍａｎα１→２結合を特異的に切断するアスペル
ギルス サイトーイα−マンノシダーゼ消化によって消
化物はすべて各４、３、２、１個のマンノース残基を遊
離して、約９グルコースユニットに相当する位置で標準
物質の下記式（化３８）と同一位置にバイオ−ゲルＰ−
４カラムから溶出した（図５のｌ実線）。
【０１０９】
【化３８】Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍα１→６（Ｍα
１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ0T
１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ0T
【０１１０】第四に、更にその後、タチナタマメα−マ
ンノシダーゼ消化を行った時、４つのマンノース残基が
図５のｌの実線で示された放射活性のある物質から遊離
し、消化物は、標準物質の下記式（化３９）の位置に溶
出した（図５のｌ点線）。
ンノシダーゼ消化を行った時、４つのマンノース残基が
図５のｌの実線で示された放射活性のある物質から遊離
し、消化物は、標準物質の下記式（化３９）の位置に溶
出した（図５のｌ点線）。
【０１１１】
【化３９】Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ0T
【０１１２】更に、かたつむりβ−マンノシダーゼ、そ
れに続くタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダ
ーゼによる逐次分解によって、標準物質の下記式（化４
０）、次いでＮ−アセチルグリコサミニトールと同じ位
置に溶出した。
れに続くタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダ
ーゼによる逐次分解によって、標準物質の下記式（化４
０）、次いでＮ−アセチルグリコサミニトールと同じ位
置に溶出した。
【０１１３】
【化４０】ＧＮβ１→４ＧＮ0T
【０１１４】第五に画分ＡからＥの混合物のメチル化分
析によってＭａｎ残基の誘導体として２，３，４，６−
テトラ−Ｏ−メチル−、３，４，６−トリ−Ｏ−メチル
−、２，４−ジ−Ｏ−メチル−マンニトールを検出した
（表３〜表５）。以上によりＤ１〜Ｄ４の構造を決定し
た。全アシアロ糖鎖の０．８％の割合である画分ＥはＲ
ＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに結合しなかったが、遅れ
て溶出した（図２）。この画分はバイオーゲルＰ−４カ
ラムより、標準物質の下記の式（化４１）、（化４２）
と、それぞれ同じ位置に約１：１の割合で２つの主要ピ
ークＥ１とＥ２に分かれた（図３Ｅ）。
析によってＭａｎ残基の誘導体として２，３，４，６−
テトラ−Ｏ−メチル−、３，４，６−トリ−Ｏ−メチル
−、２，４−ジ−Ｏ−メチル−マンニトールを検出した
（表３〜表５）。以上によりＤ１〜Ｄ４の構造を決定し
た。全アシアロ糖鎖の０．８％の割合である画分ＥはＲ
ＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに結合しなかったが、遅れ
て溶出した（図２）。この画分はバイオーゲルＰ−４カ
ラムより、標準物質の下記の式（化４１）、（化４２）
と、それぞれ同じ位置に約１：１の割合で２つの主要ピ
ークＥ１とＥ２に分かれた（図３Ｅ）。
【０１１５】
【化４１】Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（３）
〔Ｍα１→３（６）〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１
→６）ＧＮ0T
〔Ｍα１→３（６）〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１
→６）ＧＮ0T
【０１１６】
【化４２】Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（３）
〔ＧＮβ１→２Ｍα１→３（６）〕Ｍβ１→４ＧＮβ１
→４（Ｆα１→６）ＧＮ0T
〔ＧＮβ１→２Ｍα１→３（６）〕Ｍβ１→４ＧＮβ１
→４（Ｆα１→６）ＧＮ0T
【０１１７】また、放射活性のある画分Ｅ２をタチナタ
マメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化した時、
消化物は１つのＧｌｃＮＡｃ残基がはずれたことで放射
活性のある画分Ｅ１と同じ溶出パターンを示した（図５
ｍ点線）。図５ｍ（点線）と放射活性のある画分Ｅ１の
どちらの物質もタチナタマメα−マンノシダーゼに抵抗
性を示すがディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼとデ
ィプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼで
の逐次分解によって、１つのＧａｌ残基と、その後１つ
のＧｌｃＮＡｃ残基を遊離した（図５ｎ、図５のｏ）。
そして約８：２の割合でＦｕｃ残基のもつトリマンノシ
ルコア構造と、もたないものとして同定された糖鎖にな
った（図５のｏ）。したがって図５ｍの点線で示された
画分Ｅ２の消化物は画分Ｅ１の糖鎖と同一であった。
マメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化した時、
消化物は１つのＧｌｃＮＡｃ残基がはずれたことで放射
活性のある画分Ｅ１と同じ溶出パターンを示した（図５
ｍ点線）。図５ｍ（点線）と放射活性のある画分Ｅ１の
どちらの物質もタチナタマメα−マンノシダーゼに抵抗
性を示すがディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼとデ
ィプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼで
の逐次分解によって、１つのＧａｌ残基と、その後１つ
のＧｌｃＮＡｃ残基を遊離した（図５ｎ、図５のｏ）。
そして約８：２の割合でＦｕｃ残基のもつトリマンノシ
ルコア構造と、もたないものとして同定された糖鎖にな
った（図５のｏ）。したがって図５ｍの点線で示された
画分Ｅ２の消化物は画分Ｅ１の糖鎖と同一であった。
【０１１８】更にまた、放射活性のある画分Ｅ２を、デ
ィプロコッカルβ−ガラクトシダーゼと、その次のディ
プロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによ
る逐次分解を行うと、１つのＧａｌ残基と、その後に２
つのＧｌｃＮＡｃ残基を遊離して、その画分は図５のｏ
の画分と同一の生成物になった。
ィプロコッカルβ−ガラクトシダーゼと、その次のディ
プロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによ
る逐次分解を行うと、１つのＧａｌ残基と、その後に２
つのＧｌｃＮＡｃ残基を遊離して、その画分は図５のｏ
の画分と同一の生成物になった。
【０１１９】これらの結果とメチル化分析のデータ（表
３〜表５）と、ＣｏｎＡ−セファロースカラムとＲＣＡ
１２０−ＨＰＬＣカラムの糖鎖アフィニティと、画分
Ａ、Ｂ中の糖鎖に対するディプロコッカルの酵素とタチ
ナタマメα−マンノシダーゼの特異性に関する結果を合
せ、画分Ｅの糖鎖を式（化１０）、及びＧａｌ残基の１
つ付加した式（化１１）の複合型糖鎖と決定した。
３〜表５）と、ＣｏｎＡ−セファロースカラムとＲＣＡ
１２０−ＨＰＬＣカラムの糖鎖アフィニティと、画分
Ａ、Ｂ中の糖鎖に対するディプロコッカルの酵素とタチ
ナタマメα−マンノシダーゼの特異性に関する結果を合
せ、画分Ｅの糖鎖を式（化１０）、及びＧａｌ残基の１
つ付加した式（化１１）の複合型糖鎖と決定した。
【０１２０】画分ＧはＥ−ＰＨＡ−アガロースカラムで
遅れて溶出してきた糖鎖の主成分であり、全アシアロ糖
鎖の５．２％の割合を占めＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラ
ムに結合した（図２）。この画分の主成分はバイオ−ゲ
ルＰ−４カラムでは標準物質の下記式（化４３）が溶出
する位置である約１５グルコースユニットに相当する位
置に溶出した（図３Ｇ、図６ｔ）。
遅れて溶出してきた糖鎖の主成分であり、全アシアロ糖
鎖の５．２％の割合を占めＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラ
ムに結合した（図２）。この画分の主成分はバイオ−ゲ
ルＰ−４カラムでは標準物質の下記式（化４３）が溶出
する位置である約１５グルコースユニットに相当する位
置に溶出した（図３Ｇ、図６ｔ）。
【０１２１】
【化４３】Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ
１→４）（ＧＮβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ
１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ0T
１→４）（ＧＮβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ
１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ0T
【０１２２】タチナタマメβ−ガラクトシダーゼ消化に
よって、画分Ｇの放射活性のある画分（図６ｔ）から２
つのＧａｌ残基が遊離した（図６ｕ実線）。タチナタマ
メβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化を行ったと
ころ図６ｕ（実線）の放射活性のある糖鎖は、約９：１
の割合で、Ｆｕｃ残基のあるトリマンノシルコアとＦｕ
ｃ残基のないものの糖鎖になった（図６ｕ点線）。更に
また、放射活性のある画分Ｇ（図６ｔ）をタチタナマメ
由来酵素とは基質特異性の異なるディプロコッカルβ−
ガラクトシダーゼとディプロコッカルβ−Ｎ−アセチル
グルコサミニダーゼの混合物で消化したところ、標準物
質の下記の式（化４４）、（化４５）と同じ位置にそれ
ぞれ溶出してくる糖鎖に移行した（図６ｖ）。
よって、画分Ｇの放射活性のある画分（図６ｔ）から２
つのＧａｌ残基が遊離した（図６ｕ実線）。タチナタマ
メβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化を行ったと
ころ図６ｕ（実線）の放射活性のある糖鎖は、約９：１
の割合で、Ｆｕｃ残基のあるトリマンノシルコアとＦｕ
ｃ残基のないものの糖鎖になった（図６ｕ点線）。更に
また、放射活性のある画分Ｇ（図６ｔ）をタチタナマメ
由来酵素とは基質特異性の異なるディプロコッカルβ−
ガラクトシダーゼとディプロコッカルβ−Ｎ−アセチル
グルコサミニダーゼの混合物で消化したところ、標準物
質の下記の式（化４４）、（化４５）と同じ位置にそれ
ぞれ溶出してくる糖鎖に移行した（図６ｖ）。
【０１２３】
【化４４】ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）
（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）
ＧＮ0T
（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）
ＧＮ0T
【０１２４】
【化４５】ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）
（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ0T
（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ0T
【０１２５】更に、タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキ
ソサミニダーゼ消化において、図６ｖの物質はＦｕｃ残
基のあるトリマンノシルコア構造とＦｕｃ残基のない構
造になり、ディプロコッカルの酵素の混合物は２つのＧ
ａｌ残基と、１つのＧｌｃＮＡｃ残基を遊離していた。
ディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼはＧａｌβ１→
４ＧｌｃＮＡｃを水解するが、Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮ
Ａｃや、Ｇａｌβ１→６ＧｌｃＮＡｃは水解しないこ
と、また、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニダーゼは下記式（化４６）からただ１つのＧｌｃＮ
Ａｃ残基を遊離して下記式（化４７）が生成すること等
や、メチル化分析（表３〜表５）、レクチンカラムへの
親和性等から、分画Ｇの糖鎖を式（化１３）のバイオセ
クトＧｌｃＮＡｃを持った二本鎖複合型糖鎖と同定し
た。
ソサミニダーゼ消化において、図６ｖの物質はＦｕｃ残
基のあるトリマンノシルコア構造とＦｕｃ残基のない構
造になり、ディプロコッカルの酵素の混合物は２つのＧ
ａｌ残基と、１つのＧｌｃＮＡｃ残基を遊離していた。
ディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼはＧａｌβ１→
４ＧｌｃＮＡｃを水解するが、Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮ
Ａｃや、Ｇａｌβ１→６ＧｌｃＮＡｃは水解しないこ
と、また、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニダーゼは下記式（化４６）からただ１つのＧｌｃＮ
Ａｃ残基を遊離して下記式（化４７）が生成すること等
や、メチル化分析（表３〜表５）、レクチンカラムへの
親和性等から、分画Ｇの糖鎖を式（化１３）のバイオセ
クトＧｌｃＮＡｃを持った二本鎖複合型糖鎖と同定し
た。
【０１２６】
【化４６】ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）
（ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４
（±Ｆα１→６）ＧＮ0T
（ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４
（±Ｆα１→６）ＧＮ0T
【０１２７】
【化４７】ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）
（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→
６）ＧＮ0T
（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→
６）ＧＮ0T
【０１２８】アシアロ糖鎖の１．１％の割合を占める画
分ＦはＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムより遅れて溶出し
（図２）、バイオ−ゲルＰ−４カラムにより約１５．５
グルコースユニットに相当する位置に溶出する（図３
Ｆ、図５ｐ）。放射活性のある分画をディプロコッカル
β−ガラクトシダーゼ消化したところ、１つのＧａｌ残
基が遊離したことに相当するピークの移動があった（図
５ｑ）。この消化物はディプロコッカルβ−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニダーゼ消化の影響を受けないけれど、タ
チナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化を
受けた（図５ｒ）。更に、分画Ｆ（図５ｐ）をコリネバ
クテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼ消化を行ったと
ころ１つのＦｕｃ残基が遊離し放射活性のある生成物は
約１５グルコースユニットに相当する位置に溶出し（図
５ｓ）、この段階の放射活性をもつ生成物（図５ｓ）か
らはバイセクトＧｌｃＮＡｃ残基をもった二本鎖を含む
分画Ｇから得られた結果と同様の糖鎖解析結果を得た。
分ＦはＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムより遅れて溶出し
（図２）、バイオ−ゲルＰ−４カラムにより約１５．５
グルコースユニットに相当する位置に溶出する（図３
Ｆ、図５ｐ）。放射活性のある分画をディプロコッカル
β−ガラクトシダーゼ消化したところ、１つのＧａｌ残
基が遊離したことに相当するピークの移動があった（図
５ｑ）。この消化物はディプロコッカルβ−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニダーゼ消化の影響を受けないけれど、タ
チナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化を
受けた（図５ｒ）。更に、分画Ｆ（図５ｐ）をコリネバ
クテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼ消化を行ったと
ころ１つのＦｕｃ残基が遊離し放射活性のある生成物は
約１５グルコースユニットに相当する位置に溶出し（図
５ｓ）、この段階の放射活性をもつ生成物（図５ｓ）か
らはバイセクトＧｌｃＮＡｃ残基をもった二本鎖を含む
分画Ｇから得られた結果と同様の糖鎖解析結果を得た。
【０１２９】したがって、バイセクトのＧｌｃＮＡｃ残
基をもつ二本鎖のＧａｌ残基にα１→２結合したＦｕｃ
残基はディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼとタチナ
タマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの逐次分解
から２本のＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→のうち１
本を保護していた。更にまた、メチル化分析のデータよ
りＥ−ＰＨＡより遅れて溶出する画分中の糖鎖のＧａｌ
残基はＣ−２位にのみ置換があること、ディプロコッカ
ルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが下記式（化４
８）のＭａｎα１→３側からＧｌｃＮＡｃ残基を遊離さ
せることはできるが、下記式（化４９）のＭａｎα１→
６側からは遊離しないこと、またＥ−ＰＨＡ−アガロー
スカラムとの相互作用に必要な構造からＦｕｃ残基はＭ
ａｎα１→３側のＧａｌ残基のＣ−２位に結合してお
り、一方Ｍａｎα１→６側のＧａｌ残基は糖の置換が無
く、分画Ｆは式（化１２）のバイセクトＧｌｃＮＡｃ残
基をもちＭａｎα１→３側に、血液型のＨ（Ｏ）型構造
をもつ二本鎖複合型糖鎖と決定された。
基をもつ二本鎖のＧａｌ残基にα１→２結合したＦｕｃ
残基はディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼとタチナ
タマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの逐次分解
から２本のＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→のうち１
本を保護していた。更にまた、メチル化分析のデータよ
りＥ−ＰＨＡより遅れて溶出する画分中の糖鎖のＧａｌ
残基はＣ−２位にのみ置換があること、ディプロコッカ
ルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが下記式（化４
８）のＭａｎα１→３側からＧｌｃＮＡｃ残基を遊離さ
せることはできるが、下記式（化４９）のＭａｎα１→
６側からは遊離しないこと、またＥ−ＰＨＡ−アガロー
スカラムとの相互作用に必要な構造からＦｕｃ残基はＭ
ａｎα１→３側のＧａｌ残基のＣ−２位に結合してお
り、一方Ｍａｎα１→６側のＧａｌ残基は糖の置換が無
く、分画Ｆは式（化１２）のバイセクトＧｌｃＮＡｃ残
基をもちＭａｎα１→３側に、血液型のＨ（Ｏ）型構造
をもつ二本鎖複合型糖鎖と決定された。
【０１３０】
【化４８】Ｒ→ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→
４）（ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→
４（±Ｆα１→６）ＧＮ0T
４）（ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→
４（±Ｆα１→６）ＧＮ0T
【０１３１】
【化４９】ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）
（Ｒ→ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→
４（±Ｆα１→６）ＧＮ0T
（Ｒ→ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→
４（±Ｆα１→６）ＧＮ0T
【０１３２】分画Ｈはアシアロ糖鎖の０．８％の割合で
あり、ＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムと同様にＣｏｎＡ
−セファロース、Ｅ−ＰＨＡ−アガロース、ＤＳＡ−ア
ガロースカラムを素通りし、図３Ｈと図６ｗに示すよう
なバイオ−ゲルＰ−４カラムからの溶出パターンを得
た。この分画はディプロコッカルβ−ガラクトシダー
ゼ、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダ
ーゼ消化に影響を受けなかった。また、図６ｗの下線で
示した放射活性をもつ糖鎖は分画Ｈの主成分（約６０
％）であり、コリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシ
ダーゼ消化で、２つのＦｕｃ残基を遊離することによっ
て、分画Ｇと同じ位置に溶出する更に小さい糖鎖になっ
た（図６ｘ）。この段階の生成物（図６ｘ）はディプロ
コッカルβ−ガラクトシダーゼとディプロコッカルβ−
Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによる逐次分解に影響
を受けた（図６ｙ）。図６ｘの生成物のうち、約８０％
は分画Ｇから得られた結果と同じ結果を得た。
あり、ＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムと同様にＣｏｎＡ
−セファロース、Ｅ−ＰＨＡ−アガロース、ＤＳＡ−ア
ガロースカラムを素通りし、図３Ｈと図６ｗに示すよう
なバイオ−ゲルＰ−４カラムからの溶出パターンを得
た。この分画はディプロコッカルβ−ガラクトシダー
ゼ、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダ
ーゼ消化に影響を受けなかった。また、図６ｗの下線で
示した放射活性をもつ糖鎖は分画Ｈの主成分（約６０
％）であり、コリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシ
ダーゼ消化で、２つのＦｕｃ残基を遊離することによっ
て、分画Ｇと同じ位置に溶出する更に小さい糖鎖になっ
た（図６ｘ）。この段階の生成物（図６ｘ）はディプロ
コッカルβ−ガラクトシダーゼとディプロコッカルβ−
Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによる逐次分解に影響
を受けた（図６ｙ）。図６ｘの生成物のうち、約８０％
は分画Ｇから得られた結果と同じ結果を得た。
【０１３３】更に図６ｗの下線で示した放射活性のある
糖鎖をＵＥＡ−Ｉアガロースにアプライしたところ、カ
ラムに吸着し、フコースを含む緩衝液で溶出された。し
たがって、２つのＦｕｃ残基は、２つのＧａｌ残基のＣ
−２位に結合しており、Ｇａｌ残基を、β−ガラクトシ
ダーゼ消化から保護していた。この結果とメチル化分析
のデータ（表３〜表５）とディプロコッカルの酵素の基
質特異性と、レクチンカラムの結合のアフィニティよ
り、分画Ｈは式（化１４）の両方の鎖に血液型Ｈ（Ｏ）
型構造をもち、バイセクトのＧｌｃＮＡｃ残基をもった
二本鎖複合型糖鎖を含むと同定した。
糖鎖をＵＥＡ−Ｉアガロースにアプライしたところ、カ
ラムに吸着し、フコースを含む緩衝液で溶出された。し
たがって、２つのＦｕｃ残基は、２つのＧａｌ残基のＣ
−２位に結合しており、Ｇａｌ残基を、β−ガラクトシ
ダーゼ消化から保護していた。この結果とメチル化分析
のデータ（表３〜表５）とディプロコッカルの酵素の基
質特異性と、レクチンカラムの結合のアフィニティよ
り、分画Ｈは式（化１４）の両方の鎖に血液型Ｈ（Ｏ）
型構造をもち、バイセクトのＧｌｃＮＡｃ残基をもった
二本鎖複合型糖鎖を含むと同定した。
【０１３４】分画Ｉは、バイオ−ゲルＰ−４カラムによ
って、約１５．５グルコースユニットに相当する主要ピ
ークと、約１４グルコースユニットに相当する小さいピ
ークとに、約７：３の比で分けられた（図３Ｉ）。主要
ピークからは酵素消化によって図５ｐに示した画分Ｆか
ら得られたのと同様の結果が得られたけれども、画分Ｉ
のディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼ消化物（図５
ｑに示した画分Ｆから得られた放射活性をもつ糖鎖に相
当する）は画分Ｆの消化物とは違ってディプロコッカル
β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化の影響を受け
た。これらの結果と、メチル化分析（表３〜表５）Ｅ−
ＰＨＡ−アガロースカラムへの親和性、ディプロコッカ
ル酵素の基質特異性より、画分Ｉの主要成分は式（化１
５）のバイセクトＧｌｃＮＡｃをもった二本鎖複合型糖
鎖であり、Ｍａｎα１→６側の枝のＧａｌ残基のＣ−２
位に結合したＦｕｃ残基の影響により、Ｍａｎα１→３
側のＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→がディプロコッ
カルβ−ガラクトシダーゼやディプロコッカルβ−Ｎ−
アセチルグルコサミニダーゼの作用を受ける。
って、約１５．５グルコースユニットに相当する主要ピ
ークと、約１４グルコースユニットに相当する小さいピ
ークとに、約７：３の比で分けられた（図３Ｉ）。主要
ピークからは酵素消化によって図５ｐに示した画分Ｆか
ら得られたのと同様の結果が得られたけれども、画分Ｉ
のディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼ消化物（図５
ｑに示した画分Ｆから得られた放射活性をもつ糖鎖に相
当する）は画分Ｆの消化物とは違ってディプロコッカル
β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化の影響を受け
た。これらの結果と、メチル化分析（表３〜表５）Ｅ−
ＰＨＡ−アガロースカラムへの親和性、ディプロコッカ
ル酵素の基質特異性より、画分Ｉの主要成分は式（化１
５）のバイセクトＧｌｃＮＡｃをもった二本鎖複合型糖
鎖であり、Ｍａｎα１→６側の枝のＧａｌ残基のＣ−２
位に結合したＦｕｃ残基の影響により、Ｍａｎα１→３
側のＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→がディプロコッ
カルβ−ガラクトシダーゼやディプロコッカルβ−Ｎ−
アセチルグルコサミニダーゼの作用を受ける。
【０１３５】バイオ−ゲルＰ−４カラムで約１４グルコ
ースユニットに相当する位置に溶出する（図３Ｉ）小さ
い方のピークからは酵素消化で分画Ｇと、ほぼ同様の結
果が得られたが、このピークからはディプロコッカルβ
−ガラクトシダーゼやタチナタマメのβ−ガラクトシダ
ーゼ消化によって１つのＧａｌ残基しか遊離しなかっ
た。したがって、小さいピーク中の糖鎖はただ１つＧａ
ｌ残基をもった二本鎖複合型糖鎖、すなわち、式（化１
６）、又は下記式（化５０）であり、Ｅ−ＰＨＡ−アガ
ロースカラムへの親和性より、小さいピークの糖鎖は式
（化１６）であると決定した。
ースユニットに相当する位置に溶出する（図３Ｉ）小さ
い方のピークからは酵素消化で分画Ｇと、ほぼ同様の結
果が得られたが、このピークからはディプロコッカルβ
−ガラクトシダーゼやタチナタマメのβ−ガラクトシダ
ーゼ消化によって１つのＧａｌ残基しか遊離しなかっ
た。したがって、小さいピーク中の糖鎖はただ１つＧａ
ｌ残基をもった二本鎖複合型糖鎖、すなわち、式（化１
６）、又は下記式（化５０）であり、Ｅ−ＰＨＡ−アガ
ロースカラムへの親和性より、小さいピークの糖鎖は式
（化１６）であると決定した。
【０１３６】
【化５０】Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ
１→４）（ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ
１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ0T
１→４）（ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ
１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ0T
【０１３７】画分Ｋからは図３Ｋと図６ｚ（実線）に示
すようにバイオ−ゲルＰ−４カラムの溶出パターンが得
られた。図６ｚ（実線）中の下線によって示された画分
Ｋの主要な放射活性をもつ画分（９０％）はディプロコ
ッカルβ−ガラクトシダーゼ消化で３つ及び２つのＧａ
ｌ残基を遊離することによってより小さな糖鎖になった
（図６ａ′実線）。主ピークの溶出する位置は標準物質
の下記式（化５１）の溶出位置と一致した。
すようにバイオ−ゲルＰ−４カラムの溶出パターンが得
られた。図６ｚ（実線）中の下線によって示された画分
Ｋの主要な放射活性をもつ画分（９０％）はディプロコ
ッカルβ−ガラクトシダーゼ消化で３つ及び２つのＧａ
ｌ残基を遊離することによってより小さな糖鎖になった
（図６ａ′実線）。主ピークの溶出する位置は標準物質
の下記式（化５１）の溶出位置と一致した。
【０１３８】
【化５１】ＧＮβ１→２Ｍα１→６〔ＧＮβ１→４（Ｇ
Ｎβ１→２）Ｍα１→３〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆ
α１→６）ＧＮ0T
Ｎβ１→２）Ｍα１→３〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆ
α１→６）ＧＮ0T
【０１３９】また、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチル
グルコサミニダーゼ消化によって、図６ａ′（実線）中
の放射活性のある生成物の約７５％が、２つのＧｌｃＮ
Ａｃ残基を遊離し、下記式（化５２）と同じ位置に溶出
した（図６ｂ′実線）。
グルコサミニダーゼ消化によって、図６ａ′（実線）中
の放射活性のある生成物の約７５％が、２つのＧｌｃＮ
Ａｃ残基を遊離し、下記式（化５２）と同じ位置に溶出
した（図６ｂ′実線）。
【０１４０】
【化５２】Ｍα１→６（ＧＮβ１→４Ｍα１→３）Ｍβ
１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ0T
１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ0T
【０１４１】更に、その後のタチナタマメβ−Ｎ−アセ
チルヘキソサミニダーゼ消化によって、図６ｂ′（実
線）中、下線で示された糖鎖は約８：２の割合で、既に
述べたようにＦｕｃ残基のあるものとないもののトリマ
ンノシルコア構造と同一の糖鎖になった（図６ｃ′実
線）。ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニ
ダーゼは下記の式（化５３）、（化５４）からはそれぞ
れ１残基と２残基のＧｌｃＮＡｃを遊離するので、ここ
で分析した糖鎖は式（化５４）であった。
チルヘキソサミニダーゼ消化によって、図６ｂ′（実
線）中、下線で示された糖鎖は約８：２の割合で、既に
述べたようにＦｕｃ残基のあるものとないもののトリマ
ンノシルコア構造と同一の糖鎖になった（図６ｃ′実
線）。ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニ
ダーゼは下記の式（化５３）、（化５４）からはそれぞ
れ１残基と２残基のＧｌｃＮＡｃを遊離するので、ここ
で分析した糖鎖は式（化５４）であった。
【０１４２】
【化５３】ＧＮβ１→６（ＧＮβ１→２）Ｍα１→６
（ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４
（±Ｆα１→６）ＧＮ0T
（ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４
（±Ｆα１→６）ＧＮ0T
【０１４３】
【化５４】ＧＮβ１→２Ｍα１→６〔ＧＮβ１→４（Ｇ
Ｎβ１→２）Ｍα１→３〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±
Ｆα１→６）ＧＮ0T
Ｎβ１→２）Ｍα１→３〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±
Ｆα１→６）ＧＮ0T
【０１４４】これらの結果、及びメチル化分析（表３〜
表５）、レクチンカラムの挙動に必要な構造より、画分
Ｋの主要成分の７５％は式（化１７）の、Ｃ−２，４位
に枝分かれのあるＭａｎ残基をもつ三本鎖複合型糖鎖と
決定した。更にまた、図６ｚ（実線）中下線に示された
画分Ｋの主要な放射活性のある糖鎖（９０％）を、牛副
こう丸α−フコシダーゼ消化した時、０、１、２残基の
Ｆｕｃが遊離し、放射活性をもつ生成物は約１６．５グ
ルコースユニットに相当する。標準物質の下記式（化５
５）と同じ位置に単一ピークとして溶出した（図６ｚ点
線）。
表５）、レクチンカラムの挙動に必要な構造より、画分
Ｋの主要成分の７５％は式（化１７）の、Ｃ−２，４位
に枝分かれのあるＭａｎ残基をもつ三本鎖複合型糖鎖と
決定した。更にまた、図６ｚ（実線）中下線に示された
画分Ｋの主要な放射活性のある糖鎖（９０％）を、牛副
こう丸α−フコシダーゼ消化した時、０、１、２残基の
Ｆｕｃが遊離し、放射活性をもつ生成物は約１６．５グ
ルコースユニットに相当する。標準物質の下記式（化５
５）と同じ位置に単一ピークとして溶出した（図６ｚ点
線）。
【０１４５】
【化５５】Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６〔Ｇβ１
→４ＧＮβ１→４（Ｇβ１→４ＧＮβ１→２）Ｍα１→
３〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ0T
→４ＧＮβ１→４（Ｇβ１→４ＧＮβ１→２）Ｍα１→
３〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ0T
【０１４６】更に、この生成物をディプロコッカルβ−
ガラクトシダーゼ、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチル
グルコサミニダーゼ、タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘ
キソサミニダーゼによって逐次分解すると、各ステップ
の生成物は３残基のＧａｌ、２残基のＧｌｃＮＡｃ、１
残基のＧｌｃＮＡｃを遊離して標準物質の下記の式（化
５６）（図６ａ′点線）、（化５７）（図６ｂ′点
線）、（化５８）（図６ｃ′点線）と同じ位置に溶出し
た。
ガラクトシダーゼ、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチル
グルコサミニダーゼ、タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘ
キソサミニダーゼによって逐次分解すると、各ステップ
の生成物は３残基のＧａｌ、２残基のＧｌｃＮＡｃ、１
残基のＧｌｃＮＡｃを遊離して標準物質の下記の式（化
５６）（図６ａ′点線）、（化５７）（図６ｂ′点
線）、（化５８）（図６ｃ′点線）と同じ位置に溶出し
た。
【０１４７】
【化５６】ＧＮβ１→２Ｍα１→６〔ＧＮβ１→４（Ｇ
Ｎβ１→２）Ｍα１→３〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ
0T
Ｎβ１→２）Ｍα１→３〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ
0T
【０１４８】
【化５７】Ｍα１→６（ＧＮβ１→４Ｍα１→３）Ｍβ
１→４ＧＮβ１→４ＧＮ0T
１→４ＧＮβ１→４ＧＮ0T
【０１４９】
【化５８】Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ
１→４ＧＮ0T
１→４ＧＮ0T
【０１５０】図６ｚ（実線）中、下線で示された画分Ｋ
の主成分をＵＥＡ−Ｉ−アガロースカラムにアプライし
たところ、その成分の約２５％がカラムに吸着し、フコ
ースを含む緩衝液で溶出し、画分Ｋの主成分の約２５％
が血液型のＨ（Ｏ）型構造式（化１）を有する。
の主成分をＵＥＡ−Ｉ−アガロースカラムにアプライし
たところ、その成分の約２５％がカラムに吸着し、フコ
ースを含む緩衝液で溶出し、画分Ｋの主成分の約２５％
が血液型のＨ（Ｏ）型構造式（化１）を有する。
【０１５１】これらの結果をメチル化分析のデータ（表
３〜表５）から、画分Ｋ中の糖鎖はＣ−２，４位に枝分
かれのあるＭａｎ残基をもつ三本鎖複合型糖鎖を含むこ
と；鎖のＦｕｃ残基は還元末端のＧｌｃＮＡｃ残基かＧ
ａｌ残基のＣ−２位か、その両方に結合していること；
画分Ｋの主成分の糖鎖の２５％に存在しているＧａｌ残
基に結合したＦｕｃ残基はディプロコッカルβ−ガラク
トシダーゼによる水解からＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ
β１→の３本の外側の鎖のうち１本を保護している（図
６ａ′実線）ことが解明され、画分ＫのＨ（Ｏ）型構造
を有する糖鎖を式（化１８）と決定した。
３〜表５）から、画分Ｋ中の糖鎖はＣ−２，４位に枝分
かれのあるＭａｎ残基をもつ三本鎖複合型糖鎖を含むこ
と；鎖のＦｕｃ残基は還元末端のＧｌｃＮＡｃ残基かＧ
ａｌ残基のＣ−２位か、その両方に結合していること；
画分Ｋの主成分の糖鎖の２５％に存在しているＧａｌ残
基に結合したＦｕｃ残基はディプロコッカルβ−ガラク
トシダーゼによる水解からＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ
β１→の３本の外側の鎖のうち１本を保護している（図
６ａ′実線）ことが解明され、画分ＫのＨ（Ｏ）型構造
を有する糖鎖を式（化１８）と決定した。
【０１５２】画分Ｌは、バイオ−ゲルＰ−４カラムで、
その外側の鎖の部分に３、４、５個のＧａｌβ１→４Ｇ
ｌｃＮＡｃユニットをもつ複合型糖鎖の領域に、それぞ
れ４６：４３：１１の割合で３つの画分Ｌ１、Ｌ２、Ｌ
３に分かれた（図３Ｌ、図７ｄ′）。
その外側の鎖の部分に３、４、５個のＧａｌβ１→４Ｇ
ｌｃＮＡｃユニットをもつ複合型糖鎖の領域に、それぞ
れ４６：４３：１１の割合で３つの画分Ｌ１、Ｌ２、Ｌ
３に分かれた（図３Ｌ、図７ｄ′）。
【０１５３】画分Ｌ１は全アシアロ糖鎖の約５．１％の
割合を占め、バイオ−ゲルＰ−４カラムよりその外側の
鎖に３つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃユニットをもつ
複合型糖鎖の領域に溶出した（図７ｄ′）。この画分の
糖鎖からはディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼ（図
７ｅ′）、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニダーゼ（図７ｆ′実線）、タチナタマメβ−Ｎ−ア
セチルヘキソサミニダーゼ（図７ｆ′点線）での逐次分
解によって３残基のＧａｌ、１残基のＧｌｃＮＡｃ、２
残基のＧｌｃＮＡｃを遊離し、最終的には約８：２の比
で、Ｆｕｃ残基の付いたトリマンノシルコア構造と付か
ない構造の糖鎖になった（図７ｆ′点線）。これらの結
果とメチル化分析のデータ（表３〜表５）と三本鎖複合
型糖鎖へのディプロコッカル酵素の基質特異性から画分
Ｌ１の糖鎖を式（化１９）のＣ−２，６位が置換された
Ｍａｎ残基をもつ三本鎖複合型糖鎖であると決定した。
割合を占め、バイオ−ゲルＰ−４カラムよりその外側の
鎖に３つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃユニットをもつ
複合型糖鎖の領域に溶出した（図７ｄ′）。この画分の
糖鎖からはディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼ（図
７ｅ′）、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニダーゼ（図７ｆ′実線）、タチナタマメβ−Ｎ−ア
セチルヘキソサミニダーゼ（図７ｆ′点線）での逐次分
解によって３残基のＧａｌ、１残基のＧｌｃＮＡｃ、２
残基のＧｌｃＮＡｃを遊離し、最終的には約８：２の比
で、Ｆｕｃ残基の付いたトリマンノシルコア構造と付か
ない構造の糖鎖になった（図７ｆ′点線）。これらの結
果とメチル化分析のデータ（表３〜表５）と三本鎖複合
型糖鎖へのディプロコッカル酵素の基質特異性から画分
Ｌ１の糖鎖を式（化１９）のＣ−２，６位が置換された
Ｍａｎ残基をもつ三本鎖複合型糖鎖であると決定した。
【０１５４】画分Ｌ２は全アシアロ糖鎖のおよそ４．７
％の割合であり、バイオ−ゲルＰ−４カラムよりその外
側の鎖に４つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃユニットを
もつ複合型糖鎖の領域に溶出された（図７ｄ′）。放射
活性をもつ画分Ｌ２をタチナタマメβ−ガラクトシダー
ゼ消化したところ、図７ｇ′の下線で示される２つの画
分Ｌ２ａとＬ２ｂがそれぞれ４残基と、２〜３残基のＧ
ａｌ残基を遊離することによって約４４：５６の割合で
生じた。画分Ｌ２ａはディプロコッカルβ−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニダーゼ（図７ｈ′実線）と、その後のタ
チナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（図７
ｈ′点線）による逐次分解で１残基のＧｌｃＮＡｃとそ
の後３残基のＧｌｃＮＡｃを遊離した。この逐次分解で
画分Ｌ２ａは標準物質の下記式（化５９）と同じ位置に
溶出する糖鎖になり、その後約７：３の割合でフコース
残基のついたトリマンノシル構造と付かない構造になっ
た。
％の割合であり、バイオ−ゲルＰ−４カラムよりその外
側の鎖に４つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃユニットを
もつ複合型糖鎖の領域に溶出された（図７ｄ′）。放射
活性をもつ画分Ｌ２をタチナタマメβ−ガラクトシダー
ゼ消化したところ、図７ｇ′の下線で示される２つの画
分Ｌ２ａとＬ２ｂがそれぞれ４残基と、２〜３残基のＧ
ａｌ残基を遊離することによって約４４：５６の割合で
生じた。画分Ｌ２ａはディプロコッカルβ−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニダーゼ（図７ｈ′実線）と、その後のタ
チナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（図７
ｈ′点線）による逐次分解で１残基のＧｌｃＮＡｃとそ
の後３残基のＧｌｃＮＡｃを遊離した。この逐次分解で
画分Ｌ２ａは標準物質の下記式（化５９）と同じ位置に
溶出する糖鎖になり、その後約７：３の割合でフコース
残基のついたトリマンノシル構造と付かない構造になっ
た。
【０１５５】
【化５９】ＧＮβ１→６（ＧＮβ１→２）Ｍα１→６
（ＧＮβ１→４Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４
（Ｆα１→６）ＧＮ0T
（ＧＮβ１→４Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４
（Ｆα１→６）ＧＮ0T
【０１５６】ディプロコッカル酵素の基質特異性、メチ
ル化分析（表３〜表５）より、及び以上の結果より該Ｌ
２ａは、Ｌ２成分中の四本鎖複合型糖鎖由来であり、該
Ｌ２成分中の四本鎖糖鎖Ｌ２−１の構造を式（化２０）
と決定した。
ル化分析（表３〜表５）より、及び以上の結果より該Ｌ
２ａは、Ｌ２成分中の四本鎖複合型糖鎖由来であり、該
Ｌ２成分中の四本鎖糖鎖Ｌ２−１の構造を式（化２０）
と決定した。
【０１５７】画分Ｌ２ｂはタチナタマメβ−Ｎ−アセチ
ルヘキソサミニダーゼ消化によって図７ｉ′に示すよう
な３つのピークとなった。図７ｉ′中下線で示された糖
鎖は３残基のＧｌｃＮＡｃの遊離によるもので画分Ｌ２
ｂの３分の１の割合を占めるが、タチナタマメβ−ガラ
クトシダーゼとその後のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニ
ダーゼによる逐次分解によって、１残基のＧａｌと１残
基のＧｌｃＮＡｃを遊離し（図７ｊ′実線と点線）、Ｆ
ｕｃ残基がついたトリマンノシルコア構造と付かないも
のに約９：１の割合で消化された。したがって、図７
ｉ′の下線で示された糖鎖は式（化２１）に示したよう
な画分Ｌ２に含まれている１つのＧａｌβ１→４Ｇｌｃ
ＮＡｃ１→３繰返し構造をもつ三本鎖複合型糖鎖Ｌ２−
２由来であった。
ルヘキソサミニダーゼ消化によって図７ｉ′に示すよう
な３つのピークとなった。図７ｉ′中下線で示された糖
鎖は３残基のＧｌｃＮＡｃの遊離によるもので画分Ｌ２
ｂの３分の１の割合を占めるが、タチナタマメβ−ガラ
クトシダーゼとその後のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニ
ダーゼによる逐次分解によって、１残基のＧａｌと１残
基のＧｌｃＮＡｃを遊離し（図７ｊ′実線と点線）、Ｆ
ｕｃ残基がついたトリマンノシルコア構造と付かないも
のに約９：１の割合で消化された。したがって、図７
ｉ′の下線で示された糖鎖は式（化２１）に示したよう
な画分Ｌ２に含まれている１つのＧａｌβ１→４Ｇｌｃ
ＮＡｃ１→３繰返し構造をもつ三本鎖複合型糖鎖Ｌ２−
２由来であった。
【０１５８】図７ｉ′中の残りの生成物はタチナタマメ
β−ガラクトシダーゼとタチナタマメβ−Ｎ−アセチル
ヘキソサミニダーゼにもはや影響を受けなかった。画分
Ｌ２の約３０％が、ＵＥＡ−Ｉ−アガロースカラムに結
合しフコースを含む緩衝液で溶出した。
β−ガラクトシダーゼとタチナタマメβ−Ｎ−アセチル
ヘキソサミニダーゼにもはや影響を受けなかった。画分
Ｌ２の約３０％が、ＵＥＡ−Ｉ−アガロースカラムに結
合しフコースを含む緩衝液で溶出した。
【０１５９】画分Ｌ３はアシアロ糖鎖の約１．２％の割
合であって、バイオ−ゲルＰ−４カラムよりその外側の
鎖に５つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃユニットをもつ
複合型糖鎖の領域に溶出された（図７ｄ′）。タチナタ
マメβ−ガラクトシダーゼ消化によって２から４残基の
Ｇａｌを遊離し、バイオ−ゲルＰ−４カラムによって１
８〜２０グルコースユニットの間にブロードなピークと
して溶出する糖鎖となった。画分Ｌ３はディプロコッカ
ルβ−ガラクトシダーゼとディプロコッカルβ−Ｎ−ア
セチルグルコサミニダーゼの混合物によって消化したと
ころ、図７ｋ′（実線）で示すように多数のピークにな
り、その約４７％と１３％が標準物質の下記の式（化６
０）、（化６１）と同じ位置に溶出する糖鎖となった
（図７ｋ′中、下線で示したＬ３ｂ、Ｌ３ａ）。
合であって、バイオ−ゲルＰ−４カラムよりその外側の
鎖に５つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃユニットをもつ
複合型糖鎖の領域に溶出された（図７ｄ′）。タチナタ
マメβ−ガラクトシダーゼ消化によって２から４残基の
Ｇａｌを遊離し、バイオ−ゲルＰ−４カラムによって１
８〜２０グルコースユニットの間にブロードなピークと
して溶出する糖鎖となった。画分Ｌ３はディプロコッカ
ルβ−ガラクトシダーゼとディプロコッカルβ−Ｎ−ア
セチルグルコサミニダーゼの混合物によって消化したと
ころ、図７ｋ′（実線）で示すように多数のピークにな
り、その約４７％と１３％が標準物質の下記の式（化６
０）、（化６１）と同じ位置に溶出する糖鎖となった
（図７ｋ′中、下線で示したＬ３ｂ、Ｌ３ａ）。
【０１６０】
【化６０】ＧＮβ１→６（ＧＮβ１→２）Ｍα１→６
（ＧＮβ１→４Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４
（Ｆα１→６）ＧＮ0T
（ＧＮβ１→４Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４
（Ｆα１→６）ＧＮ0T
【０１６１】
【化６１】ＧＮβ１→６（ＧＮβ１→２）Ｍα１→６
（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）
ＧＮ0T
（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）
ＧＮ0T
【０１６２】タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミ
ニダーゼ消化によってＬ３ａとＬ３ｂより、それぞれ２
残基と３残基のＧｌｃＮＡｃを遊離し、約８：２の割合
でＦｕｃ残基の付いたトリマンノシルコア構造と付かな
いものとなった（図７ｋ′点線）。メチル化分析（表３
〜表５）、ディプロコッカル酵素の基質特異性と合せ、
画分Ｌ３中の２成分Ｌ３−１、Ｌ３−２をそれぞれ式
（化２２）の２つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→
３繰返し構造をもつ三本鎖複合型糖質、式（化２３）の
１つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３繰返し構造
をもつ四本鎖複合型糖質と同定した。
ニダーゼ消化によってＬ３ａとＬ３ｂより、それぞれ２
残基と３残基のＧｌｃＮＡｃを遊離し、約８：２の割合
でＦｕｃ残基の付いたトリマンノシルコア構造と付かな
いものとなった（図７ｋ′点線）。メチル化分析（表３
〜表５）、ディプロコッカル酵素の基質特異性と合せ、
画分Ｌ３中の２成分Ｌ３−１、Ｌ３−２をそれぞれ式
（化２２）の２つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→
３繰返し構造をもつ三本鎖複合型糖質、式（化２３）の
１つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３繰返し構造
をもつ四本鎖複合型糖質と同定した。
【０１６３】実施例２ （１）血液型別血漿成分の調製、分離 （ａ）Ａ、Ｂ、Ｏ型血液型別に採血した血液より血漿を
調製し、該血漿を０．３８％クエン酸ナトリウム添加
後、プロテアーゼインヒビター（４ｍＭ ＥＤＴＡ、４
ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、１００ＫＩＵアプロチニ
ン）を加え、−８０℃で保存した。次に、各血液型別血
漿１μｌのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行い、各血漿成分を分離した。α2 −マクログロブリン
は１８０ｋＤａに、ｖＷＦは２７０ｋＤａの位置に泳
動、分離した。次に血漿成分を、ＰＶＤＦ膜に移し、抗
Ａマウスモノクローナル抗体、抗Ｂマウスモノクローナ
ル抗体〔オルソー社製（ＩｇＭ）、又はバイオカーブ社
製Ａ００５（ＩｇＧ3 ）〕、ビオチン−ＵＥＡ−Ｉ（ホ
ーネン社製）とそれぞれ２０℃、９０分反応させた。な
お抗体、レクチンはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ：１
５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．
４）に０．０５％のツイーン２０を含有させたＴＷ／Ｔ
ＢＳで希釈し、使用した。血漿成分との特異的結合はホ
ースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＰＰ）結合２次
抗体、又はアビジンを使用し、４−クロロ−ナフトー
ル、Ｈ2 Ｏ2 を基質とし検出した。
調製し、該血漿を０．３８％クエン酸ナトリウム添加
後、プロテアーゼインヒビター（４ｍＭ ＥＤＴＡ、４
ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、１００ＫＩＵアプロチニ
ン）を加え、−８０℃で保存した。次に、各血液型別血
漿１μｌのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行い、各血漿成分を分離した。α2 −マクログロブリン
は１８０ｋＤａに、ｖＷＦは２７０ｋＤａの位置に泳
動、分離した。次に血漿成分を、ＰＶＤＦ膜に移し、抗
Ａマウスモノクローナル抗体、抗Ｂマウスモノクローナ
ル抗体〔オルソー社製（ＩｇＭ）、又はバイオカーブ社
製Ａ００５（ＩｇＧ3 ）〕、ビオチン−ＵＥＡ−Ｉ（ホ
ーネン社製）とそれぞれ２０℃、９０分反応させた。な
お抗体、レクチンはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ：１
５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．
４）に０．０５％のツイーン２０を含有させたＴＷ／Ｔ
ＢＳで希釈し、使用した。血漿成分との特異的結合はホ
ースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＰＰ）結合２次
抗体、又はアビジンを使用し、４−クロロ−ナフトー
ル、Ｈ2 Ｏ2 を基質とし検出した。
【０１６４】Ａ型血液より調製、分離したα2 −マクロ
グロブリン及びｖＷＦはそれぞれ、抗Ａ抗体、ＵＥＡ−
Ｉと特異的に結合した。Ｂ型血液より調製、分離したα
2 −マクログロブリン及びｖＷＦはそれぞれ、抗Ｂ抗
体、ＵＥＡ−Ｉと特異的に結合した。ＡＢ型血液より調
製、分離したα2 −マクログロブリン及びｖＷＦは抗Ａ
抗体、抗Ｂ抗体と結合した。Ｏ型血液より調製、分離し
たα2 −マクログロブリン及びｖＷＦは抗Ａ抗体、抗Ｂ
抗体とは結合せず、抗Ｈ（Ｏ）レクチンと結合した。
グロブリン及びｖＷＦはそれぞれ、抗Ａ抗体、ＵＥＡ−
Ｉと特異的に結合した。Ｂ型血液より調製、分離したα
2 −マクログロブリン及びｖＷＦはそれぞれ、抗Ｂ抗
体、ＵＥＡ−Ｉと特異的に結合した。ＡＢ型血液より調
製、分離したα2 −マクログロブリン及びｖＷＦは抗Ａ
抗体、抗Ｂ抗体と結合した。Ｏ型血液より調製、分離し
たα2 −マクログロブリン及びｖＷＦは抗Ａ抗体、抗Ｂ
抗体とは結合せず、抗Ｈ（Ｏ）レクチンと結合した。
【０１６５】（ｂ）上記（ａ）記載のＡ型血液より調製
した血漿（１ｍｌ）に抗Ａモノクローナル抗体（オルソ
ー社製、マウスＩｇＭ）０．５ｍｌ、抗α2 −マクログ
ロブリン血清（ダコー社製、ウサギＩｇＧ）１００μ
ｌ、抗ｖＷＦ血清（奈良医大、宮田博士より供与、ウサ
ギＩｇＧ）１００μｌのいずれかを添加し、２４時間、
４℃に保持した。免疫凝集物を遠心分離後、数回ＴＢＳ
で洗浄し、血漿成分の各免疫凝集物を調製した。１００
μｌのＳＤＳ−緩衝液（２％ＳＤＳ、５％２−メルカプ
トエタノール、１０％グリセリン、５０ｍＭトリス−塩
酸、ｐＨ６．８）に溶解した２〜５μｌの免疫凝集物
は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後ＰＶＤ
Ｆ膜に転写した。
した血漿（１ｍｌ）に抗Ａモノクローナル抗体（オルソ
ー社製、マウスＩｇＭ）０．５ｍｌ、抗α2 −マクログ
ロブリン血清（ダコー社製、ウサギＩｇＧ）１００μ
ｌ、抗ｖＷＦ血清（奈良医大、宮田博士より供与、ウサ
ギＩｇＧ）１００μｌのいずれかを添加し、２４時間、
４℃に保持した。免疫凝集物を遠心分離後、数回ＴＢＳ
で洗浄し、血漿成分の各免疫凝集物を調製した。１００
μｌのＳＤＳ−緩衝液（２％ＳＤＳ、５％２−メルカプ
トエタノール、１０％グリセリン、５０ｍＭトリス−塩
酸、ｐＨ６．８）に溶解した２〜５μｌの免疫凝集物
は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後ＰＶＤ
Ｆ膜に転写した。
【０１６６】Ａ型血液より調製した血漿より抗Ａ抗体で
凝集した沈殿物の１８０ｋＤａ、２７０ｋＤａの位置の
泳動物はそれぞれ抗Ａ抗体と結合し、抗Ｂ抗体とは結合
しなかった。なお、抗α2 −マクログロブリン血清で凝
集した沈殿物の１８０ｋＤａの位置の泳動物は抗Ａ抗体
と結合し、抗ｖＷＦ血清で凝集した沈殿物の２７０ｋＤ
ａの位置の泳動物は抗Ａ抗体と結合した。また、１８０
ｋＤａ、２７０ｋＤａともＵＥＡ−Ｉと結合した。
凝集した沈殿物の１８０ｋＤａ、２７０ｋＤａの位置の
泳動物はそれぞれ抗Ａ抗体と結合し、抗Ｂ抗体とは結合
しなかった。なお、抗α2 −マクログロブリン血清で凝
集した沈殿物の１８０ｋＤａの位置の泳動物は抗Ａ抗体
と結合し、抗ｖＷＦ血清で凝集した沈殿物の２７０ｋＤ
ａの位置の泳動物は抗Ａ抗体と結合した。また、１８０
ｋＤａ、２７０ｋＤａともＵＥＡ−Ｉと結合した。
【０１６７】このほか、上記（ａ）記載のＢ型、Ｏ型、
ＡＢ型の各血液型血漿より抗ｖＷＦ抗体で免疫凝集し、
各ｖＷＦ凝集物を調製した。次に、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写し、各ｖＷ
Ｆの抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉとの結合性を測定
した。
ＡＢ型の各血液型血漿より抗ｖＷＦ抗体で免疫凝集し、
各ｖＷＦ凝集物を調製した。次に、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写し、各ｖＷ
Ｆの抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉとの結合性を測定
した。
【０１６８】Ｂ型血液の血漿より分離、調製したｖＷＦ
は抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉと結合し、ＡＢ型血液の血漿よ
り分離、調製したｖＷＦは抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体、ＵＥＡ
−Ｉと結合し、Ｏ型血液の血漿より分離、調製したｖＷ
Ｆは抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体とは結合せず、ＵＥＡ−Ｉと結
合した。
は抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉと結合し、ＡＢ型血液の血漿よ
り分離、調製したｖＷＦは抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体、ＵＥＡ
−Ｉと結合し、Ｏ型血液の血漿より分離、調製したｖＷ
Ｆは抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体とは結合せず、ＵＥＡ−Ｉと結
合した。
【０１６９】同様に、各血液型の血漿より抗α2 −マク
ログロブリン抗体を用い調製したα2 −マクログロブリ
ンは、抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉに対し、上記と
同様の結果を示した。
ログロブリン抗体を用い調製したα2 −マクログロブリ
ンは、抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉに対し、上記と
同様の結果を示した。
【０１７０】なお、前記のＡ型血液の血漿より抗α2 −
マクログロブリン抗体で調製した、免疫凝集物５μｌ、
精製ｖＷＦ１０μｇをそれぞれ１００ｍＵのエンドグリ
コシダーゼＦ（ベーリンガー マンハイム社製）を含む
５０μｌの溶液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
６．０、４０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ｎ−オクチルグルコ
シド、２％２−メルカプトエタノール、０．１％ＳＤ
Ｓ、０．２５％窒化ナトリウム）中で１０時間、３７℃
で反応させ、等量のＳＤＳ−緩衝液を添加後、１００
℃、５分間熱処理を行い、反応を停止した場合、各エン
ドグリコシダーゼＦ処理されたα2 −マクログロブリ
ン、ｖＷＦはＡＢＨ（Ｏ）血液型抗原性を消失した。
マクログロブリン抗体で調製した、免疫凝集物５μｌ、
精製ｖＷＦ１０μｇをそれぞれ１００ｍＵのエンドグリ
コシダーゼＦ（ベーリンガー マンハイム社製）を含む
５０μｌの溶液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
６．０、４０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ｎ−オクチルグルコ
シド、２％２−メルカプトエタノール、０．１％ＳＤ
Ｓ、０．２５％窒化ナトリウム）中で１０時間、３７℃
で反応させ、等量のＳＤＳ−緩衝液を添加後、１００
℃、５分間熱処理を行い、反応を停止した場合、各エン
ドグリコシダーゼＦ処理されたα2 −マクログロブリ
ン、ｖＷＦはＡＢＨ（Ｏ）血液型抗原性を消失した。
【０１７１】（ｃ）血液型Ａ型、Ｂ型、Ｏ型、ＡＢ型の
健常人、各１０名より採血し、血液型別の血漿を調製し
た。次に、２０μｇ／ｍｌの抗ｖＷＦ抗体〔ＭＢＬ社
製、ヤギＩｇＧ：５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９．５）〕でＥＬＩＳＡプレート（ベクトン アンド
ディクソン社製）を２４時間、４℃処理し、プレート
を抗ｖＷＦ抗体でプレコートし、次いで１％ＢＳＡを含
むＴＢＳでブロッキングした。次いで上記の血液型別血
漿の段階希釈物を、９０分、該プレートと、室温で反応
させた。次にプレートをＴＷ／ＴＢＳで洗浄後、抗Ａ抗
体、抗Ｂ抗体（オルソー社製、ＴＷ／ＴＢＳで１／２０
に希釈）、ビオチン−ＵＥＡ−Ｉ（５μｇ／ｍｌ）とそ
れぞれ４５分、反応させた。抗体、レクチンとの結合性
はオルトフェニレンジアミン塩酸塩、Ｈ2 Ｏ2 を基質と
し、ＨＲＰ結合の二次抗体、又はアビジンなどを用い測
定した。ＨＲＰの反応は、暗所で３０分行い、硫酸で反
応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
健常人、各１０名より採血し、血液型別の血漿を調製し
た。次に、２０μｇ／ｍｌの抗ｖＷＦ抗体〔ＭＢＬ社
製、ヤギＩｇＧ：５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９．５）〕でＥＬＩＳＡプレート（ベクトン アンド
ディクソン社製）を２４時間、４℃処理し、プレート
を抗ｖＷＦ抗体でプレコートし、次いで１％ＢＳＡを含
むＴＢＳでブロッキングした。次いで上記の血液型別血
漿の段階希釈物を、９０分、該プレートと、室温で反応
させた。次にプレートをＴＷ／ＴＢＳで洗浄後、抗Ａ抗
体、抗Ｂ抗体（オルソー社製、ＴＷ／ＴＢＳで１／２０
に希釈）、ビオチン−ＵＥＡ−Ｉ（５μｇ／ｍｌ）とそ
れぞれ４５分、反応させた。抗体、レクチンとの結合性
はオルトフェニレンジアミン塩酸塩、Ｈ2 Ｏ2 を基質と
し、ＨＲＰ結合の二次抗体、又はアビジンなどを用い測
定した。ＨＲＰの反応は、暗所で３０分行い、硫酸で反
応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１７２】結果を図８に示す。Ａ型血液より分離、調
製したｖＷＦは抗Ａ抗体、ＵＥＡ−Ｉと結合し、Ｂ型血
液より分離、調製したｖＷＦは抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉと
結合し、ＡＢ型血液より分離、調製したｖＷＦは抗Ａ、
抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉと結合し、Ｏ型血液より分離、調
製したｖＷＦはＵＥＡ−Ｉと結合した。なお図中、横軸
は希釈前の血漿濃度を１とした時の、血漿希釈濃度、縦
軸は４９０ｎｍの吸光度、黒丸印は抗Ａ抗体の結合、白
丸印は抗Ｂ抗体の結合、黒三角印はＵＥＡ−Ｉの結合を
それぞれ示す。
製したｖＷＦは抗Ａ抗体、ＵＥＡ−Ｉと結合し、Ｂ型血
液より分離、調製したｖＷＦは抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉと
結合し、ＡＢ型血液より分離、調製したｖＷＦは抗Ａ、
抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉと結合し、Ｏ型血液より分離、調
製したｖＷＦはＵＥＡ−Ｉと結合した。なお図中、横軸
は希釈前の血漿濃度を１とした時の、血漿希釈濃度、縦
軸は４９０ｎｍの吸光度、黒丸印は抗Ａ抗体の結合、白
丸印は抗Ｂ抗体の結合、黒三角印はＵＥＡ−Ｉの結合を
それぞれ示す。
【０１７３】（ｄ）α2 −マクログロブリン（シグマ
社）、実施例１−（１）の精製ｖＷＦをそれぞれＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転
写した。上記α2 −マクログロブリンは各血液型の混合
血漿由来であり、抗Ａ抗体、ＵＥＡ−Ｉと結合性を示し
た。また、抗Ｂ抗体とも弱い結合性を示した。また、ｖ
ＷＦも同様な結果を示した。このα2 −マクログロブリ
ンを抗Ａ抗体結合カラム、抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体結合カ
ラム、抗Ｂ抗体結合カラムでそれぞれ処理し、抗Ｂ糖鎖
抗原、抗Ａ及び抗Ｂ糖鎖抗原、抗Ａ糖鎖抗原がそれぞれ
除去されたα2 −マクログロブリンを調製した。また同
様に該精製ｖＷＦも処理し、各糖鎖抗原別のｖＷＦを調
製した。
社）、実施例１−（１）の精製ｖＷＦをそれぞれＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転
写した。上記α2 −マクログロブリンは各血液型の混合
血漿由来であり、抗Ａ抗体、ＵＥＡ−Ｉと結合性を示し
た。また、抗Ｂ抗体とも弱い結合性を示した。また、ｖ
ＷＦも同様な結果を示した。このα2 −マクログロブリ
ンを抗Ａ抗体結合カラム、抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体結合カ
ラム、抗Ｂ抗体結合カラムでそれぞれ処理し、抗Ｂ糖鎖
抗原、抗Ａ及び抗Ｂ糖鎖抗原、抗Ａ糖鎖抗原がそれぞれ
除去されたα2 −マクログロブリンを調製した。また同
様に該精製ｖＷＦも処理し、各糖鎖抗原別のｖＷＦを調
製した。
【０１７４】（ｅ）各ＡＢＯ型血液より調製した血漿の
混合物を抗Ａ抗体結合カラムに通し、Ａ型糖鎖抗原の除
去された血漿を調製した。また、該混合物を抗Ｂ抗体結
合カラムに通し、Ｂ型糖鎖抗原の除去された血漿を調製
した。更にまた、同混合物を抗Ａ、抗Ｂ抗体結合カラム
に通し、Ａ型、Ｂ型糖鎖抗原の除去された血漿を調製し
た。また、抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体を用いる凝集法により、
生じる免疫複合体を除去し、各血漿を調製した。
混合物を抗Ａ抗体結合カラムに通し、Ａ型糖鎖抗原の除
去された血漿を調製した。また、該混合物を抗Ｂ抗体結
合カラムに通し、Ｂ型糖鎖抗原の除去された血漿を調製
した。更にまた、同混合物を抗Ａ、抗Ｂ抗体結合カラム
に通し、Ａ型、Ｂ型糖鎖抗原の除去された血漿を調製し
た。また、抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体を用いる凝集法により、
生じる免疫複合体を除去し、各血漿を調製した。
【０１７５】
【発明の効果】本発明により、ＡＢＨ（Ｏ）型糖鎖抗原
の特定された血漿由来製剤が提供される。本製剤は長期
間、反復使用した場合においても、血液凝固に起因する
副作用が生ずることなく、血友病、ｖＷ病等の治療、血
漿由来成分の輸血等において安全な製剤として有用であ
る。
の特定された血漿由来製剤が提供される。本製剤は長期
間、反復使用した場合においても、血液凝固に起因する
副作用が生ずることなく、血友病、ｖＷ病等の治療、血
漿由来成分の輸血等において安全な製剤として有用であ
る。
【図１】ｖＷＦのＮ結合糖鎖の電気泳動を示す図であ
る。
る。
【図２】アシアロ糖鎖のレクチンカラム処理工程を示す
図である。
図である。
【図３】レクチンカラム処理糖鎖のバイオ−ゲルＰ−４
溶出パターンを示す図である。
溶出パターンを示す図である。
【図４】酵素処理前後の糖鎖のバイオ−ゲルＰ−４溶出
パターンを示す図である。
パターンを示す図である。
【図５】酵素処理前後の糖鎖のバイオ−ゲルＰ−４溶出
パターンを示す図である。
パターンを示す図である。
【図６】酵素処理前後の糖鎖のバイオ−ゲルＰ−４溶出
パターンを示す図である。
パターンを示す図である。
【図７】酵素処理前後の糖鎖のバイオ−ゲルＰ−４溶出
パターンを示す図である。
パターンを示す図である。
【図８】血液型別血漿由来のｖＷＦの抗Ａ抗体、抗Ｂ抗
体、ＵＥＡ−Ｉとの結合性を示す図である。
体、ＵＥＡ−Ｉとの結合性を示す図である。
Claims (2)
- 【請求項１】 血漿由来製剤において、ａ）Ａ型糖鎖抗
原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原、ｂ）Ｂ型糖鎖抗原及びＨ
（Ｏ）型糖鎖抗原、ｃ）Ａ型糖鎖抗原、Ｂ型糖鎖抗原、
及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原、ｄ）Ｈ（Ｏ）型糖鎖抗原より
成る群より選択される糖鎖抗原を実質上一種含有する血
漿成分を有効成分とすることを特徴とする血漿由来製
剤。 - 【請求項２】 血漿由来製剤において、血漿中のＡ型糖
鎖抗原及びＢ型糖鎖抗原を除去した血漿成分を有効成分
とすることを特徴とする血漿由来製剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10382492A JP3575770B2 (ja) | 1992-03-31 | 1992-03-31 | 血漿由来製剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10382492A JP3575770B2 (ja) | 1992-03-31 | 1992-03-31 | 血漿由来製剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06281650A true JPH06281650A (ja) | 1994-10-07 |
| JP3575770B2 JP3575770B2 (ja) | 2004-10-13 |
Family
ID=14364166
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10382492A Expired - Fee Related JP3575770B2 (ja) | 1992-03-31 | 1992-03-31 | 血漿由来製剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3575770B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001513507A (ja) * | 1997-08-05 | 2001-09-04 | オクタファルマ アクチェン ゲゼルシャフト | 一般的に応用可能な血漿 |
| JP2007297429A (ja) * | 2006-04-27 | 2007-11-15 | Institute Of Physical & Chemical Research | 糖鎖ライブラリの作製方法及びその利用 |
-
1992
- 1992-03-31 JP JP10382492A patent/JP3575770B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001513507A (ja) * | 1997-08-05 | 2001-09-04 | オクタファルマ アクチェン ゲゼルシャフト | 一般的に応用可能な血漿 |
| JP2007297429A (ja) * | 2006-04-27 | 2007-11-15 | Institute Of Physical & Chemical Research | 糖鎖ライブラリの作製方法及びその利用 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3575770B2 (ja) | 2004-10-13 |
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