JP3575770B2 - 血漿由来製剤 - Google Patents
血漿由来製剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3575770B2 JP3575770B2 JP10382492A JP10382492A JP3575770B2 JP 3575770 B2 JP3575770 B2 JP 3575770B2 JP 10382492 A JP10382492 A JP 10382492A JP 10382492 A JP10382492 A JP 10382492A JP 3575770 B2 JP3575770 B2 JP 3575770B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sugar chain
- fraction
- plasma
- column
- formula
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- JAPMJSVZDUYFKL-UHFFFAOYSA-N C1C2C1CCC2 Chemical compound C1C2C1CCC2 JAPMJSVZDUYFKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は糖鎖抗原の特定された血漿成分を含有する血漿由来製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
通常輸血に際し、ＡＢＯ式血液型の判定は必須であり、その不適合は輸血そのものに危険をもたらし、臨床症状としては軽度のアレルギー反応から、ショック、腎不全、播種性血管内凝固など重篤な症状を呈することもまれではない。
ＡＢＯ式血液型は赤血球の表面にあるＡＢＨ（Ｏ）糖鎖抗原の違いによって決定される。
一方、血漿成分採取装置の開発に伴い、血漿成分は、成分輸血や、血友病や感染症の治療薬の原料として使用されるようになってきた。遺伝的血液病である血友病は血液凝固因子のうち、先天的に第ＶＩＩＩ因子、又は第ＩＸ因子活性が低下しているため出血性素因をもたらす伴性劣性遺伝疾患であり、第ＶＩＩＩ因子欠乏による血友病Ａの場合は第ＶＩＩＩ因子濃縮製剤の、第ＩＸ因子欠乏による血友病Ｂの場合にはプロトロンビン複合製剤の補充療法が行われている。また、皮膚、粘膜出血を特徴とし、出血時間の延長と第ＶＩＩＩ因子活性の低下を示す男女両性に出現する常染色体優性の遺伝的出血症であるフォンビルブランド（ｖＷ）病の場合は、血漿中のフォンビルブランド因子（ｖＷＦ）の量的あるいは質的異常のため、血小板による一次止血が障害され、その治療として、新鮮血漿の補充療法が行われている。
このｖＷＦは、血小板の内皮下組織粘着に大きな役割を果すことで知られている血漿糖タンパク質で、血液凝固第ＶＩＩＩ因子のキャリアーである〔チタニ（ Ｔｉｔａｎｉ ） ら、トレンズ イン バイオケミカル サイエンシーズ（Ｔ．Ｉ．Ｂ．Ｓ．）、第１３巻、第９４〜９７頁（１９８８）、ギルマ（ Ｇｉｒｍａ ）ら、ブラッド（ Ｂｌｏｏｄ ）、第７０巻、第６０５〜６１１頁（１９８７）〕。またｖＷＦは、分子量０．５〜２０×１０６ Ｄａのマルチマーとして循環し、２７０ｋＤａのサブユニットから成る〔前出Ｔ．Ｉ．Ｂ．Ｓ．、チョペック（ Ｃｈｏｐｅｋ ） ら、バイオケミストリー（ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ） 、第２５巻、第３１４６〜３１５５頁（１９８６）〕。成熟サブユニットの完全なアミノ酸配列は明らかにされ〔チタニら、バイオケミストリー、第２５巻、第３１７１〜３１８４頁（１９８６）〕、また糖タンパク質の限定タンパク分解によって得た断片や、各ドメインに特異的な抗体を使用して、ヘパリン〔フジムラ（ Ｆｕｊｉｍｕｒａ ） ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２６２巻、第１７３４〜１７３９頁（１９８７）〕、血小板膜糖タンパク質〔プロウ（ Ｐｌｏｗ ） ら、プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザＵＳＡ（ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８２巻、第８０５７〜８０６１頁（１９８５）、アンドリュース（ Ａｎｄｒｅｗｓ ）ら、バイオケミストリー、第２８巻、第８３２６〜８３３６頁（１９８９）〕、コラーゲン〔タカギ（ Ｔａｋａｇｉ ） ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６４巻、第６０１７〜６０２０頁（１９８９）〕、血液凝固第ＶＩＩＩ因子〔ホスター（ Ｆｏｓｔｅｒ ） ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６２巻、第８４４３〜８４４６頁（１９８７）〕等への結合ドメインがそれぞれ同定されている。
【０００３】
本発明者らは先にｖＷＦは、サブユニット当り１２個のＮ結合オリゴ糖鎖と１０個のＯ結合オリゴ糖鎖を有し、これは全重量の約１５％に相当することを報告した〔前出バイオケミストリー、第２５巻、第３１７１〜３１８４頁（１９８６）〕。ｖＷＦの糖鎖部分の機能的役割はいまだ未解明であるが、タンパク質分解酵素に対する耐性〔フェデリシ（ Ｆｅｄｅｒｉｃｉ ） ら、ジャーナル オブ クリニカル インベスチゲーション（ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、第７４巻、第２０４９〜２０５５頁（１９８４）〕、マルチマー化〔ワグナー（ Ｗａｇｎｅｒ ） ら、ジャーナル オブ セル バイオロジー（ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、第１０２巻、第１３２０〜１３２４頁（１９８６）〕、血小板〔ソデツ（ Ｓｏｄｅｔｚ ） ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２５３巻、第７２０２〜７２０６頁（１９７８）、ゴウデマンド（ Ｇｏｕｄｅｍａｎｄ ）ら、スロンボシス ヘモスタス（ Ｔｈｒｏｍｂｏｓ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ）、第５３巻、第３９０〜３９５頁（１９８５）、フェデリシら、ブラッド、第７１巻、第９４７〜９５２頁（１９８８）〕、あるいはコラーゲン〔ケスラー（ Ｋｅｓｓｌｅｒ） ら、スロンボシス リサーチ（ Ｔｈｒｏｍｂｏｓ．Ｒｅｓ． ）、第５７巻、第５９〜７６頁（１９９０）〕との相互作用に関与すると示唆されている。またアシアロｖＷＦがリストセチンのような補助因子の存在しないところで血小板凝集を誘因するところから、ｖＷＦの糖鎖部分は、糖タンパク質のコンホメーションに影響すると考えられる〔デ マルコ（ Ｄｅ Ｍａｒｏ ）ら、ジャーナル オブ クリニカル インベスチゲーション、第６８巻、第３２１〜３２８頁（１９８１）〕。更にある種のｖＷ病において、活性の無い糖鎖欠損ｖＷＦが報告されている〔グラルニク（ Ｇｒａｌｎｉｃｋ ） ら、サイエンス（ Ｓｃｉｅｎｃｅ ）、第１９２巻、第５６〜５９頁（１９７６）〕。
【０００４】
ｖＷＦの糖鎖構造の詳細については明らかでは無く、今までのところ、その９０％がｖＷＦである、ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子／ｖＷＦ複合体において、二本鎖及び四本鎖複合型Ｎ結合糖鎖が２種、Ｏ結合糖鎖が一種決定されているのみである〔デベイレ（ Ｄｅｂｅｉｒｅ ）ら、フェブス レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ） 、第１５１巻、第２２〜２６頁（１９８３）、サモル（ Ｓａｍｏｒ ）ら、ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー（ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ） 、第１５８巻、第２９５〜２９８頁（１９８６）、サモルら、グリココンジュゲート ジャーナル（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ． ） 、第６巻、第２６３〜２７０頁（１９８９）〕。本発明者らは、先に西洋ワサビのパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合レクチンを使用した一連の研究で、表１に示す様に、市販の第ＶＩＩＩ因子濃縮物より、精製したｖＷＦが、ハリエニシダ（ Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ ） アグルチニンＩ（ＵＥＡ−Ｉ）と結合活性を有することを見出した〔マツイ（ Ｍａｔｓｕｉ ） ら、バイオケミカル
アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ（ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． ）、第１７８巻、第１２５３〜１２５９頁（１９９１）〕。
【０００５】
【表１】
【０００６】
なお、ＣｏｎＡはコンカナバリンＡ、ＷＧＡは麦芽（ Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ） 凝集素、ＲＣＡ１２０ はトウゴマ（ Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ ） 凝集素、ＰＮＡはピーナッツ凝集素を示し、表１中ではＨＲＰ結合物を意味する。
【０００７】
約１０μｇの各糖タンパク質、約３μｇのｖＷＦを各ＨＲＰ−レクチンのドットブロットアッセイに使用し、＋はＨＲＰ−レクチン結合性有、−は結合性無を示す。ＵＥＡ−Ｉは血液型Ｈ（Ｏ）型構造のオリゴ糖に強い親和性を示すことが知られており、ｖＷＦは下記式（化１）の糖鎖を有することが示唆される。
【０００８】
【化１】
Ｆα１ → ２Ｇβ１ → ４ＧＮβ１ →
【０００９】
（なお以下の各化学式中Ｆはフコース、Ｇはガラクトース、ＧＮはＮ−アセチルグルコサミンを示す）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らが明らかとした血漿成分中の血液型Ｈ（Ｏ）型糖鎖抗原の存在の可能性は、血漿成分の臨床使用上、重要な問題を提起するものであり、そのため、該抗原の構造を特定する必要がある。
本発明の目的は上記現状にかんがみ、血漿成分の血液型糖鎖抗原を特定し、臨床使用上、安全な、管理された血漿成分を含有する血漿由来製剤を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は精製されたフォンビルブランド因子を有効成分として使用する血漿由来製剤に関し、血漿由来製剤において、ａ）Ａ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原、ｂ）Ｂ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原、ｃ）Ａ型糖鎖抗原、Ｂ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原、ｄ）Ｈ（Ｏ）型抗原より成る群より選択される糖鎖抗原を実質上一種含有する精製されたフォンビルブランド因子を有効成分として使用することを特徴とする。また、本発明の第２の発明も血漿由来製剤に関し、精製されたフォンビルブランド因子を有効成分として使用する血漿由来製剤において、血漿中のＡ型糖鎖抗原及びＢ型糖鎖抗原を除去した血漿成分より調製されてなることを特徴とする。
【００１２】
血漿成分、例えばｖＷＦは、市販の第ＶＩＩＩ因子濃縮物より、前出バイオケミストリー、第２５巻、第３１４６〜３１５５頁（１９８６）記載の方法により、セファロース（ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ）ＣＬ−４Ｂ、ゼラチン−セファロース（ ｇｅｌａｔｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ）、アグマチン−セファロース（ ａｇｍａｔｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ） 、高濃度Ｃａ＋＋下でのセファロースＣＬ−４Ｂ等を用い高度に精製することができる。次に該精製物のヒドラジン分解を行い、ｖＷＦのＮ結合糖鎖をポリペプチド部分から定量的に分離することができる。分離した糖鎖のＮ−アセチル化後、例えばＮａＢ３ Ｈ４ を用い、該糖鎖の標識化を行う。標識化Ｎ結合糖鎖のｐＨ５．４での高圧ろ紙電気泳動により、図１に示す様にｖＷＦのＮ結合糖鎖は中性分画（Ｎ）、２酸性成分（Ａ−１及びＡ−２）に分離される。なお図１はｖＷＦのＮ結合糖鎖の電気泳動図であり、横軸は泳動距離、縦軸は放射活性を示す。Ｎ、Ａ−１、Ａ−２の量比は１４：５６：３０であり、Ａ−１は１シアル酸、Ａ−２は２シアル酸を含有する。
【００１３】
Ｎ結合糖鎖構造は、例えば次の様にして決定することができる。すなわち、Ｎ結合糖鎖標識物をシアリダーゼ処理し、アシアロ糖鎖を調製し、次いで該調製物をレクチン結合カラム、例えばＣｏｎＡカラム、インゲン豆（ Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ） のエリスロフィトヘマグルチニン（Ｅ−ＰＨＡ）カラム、ヨウシュチョウセンアサガオ（ Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ ）凝集素（ＤＳＡ）カラム、ＲＣＡ１２０ カラム、ＵＥＡ−Ｉカラム等で処理することにより、糖鎖構造に応じ、図２に示すＡ〜Ｌの成分に分画することができる。すなわち、図２はアシアロ糖鎖より各種レクチンカラムを用いて、Ｎ結合糖鎖を分別した経過を示す図であり、図中α−ｍＧはα−メチルグルコシド、α−ｍＭはα−メチルマンノシド、Ｌａｃはラクトース、ＧＮ２ はジ−Ｎ−アセチルキトビオースを示す。Ａ〜Ｌのモル比は２．８：６．９：５９．９：０．８：０．８：１．１：５．２：０．８：１．５：２．９：６．３：１１．０であり、Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｌについてはバイオ−ゲルＰ−４カラムにより、それぞれＡ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｄ１〜Ｄ４、Ｅ１、Ｅ２、Ｌ１〜Ｌ３に分別される。
【００１４】
図３はアシアロ糖鎖及びＡ〜Ｌのバイオ−ゲルＰ−４カラムによる溶出パターンであり、縦軸は放射活性、横軸は溶出時間を示し、図中の矢印はグルコースオリゴマーの溶出位置を示す。
【００１５】
次に、各種のエキソグリコシダーゼ、例えばα−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、α１→２−Ｌ−フコシダーゼ等による分画されたＮ結合糖鎖の逐次分解分析、及び各フラクションのメチル化分析により各Ｎ結合糖鎖の構造が決定される。
【００１６】
下記式（化２）にＡ１の構造を示す。Ａ１のモル比％は全体の２．２％であり、Ｈ（Ｏ）型構造を有する。なお以下の各化学式中Ｍはマンノース、ＧＮＯＴはＮ−〔 ３Ｈ〕アセチルグルコサミニトール、±は残基が糖鎖中の７０％以上に存在することを示す。
【００１７】
【化２】
【００１８】
下記の式（化３）、（化４）にＡ２中の２成分、Ａ２−１、Ａ２−２の構造を示す。（化３）はＡ２−１の構造であり、Ａ２−１のモル比％は全体の０．５％であり、Ａ型構造を有する。なお以下の各化学式中ＧａＮはＮ−アセチルガラクトサミンを示す。
【００１９】
【化３】
【００２０】
下記式（化４）はＡ２−２の構造であり、Ａ２−２のモル比％は全体の０．１％であり、Ｂ型構造を有する。
【００２１】
【化４】
【００２２】
下記式（化５）にＢ１の構造を示す。Ｂ１のモル比％は全体の５．５％であり、Ｈ（Ｏ）型構造を有する。
【００２３】
【化５】
【００２４】
下記の式（化６）、（化７）にＢ２中の２成分、Ｂ２−１、Ｂ２−２の構造を示す。
（化６）はＢ２−１の構造であり、Ｂ２−１のモル比％は全体の１．２％であり、Ａ型構造を有する。
【００２５】
【化６】
【００２６】
下記式（化７）はＢ２−２の構造であり、Ｂ２−２のモル比％は全体の０．２％であり、Ｂ型構造を有する。
【００２７】
【化７】
【００２８】
下記式（化８）にＣの構造を示す。Ｃのモル比％は全体の５９．９％であり、前出フェブス レターズ、第１５１巻、第２２〜２６頁（１９８３）に報告の構造と一致する。
【００２９】
【化８】
【００３０】
下記式（化９）にＤ１〜Ｄ４の一般構造式を示す。Ｄ１はｎ＝１で、モル比％は全体の０．３％であり、Ｄ２はｎ＝２で、モル比％は全体の０．２％であり、Ｄ３はｎ＝３で、モル比％は全体の０．２％であり、Ｄ４はｎ＝４で、モル比％は全体の０．１％である。
【００３１】
【化９】
【００３２】
下記式（化１０）にＥ１の構造を示す。Ｅ１のモル比％は全体の０．４％である。
【００３３】
【化１０】
【００３４】
下記式（化１１）にＥ２の構造を示す。Ｅ２のモル比％は全体の０．４％である。
【００３５】
【化１１】
【００３６】
下記式（化１２）にＦの構造を示す。Ｆのモル比％は全体の１．１％であり、Ｈ（Ｏ）型の構造を有する。
【００３７】
【化１２】
【００３８】
下記式（化１３）にＧの構造を示す。Ｇのモル比％は全体の５．２％である。
【００３９】
【化１３】
【００４０】
下記式（化１４）にＨの構造を示す。Ｈのモル比％は全体の０．４％であり、Ｈ（Ｏ）型の構造を有する。
【００４１】
【化１４】
【００４２】
下記の式（化１５）、（化１６）にＩ中の２成分、Ｉ１、Ｉ２の構造を示す。Ｉ１のモル比％は全体の１．１％であり、Ｈ（Ｏ）型の構造を有する。Ｉ２のモル比％は全体の０．４％である。
【００４３】
【化１５】
【００４４】
【化１６】
【００４５】
下記の式（化１７）、（化１８）にＫ中の２成分、Ｋ１、Ｋ２の構造を示す。Ｋ１のモル比％は全体の４．３％である。Ｋ２のモル比％は全体の１．４％であり、Ｈ（Ｏ）型の構造を有する。
【００４６】
【化１７】
【００４７】
【化１８】
【００４８】
下記式（化１９）にＬ１の構造を示す。Ｌ１のモル比％は全体の５．１％である。
【００４９】
【化１９】
【００５０】
下記の式（化２０）、（化２１）にＬ２中の２成分Ｌ２−１、Ｌ２−２の構造を示す。Ｌ２−１のモル比％は全体の２．１％であり、前出ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー、第１５８巻、第２９５〜２９８頁（１９８６）に報告の構造と一致する。Ｌ２−２のモル比％は全体の０．９％である。
【００５１】
【化２０】
【００５２】
【化２１】
【００５３】
下記の式（化２２）、（化２３）にＬ３中の２成分Ｌ３−１、Ｌ３−２の構造を示す。Ｌ３−１のモル比％は全体の０．６％であり、Ｌ３−２のモル比％は全体の０．２％である。
【００５４】
【化２２】
【００５５】
【化２３】
【００５６】
以上、市販の血漿製剤より精製されたｖＷＦのアシアロＮ結合糖鎖の構造が決定される。これらのうち（化１）のＨ（Ｏ）型糖鎖構造を有するＮ結合糖鎖のモル比％は全体の１１．７％であり、本発明者らが先に見出していたＵＥＡ−ＩのｖＷＦへの結合は、これらの糖鎖構造によるものである。また下記の式（化２４）、（化２５）のＡ型、Ｂ型糖鎖構造を有するＮ結合糖鎖が血漿糖タンパク質の糖鎖として初めて見出され、（化２４）のＡ型糖鎖構造を有するＮ結合糖鎖のモモ比は全体の１．７％、（化２５）のＢ型糖鎖構造を有するＮ結合糖鎖のモル比は全体の０．３％である。
【００５７】
【化２４】
【００５８】
【化２５】
【００５９】
また、この精製ｖＷＦをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写した場合、該ｖＷＦは抗Ａ血清、抗Ｂ血清、抗ＨレクチンのＵＥＡ−Ｉと、それぞれ反応性を示す。なお、該ＰＶＤＦ膜を有機溶媒で脱脂処理しても反応性は消失しないが、前もってエンドグリコシダーゼＦで処理したｖＷＦが転写されている場合、該ｖＷＦは反応性を失っていた。
【００６０】
Ａ、Ｂ、Ｏ、ＡＢ型ドナー由来血漿に抗ｖＷＦ抗体を加え、ｖＷＦを免疫沈降させ、該ｖＷＦをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写した場合の、各ドナー由来ｖＷＦの抗Ａモノクローナル抗体、抗Ｂモノクローナル抗体、抗ＨレクチンのＵＥＡ−Ｉとの反応性を表２に示す。
【００６１】
【表２】
表 ２
───────────────────────────────────
血漿ドナー 抗Ａモノクローナル 抗Ｂモノクローナル ＵＥＡ−Ｉ
血液型 抗体 抗体
───────────────────────────────────
Ａ ＋ − ＋
Ｂ − ＋ ＋
Ｏ − − ＋
ＡＢ ＋ ＋ ＋
───────────────────────────────────
【００６２】
（表中＋は反応性有、−は反応性無を示す）
Ａ型ドナーの血漿からは、Ａ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原を有するｖＷＦ、Ｂ型ドナーの血漿からは、Ｂ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原を有するｖＷＦ、Ｏ型ドナーの血漿からは、Ｈ（Ｏ）型糖鎖抗原を有するｖＷＦ、ＡＢ型ドナーの血漿からはＡ型糖鎖抗原、Ｂ型糖鎖抗原、Ｈ（Ｏ）型糖鎖抗原を有するｖＷＦが得られる。
【００６３】
以上、本発明により、糖鎖抗原の特定された、血漿由来製剤が提供される。該血漿由来製剤中には、糖鎖抗原の特定された血漿成分、例えばｖＷＦ、α２ −マクログロブリン等の血漿糖タンパク質が少なくとも１種含有されている。ＡＢＨ（Ｏ）糖鎖抗原の特定された血漿成分は、例えば各血液型ドナー由来血漿の混合物、該混合物より調製された血漿製剤等より、例えば抗Ａ、抗Ｂ抗体固定カラム、レクチン固定カラム等を用いて調製することができる。また、各血液型ドナー血漿別に適宜、調製してもよい。調製された糖鎖抗原の特定された血漿成分は、必要に応じて、賦形剤や担体と共に、常法により製剤化し、使用することができる。
【００６４】
以上、詳細に説明したように、本発明により、血液型に留意した血漿由来製剤が提供される。該製剤は血液凝固因子が血液型別に管理されており、長期間、反復使用時においても副作用の危険がなく安全な、また、輸血時の半減期の問題も改善された血漿由来製剤が提供される。
【００６５】
【実施例】
以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
【００６６】
実施例１
（１）精製ｖＷＦよりのＮ結合糖鎖の調製及び放射標識化
市販の第ＶＩＩＩ因子濃縮物（ハイランドセラピューティクス製）より、前出バイオケミストリー、第２５巻、第３１４６〜３１５５頁（１９８６）に記載の方法に準じ、ヒトｖＷＦを精製した。
次に該ｖＷＦ３７．９ｍｇを無水ヒドラジン１ｍｌに懸濁し、９時間のヒドラジン分解を行った後、Ｎ−アセチル化を行い、定量的にＮ結合糖鎖を遊離した。次に該糖鎖の１／６量を、０．０５Ｎ ＮａＯＨ ０．８ｍｌ中で、３０℃、４時間、ＮａＢ３ Ｈ４ （１６０ＭＢｑ）で還元し、糖鎖のトリチウム標識を行い、その後ＮａＢＨ４ を６ｍｇ溶解した０．０５Ｎ ＮａＯＨ ０．３ｍｌを加えて、反応を更に２時間続けて、反応を終了した。
結合した放射活性は９．８×１０６ ｃｐｍであった。また残りの５／６量の糖鎖は０．０５Ｎ ＮａＯＨ １．５ｍｌ中、３０℃、４時間、ＮａＢ２ Ｈ４ ３０ｍｇで還元し、メチル化分析用の ２Ｈ標識物を調製した。
【００６７】
（２）アシアロ糖鎖の調製及びレクチンカラムによる分画
標識化糖鎖のｐＨ５．４での高圧ろ紙電気泳動図を図１に示す。Ｎは中性画分、Ａ−１は１シアル酸結合物、Ａ−２は２シアル酸結合物であり、図中、矢印１、２、３は標準物質、ラクチトール、シアリルラクチトール、ブロモフェノールブルーのそれぞれの泳動位置を示す。なお図１において、横軸は泳動距離（ｃｍ）、縦軸は放射活性を示す。
次にレクチンカラム分画に供するため、糖鎖のシアリダーゼ〔アルスロバクター ウレアファシエンス（ Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ ） 由来：ナカライテスク社製〕処理を行い、アシアロ糖鎖を調製した。なお酵素反応は０．１５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中、３７℃、２０時間行った。
【００６８】
レクチン アフィニティ クロマトグラフィーは以下のように行った。ＣｏｎＡ−セファロースカラム（ファルマシア社製）（０．７×１３ｃｍ）は３０ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．４を用い、流速１２ｍｌ／ｈｒで平衡化を行い、２５℃中保持した。糖鎖の試料は緩衝液１５ｍｌで洗浄したカラムへアプライした。その後、溶出液を１０ｍＭα−メチルグルコシドを含む緩衝液１５ｍｌとした後、１００ｍＭα−メチルマンノシドを含む緩衝液１５ｍｌで溶出した。Ｅ−ＰＨＡ−アガロースカラム（Ｅ−Ｙラボラトリーズ社製）（０．７×１５ｃｍ）は０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２（ＰＢＳ）を用いて流速１２ｍｌ／ｈｒで平衡化を行い、２５℃中保持した。糖鎖試料をアプライした後、ＰＢＳ３０ｍｌで溶出した。ＤＳＡ−アガロースカラム（Ｅ−Ｙラボラトリーズ社製）（０．７×１８ｃｍ）は３０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．４を用いて、流速６ｍｌ／ｈｒで平衡化し、４℃中保持した。糖鎖試料をアプライした後、緩衝液２０ｍｌで溶出を行い、ジ−Ｎ−アセチルキトビオースを含む（２ｍｇ／ｍｌ）緩衝液５ｍｌで溶出した。ＵＥＡ−Ｉ−アガロース（Ｅ−Ｙラボラトリーズ社製）カラム（０．５×１０ｃｍ）は流速６ｍｌ／ｈｒでＰＢＳによって平衡化し、４℃中保持した。糖鎖試料をアプライした後溶出は６ｍｌのＰＢＳで行った後、５０ｍＭ Ｌ−フコシダーゼを含むＰＢＳ５ｍｌで行った。レクチン（ＲＣＡ１２０）アフィニティカラム（ホーネン社製）ＨＰＬＣは、アーカイブズ オブ バイオケミストリー アンド バイオフィジクス（ Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． ）第２５７巻、第３８７〜３９４頁（１９８７）に報告の本発明者らの方法で行った。
【００６９】
ヒトｖＷＦより得られた全アシアロ糖鎖の約７１％が、ＣｏｎＡ−セファロースカラムに吸着した。このうち約９８％が１０ｍＭα−メチルグルコシドを含む緩衝液で溶出し約２％が１００ｍＭα−メチルマンノシドを含む緩衝液で溶出した。
これらはレクチン（ＲＣＡ１２０）アフィニティＨＰＬＣによって３つ（Ａ、Ｂ、Ｃ）と２つ（Ｄ、Ｅ）の画分に分けられた（図２）。更に画分Ａはバイオ−ゲルＰ−４カラムによってＡ１、Ａ２、画分Ｂはバイオ−ゲルＰ−４カラムによってＢ１、Ｂ２に分けられた（図３）。
ラクトースを含む緩衝液でＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣから溶出されてきた画分Ｃは全アシアロ糖鎖の５９．９％の割合であった（図２）。
全アシアロ糖鎖の０．８％の割合の画分ＤはＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムを素通りし（図２）、更にバイオ−ゲルＰ−４カラムによって約３：２：２：１の割合でＤ１〜Ｄ４のピークに分けられた（図３）。
全アシアロ糖鎖の０．８％の割合である画分ＥはＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに結合しなかったが、遅れて溶出した（図２）。この画分は更にバイオ−ゲルＰ−４カラムによりＥ１とＥ２に分けられた（図３）。
ＣｏｎＡ−セファロースカラムを素通りするアシアロ糖鎖の約６．３％はＥ−ＰＨＡ−アガロースカラムから溶出が遅れ（図２）たが、このカラムはＲ１ 、Ｒ２ がＨか糖であるような下記式（化２６）に示す糖鎖にアフィニティーがあり、溶出が遅れた糖鎖は次のＤＳＡ−アガロースカラムに吸着しなかったけれど、その次のＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣによって約１７：８３の割合で２つの画分ＦとＧに分けられた（図２）。
【００７０】
【化２６】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）〔Ｒ１ →４（Ｒ２ →４ＧＮβ１→２）Ｍα１→３〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→
【００７１】
また、アシアロ糖鎖の１．１％を占める分画Ｆは、バイオ−ゲルＰ−４カラムにより約１５．５グルコースユニットに相当する位置に溶出した（図３）。
画分ＧはＥ−ＰＨＡ−アガロースカラムで遅れて溶出してきた糖鎖の主成分であり、アシアロ糖鎖の５．２％の割合を占め、ＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに結合した。この画分はラクトースを含む緩衝液で溶出した（図２）。
分画Ｈはアシアロ糖鎖の０．８％の割合であり、ＣｏｎＡ−セファロース、Ｅ−ＰＨＡ−アガロース、ＤＳＡ−アガロースを素通りし、更にＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムも同様に素通りした（図２）。
アシアロ糖鎖の１．５％の割合を占めＣｏｎＡ−セファロース、Ｅ−ＰＨＡ−アガロース、ＤＳＡ−アガロースカラムを素通りする分画ＩはＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムから遅れて溶出された（図２）。
アシアロ糖鎖の２．９％の割合を占めＣｏｎＡ−セファロース、Ｅ−ＰＨＡ−アガロース、ＤＳＡ−アガロースカラムを素通りした分画ＪはＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに結合しラクトースを含む緩衝液で溶出した（図２）。
アシアロ糖鎖の６．３％の割合の画分ＫはＣｏｎＡ−セファロースとＥ−ＰＨＡ−アガロースを素通りし、ＤＳＡ−アガロースカラムからは遅れて溶出されたがＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムには吸着してラクトースを含む緩衝液で溶出された（図２）。この画分のＤＳＡ−アガロースカラムへのアフィニティによって、画分Ｋの糖鎖には下記式（化２７）の構造が含まれる。
【００７２】
【化２７】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→４（Ｇβ１→４ＧＮβ１→２）Ｍ
【００７３】
アシアロ糖鎖の１７％の割合を占め、ＣｏｎＡ−セファロースとＥ−ＰＨＡ−アガロースカラムを素通りする画分ＬはＤＳＡ−アガロースカラムとＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに吸着しそれぞれジ−Ｎ−アセチルキトビオース、ラクトースを含む緩衝液で溶出した（図２）。この画分はバイオ−ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）Ｐ−４カラムで、その外側の鎖の部分に３、４、５つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃユニットをもつ、複合型糖鎖の領域に、それぞれ４６：４３：１１の割合で３つの画分Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３に分かれた（図３）。
【００７４】
（３）メチル化分析及びグリコシダーゼ処理
Ｎ結合糖鎖、Ａ１〜Ｅ２のＣｏｎＡ吸着分画（分画１）、Ｆ、ＧのＥ−ＰＨＡ吸着分画（分画２）、Ｈ〜Ｌ３のＣｏｎＡ、Ｅ−ＰＨＡ非吸着分画（分画３）のメチル化分析を行った。結果を表３〜表５に示す。
【００７５】
【表３】
【００７６】
【表４】
【００７７】
【表５】
【００７８】
表３〜表５の結果より、Ｃ−４，６位が置換されているＧｌｃＮＡｃ残基は主たる還元末端残基であり、Ｇａｌ、Ｆｕｃ、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、Ｍａｎ残基は非還元末端にも存在する。また、Ｆｕｃ残基をもつトリマンノシルコア構造が主要であり、糖鎖内部のＧａｌ残基はＣ−２，３、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−６位に置換がある。Ｎ結合糖鎖では検出された２，３，４−トリ−Ｏ−メチルガラクチトールがアシアロ糖鎖では検出されないこと、２，３，４，６−Ｏ−メチルガラクチトールがアシアロ糖鎖では増加していることにより、Ｎ結合糖鎖のシアル酸残基はＧａｌ残基のＣ−６位に主に結合している。Ｍａｎ残基は分画１の糖鎖ではＣ−２、Ｃ−３，６位に置換があり、分画２の糖鎖ではＣ−２、Ｃ−３，４，６位に置換がある。更に、分画３の糖鎖ではＣ−２、Ｃ−３，６、Ｃ−２，６、Ｃ−２，４位に置換がある。また、非還元末端のＧａｌＮＡｃ残基と、Ｃ−２，３位に置換があるＧａｌ残基は分画１に検出された。また、糖鎖内部のＧｌｃＮＡｃ残基はＣ−４位に限って置換がある。
【００７９】
グリコシダーゼによる放射活性をもつ糖鎖（０．５〜１００×１０４ ｃｐｍ）の消化は次の酵素を用い行った。アルスロバクター ウレアファシエンス由来シアリダーゼは、ナカライテスク社より購入した。α−マンノシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、リー（ Ｌｉ ） らの方法〔メソッズ イン エンザイモロシー（ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ） 第２８巻、第７０２〜７１３頁（１９７２）〕に従って、タチナタマメのひきわりより精製した。Ｍａｎα１→２Ｍａｎ結合を特異的に切断するアスペルギルス サイトーイ（ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ ） 由来α−マンノシダーゼ〔ヤマシタ（ Ｙａｍａｓｈｉｔａ ）ら、バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ、第９６巻、第１３３５〜１３４２頁（１９８０）〕はバイオキミカ エ バイオフィジカ アクタ（ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ） 、第６５８巻、第４５〜５３頁（１９８１）、ジャーナル オブ バイオケミストリー（ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ）、第９９巻、第１６４５〜１６５４頁（１９８６）に記載の方法に従って、モルシン（盛進製薬社製）より、精製した。
【００８０】
Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ結合は水解するが、Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃ結合や、Ｇａｌβ１→６ＧｌｃＮＡｃ結合は水解しないディプロコッカル（ Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃａｌ ）β−ガラクトシダーゼ〔ポールソン（ Ｐａｕｌｓｏｎ ）ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２５３巻、第５６１７〜５６２４頁（１９７８）〕とＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎ結合は水解するが、ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＭａｎやＧｌｃＮＡｃβ１→６Ｍａｎ結合は水解しない。
【００８１】
β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ〔ヤマシタ（ Ｙａｍａｓｈｉｔａ ）ら、バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ、第１００巻、第２２６〜２３２頁（１９８１）〕はジャーナル オブ バイオロジカルケミストリー、第２５２巻、第８６１５〜８６２３頁（１９７７）に記載の方法によって精製した。アチャティナ フリカ（ Ａｃｈａｔｉｎａ ｆｕｌｉｃａ ）より精製したかたつむりのβ−マンノシダーゼと、アクレモニウム エスピー（ Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ． ） 由来α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、生化学工業社より購入した。
グリーンコーヒー豆由来α−ガラクトシダーゼと牛副こう丸α−Ｌ−フコシダーゼは、シグマ社より購入した。Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→よりＦｕｃ残基を遊離するがＧａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃβ１→と、Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃβ１→からは遊離しないコリネバクテリウム（ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）のα１→２−Ｌ−フコシダーゼは宝酒造社より購入した。
【００８２】
酵素消化は通常、３７℃、２０時間トルエン存在下、下記の条件で行った。
タチナタ豆β−ガラクトシダーゼ消化：０．２Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）４０μｌ中、酵素５ミリユニット。α−ガラクトシダーゼ消化：０．２Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）８０μｌ中、２５℃、酵素０．１ユニット。タチナタ豆β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化：０．２Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μｌ中酵素０．５ユニット。ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化：０．２Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）４０μｌ中、酵素５ミリユニット。ディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼとディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの混合した酵素による消化：０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）６０μｌ中、各酵素５ミリユニット。α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ消化：０．２Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．５）６０μｌ中酵素０．１ユニット ４５時間。タチナタマメα−マンノシダーゼ消化：０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）５０μｌ中酵素１ユニット。かたつむりβ−マンノシダーゼ消化：０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）５０μｌ中酵素１０ミリユニット。牛副こう丸α−Ｌ−フコシダーゼ消化：０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）４０μｌ中、酵素２０ミリユニット。コリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼ消化：０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）３０μｌ中、３３℃ ４５時間、酵素０．１ユニット。なお、コリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼ消化の反応液は複合型糖鎖の還元末端のＧｌｃＮＡｃにα１→６結合しているフコース残基を遊離しなかった。これらの酵素反応後、各反応液は沸騰水浴中で３分間加熱して反応を停止した。
【００８３】
図５〜図８にアシアロ糖鎖、及び酵素処理物のバイオ−ゲルＰ−４溶出パターンをそれぞれ示す。なおバイオ−ゲルＰ−４はエキストラファインを使用し、各図中の縦軸は放射活性、横軸は溶出時間を示し、図中の矢印はグルコース オリゴマーの溶出位置を示す。
【００８４】
（４）糖鎖構造の決定
画分Ａ１はタチナタマメβ−ガラクトシダーゼと、その後のタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの逐次分解で１つのＧａｌ残基（図４ｂ実線）と、その後、１つのＧｌｃＮＡｃ残基（図４ｂ点線）を遊離させることでより小さな糖鎖に変った。同様の結果がディプロコッカルの酵素を使用することで得られた。更に、画分Ａ１はコリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼで消化した時、約０．５グルコースユニット溶出位置が移動し、この放射活性のピークは、標準物質の下記式（化２８）と同じ位置である約１４．５グルコースユニットに相当する位置に溶出した（図４ｃ）。
【００８５】
【化２８】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【００８６】
更に、この放射活性のある糖鎖は、ディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼとディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによる逐次分解で、２つのＧａｌ残基（図４ｄ実線）と、その後、２つのＧｌｃＮＡｃ残基（図４ｄ点線）を遊離し標準物質のトリマンノシル糖鎖下記の式（化２９）、（化３０）と同じ位置である約８と７グルコースユニットに相当する位置に各約９：１の割合で溶出して主たるピークと小さいピークを与えた（図４ｄ点線）。
【００８７】
【化２９】
Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【００８８】
【化３０】
Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ０Ｔ
【００８９】
更に、この図４ｄ（点線）に示した放射活性のある糖鎖は更にタチナタマメα−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、牛副こう丸α−フコシダーゼを用いた逐次分解によってトリマンノシルコアの構造と同定された。
【００９０】
ＣｏｎＡ−セファロースに吸着する糖鎖は、Ｃ−３、Ｃ−４、Ｃ−６位に置換のないα−マンノース残基が少なくとも２つ存在する必要があること、ディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼはＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ結合は水解するが、Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃとＧａｌβ１→６ＧｌｃＮＡｃ結合は水解しないこと、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼがＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎ結合は水解するがＧｌｃＮＡｃβ１→４ＭａｎとＧｌｃＮＡｃβ１→６Ｍａｎ結合は水解しないことより、図４ｃの放射活性のある糖鎖は下記式（化３１）の二本鎖複合型糖鎖構造をもつことが示された。
【００９１】
【化３１】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【００９２】
更に、コリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼはＦｕｃα１→２Ｇａｌ→結合よりフコース残基を遊離するが、Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃβ１→、還元末端のＧｌｃＮＡｃ残基のＣ−６位に結合したフコース残基をもつ二本鎖複合型糖鎖からは遊離しないこと、画分Ａ１はＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに結合しない（図２）けれども、酵素消化によってその画分から得られた図４ｃの放射活性のある糖鎖は吸着し、ラクトースを含む緩衝液で溶出すること、該ＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムには、非還元末端のＧａｌ残基を２つもつ二本鎖複合型糖鎖が吸着し、ラクトースを含む緩衝液で溶出すること、その上、画分Ａ１の糖鎖は血液型のＨ（Ｏ）構造、すなわち式（化１）の糖鎖に高い親和性があるＵＥＡ−Ｉ−アガロースカラムに吸着し、５０ｍＭ Ｌ−フコースを含む緩衝液によって溶出したこと等により、Ｆｕｃ残基は、二本鎖糖鎖の２つの非還元末端Ｇａｌ残基のうち１つのＣ−２位に結合しており、β−ガラクトシダーゼとβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの逐次分解からＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→の外側の二本鎖のうち一本を保護していると決定された。これはＣｏｎＡ−セファロースに結合した糖鎖画分のメチル化分析（表３〜表５）より、糖鎖内部の糖の誘導体として、３，４，６−トリ−Ｏ−メチルガラクチトール、３，４，６−トリ−Ｏ−メチルマンニトール、２，４−ジ−Ｏ−メチルマンニトール、３，６−ジ−Ｏ−メチル２−Ｎ−メチルアセトアミド−２−デオキシグルチトールが検出されることと合致した。これらの結果より、画分Ａ１は式（化２）に示したように血液型のＨ（Ｏ）構造、式（化１）をもつ二本鎖複合型糖鎖を含むと決定した。血液型Ｈ（Ｏ）構造が画分Ａ１中の糖鎖のＭａｎα１→３側にのみ位置しているという事実は以下のようにタチナタマメα−マンノシダーゼの特異性に基づいて確認した。すなわち、タチナタマメβ−ガラクトシダーゼとタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼによる消化により、画分Ａ１から得られた放射活性のある糖鎖（図４ｂ点線）をタチナタマメα−マンノシダーゼ消化した時、マンノースは遊離しなかった。この放射活性のある糖鎖は下記の式（化３２）、又は（化３３）の構造をもつこと、タチナタマメのα−マンノシダーゼは下記式（化３４）からＭａｎ残基を１つ遊離するが下記式（化３５）からは遊離しないことより血液型Ｈ構造は式（化２）のように二本鎖のＭａｎα１→３の側に存在することが決定された。
【００９３】
【化３２】
Ｆα１→２Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【００９４】
【化３３】
Ｆα１→２Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３（Ｍα１→６）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【００９５】
【化３４】
Ｒ１→２Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【００９６】
【化３５】
Ｍα１→６（Ｒ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【００９７】
画分Ｂ１は図３Ｂの下線で示されているが、画分Ａ１から得られた図４ｂ（点線）に相当する、放射活性をもつＢ１の酵素処理糖鎖を、タチナタマメα−マンノシダーゼで消化したとき、１つのＭａｎ残基が遊離されたことを除いて画分Ｂ１からは画分Ａ１から得られたのと同様の結果を得た。したがって、画分Ｂ１には式（化５）に示すようにＭａｎα１→６側に血液型のＨ（Ｏ）型構造をもつ二本鎖複合型糖鎖が含まれる。
また、バイセクトＧｌｃＮＡｃ残基をもたないで、Ｍａｎα１→６側に非還元末端のＧａｌβ１→残基をもつ二本鎖複合型糖鎖は、Ｍａｎα１→３側にこの構造をもつ糖鎖よりもＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムよりはやく溶出するので、画分Ａ１とＢ１がそれぞれ二本鎖のＭａｎα１→３側とＭａｎα１→６側にＨ（Ｏ）型構造をもつということはそれらのＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムの挙動とも合致する。
【００９８】
画分Ａ２は図３Ａに下線で示されているがタチナタマメβ−ガラクトシダーゼとその後のタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼによる逐次分解によって、１つのＧａｌ残基（図４ｅ実線）と、１つのＧｌｃＮＡｃ残基（図４ｅ点線）を遊離することで、より小さな糖鎖へ移行した。同じ結果がディプロコッカルの酵素を用いても得られた。また、画分Ａ２をα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼで消化した時、バイオ−ゲルＰ−４の溶出において、１つのＧａｌＮＡｃ残基の遊離に相当する約２グルコースユニット分の移動があった（図４ｆ実線）。また、コリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼでの消化によって図４ｆの実線で示された一部の糖鎖からＦｕｃ残基を遊離したことを示す、溶出パターンの移動があった（図４ｆ点線）。図４ｆの点線で示される放射活性をもつ物質の約８５％が、図４ｃ中の画分Ａ１から得られた放射活性をもつ糖鎖から得た結果と同じ結果を示した。すなわち、ディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼと、その後のディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの逐次分解で、２つのＧａｌ残基とその後２つのＧｌｃＮＡｃ残基を遊離し（図４ｇの主ピーク及び図４ｈ実線）、生成物は約９：１の割合で約８と７のグルコースユニットに相当する位置に溶出した。これらはそれぞれＦｕｃ残基のあるトリマンノシルコアの糖鎖と、ないものであり図４ｄ（点線）の糖鎖に一致した。
【００９９】
一方、図４ｆ中点線で示された放射活性をもつ物質の残り１５％からはディプロコッカルの酵素の逐次分解によって１つのＧａｌ残基とその後１つのＧｌｃＮＡｃ残基を遊離した（図４ｇの小さいピーク及び図４ｈ点線）。この生成物（図４ｈ点線）はα−ガラクトシダーゼ消化によって１つのＧａｌ残基を遊離した（図４ｉ）。図４ｉ中の放射活性のもつ生成物はコリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼ、ディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼ、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの逐次分解によって約９：１の割合でＦｕｃ残基のあるものとないものの、トリマンノシルコア構造にまで移行した（図４ｊ）。また、画物Ａ２の放射活性をもつ糖鎖はＵＥＡ−Ｉ−アガロースカラムに吸着しないけれども、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼとα−ガラクトシダーゼによる逐次分解の後では、カラムに吸着し、フコースを含む緩衝液で溶出した。
【０１００】
以上の結果と、メチル化分析（表３〜表５）より、画分Ａ２の糖鎖は、下記式（化３６）という糖鎖のフコースの付いたＧａｌ残基にそれぞれ８５％と１５％の割合でα配位結合したＧａｌＮＡｃ残基とＧａｌ残基を含み、２つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→グループのうち１つがβ−ガラクトシダーゼとβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの逐次分解を受けることが解明された。
【０１０１】
【化３６】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（Ｆα１→２Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１０２】
また、ＣｏｎＡ−セファロースに結合した糖鎖分画のメチル化分析より、４，６−ジ−Ｏ−メチルガラクチトールのみが他の糖によって２箇所置換されているＧａｌ残基の誘導体として検出されたことから画分Ａ２は式（化２４）、（化２５）の血液型のＡ型構造、Ｂ型構造をそれぞれもつ式（化３）、（化４）の二本鎖複合型糖鎖（Ａ２−１、及びＡ２−２）と決定された。
【０１０３】
画分Ｂ２は、図３Ｂの下線で示されているが、画分Ａ１とＢ１の糖鎖の解析の場合において、画分Ａ２で得られた解析結果を同様の結果が得られた。
したがって、画分Ｂ２は式（化６）、（化７）に示すように血液型Ａ型、Ｂ型構造をもつ二本鎖複合型糖鎖（Ｂ２−１、及びＢ２−２）と決定された。なお画分Ａ２、Ｂ２において、血液型構造が二本鎖のＭａｎα１→３側とＭａｎα１→６側に結合していることは、既述の場合と同様に、ＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムへの挙動により決定した。
【０１０４】
ラクトースを含む緩衝液でＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣから溶出されてきた画分Ｃは全アシアロ糖鎖の５９．９％の割合であり、図４ｃの放射活性のある糖鎖と標準物質の下記式（化３７）と同じ位置、つまり約１４．５グルコースユニットに相当する位置（図３Ｃ）にバイオ−ゲルＰ−４カラムより溶出した。
【０１０５】
【化３７】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１０６】
画分Ｃの解析からは、画分Ａ１から得られた図４ｃに示す放射活性をもつ糖鎖について先に述べた結果と同一の結果が得られた。したがってメチル化分析のデータ（表３〜表５）を合せ、画分Ｃ中の糖鎖を式（化８）のＧａｌが２つ付加した二本鎖複合型糖鎖と決定した。
【０１０７】
全アシアロ糖鎖の０．８％の割合の画分ＤはＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムを素通りし（図２）、バイオ−ゲルＰ−４カラムによって約３：２：２：１の割合で、Ｄ１からＤ４の４つのピークに分けられた（図３Ｄ）。ピークＤ１〜Ｄ４は以下のような結果から、ハイマンノース型糖鎖の式（化９）のｎ＝１：Ｍａｎ６ ＧｌｃＮＡｃ２ 、ｎ＝２：Ｍａｎ７ ＧｌｃＮＡｃ２ 、ｎ＝３：Ｍａｎ８ ＧｌｃＮＡｃ２ 、ｎ＝４：Ｍａｎ９ ＧｌｃＮＡｃ２ とそれぞれ同定した。
【０１０８】
まず、第一に、β−ガラクトシドに特異的なＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムを素通りした。第二に、バイオ−ゲルＰ−４カラムからの溶出位置（図５ｋ）は、それぞれの標準物質の位置と同じであった。第三に、Ｍａｎα１→２結合を特異的に切断するアスペルギルス サイトーイα−マンノシダーゼ消化によって消化物はすべて各４、３、２、１個のマンノース残基を遊離して、約９グルコースユニットに相当する位置で標準物質の下記式（化３８）と同一位置にバイオ−ゲルＰ−４カラムから溶出した（図５のｌ実線）。
【０１０９】
【化３８】
Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ０Ｔ
【０１１０】
第四に、更にその後、タチナタマメα−マンノシダーゼ消化を行った時、４つのマンノース残基が図５のｌの実線で示された放射活性のある物質から遊離し、消化物は、標準物質の下記式（化３９）の位置に溶出した（図５のｌ点線）。
【０１１１】
【化３９】
Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ０Ｔ
【０１１２】
更に、かたつむりβ−マンノシダーゼ、それに続くタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼによる逐次分解によって、標準物質の下記式（化４０）、次いでＮ−アセチルグリコサミニトールと同じ位置に溶出した。
【０１１３】
【化４０】
ＧＮβ１→４ＧＮ０Ｔ
【０１１４】
第五に画分ＡからＥの混合物のメチル化分析によってＭａｎ残基の誘導体として２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メチル−、３，４，６−トリ−Ｏ−メチル−、２，４−ジ−Ｏ−メチル−マンニトールを検出した（表３〜表５）。以上によりＤ１〜Ｄ４の構造を決定した。
全アシアロ糖鎖の０．８％の割合である画分ＥはＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに結合しなかったが、遅れて溶出した（図２）。この画分はバイオーゲルＰ−４カラムより、標準物質の下記の式（化４１）、（化４２）と、それぞれ同じ位置に約１：１の割合で２つの主要ピークＥ１とＥ２に分かれた（図３Ｅ）。
【０１１５】
【化４１】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（３）〔Ｍα１→３（６）〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１１６】
【化４２】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（３）〔ＧＮβ１→２Ｍα１→３（６）〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１１７】
また、放射活性のある画分Ｅ２をタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化した時、消化物は１つのＧｌｃＮＡｃ残基がはずれたことで放射活性のある画分Ｅ１と同じ溶出パターンを示した（図５ｍ点線）。図５ｍ（点線）と放射活性のある画分Ｅ１のどちらの物質もタチナタマメα−マンノシダーゼに抵抗性を示すがディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼとディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼでの逐次分解によって、１つのＧａｌ残基と、その後１つのＧｌｃＮＡｃ残基を遊離した（図５ｎ、図５のｏ）。そして約８：２の割合でＦｕｃ残基のもつトリマンノシルコア構造と、もたないものとして同定された糖鎖になった（図５のｏ）。したがって図５ｍの点線で示された画分Ｅ２の消化物は画分Ｅ１の糖鎖と同一であった。
【０１１８】
更にまた、放射活性のある画分Ｅ２を、ディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼと、その次のディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによる逐次分解を行うと、１つのＧａｌ残基と、その後に２つのＧｌｃＮＡｃ残基を遊離して、その画分は図５のｏの画分と同一の生成物になった。
【０１１９】
これらの結果とメチル化分析のデータ（表３〜表５）と、ＣｏｎＡ−セファロースカラムとＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムの糖鎖アフィニティと、画分Ａ、Ｂ中の糖鎖に対するディプロコッカルの酵素とタチナタマメα−マンノシダーゼの特異性に関する結果を合せ、画分Ｅの糖鎖を式（化１０）、及びＧａｌ残基の１つ付加した式（化１１）の複合型糖鎖と決定した。
【０１２０】
画分ＧはＥ−ＰＨＡ−アガロースカラムで遅れて溶出してきた糖鎖の主成分であり、全アシアロ糖鎖の５．２％の割合を占めＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに結合した（図２）。
この画分の主成分はバイオ−ゲルＰ−４カラムでは標準物質の下記式（化４３）が溶出する位置である約１５グルコースユニットに相当する位置に溶出した（図３Ｇ、図６ｔ）。
【０１２１】
【化４３】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）（ＧＮβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１２２】
タチナタマメβ−ガラクトシダーゼ消化によって、画分Ｇの放射活性のある画分（図６ｔ）から２つのＧａｌ残基が遊離した（図６ｕ実線）。タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化を行ったところ図６ｕ（実線）の放射活性のある糖鎖は、約９：１の割合で、Ｆｕｃ残基のあるトリマンノシルコアとＦｕｃ残基のないものの糖鎖になった（図６ｕ点線）。更にまた、放射活性のある画分Ｇ（図６ｔ）をタチタナマメ由来酵素とは基質特異性の異なるディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼとディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの混合物で消化したところ、標準物質の下記の式（化４４）、（化４５）と同じ位置にそれぞれ溶出してくる糖鎖に移行した（図６ｖ）。
【０１２３】
【化４４】
ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１２４】
【化４５】
ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ０Ｔ
【０１２５】
更に、タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化において、図６ｖの物質はＦｕｃ残基のあるトリマンノシルコア構造とＦｕｃ残基のない構造になり、ディプロコッカルの酵素の混合物は２つのＧａｌ残基と、１つのＧｌｃＮＡｃ残基を遊離していた。ディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼはＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃを水解するが、Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃや、Ｇａｌβ１→６ＧｌｃＮＡｃは水解しないこと、また、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは下記式（化４６）からただ１つのＧｌｃＮＡｃ残基を遊離して下記式（化４７）が生成すること等や、メチル化分析（表３〜表５）、レクチンカラムへの親和性等から、分画Ｇの糖鎖を式（化１３）のバイオセクトＧｌｃＮＡｃを持った二本鎖複合型糖鎖と同定した。
【０１２６】
【化４６】
ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）（ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１２７】
【化４７】
ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１２８】
アシアロ糖鎖の１．１％の割合を占める画分ＦはＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムより遅れて溶出し（図２）、バイオ−ゲルＰ−４カラムにより約１５．５グルコースユニットに相当する位置に溶出する（図３Ｆ、図５ｐ）。放射活性のある分画をディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼ消化したところ、１つのＧａｌ残基が遊離したことに相当するピークの移動があった（図５ｑ）。この消化物はディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化の影響を受けないけれど、タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化を受けた（図５ｒ）。更に、分画Ｆ（図５ｐ）をコリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼ消化を行ったところ１つのＦｕｃ残基が遊離し放射活性のある生成物は約１５グルコースユニットに相当する位置に溶出し（図５ｓ）、この段階の放射活性をもつ生成物（図５ｓ）からはバイセクトＧｌｃＮＡｃ残基をもった二本鎖を含む分画Ｇから得られた結果と同様の糖鎖解析結果を得た。
【０１２９】
したがって、バイセクトのＧｌｃＮＡｃ残基をもつ二本鎖のＧａｌ残基にα１→２結合したＦｕｃ残基はディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼとタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの逐次分解から２本のＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→のうち１本を保護していた。
更にまた、メチル化分析のデータよりＥ−ＰＨＡより遅れて溶出する画分中の糖鎖のＧａｌ残基はＣ−２位にのみ置換があること、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが下記式（化４８）のＭａｎα１→３側からＧｌｃＮＡｃ残基を遊離させることはできるが、下記式（化４９）のＭａｎα１→６側からは遊離しないこと、またＥ−ＰＨＡ−アガロースカラムとの相互作用に必要な構造からＦｕｃ残基はＭａｎα１→３側のＧａｌ残基のＣ−２位に結合しており、一方Ｍａｎα１→６側のＧａｌ残基は糖の置換が無く、分画Ｆは式（化１２）のバイセクトＧｌｃＮＡｃ残基をもちＭａｎα１→３側に、血液型のＨ（Ｏ）型構造をもつ二本鎖複合型糖鎖と決定された。
【０１３０】
【化４８】
Ｒ→ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）（ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１３１】
【化４９】
ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）（Ｒ→ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１３２】
分画Ｈはアシアロ糖鎖の０．８％の割合であり、ＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムと同様にＣｏｎＡ−セファロース、Ｅ−ＰＨＡ−アガロース、ＤＳＡ−アガロースカラムを素通りし、図３Ｈと図６ｗに示すようなバイオ−ゲルＰ−４カラムからの溶出パターンを得た。この分画はディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼ、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化に影響を受けなかった。また、図６ｗの下線で示した放射活性をもつ糖鎖は分画Ｈの主成分（約６０％）であり、コリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼ消化で、２つのＦｕｃ残基を遊離することによって、分画Ｇと同じ位置に溶出する更に小さい糖鎖になった（図６ｘ）。この段階の生成物（図６ｘ）はディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼとディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによる逐次分解に影響を受けた（図６ｙ）。図６ｘの生成物のうち、約８０％は分画Ｇから得られた結果と同じ結果を得た。
【０１３３】
更に図６ｗの下線で示した放射活性のある糖鎖をＵＥＡ−Ｉアガロースにアプライしたところ、カラムに吸着し、フコースを含む緩衝液で溶出された。したがって、２つのＦｕｃ残基は、２つのＧａｌ残基のＣ−２位に結合しており、Ｇａｌ残基を、β−ガラクトシダーゼ消化から保護していた。この結果とメチル化分析のデータ（表３〜表５）とディプロコッカルの酵素の基質特異性と、レクチンカラムの結合のアフィニティより、分画Ｈは式（化１４）の両方の鎖に血液型Ｈ（Ｏ）型構造をもち、バイセクトのＧｌｃＮＡｃ残基をもった二本鎖複合型糖鎖を含むと同定した。
【０１３４】
分画Ｉは、バイオ−ゲルＰ−４カラムによって、約１５．５グルコースユニットに相当する主要ピークと、約１４グルコースユニットに相当する小さいピークとに、約７：３の比で分けられた（図３Ｉ）。主要ピークからは酵素消化によって図５ｐに示した画分Ｆから得られたのと同様の結果が得られたけれども、画分Ｉのディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼ消化物（図５ｑに示した画分Ｆから得られた放射活性をもつ糖鎖に相当する）は画分Ｆの消化物とは違ってディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化の影響を受けた。これらの結果と、メチル化分析（表３〜表５）Ｅ−ＰＨＡ−アガロースカラムへの親和性、ディプロコッカル酵素の基質特異性より、画分Ｉの主要成分は式（化１５）のバイセクトＧｌｃＮＡｃをもった二本鎖複合型糖鎖であり、Ｍａｎα１→６側の枝のＧａｌ残基のＣ−２位に結合したＦｕｃ残基の影響により、Ｍａｎα１→３側のＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→がディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼやディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの作用を受ける。
【０１３５】
バイオ−ゲルＰ−４カラムで約１４グルコースユニットに相当する位置に溶出する（図３Ｉ）小さい方のピークからは酵素消化で分画Ｇと、ほぼ同様の結果が得られたが、このピークからはディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼやタチナタマメのβ−ガラクトシダーゼ消化によって１つのＧａｌ残基しか遊離しなかった。
したがって、小さいピーク中の糖鎖はただ１つＧａｌ残基をもった二本鎖複合型糖鎖、すなわち、式（化１６）、又は下記式（化５０）であり、Ｅ−ＰＨＡ−アガロースカラムへの親和性より、小さいピークの糖鎖は式（化１６）であると決定した。
【０１３６】
【化５０】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）（ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１３７】
画分Ｋからは図３Ｋと図６ｚ（実線）に示すようにバイオ−ゲルＰ−４カラムの溶出パターンが得られた。図６ｚ（実線）中の下線によって示された画分Ｋの主要な放射活性をもつ画分（９０％）はディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼ消化で３つ及び２つのＧａｌ残基を遊離することによってより小さな糖鎖になった（図６ａ′実線）。主ピークの溶出する位置は標準物質の下記式（化５１）の溶出位置と一致した。
【０１３８】
【化５１】
ＧＮβ１→２Ｍα１→６〔ＧＮβ１→４（ＧＮβ１→２）Ｍα１→３〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１３９】
また、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化によって、図６ａ′（実線）中の放射活性のある生成物の約７５％が、２つのＧｌｃＮＡｃ残基を遊離し、下記式（化５２）と同じ位置に溶出した（図６ｂ′実線）。
【０１４０】
【化５２】
Ｍα１→６（ＧＮβ１→４Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１４１】
更に、その後のタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化によって、図６ｂ′（実線）中、下線で示された糖鎖は約８：２の割合で、既に述べたようにＦｕｃ残基のあるものとないもののトリマンノシルコア構造と同一の糖鎖になった（図６ｃ′実線）。ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは下記の式（化５３）、（化５４）からはそれぞれ１残基と２残基のＧｌｃＮＡｃを遊離するので、ここで分析した糖鎖は式（化５４）であった。
【０１４２】
【化５３】
ＧＮβ１→６（ＧＮβ１→２）Ｍα１→６（ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１４３】
【化５４】
ＧＮβ１→２Ｍα１→６〔ＧＮβ１→４（ＧＮβ１→２）Ｍα１→３〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１４４】
これらの結果、及びメチル化分析（表３〜表５）、レクチンカラムの挙動に必要な構造より、画分Ｋの主要成分の７５％は式（化１７）の、Ｃ−２，４位に枝分かれのあるＭａｎ残基をもつ三本鎖複合型糖鎖と決定した。
更にまた、図６ｚ（実線）中下線に示された画分Ｋの主要な放射活性のある糖鎖（９０％）を、牛副こう丸α−フコシダーゼ消化した時、０、１、２残基のＦｕｃが遊離し、放射活性をもつ生成物は約１６．５グルコースユニットに相当する。標準物質の下記式（化５５）と同じ位置に単一ピークとして溶出した（図６ｚ点線）。
【０１４５】
【化５５】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６〔Ｇβ１→４ＧＮβ１→４（Ｇβ１→４ＧＮβ１→２）Ｍα１→３〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ０Ｔ
【０１４６】
更に、この生成物をディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼ、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼによって逐次分解すると、各ステップの生成物は３残基のＧａｌ、２残基のＧｌｃＮＡｃ、１残基のＧｌｃＮＡｃを遊離して標準物質の下記の式（化５６）（図６ａ′点線）、（化５７）（図６ｂ′点線）、（化５８）（図６ｃ′点線）と同じ位置に溶出した。
【０１４７】
【化５６】
ＧＮβ１→２Ｍα１→６〔ＧＮβ１→４（ＧＮβ１→２）Ｍα１→３〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ０Ｔ
【０１４８】
【化５７】
Ｍα１→６（ＧＮβ１→４Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ０Ｔ
【０１４９】
【化５８】
Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ０Ｔ
【０１５０】
図６ｚ（実線）中、下線で示された画分Ｋの主成分をＵＥＡ−Ｉ−アガロースカラムにアプライしたところ、その成分の約２５％がカラムに吸着し、フコースを含む緩衝液で溶出し、画分Ｋの主成分の約２５％が血液型のＨ（Ｏ）型構造式（化１）を有する。
【０１５１】
これらの結果をメチル化分析のデータ（表３〜表５）から、画分Ｋ中の糖鎖はＣ−２，４位に枝分かれのあるＭａｎ残基をもつ三本鎖複合型糖鎖を含むこと；鎖のＦｕｃ残基は還元末端のＧｌｃＮＡｃ残基かＧａｌ残基のＣ−２位か、その両方に結合していること；画分Ｋの主成分の糖鎖の２５％に存在しているＧａｌ残基に結合したＦｕｃ残基はディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼによる水解からＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→の３本の外側の鎖のうち１本を保護している（図６ａ′実線）ことが解明され、画分ＫのＨ（Ｏ）型構造を有する糖鎖を式（化１８）と決定した。
【０１５２】
画分Ｌは、バイオ−ゲルＰ−４カラムで、その外側の鎖の部分に３、４、５個のＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃユニットをもつ複合型糖鎖の領域に、それぞれ４６：４３：１１の割合で３つの画分Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３に分かれた（図３Ｌ、図７ｄ′）。
【０１５３】
画分Ｌ１は全アシアロ糖鎖の約５．１％の割合を占め、バイオ−ゲルＰ−４カラムよりその外側の鎖に３つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃユニットをもつ複合型糖鎖の領域に溶出した（図７ｄ′）。この画分の糖鎖からはディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼ（図７ｅ′）、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（図７ｆ′実線）、タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（図７ｆ′点線）での逐次分解によって３残基のＧａｌ、１残基のＧｌｃＮＡｃ、２残基のＧｌｃＮＡｃを遊離し、最終的には約８：２の比で、Ｆｕｃ残基の付いたトリマンノシルコア構造と付かない構造の糖鎖になった（図７ｆ′点線）。これらの結果とメチル化分析のデータ（表３〜表５）と三本鎖複合型糖鎖へのディプロコッカル酵素の基質特異性から画分Ｌ１の糖鎖を式（化１９）のＣ−２，６位が置換されたＭａｎ残基をもつ三本鎖複合型糖鎖であると決定した。
【０１５４】
画分Ｌ２は全アシアロ糖鎖のおよそ４．７％の割合であり、バイオ−ゲルＰ−４カラムよりその外側の鎖に４つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃユニットをもつ複合型糖鎖の領域に溶出された（図７ｄ′）。放射活性をもつ画分Ｌ２をタチナタマメβ−ガラクトシダーゼ消化したところ、図７ｇ′の下線で示される２つの画分Ｌ２ａとＬ２ｂがそれぞれ４残基と、２〜３残基のＧａｌ残基を遊離することによって約４４：５６の割合で生じた。画分Ｌ２ａはディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（図７ｈ′実線）と、その後のタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（図７ｈ′点線）による逐次分解で１残基のＧｌｃＮＡｃとその後３残基のＧｌｃＮＡｃを遊離した。この逐次分解で画分Ｌ２ａは標準物質の下記式（化５９）と同じ位置に溶出する糖鎖になり、その後約７：３の割合でフコース残基のついたトリマンノシル構造と付かない構造になった。
【０１５５】
【化５９】
ＧＮβ１→６（ＧＮβ１→２）Ｍα１→６（ＧＮβ１→４Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１５６】
ディプロコッカル酵素の基質特異性、メチル化分析（表３〜表５）より、及び以上の結果より該Ｌ２ａは、Ｌ２成分中の四本鎖複合型糖鎖由来であり、該Ｌ２成分中の四本鎖糖鎖Ｌ２−１の構造を式（化２０）と決定した。
【０１５７】
画分Ｌ２ｂはタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化によって図７ｉ′に示すような３つのピークとなった。図７ｉ′中下線で示された糖鎖は３残基のＧｌｃＮＡｃの遊離によるもので画分Ｌ２ｂの３分の１の割合を占めるが、タチナタマメβ−ガラクトシダーゼとその後のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼによる逐次分解によって、１残基のＧａｌと１残基のＧｌｃＮＡｃを遊離し（図７ｊ′実線と点線）、Ｆｕｃ残基がついたトリマンノシルコア構造と付かないものに約９：１の割合で消化された。したがって、図７ｉ′の下線で示された糖鎖は式（化２１）に示したような画分Ｌ２に含まれている１つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ１→３繰返し構造をもつ三本鎖複合型糖鎖Ｌ２−２由来であった。
【０１５８】
図７ｉ′中の残りの生成物はタチナタマメβ−ガラクトシダーゼとタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼにもはや影響を受けなかった。画分Ｌ２の約３０％が、ＵＥＡ−Ｉ−アガロースカラムに結合しフコースを含む緩衝液で溶出した。
【０１５９】
画分Ｌ３はアシアロ糖鎖の約１．２％の割合であって、バイオ−ゲルＰ−４カラムよりその外側の鎖に５つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃユニットをもつ複合型糖鎖の領域に溶出された（図７ｄ′）。タチナタマメβ−ガラクトシダーゼ消化によって２から４残基のＧａｌを遊離し、バイオ−ゲルＰ−４カラムによって１８〜２０グルコースユニットの間にブロードなピークとして溶出する糖鎖となった。
画分Ｌ３はディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼとディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの混合物によって消化したところ、図７ｋ′（実線）で示すように多数のピークになり、その約４７％と１３％が標準物質の下記の式（化６０）、（化６１）と同じ位置に溶出する糖鎖となった（図７ｋ′中、下線で示したＬ３ｂ、Ｌ３ａ）。
【０１６０】
【化６０】
ＧＮβ１→６（ＧＮβ１→２）Ｍα１→６（ＧＮβ１→４Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１６１】
【化６１】
ＧＮβ１→６（ＧＮβ１→２）Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１６２】
タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化によってＬ３ａとＬ３ｂより、それぞれ２残基と３残基のＧｌｃＮＡｃを遊離し、約８：２の割合でＦｕｃ残基の付いたトリマンノシルコア構造と付かないものとなった（図７ｋ′点線）。メチル化分析（表３〜表５）、ディプロコッカル酵素の基質特異性と合せ、画分Ｌ３中の２成分Ｌ３−１、Ｌ３−２をそれぞれ式（化２２）の２つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３繰返し構造をもつ三本鎖複合型糖質、式（化２３）の１つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３繰返し構造をもつ四本鎖複合型糖質と同定した。
【０１６３】
実施例２
（１）血液型別血漿成分の調製、分離
（ａ）Ａ、Ｂ、Ｏ型血液型別に採血した血液より血漿を調製し、該血漿を０．３８％クエン酸ナトリウム添加後、プロテアーゼインヒビター（４ｍＭ ＥＤＴＡ、４ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、１００ＫＩＵアプロチニン）を加え、−８０℃で保存した。次に、各血液型別血漿１μｌのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、各血漿成分を分離した。α２ −マクログロブリンは１８０ｋＤａに、ｖＷＦは２７０ｋＤａの位置に泳動、分離した。次に血漿成分を、ＰＶＤＦ膜に移し、抗Ａマウスモノクローナル抗体、抗Ｂマウスモノクローナル抗体〔オルソー社製（ＩｇＭ）、又はバイオカーブ社製Ａ００５（ＩｇＧ３ ）〕、ビオチン−ＵＥＡ−Ｉ（ホーネン社製）とそれぞれ２０℃、９０分反応させた。なお抗体、レクチンはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．４）に０．０５％のツイーン２０を含有させたＴＷ／ＴＢＳで希釈し、使用した。血漿成分との特異的結合はホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＰＰ）結合２次抗体、又はアビジンを使用し、４−クロロ−ナフトール、Ｈ２ Ｏ２ を基質とし検出した。
【０１６４】
Ａ型血液より調製、分離したα２ −マクログロブリン及びｖＷＦはそれぞれ、抗Ａ抗体、ＵＥＡ−Ｉと特異的に結合した。
Ｂ型血液より調製、分離したα２ −マクログロブリン及びｖＷＦはそれぞれ、抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉと特異的に結合した。
ＡＢ型血液より調製、分離したα２ −マクログロブリン及びｖＷＦは抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体と結合した。
Ｏ型血液より調製、分離したα２ −マクログロブリン及びｖＷＦは抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体とは結合せず、抗Ｈ（Ｏ）レクチンと結合した。
【０１６５】
（ｂ）上記（ａ）記載のＡ型血液より調製した血漿（１ｍｌ）に抗Ａモノクローナル抗体（オルソー社製、マウスＩｇＭ）０．５ｍｌ、抗α２ −マクログロブリン血清（ダコー社製、ウサギＩｇＧ）１００μｌ、抗ｖＷＦ血清（奈良医大、宮田博士より供与、ウサギＩｇＧ）１００μｌのいずれかを添加し、２４時間、４℃に保持した。免疫凝集物を遠心分離後、数回ＴＢＳで洗浄し、血漿成分の各免疫凝集物を調製した。１００μｌのＳＤＳ−緩衝液（２％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタノール、１０％グリセリン、５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ６．８）に溶解した２〜５μｌの免疫凝集物は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後ＰＶＤＦ膜に転写した。
【０１６６】
Ａ型血液より調製した血漿より抗Ａ抗体で凝集した沈殿物の１８０ｋＤａ、２７０ｋＤａの位置の泳動物はそれぞれ抗Ａ抗体と結合し、抗Ｂ抗体とは結合しなかった。なお、抗α２ −マクログロブリン血清で凝集した沈殿物の１８０ｋＤａの位置の泳動物は抗Ａ抗体と結合し、抗ｖＷＦ血清で凝集した沈殿物の２７０ｋＤａの位置の泳動物は抗Ａ抗体と結合した。また、１８０ｋＤａ、２７０ｋＤａともＵＥＡ−Ｉと結合した。
【０１６７】
このほか、上記（ａ）記載のＢ型、Ｏ型、ＡＢ型の各血液型血漿より抗ｖＷＦ抗体で免疫凝集し、各ｖＷＦ凝集物を調製した。次に、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写し、各ｖＷＦの抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉとの結合性を測定した。
【０１６８】
Ｂ型血液の血漿より分離、調製したｖＷＦは抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉと結合し、ＡＢ型血液の血漿より分離、調製したｖＷＦは抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉと結合し、Ｏ型血液の血漿より分離、調製したｖＷＦは抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体とは結合せず、ＵＥＡ−Ｉと結合した。
【０１６９】
同様に、各血液型の血漿より抗α２ −マクログロブリン抗体を用い調製したα２ −マクログロブリンは、抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉに対し、上記と同様の結果を示した。
【０１７０】
なお、前記のＡ型血液の血漿より抗α２ −マクログロブリン抗体で調製した、免疫凝集物５μｌ、精製ｖＷＦ１０μｇをそれぞれ１００ｍＵのエンドグリコシダーゼＦ（ベーリンガー マンハイム社製）を含む５０μｌの溶液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、４０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ｎ−オクチルグルコシド、２％２−メルカプトエタノール、０．１％ＳＤＳ、０．２５％窒化ナトリウム）中で１０時間、３７℃で反応させ、等量のＳＤＳ−緩衝液を添加後、１００℃、５分間熱処理を行い、反応を停止した場合、各エンドグリコシダーゼＦ処理されたα２ −マクログロブリン、ｖＷＦはＡＢＨ（Ｏ）血液型抗原性を消失した。
【０１７１】
（ｃ）血液型Ａ型、Ｂ型、Ｏ型、ＡＢ型の健常人、各１０名より採血し、血液型別の血漿を調製した。
次に、２０μｇ／ｍｌの抗ｖＷＦ抗体〔ＭＢＬ社製、ヤギＩｇＧ：５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）〕でＥＬＩＳＡプレート（ベクトン アンド ディクソン社製）を２４時間、４℃処理し、プレートを抗ｖＷＦ抗体でプレコートし、次いで１％ＢＳＡを含むＴＢＳでブロッキングした。次いで上記の血液型別血漿の段階希釈物を、９０分、該プレートと、室温で反応させた。次にプレートをＴＷ／ＴＢＳで洗浄後、抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体（オルソー社製、ＴＷ／ＴＢＳで１／２０に希釈）、ビオチン−ＵＥＡ−Ｉ（５μｇ／ｍｌ）とそれぞれ４５分、反応させた。抗体、レクチンとの結合性はオルトフェニレンジアミン塩酸塩、Ｈ２ Ｏ２ を基質とし、ＨＲＰ結合の二次抗体、又はアビジンなどを用い測定した。ＨＲＰの反応は、暗所で３０分行い、硫酸で反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１７２】
結果を図８に示す。Ａ型血液より分離、調製したｖＷＦは抗Ａ抗体、ＵＥＡ−Ｉと結合し、Ｂ型血液より分離、調製したｖＷＦは抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉと結合し、ＡＢ型血液より分離、調製したｖＷＦは抗Ａ、抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉと結合し、Ｏ型血液より分離、調製したｖＷＦはＵＥＡ−Ｉと結合した。なお図中、横軸は希釈前の血漿濃度を１とした時の、血漿希釈濃度、縦軸は４９０ｎｍの吸光度、黒丸印は抗Ａ抗体の結合、白丸印は抗Ｂ抗体の結合、黒三角印はＵＥＡ−Ｉの結合をそれぞれ示す。
【０１７３】
（ｄ）α２ −マクログロブリン（シグマ社）、実施例１−（１）の精製ｖＷＦをそれぞれＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写した。上記α２ −マクログロブリンは各血液型の混合血漿由来であり、抗Ａ抗体、ＵＥＡ−Ｉと結合性を示した。また、抗Ｂ抗体とも弱い結合性を示した。また、ｖＷＦも同様な結果を示した。このα２ −マクログロブリンを抗Ａ抗体結合カラム、抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体結合カラム、抗Ｂ抗体結合カラムでそれぞれ処理し、抗Ｂ糖鎖抗原、抗Ａ及び抗Ｂ糖鎖抗原、抗Ａ糖鎖抗原がそれぞれ除去されたα２ −マクログロブリンを調製した。また同様に該精製ｖＷＦも処理し、各糖鎖抗原別のｖＷＦを調製した。
【０１７４】
（ｅ）各ＡＢＯ型血液より調製した血漿の混合物を抗Ａ抗体結合カラムに通し、Ａ型糖鎖抗原の除去された血漿を調製した。また、該混合物を抗Ｂ抗体結合カラムに通し、Ｂ型糖鎖抗原の除去された血漿を調製した。更にまた、同混合物を抗Ａ、抗Ｂ抗体結合カラムに通し、Ａ型、Ｂ型糖鎖抗原の除去された血漿を調製した。また、抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体を用いる凝集法により、生じる免疫複合体を除去し、各血漿を調製した。
【０１７５】
【発明の効果】
本発明により、ＡＢＨ（Ｏ）型糖鎖抗原の特定された血漿由来製剤が提供される。本製剤は長期間、反復使用した場合においても、血液凝固に起因する副作用が生ずることなく、血友病、ｖＷ病等の治療、血漿由来成分の輸血等において安全な製剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｖＷＦのＮ結合糖鎖の電気泳動を示す図である。
【図２】アシアロ糖鎖のレクチンカラム処理工程を示す図である。
【図３】レクチンカラム処理糖鎖のバイオ−ゲルＰ−４溶出パターンを示す図である。
【図４】酵素処理前後の糖鎖のバイオ−ゲルＰ−４溶出パターンを示す図である。
【図５】酵素処理前後の糖鎖のバイオ−ゲルＰ−４溶出パターンを示す図である。
【図６】酵素処理前後の糖鎖のバイオ−ゲルＰ−４溶出パターンを示す図である。
【図７】酵素処理前後の糖鎖のバイオ−ゲルＰ−４溶出パターンを示す図である。
【図８】血液型別血漿由来のｖＷＦの抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉとの結合性を示す図である。
【産業上の利用分野】
本発明は糖鎖抗原の特定された血漿成分を含有する血漿由来製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
通常輸血に際し、ＡＢＯ式血液型の判定は必須であり、その不適合は輸血そのものに危険をもたらし、臨床症状としては軽度のアレルギー反応から、ショック、腎不全、播種性血管内凝固など重篤な症状を呈することもまれではない。
ＡＢＯ式血液型は赤血球の表面にあるＡＢＨ（Ｏ）糖鎖抗原の違いによって決定される。
一方、血漿成分採取装置の開発に伴い、血漿成分は、成分輸血や、血友病や感染症の治療薬の原料として使用されるようになってきた。遺伝的血液病である血友病は血液凝固因子のうち、先天的に第ＶＩＩＩ因子、又は第ＩＸ因子活性が低下しているため出血性素因をもたらす伴性劣性遺伝疾患であり、第ＶＩＩＩ因子欠乏による血友病Ａの場合は第ＶＩＩＩ因子濃縮製剤の、第ＩＸ因子欠乏による血友病Ｂの場合にはプロトロンビン複合製剤の補充療法が行われている。また、皮膚、粘膜出血を特徴とし、出血時間の延長と第ＶＩＩＩ因子活性の低下を示す男女両性に出現する常染色体優性の遺伝的出血症であるフォンビルブランド（ｖＷ）病の場合は、血漿中のフォンビルブランド因子（ｖＷＦ）の量的あるいは質的異常のため、血小板による一次止血が障害され、その治療として、新鮮血漿の補充療法が行われている。
このｖＷＦは、血小板の内皮下組織粘着に大きな役割を果すことで知られている血漿糖タンパク質で、血液凝固第ＶＩＩＩ因子のキャリアーである〔チタニ（ Ｔｉｔａｎｉ ） ら、トレンズ イン バイオケミカル サイエンシーズ（Ｔ．Ｉ．Ｂ．Ｓ．）、第１３巻、第９４〜９７頁（１９８８）、ギルマ（ Ｇｉｒｍａ ）ら、ブラッド（ Ｂｌｏｏｄ ）、第７０巻、第６０５〜６１１頁（１９８７）〕。またｖＷＦは、分子量０．５〜２０×１０６ Ｄａのマルチマーとして循環し、２７０ｋＤａのサブユニットから成る〔前出Ｔ．Ｉ．Ｂ．Ｓ．、チョペック（ Ｃｈｏｐｅｋ ） ら、バイオケミストリー（ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ） 、第２５巻、第３１４６〜３１５５頁（１９８６）〕。成熟サブユニットの完全なアミノ酸配列は明らかにされ〔チタニら、バイオケミストリー、第２５巻、第３１７１〜３１８４頁（１９８６）〕、また糖タンパク質の限定タンパク分解によって得た断片や、各ドメインに特異的な抗体を使用して、ヘパリン〔フジムラ（ Ｆｕｊｉｍｕｒａ ） ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２６２巻、第１７３４〜１７３９頁（１９８７）〕、血小板膜糖タンパク質〔プロウ（ Ｐｌｏｗ ） ら、プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザＵＳＡ（ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８２巻、第８０５７〜８０６１頁（１９８５）、アンドリュース（ Ａｎｄｒｅｗｓ ）ら、バイオケミストリー、第２８巻、第８３２６〜８３３６頁（１９８９）〕、コラーゲン〔タカギ（ Ｔａｋａｇｉ ） ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６４巻、第６０１７〜６０２０頁（１９８９）〕、血液凝固第ＶＩＩＩ因子〔ホスター（ Ｆｏｓｔｅｒ ） ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６２巻、第８４４３〜８４４６頁（１９８７）〕等への結合ドメインがそれぞれ同定されている。
【０００３】
本発明者らは先にｖＷＦは、サブユニット当り１２個のＮ結合オリゴ糖鎖と１０個のＯ結合オリゴ糖鎖を有し、これは全重量の約１５％に相当することを報告した〔前出バイオケミストリー、第２５巻、第３１７１〜３１８４頁（１９８６）〕。ｖＷＦの糖鎖部分の機能的役割はいまだ未解明であるが、タンパク質分解酵素に対する耐性〔フェデリシ（ Ｆｅｄｅｒｉｃｉ ） ら、ジャーナル オブ クリニカル インベスチゲーション（ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、第７４巻、第２０４９〜２０５５頁（１９８４）〕、マルチマー化〔ワグナー（ Ｗａｇｎｅｒ ） ら、ジャーナル オブ セル バイオロジー（ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、第１０２巻、第１３２０〜１３２４頁（１９８６）〕、血小板〔ソデツ（ Ｓｏｄｅｔｚ ） ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２５３巻、第７２０２〜７２０６頁（１９７８）、ゴウデマンド（ Ｇｏｕｄｅｍａｎｄ ）ら、スロンボシス ヘモスタス（ Ｔｈｒｏｍｂｏｓ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ）、第５３巻、第３９０〜３９５頁（１９８５）、フェデリシら、ブラッド、第７１巻、第９４７〜９５２頁（１９８８）〕、あるいはコラーゲン〔ケスラー（ Ｋｅｓｓｌｅｒ） ら、スロンボシス リサーチ（ Ｔｈｒｏｍｂｏｓ．Ｒｅｓ． ）、第５７巻、第５９〜７６頁（１９９０）〕との相互作用に関与すると示唆されている。またアシアロｖＷＦがリストセチンのような補助因子の存在しないところで血小板凝集を誘因するところから、ｖＷＦの糖鎖部分は、糖タンパク質のコンホメーションに影響すると考えられる〔デ マルコ（ Ｄｅ Ｍａｒｏ ）ら、ジャーナル オブ クリニカル インベスチゲーション、第６８巻、第３２１〜３２８頁（１９８１）〕。更にある種のｖＷ病において、活性の無い糖鎖欠損ｖＷＦが報告されている〔グラルニク（ Ｇｒａｌｎｉｃｋ ） ら、サイエンス（ Ｓｃｉｅｎｃｅ ）、第１９２巻、第５６〜５９頁（１９７６）〕。
【０００４】
ｖＷＦの糖鎖構造の詳細については明らかでは無く、今までのところ、その９０％がｖＷＦである、ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子／ｖＷＦ複合体において、二本鎖及び四本鎖複合型Ｎ結合糖鎖が２種、Ｏ結合糖鎖が一種決定されているのみである〔デベイレ（ Ｄｅｂｅｉｒｅ ）ら、フェブス レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ） 、第１５１巻、第２２〜２６頁（１９８３）、サモル（ Ｓａｍｏｒ ）ら、ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー（ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ） 、第１５８巻、第２９５〜２９８頁（１９８６）、サモルら、グリココンジュゲート ジャーナル（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ． ） 、第６巻、第２６３〜２７０頁（１９８９）〕。本発明者らは、先に西洋ワサビのパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合レクチンを使用した一連の研究で、表１に示す様に、市販の第ＶＩＩＩ因子濃縮物より、精製したｖＷＦが、ハリエニシダ（ Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ ） アグルチニンＩ（ＵＥＡ−Ｉ）と結合活性を有することを見出した〔マツイ（ Ｍａｔｓｕｉ ） ら、バイオケミカル
アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ（ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． ）、第１７８巻、第１２５３〜１２５９頁（１９９１）〕。
【０００５】
【表１】
なお、ＣｏｎＡはコンカナバリンＡ、ＷＧＡは麦芽（ Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ） 凝集素、ＲＣＡ１２０ はトウゴマ（ Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ ） 凝集素、ＰＮＡはピーナッツ凝集素を示し、表１中ではＨＲＰ結合物を意味する。
【０００７】
約１０μｇの各糖タンパク質、約３μｇのｖＷＦを各ＨＲＰ−レクチンのドットブロットアッセイに使用し、＋はＨＲＰ−レクチン結合性有、−は結合性無を示す。ＵＥＡ−Ｉは血液型Ｈ（Ｏ）型構造のオリゴ糖に強い親和性を示すことが知られており、ｖＷＦは下記式（化１）の糖鎖を有することが示唆される。
【０００８】
【化１】
Ｆα１ → ２Ｇβ１ → ４ＧＮβ１ →
【０００９】
（なお以下の各化学式中Ｆはフコース、Ｇはガラクトース、ＧＮはＮ−アセチルグルコサミンを示す）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らが明らかとした血漿成分中の血液型Ｈ（Ｏ）型糖鎖抗原の存在の可能性は、血漿成分の臨床使用上、重要な問題を提起するものであり、そのため、該抗原の構造を特定する必要がある。
本発明の目的は上記現状にかんがみ、血漿成分の血液型糖鎖抗原を特定し、臨床使用上、安全な、管理された血漿成分を含有する血漿由来製剤を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は精製されたフォンビルブランド因子を有効成分として使用する血漿由来製剤に関し、血漿由来製剤において、ａ）Ａ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原、ｂ）Ｂ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原、ｃ）Ａ型糖鎖抗原、Ｂ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原、ｄ）Ｈ（Ｏ）型抗原より成る群より選択される糖鎖抗原を実質上一種含有する精製されたフォンビルブランド因子を有効成分として使用することを特徴とする。また、本発明の第２の発明も血漿由来製剤に関し、精製されたフォンビルブランド因子を有効成分として使用する血漿由来製剤において、血漿中のＡ型糖鎖抗原及びＢ型糖鎖抗原を除去した血漿成分より調製されてなることを特徴とする。
【００１２】
血漿成分、例えばｖＷＦは、市販の第ＶＩＩＩ因子濃縮物より、前出バイオケミストリー、第２５巻、第３１４６〜３１５５頁（１９８６）記載の方法により、セファロース（ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ）ＣＬ−４Ｂ、ゼラチン−セファロース（ ｇｅｌａｔｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ）、アグマチン−セファロース（ ａｇｍａｔｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ） 、高濃度Ｃａ＋＋下でのセファロースＣＬ−４Ｂ等を用い高度に精製することができる。次に該精製物のヒドラジン分解を行い、ｖＷＦのＮ結合糖鎖をポリペプチド部分から定量的に分離することができる。分離した糖鎖のＮ−アセチル化後、例えばＮａＢ３ Ｈ４ を用い、該糖鎖の標識化を行う。標識化Ｎ結合糖鎖のｐＨ５．４での高圧ろ紙電気泳動により、図１に示す様にｖＷＦのＮ結合糖鎖は中性分画（Ｎ）、２酸性成分（Ａ−１及びＡ−２）に分離される。なお図１はｖＷＦのＮ結合糖鎖の電気泳動図であり、横軸は泳動距離、縦軸は放射活性を示す。Ｎ、Ａ−１、Ａ−２の量比は１４：５６：３０であり、Ａ−１は１シアル酸、Ａ−２は２シアル酸を含有する。
【００１３】
Ｎ結合糖鎖構造は、例えば次の様にして決定することができる。すなわち、Ｎ結合糖鎖標識物をシアリダーゼ処理し、アシアロ糖鎖を調製し、次いで該調製物をレクチン結合カラム、例えばＣｏｎＡカラム、インゲン豆（ Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ） のエリスロフィトヘマグルチニン（Ｅ−ＰＨＡ）カラム、ヨウシュチョウセンアサガオ（ Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ ）凝集素（ＤＳＡ）カラム、ＲＣＡ１２０ カラム、ＵＥＡ−Ｉカラム等で処理することにより、糖鎖構造に応じ、図２に示すＡ〜Ｌの成分に分画することができる。すなわち、図２はアシアロ糖鎖より各種レクチンカラムを用いて、Ｎ結合糖鎖を分別した経過を示す図であり、図中α−ｍＧはα−メチルグルコシド、α−ｍＭはα−メチルマンノシド、Ｌａｃはラクトース、ＧＮ２ はジ−Ｎ−アセチルキトビオースを示す。Ａ〜Ｌのモル比は２．８：６．９：５９．９：０．８：０．８：１．１：５．２：０．８：１．５：２．９：６．３：１１．０であり、Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｌについてはバイオ−ゲルＰ−４カラムにより、それぞれＡ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｄ１〜Ｄ４、Ｅ１、Ｅ２、Ｌ１〜Ｌ３に分別される。
【００１４】
図３はアシアロ糖鎖及びＡ〜Ｌのバイオ−ゲルＰ−４カラムによる溶出パターンであり、縦軸は放射活性、横軸は溶出時間を示し、図中の矢印はグルコースオリゴマーの溶出位置を示す。
【００１５】
次に、各種のエキソグリコシダーゼ、例えばα−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、α１→２−Ｌ−フコシダーゼ等による分画されたＮ結合糖鎖の逐次分解分析、及び各フラクションのメチル化分析により各Ｎ結合糖鎖の構造が決定される。
【００１６】
下記式（化２）にＡ１の構造を示す。Ａ１のモル比％は全体の２．２％であり、Ｈ（Ｏ）型構造を有する。なお以下の各化学式中Ｍはマンノース、ＧＮＯＴはＮ−〔 ３Ｈ〕アセチルグルコサミニトール、±は残基が糖鎖中の７０％以上に存在することを示す。
【００１７】
【化２】
下記の式（化３）、（化４）にＡ２中の２成分、Ａ２−１、Ａ２−２の構造を示す。（化３）はＡ２−１の構造であり、Ａ２−１のモル比％は全体の０．５％であり、Ａ型構造を有する。なお以下の各化学式中ＧａＮはＮ−アセチルガラクトサミンを示す。
【００１９】
【化３】
下記式（化４）はＡ２−２の構造であり、Ａ２−２のモル比％は全体の０．１％であり、Ｂ型構造を有する。
【００２１】
【化４】
下記式（化５）にＢ１の構造を示す。Ｂ１のモル比％は全体の５．５％であり、Ｈ（Ｏ）型構造を有する。
【００２３】
【化５】
下記の式（化６）、（化７）にＢ２中の２成分、Ｂ２−１、Ｂ２−２の構造を示す。
（化６）はＢ２−１の構造であり、Ｂ２−１のモル比％は全体の１．２％であり、Ａ型構造を有する。
【００２５】
【化６】
下記式（化７）はＢ２−２の構造であり、Ｂ２−２のモル比％は全体の０．２％であり、Ｂ型構造を有する。
【００２７】
【化７】
下記式（化８）にＣの構造を示す。Ｃのモル比％は全体の５９．９％であり、前出フェブス レターズ、第１５１巻、第２２〜２６頁（１９８３）に報告の構造と一致する。
【００２９】
【化８】
下記式（化９）にＤ１〜Ｄ４の一般構造式を示す。Ｄ１はｎ＝１で、モル比％は全体の０．３％であり、Ｄ２はｎ＝２で、モル比％は全体の０．２％であり、Ｄ３はｎ＝３で、モル比％は全体の０．２％であり、Ｄ４はｎ＝４で、モル比％は全体の０．１％である。
【００３１】
【化９】
下記式（化１０）にＥ１の構造を示す。Ｅ１のモル比％は全体の０．４％である。
【００３３】
【化１０】
下記式（化１１）にＥ２の構造を示す。Ｅ２のモル比％は全体の０．４％である。
【００３５】
【化１１】
下記式（化１２）にＦの構造を示す。Ｆのモル比％は全体の１．１％であり、Ｈ（Ｏ）型の構造を有する。
【００３７】
【化１２】
下記式（化１３）にＧの構造を示す。Ｇのモル比％は全体の５．２％である。
【００３９】
【化１３】
下記式（化１４）にＨの構造を示す。Ｈのモル比％は全体の０．４％であり、Ｈ（Ｏ）型の構造を有する。
【００４１】
【化１４】
下記の式（化１５）、（化１６）にＩ中の２成分、Ｉ１、Ｉ２の構造を示す。Ｉ１のモル比％は全体の１．１％であり、Ｈ（Ｏ）型の構造を有する。Ｉ２のモル比％は全体の０．４％である。
【００４３】
【化１５】
【化１６】
下記の式（化１７）、（化１８）にＫ中の２成分、Ｋ１、Ｋ２の構造を示す。Ｋ１のモル比％は全体の４．３％である。Ｋ２のモル比％は全体の１．４％であり、Ｈ（Ｏ）型の構造を有する。
【００４６】
【化１７】
【化１８】
下記式（化１９）にＬ１の構造を示す。Ｌ１のモル比％は全体の５．１％である。
【００４９】
【化１９】
下記の式（化２０）、（化２１）にＬ２中の２成分Ｌ２−１、Ｌ２−２の構造を示す。Ｌ２−１のモル比％は全体の２．１％であり、前出ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー、第１５８巻、第２９５〜２９８頁（１９８６）に報告の構造と一致する。Ｌ２−２のモル比％は全体の０．９％である。
【００５１】
【化２０】
【化２１】
下記の式（化２２）、（化２３）にＬ３中の２成分Ｌ３−１、Ｌ３−２の構造を示す。Ｌ３−１のモル比％は全体の０．６％であり、Ｌ３−２のモル比％は全体の０．２％である。
【００５４】
【化２２】
【化２３】
以上、市販の血漿製剤より精製されたｖＷＦのアシアロＮ結合糖鎖の構造が決定される。これらのうち（化１）のＨ（Ｏ）型糖鎖構造を有するＮ結合糖鎖のモル比％は全体の１１．７％であり、本発明者らが先に見出していたＵＥＡ−ＩのｖＷＦへの結合は、これらの糖鎖構造によるものである。また下記の式（化２４）、（化２５）のＡ型、Ｂ型糖鎖構造を有するＮ結合糖鎖が血漿糖タンパク質の糖鎖として初めて見出され、（化２４）のＡ型糖鎖構造を有するＮ結合糖鎖のモモ比は全体の１．７％、（化２５）のＢ型糖鎖構造を有するＮ結合糖鎖のモル比は全体の０．３％である。
【００５７】
【化２４】
【化２５】
また、この精製ｖＷＦをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写した場合、該ｖＷＦは抗Ａ血清、抗Ｂ血清、抗ＨレクチンのＵＥＡ−Ｉと、それぞれ反応性を示す。なお、該ＰＶＤＦ膜を有機溶媒で脱脂処理しても反応性は消失しないが、前もってエンドグリコシダーゼＦで処理したｖＷＦが転写されている場合、該ｖＷＦは反応性を失っていた。
【００６０】
Ａ、Ｂ、Ｏ、ＡＢ型ドナー由来血漿に抗ｖＷＦ抗体を加え、ｖＷＦを免疫沈降させ、該ｖＷＦをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写した場合の、各ドナー由来ｖＷＦの抗Ａモノクローナル抗体、抗Ｂモノクローナル抗体、抗ＨレクチンのＵＥＡ−Ｉとの反応性を表２に示す。
【００６１】
【表２】
表 ２
───────────────────────────────────
血漿ドナー 抗Ａモノクローナル 抗Ｂモノクローナル ＵＥＡ−Ｉ
血液型 抗体 抗体
───────────────────────────────────
Ａ ＋ − ＋
Ｂ − ＋ ＋
Ｏ − − ＋
ＡＢ ＋ ＋ ＋
───────────────────────────────────
【００６２】
（表中＋は反応性有、−は反応性無を示す）
Ａ型ドナーの血漿からは、Ａ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原を有するｖＷＦ、Ｂ型ドナーの血漿からは、Ｂ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原を有するｖＷＦ、Ｏ型ドナーの血漿からは、Ｈ（Ｏ）型糖鎖抗原を有するｖＷＦ、ＡＢ型ドナーの血漿からはＡ型糖鎖抗原、Ｂ型糖鎖抗原、Ｈ（Ｏ）型糖鎖抗原を有するｖＷＦが得られる。
【００６３】
以上、本発明により、糖鎖抗原の特定された、血漿由来製剤が提供される。該血漿由来製剤中には、糖鎖抗原の特定された血漿成分、例えばｖＷＦ、α２ −マクログロブリン等の血漿糖タンパク質が少なくとも１種含有されている。ＡＢＨ（Ｏ）糖鎖抗原の特定された血漿成分は、例えば各血液型ドナー由来血漿の混合物、該混合物より調製された血漿製剤等より、例えば抗Ａ、抗Ｂ抗体固定カラム、レクチン固定カラム等を用いて調製することができる。また、各血液型ドナー血漿別に適宜、調製してもよい。調製された糖鎖抗原の特定された血漿成分は、必要に応じて、賦形剤や担体と共に、常法により製剤化し、使用することができる。
【００６４】
以上、詳細に説明したように、本発明により、血液型に留意した血漿由来製剤が提供される。該製剤は血液凝固因子が血液型別に管理されており、長期間、反復使用時においても副作用の危険がなく安全な、また、輸血時の半減期の問題も改善された血漿由来製剤が提供される。
【００６５】
【実施例】
以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
【００６６】
実施例１
（１）精製ｖＷＦよりのＮ結合糖鎖の調製及び放射標識化
市販の第ＶＩＩＩ因子濃縮物（ハイランドセラピューティクス製）より、前出バイオケミストリー、第２５巻、第３１４６〜３１５５頁（１９８６）に記載の方法に準じ、ヒトｖＷＦを精製した。
次に該ｖＷＦ３７．９ｍｇを無水ヒドラジン１ｍｌに懸濁し、９時間のヒドラジン分解を行った後、Ｎ−アセチル化を行い、定量的にＮ結合糖鎖を遊離した。次に該糖鎖の１／６量を、０．０５Ｎ ＮａＯＨ ０．８ｍｌ中で、３０℃、４時間、ＮａＢ３ Ｈ４ （１６０ＭＢｑ）で還元し、糖鎖のトリチウム標識を行い、その後ＮａＢＨ４ を６ｍｇ溶解した０．０５Ｎ ＮａＯＨ ０．３ｍｌを加えて、反応を更に２時間続けて、反応を終了した。
結合した放射活性は９．８×１０６ ｃｐｍであった。また残りの５／６量の糖鎖は０．０５Ｎ ＮａＯＨ １．５ｍｌ中、３０℃、４時間、ＮａＢ２ Ｈ４ ３０ｍｇで還元し、メチル化分析用の ２Ｈ標識物を調製した。
【００６７】
（２）アシアロ糖鎖の調製及びレクチンカラムによる分画
標識化糖鎖のｐＨ５．４での高圧ろ紙電気泳動図を図１に示す。Ｎは中性画分、Ａ−１は１シアル酸結合物、Ａ−２は２シアル酸結合物であり、図中、矢印１、２、３は標準物質、ラクチトール、シアリルラクチトール、ブロモフェノールブルーのそれぞれの泳動位置を示す。なお図１において、横軸は泳動距離（ｃｍ）、縦軸は放射活性を示す。
次にレクチンカラム分画に供するため、糖鎖のシアリダーゼ〔アルスロバクター ウレアファシエンス（ Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ ） 由来：ナカライテスク社製〕処理を行い、アシアロ糖鎖を調製した。なお酵素反応は０．１５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中、３７℃、２０時間行った。
【００６８】
レクチン アフィニティ クロマトグラフィーは以下のように行った。ＣｏｎＡ−セファロースカラム（ファルマシア社製）（０．７×１３ｃｍ）は３０ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．４を用い、流速１２ｍｌ／ｈｒで平衡化を行い、２５℃中保持した。糖鎖の試料は緩衝液１５ｍｌで洗浄したカラムへアプライした。その後、溶出液を１０ｍＭα−メチルグルコシドを含む緩衝液１５ｍｌとした後、１００ｍＭα−メチルマンノシドを含む緩衝液１５ｍｌで溶出した。Ｅ−ＰＨＡ−アガロースカラム（Ｅ−Ｙラボラトリーズ社製）（０．７×１５ｃｍ）は０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２（ＰＢＳ）を用いて流速１２ｍｌ／ｈｒで平衡化を行い、２５℃中保持した。糖鎖試料をアプライした後、ＰＢＳ３０ｍｌで溶出した。ＤＳＡ−アガロースカラム（Ｅ−Ｙラボラトリーズ社製）（０．７×１８ｃｍ）は３０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．４を用いて、流速６ｍｌ／ｈｒで平衡化し、４℃中保持した。糖鎖試料をアプライした後、緩衝液２０ｍｌで溶出を行い、ジ−Ｎ−アセチルキトビオースを含む（２ｍｇ／ｍｌ）緩衝液５ｍｌで溶出した。ＵＥＡ−Ｉ−アガロース（Ｅ−Ｙラボラトリーズ社製）カラム（０．５×１０ｃｍ）は流速６ｍｌ／ｈｒでＰＢＳによって平衡化し、４℃中保持した。糖鎖試料をアプライした後溶出は６ｍｌのＰＢＳで行った後、５０ｍＭ Ｌ−フコシダーゼを含むＰＢＳ５ｍｌで行った。レクチン（ＲＣＡ１２０）アフィニティカラム（ホーネン社製）ＨＰＬＣは、アーカイブズ オブ バイオケミストリー アンド バイオフィジクス（ Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． ）第２５７巻、第３８７〜３９４頁（１９８７）に報告の本発明者らの方法で行った。
【００６９】
ヒトｖＷＦより得られた全アシアロ糖鎖の約７１％が、ＣｏｎＡ−セファロースカラムに吸着した。このうち約９８％が１０ｍＭα−メチルグルコシドを含む緩衝液で溶出し約２％が１００ｍＭα−メチルマンノシドを含む緩衝液で溶出した。
これらはレクチン（ＲＣＡ１２０）アフィニティＨＰＬＣによって３つ（Ａ、Ｂ、Ｃ）と２つ（Ｄ、Ｅ）の画分に分けられた（図２）。更に画分Ａはバイオ−ゲルＰ−４カラムによってＡ１、Ａ２、画分Ｂはバイオ−ゲルＰ−４カラムによってＢ１、Ｂ２に分けられた（図３）。
ラクトースを含む緩衝液でＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣから溶出されてきた画分Ｃは全アシアロ糖鎖の５９．９％の割合であった（図２）。
全アシアロ糖鎖の０．８％の割合の画分ＤはＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムを素通りし（図２）、更にバイオ−ゲルＰ−４カラムによって約３：２：２：１の割合でＤ１〜Ｄ４のピークに分けられた（図３）。
全アシアロ糖鎖の０．８％の割合である画分ＥはＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに結合しなかったが、遅れて溶出した（図２）。この画分は更にバイオ−ゲルＰ−４カラムによりＥ１とＥ２に分けられた（図３）。
ＣｏｎＡ−セファロースカラムを素通りするアシアロ糖鎖の約６．３％はＥ−ＰＨＡ−アガロースカラムから溶出が遅れ（図２）たが、このカラムはＲ１ 、Ｒ２ がＨか糖であるような下記式（化２６）に示す糖鎖にアフィニティーがあり、溶出が遅れた糖鎖は次のＤＳＡ−アガロースカラムに吸着しなかったけれど、その次のＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣによって約１７：８３の割合で２つの画分ＦとＧに分けられた（図２）。
【００７０】
【化２６】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）〔Ｒ１ →４（Ｒ２ →４ＧＮβ１→２）Ｍα１→３〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→
【００７１】
また、アシアロ糖鎖の１．１％を占める分画Ｆは、バイオ−ゲルＰ−４カラムにより約１５．５グルコースユニットに相当する位置に溶出した（図３）。
画分ＧはＥ−ＰＨＡ−アガロースカラムで遅れて溶出してきた糖鎖の主成分であり、アシアロ糖鎖の５．２％の割合を占め、ＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに結合した。この画分はラクトースを含む緩衝液で溶出した（図２）。
分画Ｈはアシアロ糖鎖の０．８％の割合であり、ＣｏｎＡ−セファロース、Ｅ−ＰＨＡ−アガロース、ＤＳＡ−アガロースを素通りし、更にＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムも同様に素通りした（図２）。
アシアロ糖鎖の１．５％の割合を占めＣｏｎＡ−セファロース、Ｅ−ＰＨＡ−アガロース、ＤＳＡ−アガロースカラムを素通りする分画ＩはＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムから遅れて溶出された（図２）。
アシアロ糖鎖の２．９％の割合を占めＣｏｎＡ−セファロース、Ｅ−ＰＨＡ−アガロース、ＤＳＡ−アガロースカラムを素通りした分画ＪはＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに結合しラクトースを含む緩衝液で溶出した（図２）。
アシアロ糖鎖の６．３％の割合の画分ＫはＣｏｎＡ−セファロースとＥ−ＰＨＡ−アガロースを素通りし、ＤＳＡ−アガロースカラムからは遅れて溶出されたがＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムには吸着してラクトースを含む緩衝液で溶出された（図２）。この画分のＤＳＡ−アガロースカラムへのアフィニティによって、画分Ｋの糖鎖には下記式（化２７）の構造が含まれる。
【００７２】
【化２７】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→４（Ｇβ１→４ＧＮβ１→２）Ｍ
【００７３】
アシアロ糖鎖の１７％の割合を占め、ＣｏｎＡ−セファロースとＥ−ＰＨＡ−アガロースカラムを素通りする画分ＬはＤＳＡ−アガロースカラムとＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに吸着しそれぞれジ−Ｎ−アセチルキトビオース、ラクトースを含む緩衝液で溶出した（図２）。この画分はバイオ−ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）Ｐ−４カラムで、その外側の鎖の部分に３、４、５つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃユニットをもつ、複合型糖鎖の領域に、それぞれ４６：４３：１１の割合で３つの画分Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３に分かれた（図３）。
【００７４】
（３）メチル化分析及びグリコシダーゼ処理
Ｎ結合糖鎖、Ａ１〜Ｅ２のＣｏｎＡ吸着分画（分画１）、Ｆ、ＧのＥ−ＰＨＡ吸着分画（分画２）、Ｈ〜Ｌ３のＣｏｎＡ、Ｅ−ＰＨＡ非吸着分画（分画３）のメチル化分析を行った。結果を表３〜表５に示す。
【００７５】
【表３】
【表４】
【表５】
表３〜表５の結果より、Ｃ−４，６位が置換されているＧｌｃＮＡｃ残基は主たる還元末端残基であり、Ｇａｌ、Ｆｕｃ、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、Ｍａｎ残基は非還元末端にも存在する。また、Ｆｕｃ残基をもつトリマンノシルコア構造が主要であり、糖鎖内部のＧａｌ残基はＣ−２，３、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−６位に置換がある。Ｎ結合糖鎖では検出された２，３，４−トリ−Ｏ−メチルガラクチトールがアシアロ糖鎖では検出されないこと、２，３，４，６−Ｏ−メチルガラクチトールがアシアロ糖鎖では増加していることにより、Ｎ結合糖鎖のシアル酸残基はＧａｌ残基のＣ−６位に主に結合している。Ｍａｎ残基は分画１の糖鎖ではＣ−２、Ｃ−３，６位に置換があり、分画２の糖鎖ではＣ−２、Ｃ−３，４，６位に置換がある。更に、分画３の糖鎖ではＣ−２、Ｃ−３，６、Ｃ−２，６、Ｃ−２，４位に置換がある。また、非還元末端のＧａｌＮＡｃ残基と、Ｃ−２，３位に置換があるＧａｌ残基は分画１に検出された。また、糖鎖内部のＧｌｃＮＡｃ残基はＣ−４位に限って置換がある。
【００７９】
グリコシダーゼによる放射活性をもつ糖鎖（０．５〜１００×１０４ ｃｐｍ）の消化は次の酵素を用い行った。アルスロバクター ウレアファシエンス由来シアリダーゼは、ナカライテスク社より購入した。α−マンノシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、リー（ Ｌｉ ） らの方法〔メソッズ イン エンザイモロシー（ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ） 第２８巻、第７０２〜７１３頁（１９７２）〕に従って、タチナタマメのひきわりより精製した。Ｍａｎα１→２Ｍａｎ結合を特異的に切断するアスペルギルス サイトーイ（ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ ） 由来α−マンノシダーゼ〔ヤマシタ（ Ｙａｍａｓｈｉｔａ ）ら、バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ、第９６巻、第１３３５〜１３４２頁（１９８０）〕はバイオキミカ エ バイオフィジカ アクタ（ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ） 、第６５８巻、第４５〜５３頁（１９８１）、ジャーナル オブ バイオケミストリー（ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ）、第９９巻、第１６４５〜１６５４頁（１９８６）に記載の方法に従って、モルシン（盛進製薬社製）より、精製した。
【００８０】
Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ結合は水解するが、Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃ結合や、Ｇａｌβ１→６ＧｌｃＮＡｃ結合は水解しないディプロコッカル（ Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃａｌ ）β−ガラクトシダーゼ〔ポールソン（ Ｐａｕｌｓｏｎ ）ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２５３巻、第５６１７〜５６２４頁（１９７８）〕とＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎ結合は水解するが、ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＭａｎやＧｌｃＮＡｃβ１→６Ｍａｎ結合は水解しない。
【００８１】
β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ〔ヤマシタ（ Ｙａｍａｓｈｉｔａ ）ら、バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ、第１００巻、第２２６〜２３２頁（１９８１）〕はジャーナル オブ バイオロジカルケミストリー、第２５２巻、第８６１５〜８６２３頁（１９７７）に記載の方法によって精製した。アチャティナ フリカ（ Ａｃｈａｔｉｎａ ｆｕｌｉｃａ ）より精製したかたつむりのβ−マンノシダーゼと、アクレモニウム エスピー（ Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ． ） 由来α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、生化学工業社より購入した。
グリーンコーヒー豆由来α−ガラクトシダーゼと牛副こう丸α−Ｌ−フコシダーゼは、シグマ社より購入した。Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→よりＦｕｃ残基を遊離するがＧａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃβ１→と、Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃβ１→からは遊離しないコリネバクテリウム（ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）のα１→２−Ｌ−フコシダーゼは宝酒造社より購入した。
【００８２】
酵素消化は通常、３７℃、２０時間トルエン存在下、下記の条件で行った。
タチナタ豆β−ガラクトシダーゼ消化：０．２Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）４０μｌ中、酵素５ミリユニット。α−ガラクトシダーゼ消化：０．２Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）８０μｌ中、２５℃、酵素０．１ユニット。タチナタ豆β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化：０．２Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μｌ中酵素０．５ユニット。ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化：０．２Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）４０μｌ中、酵素５ミリユニット。ディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼとディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの混合した酵素による消化：０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）６０μｌ中、各酵素５ミリユニット。α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ消化：０．２Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．５）６０μｌ中酵素０．１ユニット ４５時間。タチナタマメα−マンノシダーゼ消化：０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）５０μｌ中酵素１ユニット。かたつむりβ−マンノシダーゼ消化：０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）５０μｌ中酵素１０ミリユニット。牛副こう丸α−Ｌ−フコシダーゼ消化：０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）４０μｌ中、酵素２０ミリユニット。コリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼ消化：０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）３０μｌ中、３３℃ ４５時間、酵素０．１ユニット。なお、コリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼ消化の反応液は複合型糖鎖の還元末端のＧｌｃＮＡｃにα１→６結合しているフコース残基を遊離しなかった。これらの酵素反応後、各反応液は沸騰水浴中で３分間加熱して反応を停止した。
【００８３】
図５〜図８にアシアロ糖鎖、及び酵素処理物のバイオ−ゲルＰ−４溶出パターンをそれぞれ示す。なおバイオ−ゲルＰ−４はエキストラファインを使用し、各図中の縦軸は放射活性、横軸は溶出時間を示し、図中の矢印はグルコース オリゴマーの溶出位置を示す。
【００８４】
（４）糖鎖構造の決定
画分Ａ１はタチナタマメβ−ガラクトシダーゼと、その後のタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの逐次分解で１つのＧａｌ残基（図４ｂ実線）と、その後、１つのＧｌｃＮＡｃ残基（図４ｂ点線）を遊離させることでより小さな糖鎖に変った。同様の結果がディプロコッカルの酵素を使用することで得られた。更に、画分Ａ１はコリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼで消化した時、約０．５グルコースユニット溶出位置が移動し、この放射活性のピークは、標準物質の下記式（化２８）と同じ位置である約１４．５グルコースユニットに相当する位置に溶出した（図４ｃ）。
【００８５】
【化２８】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【００８６】
更に、この放射活性のある糖鎖は、ディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼとディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによる逐次分解で、２つのＧａｌ残基（図４ｄ実線）と、その後、２つのＧｌｃＮＡｃ残基（図４ｄ点線）を遊離し標準物質のトリマンノシル糖鎖下記の式（化２９）、（化３０）と同じ位置である約８と７グルコースユニットに相当する位置に各約９：１の割合で溶出して主たるピークと小さいピークを与えた（図４ｄ点線）。
【００８７】
【化２９】
Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【００８８】
【化３０】
Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ０Ｔ
【００８９】
更に、この図４ｄ（点線）に示した放射活性のある糖鎖は更にタチナタマメα−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、牛副こう丸α−フコシダーゼを用いた逐次分解によってトリマンノシルコアの構造と同定された。
【００９０】
ＣｏｎＡ−セファロースに吸着する糖鎖は、Ｃ−３、Ｃ−４、Ｃ−６位に置換のないα−マンノース残基が少なくとも２つ存在する必要があること、ディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼはＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ結合は水解するが、Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃとＧａｌβ１→６ＧｌｃＮＡｃ結合は水解しないこと、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼがＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎ結合は水解するがＧｌｃＮＡｃβ１→４ＭａｎとＧｌｃＮＡｃβ１→６Ｍａｎ結合は水解しないことより、図４ｃの放射活性のある糖鎖は下記式（化３１）の二本鎖複合型糖鎖構造をもつことが示された。
【００９１】
【化３１】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【００９２】
更に、コリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼはＦｕｃα１→２Ｇａｌ→結合よりフコース残基を遊離するが、Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃβ１→、Ｇａｌβ１→３（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮＡｃβ１→、還元末端のＧｌｃＮＡｃ残基のＣ−６位に結合したフコース残基をもつ二本鎖複合型糖鎖からは遊離しないこと、画分Ａ１はＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに結合しない（図２）けれども、酵素消化によってその画分から得られた図４ｃの放射活性のある糖鎖は吸着し、ラクトースを含む緩衝液で溶出すること、該ＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムには、非還元末端のＧａｌ残基を２つもつ二本鎖複合型糖鎖が吸着し、ラクトースを含む緩衝液で溶出すること、その上、画分Ａ１の糖鎖は血液型のＨ（Ｏ）構造、すなわち式（化１）の糖鎖に高い親和性があるＵＥＡ−Ｉ−アガロースカラムに吸着し、５０ｍＭ Ｌ−フコースを含む緩衝液によって溶出したこと等により、Ｆｕｃ残基は、二本鎖糖鎖の２つの非還元末端Ｇａｌ残基のうち１つのＣ−２位に結合しており、β−ガラクトシダーゼとβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの逐次分解からＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→の外側の二本鎖のうち一本を保護していると決定された。これはＣｏｎＡ−セファロースに結合した糖鎖画分のメチル化分析（表３〜表５）より、糖鎖内部の糖の誘導体として、３，４，６−トリ−Ｏ−メチルガラクチトール、３，４，６−トリ−Ｏ−メチルマンニトール、２，４−ジ−Ｏ−メチルマンニトール、３，６−ジ−Ｏ−メチル２−Ｎ−メチルアセトアミド−２−デオキシグルチトールが検出されることと合致した。これらの結果より、画分Ａ１は式（化２）に示したように血液型のＨ（Ｏ）構造、式（化１）をもつ二本鎖複合型糖鎖を含むと決定した。血液型Ｈ（Ｏ）構造が画分Ａ１中の糖鎖のＭａｎα１→３側にのみ位置しているという事実は以下のようにタチナタマメα−マンノシダーゼの特異性に基づいて確認した。すなわち、タチナタマメβ−ガラクトシダーゼとタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼによる消化により、画分Ａ１から得られた放射活性のある糖鎖（図４ｂ点線）をタチナタマメα−マンノシダーゼ消化した時、マンノースは遊離しなかった。この放射活性のある糖鎖は下記の式（化３２）、又は（化３３）の構造をもつこと、タチナタマメのα−マンノシダーゼは下記式（化３４）からＭａｎ残基を１つ遊離するが下記式（化３５）からは遊離しないことより血液型Ｈ構造は式（化２）のように二本鎖のＭａｎα１→３の側に存在することが決定された。
【００９３】
【化３２】
Ｆα１→２Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【００９４】
【化３３】
Ｆα１→２Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３（Ｍα１→６）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【００９５】
【化３４】
Ｒ１→２Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【００９６】
【化３５】
Ｍα１→６（Ｒ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【００９７】
画分Ｂ１は図３Ｂの下線で示されているが、画分Ａ１から得られた図４ｂ（点線）に相当する、放射活性をもつＢ１の酵素処理糖鎖を、タチナタマメα−マンノシダーゼで消化したとき、１つのＭａｎ残基が遊離されたことを除いて画分Ｂ１からは画分Ａ１から得られたのと同様の結果を得た。したがって、画分Ｂ１には式（化５）に示すようにＭａｎα１→６側に血液型のＨ（Ｏ）型構造をもつ二本鎖複合型糖鎖が含まれる。
また、バイセクトＧｌｃＮＡｃ残基をもたないで、Ｍａｎα１→６側に非還元末端のＧａｌβ１→残基をもつ二本鎖複合型糖鎖は、Ｍａｎα１→３側にこの構造をもつ糖鎖よりもＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムよりはやく溶出するので、画分Ａ１とＢ１がそれぞれ二本鎖のＭａｎα１→３側とＭａｎα１→６側にＨ（Ｏ）型構造をもつということはそれらのＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムの挙動とも合致する。
【００９８】
画分Ａ２は図３Ａに下線で示されているがタチナタマメβ−ガラクトシダーゼとその後のタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼによる逐次分解によって、１つのＧａｌ残基（図４ｅ実線）と、１つのＧｌｃＮＡｃ残基（図４ｅ点線）を遊離することで、より小さな糖鎖へ移行した。同じ結果がディプロコッカルの酵素を用いても得られた。また、画分Ａ２をα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼで消化した時、バイオ−ゲルＰ−４の溶出において、１つのＧａｌＮＡｃ残基の遊離に相当する約２グルコースユニット分の移動があった（図４ｆ実線）。また、コリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼでの消化によって図４ｆの実線で示された一部の糖鎖からＦｕｃ残基を遊離したことを示す、溶出パターンの移動があった（図４ｆ点線）。図４ｆの点線で示される放射活性をもつ物質の約８５％が、図４ｃ中の画分Ａ１から得られた放射活性をもつ糖鎖から得た結果と同じ結果を示した。すなわち、ディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼと、その後のディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの逐次分解で、２つのＧａｌ残基とその後２つのＧｌｃＮＡｃ残基を遊離し（図４ｇの主ピーク及び図４ｈ実線）、生成物は約９：１の割合で約８と７のグルコースユニットに相当する位置に溶出した。これらはそれぞれＦｕｃ残基のあるトリマンノシルコアの糖鎖と、ないものであり図４ｄ（点線）の糖鎖に一致した。
【００９９】
一方、図４ｆ中点線で示された放射活性をもつ物質の残り１５％からはディプロコッカルの酵素の逐次分解によって１つのＧａｌ残基とその後１つのＧｌｃＮＡｃ残基を遊離した（図４ｇの小さいピーク及び図４ｈ点線）。この生成物（図４ｈ点線）はα−ガラクトシダーゼ消化によって１つのＧａｌ残基を遊離した（図４ｉ）。図４ｉ中の放射活性のもつ生成物はコリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼ、ディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼ、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの逐次分解によって約９：１の割合でＦｕｃ残基のあるものとないものの、トリマンノシルコア構造にまで移行した（図４ｊ）。また、画物Ａ２の放射活性をもつ糖鎖はＵＥＡ−Ｉ−アガロースカラムに吸着しないけれども、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼとα−ガラクトシダーゼによる逐次分解の後では、カラムに吸着し、フコースを含む緩衝液で溶出した。
【０１００】
以上の結果と、メチル化分析（表３〜表５）より、画分Ａ２の糖鎖は、下記式（化３６）という糖鎖のフコースの付いたＧａｌ残基にそれぞれ８５％と１５％の割合でα配位結合したＧａｌＮＡｃ残基とＧａｌ残基を含み、２つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→グループのうち１つがβ−ガラクトシダーゼとβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの逐次分解を受けることが解明された。
【０１０１】
【化３６】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（Ｆα１→２Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１０２】
また、ＣｏｎＡ−セファロースに結合した糖鎖分画のメチル化分析より、４，６−ジ−Ｏ−メチルガラクチトールのみが他の糖によって２箇所置換されているＧａｌ残基の誘導体として検出されたことから画分Ａ２は式（化２４）、（化２５）の血液型のＡ型構造、Ｂ型構造をそれぞれもつ式（化３）、（化４）の二本鎖複合型糖鎖（Ａ２−１、及びＡ２−２）と決定された。
【０１０３】
画分Ｂ２は、図３Ｂの下線で示されているが、画分Ａ１とＢ１の糖鎖の解析の場合において、画分Ａ２で得られた解析結果を同様の結果が得られた。
したがって、画分Ｂ２は式（化６）、（化７）に示すように血液型Ａ型、Ｂ型構造をもつ二本鎖複合型糖鎖（Ｂ２−１、及びＢ２−２）と決定された。なお画分Ａ２、Ｂ２において、血液型構造が二本鎖のＭａｎα１→３側とＭａｎα１→６側に結合していることは、既述の場合と同様に、ＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムへの挙動により決定した。
【０１０４】
ラクトースを含む緩衝液でＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣから溶出されてきた画分Ｃは全アシアロ糖鎖の５９．９％の割合であり、図４ｃの放射活性のある糖鎖と標準物質の下記式（化３７）と同じ位置、つまり約１４．５グルコースユニットに相当する位置（図３Ｃ）にバイオ−ゲルＰ−４カラムより溶出した。
【０１０５】
【化３７】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１０６】
画分Ｃの解析からは、画分Ａ１から得られた図４ｃに示す放射活性をもつ糖鎖について先に述べた結果と同一の結果が得られた。したがってメチル化分析のデータ（表３〜表５）を合せ、画分Ｃ中の糖鎖を式（化８）のＧａｌが２つ付加した二本鎖複合型糖鎖と決定した。
【０１０７】
全アシアロ糖鎖の０．８％の割合の画分ＤはＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムを素通りし（図２）、バイオ−ゲルＰ−４カラムによって約３：２：２：１の割合で、Ｄ１からＤ４の４つのピークに分けられた（図３Ｄ）。ピークＤ１〜Ｄ４は以下のような結果から、ハイマンノース型糖鎖の式（化９）のｎ＝１：Ｍａｎ６ ＧｌｃＮＡｃ２ 、ｎ＝２：Ｍａｎ７ ＧｌｃＮＡｃ２ 、ｎ＝３：Ｍａｎ８ ＧｌｃＮＡｃ２ 、ｎ＝４：Ｍａｎ９ ＧｌｃＮＡｃ２ とそれぞれ同定した。
【０１０８】
まず、第一に、β−ガラクトシドに特異的なＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムを素通りした。第二に、バイオ−ゲルＰ−４カラムからの溶出位置（図５ｋ）は、それぞれの標準物質の位置と同じであった。第三に、Ｍａｎα１→２結合を特異的に切断するアスペルギルス サイトーイα−マンノシダーゼ消化によって消化物はすべて各４、３、２、１個のマンノース残基を遊離して、約９グルコースユニットに相当する位置で標準物質の下記式（化３８）と同一位置にバイオ−ゲルＰ−４カラムから溶出した（図５のｌ実線）。
【０１０９】
【化３８】
Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ０Ｔ
【０１１０】
第四に、更にその後、タチナタマメα−マンノシダーゼ消化を行った時、４つのマンノース残基が図５のｌの実線で示された放射活性のある物質から遊離し、消化物は、標準物質の下記式（化３９）の位置に溶出した（図５のｌ点線）。
【０１１１】
【化３９】
Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ０Ｔ
【０１１２】
更に、かたつむりβ−マンノシダーゼ、それに続くタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼによる逐次分解によって、標準物質の下記式（化４０）、次いでＮ−アセチルグリコサミニトールと同じ位置に溶出した。
【０１１３】
【化４０】
ＧＮβ１→４ＧＮ０Ｔ
【０１１４】
第五に画分ＡからＥの混合物のメチル化分析によってＭａｎ残基の誘導体として２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メチル−、３，４，６−トリ−Ｏ−メチル−、２，４−ジ−Ｏ−メチル−マンニトールを検出した（表３〜表５）。以上によりＤ１〜Ｄ４の構造を決定した。
全アシアロ糖鎖の０．８％の割合である画分ＥはＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに結合しなかったが、遅れて溶出した（図２）。この画分はバイオーゲルＰ−４カラムより、標準物質の下記の式（化４１）、（化４２）と、それぞれ同じ位置に約１：１の割合で２つの主要ピークＥ１とＥ２に分かれた（図３Ｅ）。
【０１１５】
【化４１】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（３）〔Ｍα１→３（６）〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１１６】
【化４２】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（３）〔ＧＮβ１→２Ｍα１→３（６）〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１１７】
また、放射活性のある画分Ｅ２をタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化した時、消化物は１つのＧｌｃＮＡｃ残基がはずれたことで放射活性のある画分Ｅ１と同じ溶出パターンを示した（図５ｍ点線）。図５ｍ（点線）と放射活性のある画分Ｅ１のどちらの物質もタチナタマメα−マンノシダーゼに抵抗性を示すがディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼとディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼでの逐次分解によって、１つのＧａｌ残基と、その後１つのＧｌｃＮＡｃ残基を遊離した（図５ｎ、図５のｏ）。そして約８：２の割合でＦｕｃ残基のもつトリマンノシルコア構造と、もたないものとして同定された糖鎖になった（図５のｏ）。したがって図５ｍの点線で示された画分Ｅ２の消化物は画分Ｅ１の糖鎖と同一であった。
【０１１８】
更にまた、放射活性のある画分Ｅ２を、ディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼと、その次のディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによる逐次分解を行うと、１つのＧａｌ残基と、その後に２つのＧｌｃＮＡｃ残基を遊離して、その画分は図５のｏの画分と同一の生成物になった。
【０１１９】
これらの結果とメチル化分析のデータ（表３〜表５）と、ＣｏｎＡ−セファロースカラムとＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムの糖鎖アフィニティと、画分Ａ、Ｂ中の糖鎖に対するディプロコッカルの酵素とタチナタマメα−マンノシダーゼの特異性に関する結果を合せ、画分Ｅの糖鎖を式（化１０）、及びＧａｌ残基の１つ付加した式（化１１）の複合型糖鎖と決定した。
【０１２０】
画分ＧはＥ−ＰＨＡ−アガロースカラムで遅れて溶出してきた糖鎖の主成分であり、全アシアロ糖鎖の５．２％の割合を占めＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムに結合した（図２）。
この画分の主成分はバイオ−ゲルＰ−４カラムでは標準物質の下記式（化４３）が溶出する位置である約１５グルコースユニットに相当する位置に溶出した（図３Ｇ、図６ｔ）。
【０１２１】
【化４３】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）（ＧＮβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１２２】
タチナタマメβ−ガラクトシダーゼ消化によって、画分Ｇの放射活性のある画分（図６ｔ）から２つのＧａｌ残基が遊離した（図６ｕ実線）。タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化を行ったところ図６ｕ（実線）の放射活性のある糖鎖は、約９：１の割合で、Ｆｕｃ残基のあるトリマンノシルコアとＦｕｃ残基のないものの糖鎖になった（図６ｕ点線）。更にまた、放射活性のある画分Ｇ（図６ｔ）をタチタナマメ由来酵素とは基質特異性の異なるディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼとディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの混合物で消化したところ、標準物質の下記の式（化４４）、（化４５）と同じ位置にそれぞれ溶出してくる糖鎖に移行した（図６ｖ）。
【０１２３】
【化４４】
ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１２４】
【化４５】
ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ０Ｔ
【０１２５】
更に、タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化において、図６ｖの物質はＦｕｃ残基のあるトリマンノシルコア構造とＦｕｃ残基のない構造になり、ディプロコッカルの酵素の混合物は２つのＧａｌ残基と、１つのＧｌｃＮＡｃ残基を遊離していた。ディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼはＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃを水解するが、Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃや、Ｇａｌβ１→６ＧｌｃＮＡｃは水解しないこと、また、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは下記式（化４６）からただ１つのＧｌｃＮＡｃ残基を遊離して下記式（化４７）が生成すること等や、メチル化分析（表３〜表５）、レクチンカラムへの親和性等から、分画Ｇの糖鎖を式（化１３）のバイオセクトＧｌｃＮＡｃを持った二本鎖複合型糖鎖と同定した。
【０１２６】
【化４６】
ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）（ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１２７】
【化４７】
ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１２８】
アシアロ糖鎖の１．１％の割合を占める画分ＦはＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムより遅れて溶出し（図２）、バイオ−ゲルＰ−４カラムにより約１５．５グルコースユニットに相当する位置に溶出する（図３Ｆ、図５ｐ）。放射活性のある分画をディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼ消化したところ、１つのＧａｌ残基が遊離したことに相当するピークの移動があった（図５ｑ）。この消化物はディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化の影響を受けないけれど、タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化を受けた（図５ｒ）。更に、分画Ｆ（図５ｐ）をコリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼ消化を行ったところ１つのＦｕｃ残基が遊離し放射活性のある生成物は約１５グルコースユニットに相当する位置に溶出し（図５ｓ）、この段階の放射活性をもつ生成物（図５ｓ）からはバイセクトＧｌｃＮＡｃ残基をもった二本鎖を含む分画Ｇから得られた結果と同様の糖鎖解析結果を得た。
【０１２９】
したがって、バイセクトのＧｌｃＮＡｃ残基をもつ二本鎖のＧａｌ残基にα１→２結合したＦｕｃ残基はディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼとタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの逐次分解から２本のＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→のうち１本を保護していた。
更にまた、メチル化分析のデータよりＥ−ＰＨＡより遅れて溶出する画分中の糖鎖のＧａｌ残基はＣ−２位にのみ置換があること、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが下記式（化４８）のＭａｎα１→３側からＧｌｃＮＡｃ残基を遊離させることはできるが、下記式（化４９）のＭａｎα１→６側からは遊離しないこと、またＥ−ＰＨＡ−アガロースカラムとの相互作用に必要な構造からＦｕｃ残基はＭａｎα１→３側のＧａｌ残基のＣ−２位に結合しており、一方Ｍａｎα１→６側のＧａｌ残基は糖の置換が無く、分画Ｆは式（化１２）のバイセクトＧｌｃＮＡｃ残基をもちＭａｎα１→３側に、血液型のＨ（Ｏ）型構造をもつ二本鎖複合型糖鎖と決定された。
【０１３０】
【化４８】
Ｒ→ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）（ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１３１】
【化４９】
ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）（Ｒ→ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１３２】
分画Ｈはアシアロ糖鎖の０．８％の割合であり、ＲＣＡ１２０−ＨＰＬＣカラムと同様にＣｏｎＡ−セファロース、Ｅ−ＰＨＡ−アガロース、ＤＳＡ−アガロースカラムを素通りし、図３Ｈと図６ｗに示すようなバイオ−ゲルＰ−４カラムからの溶出パターンを得た。この分画はディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼ、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化に影響を受けなかった。また、図６ｗの下線で示した放射活性をもつ糖鎖は分画Ｈの主成分（約６０％）であり、コリネバクテリウムα１→２−Ｌ−フコシダーゼ消化で、２つのＦｕｃ残基を遊離することによって、分画Ｇと同じ位置に溶出する更に小さい糖鎖になった（図６ｘ）。この段階の生成物（図６ｘ）はディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼとディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによる逐次分解に影響を受けた（図６ｙ）。図６ｘの生成物のうち、約８０％は分画Ｇから得られた結果と同じ結果を得た。
【０１３３】
更に図６ｗの下線で示した放射活性のある糖鎖をＵＥＡ−Ｉアガロースにアプライしたところ、カラムに吸着し、フコースを含む緩衝液で溶出された。したがって、２つのＦｕｃ残基は、２つのＧａｌ残基のＣ−２位に結合しており、Ｇａｌ残基を、β−ガラクトシダーゼ消化から保護していた。この結果とメチル化分析のデータ（表３〜表５）とディプロコッカルの酵素の基質特異性と、レクチンカラムの結合のアフィニティより、分画Ｈは式（化１４）の両方の鎖に血液型Ｈ（Ｏ）型構造をもち、バイセクトのＧｌｃＮＡｃ残基をもった二本鎖複合型糖鎖を含むと同定した。
【０１３４】
分画Ｉは、バイオ−ゲルＰ−４カラムによって、約１５．５グルコースユニットに相当する主要ピークと、約１４グルコースユニットに相当する小さいピークとに、約７：３の比で分けられた（図３Ｉ）。主要ピークからは酵素消化によって図５ｐに示した画分Ｆから得られたのと同様の結果が得られたけれども、画分Ｉのディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼ消化物（図５ｑに示した画分Ｆから得られた放射活性をもつ糖鎖に相当する）は画分Ｆの消化物とは違ってディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化の影響を受けた。これらの結果と、メチル化分析（表３〜表５）Ｅ−ＰＨＡ−アガロースカラムへの親和性、ディプロコッカル酵素の基質特異性より、画分Ｉの主要成分は式（化１５）のバイセクトＧｌｃＮＡｃをもった二本鎖複合型糖鎖であり、Ｍａｎα１→６側の枝のＧａｌ残基のＣ−２位に結合したＦｕｃ残基の影響により、Ｍａｎα１→３側のＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→がディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼやディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの作用を受ける。
【０１３５】
バイオ−ゲルＰ−４カラムで約１４グルコースユニットに相当する位置に溶出する（図３Ｉ）小さい方のピークからは酵素消化で分画Ｇと、ほぼ同様の結果が得られたが、このピークからはディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼやタチナタマメのβ−ガラクトシダーゼ消化によって１つのＧａｌ残基しか遊離しなかった。
したがって、小さいピーク中の糖鎖はただ１つＧａｌ残基をもった二本鎖複合型糖鎖、すなわち、式（化１６）、又は下記式（化５０）であり、Ｅ−ＰＨＡ−アガロースカラムへの親和性より、小さいピークの糖鎖は式（化１６）であると決定した。
【０１３６】
【化５０】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６（ＧＮβ１→４）（ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１３７】
画分Ｋからは図３Ｋと図６ｚ（実線）に示すようにバイオ−ゲルＰ−４カラムの溶出パターンが得られた。図６ｚ（実線）中の下線によって示された画分Ｋの主要な放射活性をもつ画分（９０％）はディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼ消化で３つ及び２つのＧａｌ残基を遊離することによってより小さな糖鎖になった（図６ａ′実線）。主ピークの溶出する位置は標準物質の下記式（化５１）の溶出位置と一致した。
【０１３８】
【化５１】
ＧＮβ１→２Ｍα１→６〔ＧＮβ１→４（ＧＮβ１→２）Ｍα１→３〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１３９】
また、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化によって、図６ａ′（実線）中の放射活性のある生成物の約７５％が、２つのＧｌｃＮＡｃ残基を遊離し、下記式（化５２）と同じ位置に溶出した（図６ｂ′実線）。
【０１４０】
【化５２】
Ｍα１→６（ＧＮβ１→４Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１４１】
更に、その後のタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化によって、図６ｂ′（実線）中、下線で示された糖鎖は約８：２の割合で、既に述べたようにＦｕｃ残基のあるものとないもののトリマンノシルコア構造と同一の糖鎖になった（図６ｃ′実線）。ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは下記の式（化５３）、（化５４）からはそれぞれ１残基と２残基のＧｌｃＮＡｃを遊離するので、ここで分析した糖鎖は式（化５４）であった。
【０１４２】
【化５３】
ＧＮβ１→６（ＧＮβ１→２）Ｍα１→６（ＧＮβ１→２Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１４３】
【化５４】
ＧＮβ１→２Ｍα１→６〔ＧＮβ１→４（ＧＮβ１→２）Ｍα１→３〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（±Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１４４】
これらの結果、及びメチル化分析（表３〜表５）、レクチンカラムの挙動に必要な構造より、画分Ｋの主要成分の７５％は式（化１７）の、Ｃ−２，４位に枝分かれのあるＭａｎ残基をもつ三本鎖複合型糖鎖と決定した。
更にまた、図６ｚ（実線）中下線に示された画分Ｋの主要な放射活性のある糖鎖（９０％）を、牛副こう丸α−フコシダーゼ消化した時、０、１、２残基のＦｕｃが遊離し、放射活性をもつ生成物は約１６．５グルコースユニットに相当する。標準物質の下記式（化５５）と同じ位置に単一ピークとして溶出した（図６ｚ点線）。
【０１４５】
【化５５】
Ｇβ１→４ＧＮβ１→２Ｍα１→６〔Ｇβ１→４ＧＮβ１→４（Ｇβ１→４ＧＮβ１→２）Ｍα１→３〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ０Ｔ
【０１４６】
更に、この生成物をディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼ、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼによって逐次分解すると、各ステップの生成物は３残基のＧａｌ、２残基のＧｌｃＮＡｃ、１残基のＧｌｃＮＡｃを遊離して標準物質の下記の式（化５６）（図６ａ′点線）、（化５７）（図６ｂ′点線）、（化５８）（図６ｃ′点線）と同じ位置に溶出した。
【０１４７】
【化５６】
ＧＮβ１→２Ｍα１→６〔ＧＮβ１→４（ＧＮβ１→２）Ｍα１→３〕Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ０Ｔ
【０１４８】
【化５７】
Ｍα１→６（ＧＮβ１→４Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ０Ｔ
【０１４９】
【化５８】
Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４ＧＮ０Ｔ
【０１５０】
図６ｚ（実線）中、下線で示された画分Ｋの主成分をＵＥＡ−Ｉ−アガロースカラムにアプライしたところ、その成分の約２５％がカラムに吸着し、フコースを含む緩衝液で溶出し、画分Ｋの主成分の約２５％が血液型のＨ（Ｏ）型構造式（化１）を有する。
【０１５１】
これらの結果をメチル化分析のデータ（表３〜表５）から、画分Ｋ中の糖鎖はＣ−２，４位に枝分かれのあるＭａｎ残基をもつ三本鎖複合型糖鎖を含むこと；鎖のＦｕｃ残基は還元末端のＧｌｃＮＡｃ残基かＧａｌ残基のＣ−２位か、その両方に結合していること；画分Ｋの主成分の糖鎖の２５％に存在しているＧａｌ残基に結合したＦｕｃ残基はディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼによる水解からＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→の３本の外側の鎖のうち１本を保護している（図６ａ′実線）ことが解明され、画分ＫのＨ（Ｏ）型構造を有する糖鎖を式（化１８）と決定した。
【０１５２】
画分Ｌは、バイオ−ゲルＰ−４カラムで、その外側の鎖の部分に３、４、５個のＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃユニットをもつ複合型糖鎖の領域に、それぞれ４６：４３：１１の割合で３つの画分Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３に分かれた（図３Ｌ、図７ｄ′）。
【０１５３】
画分Ｌ１は全アシアロ糖鎖の約５．１％の割合を占め、バイオ−ゲルＰ−４カラムよりその外側の鎖に３つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃユニットをもつ複合型糖鎖の領域に溶出した（図７ｄ′）。この画分の糖鎖からはディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼ（図７ｅ′）、ディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（図７ｆ′実線）、タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（図７ｆ′点線）での逐次分解によって３残基のＧａｌ、１残基のＧｌｃＮＡｃ、２残基のＧｌｃＮＡｃを遊離し、最終的には約８：２の比で、Ｆｕｃ残基の付いたトリマンノシルコア構造と付かない構造の糖鎖になった（図７ｆ′点線）。これらの結果とメチル化分析のデータ（表３〜表５）と三本鎖複合型糖鎖へのディプロコッカル酵素の基質特異性から画分Ｌ１の糖鎖を式（化１９）のＣ−２，６位が置換されたＭａｎ残基をもつ三本鎖複合型糖鎖であると決定した。
【０１５４】
画分Ｌ２は全アシアロ糖鎖のおよそ４．７％の割合であり、バイオ−ゲルＰ−４カラムよりその外側の鎖に４つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃユニットをもつ複合型糖鎖の領域に溶出された（図７ｄ′）。放射活性をもつ画分Ｌ２をタチナタマメβ−ガラクトシダーゼ消化したところ、図７ｇ′の下線で示される２つの画分Ｌ２ａとＬ２ｂがそれぞれ４残基と、２〜３残基のＧａｌ残基を遊離することによって約４４：５６の割合で生じた。画分Ｌ２ａはディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（図７ｈ′実線）と、その後のタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（図７ｈ′点線）による逐次分解で１残基のＧｌｃＮＡｃとその後３残基のＧｌｃＮＡｃを遊離した。この逐次分解で画分Ｌ２ａは標準物質の下記式（化５９）と同じ位置に溶出する糖鎖になり、その後約７：３の割合でフコース残基のついたトリマンノシル構造と付かない構造になった。
【０１５５】
【化５９】
ＧＮβ１→６（ＧＮβ１→２）Ｍα１→６（ＧＮβ１→４Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１５６】
ディプロコッカル酵素の基質特異性、メチル化分析（表３〜表５）より、及び以上の結果より該Ｌ２ａは、Ｌ２成分中の四本鎖複合型糖鎖由来であり、該Ｌ２成分中の四本鎖糖鎖Ｌ２−１の構造を式（化２０）と決定した。
【０１５７】
画分Ｌ２ｂはタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化によって図７ｉ′に示すような３つのピークとなった。図７ｉ′中下線で示された糖鎖は３残基のＧｌｃＮＡｃの遊離によるもので画分Ｌ２ｂの３分の１の割合を占めるが、タチナタマメβ−ガラクトシダーゼとその後のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼによる逐次分解によって、１残基のＧａｌと１残基のＧｌｃＮＡｃを遊離し（図７ｊ′実線と点線）、Ｆｕｃ残基がついたトリマンノシルコア構造と付かないものに約９：１の割合で消化された。したがって、図７ｉ′の下線で示された糖鎖は式（化２１）に示したような画分Ｌ２に含まれている１つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ１→３繰返し構造をもつ三本鎖複合型糖鎖Ｌ２−２由来であった。
【０１５８】
図７ｉ′中の残りの生成物はタチナタマメβ−ガラクトシダーゼとタチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼにもはや影響を受けなかった。画分Ｌ２の約３０％が、ＵＥＡ−Ｉ−アガロースカラムに結合しフコースを含む緩衝液で溶出した。
【０１５９】
画分Ｌ３はアシアロ糖鎖の約１．２％の割合であって、バイオ−ゲルＰ−４カラムよりその外側の鎖に５つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃユニットをもつ複合型糖鎖の領域に溶出された（図７ｄ′）。タチナタマメβ−ガラクトシダーゼ消化によって２から４残基のＧａｌを遊離し、バイオ−ゲルＰ−４カラムによって１８〜２０グルコースユニットの間にブロードなピークとして溶出する糖鎖となった。
画分Ｌ３はディプロコッカルβ−ガラクトシダーゼとディプロコッカルβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの混合物によって消化したところ、図７ｋ′（実線）で示すように多数のピークになり、その約４７％と１３％が標準物質の下記の式（化６０）、（化６１）と同じ位置に溶出する糖鎖となった（図７ｋ′中、下線で示したＬ３ｂ、Ｌ３ａ）。
【０１６０】
【化６０】
ＧＮβ１→６（ＧＮβ１→２）Ｍα１→６（ＧＮβ１→４Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１６１】
【化６１】
ＧＮβ１→６（ＧＮβ１→２）Ｍα１→６（Ｍα１→３）Ｍβ１→４ＧＮβ１→４（Ｆα１→６）ＧＮ０Ｔ
【０１６２】
タチナタマメβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化によってＬ３ａとＬ３ｂより、それぞれ２残基と３残基のＧｌｃＮＡｃを遊離し、約８：２の割合でＦｕｃ残基の付いたトリマンノシルコア構造と付かないものとなった（図７ｋ′点線）。メチル化分析（表３〜表５）、ディプロコッカル酵素の基質特異性と合せ、画分Ｌ３中の２成分Ｌ３−１、Ｌ３−２をそれぞれ式（化２２）の２つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３繰返し構造をもつ三本鎖複合型糖質、式（化２３）の１つのＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３繰返し構造をもつ四本鎖複合型糖質と同定した。
【０１６３】
実施例２
（１）血液型別血漿成分の調製、分離
（ａ）Ａ、Ｂ、Ｏ型血液型別に採血した血液より血漿を調製し、該血漿を０．３８％クエン酸ナトリウム添加後、プロテアーゼインヒビター（４ｍＭ ＥＤＴＡ、４ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、１００ＫＩＵアプロチニン）を加え、−８０℃で保存した。次に、各血液型別血漿１μｌのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、各血漿成分を分離した。α２ −マクログロブリンは１８０ｋＤａに、ｖＷＦは２７０ｋＤａの位置に泳動、分離した。次に血漿成分を、ＰＶＤＦ膜に移し、抗Ａマウスモノクローナル抗体、抗Ｂマウスモノクローナル抗体〔オルソー社製（ＩｇＭ）、又はバイオカーブ社製Ａ００５（ＩｇＧ３ ）〕、ビオチン−ＵＥＡ−Ｉ（ホーネン社製）とそれぞれ２０℃、９０分反応させた。なお抗体、レクチンはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．４）に０．０５％のツイーン２０を含有させたＴＷ／ＴＢＳで希釈し、使用した。血漿成分との特異的結合はホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＰＰ）結合２次抗体、又はアビジンを使用し、４−クロロ−ナフトール、Ｈ２ Ｏ２ を基質とし検出した。
【０１６４】
Ａ型血液より調製、分離したα２ −マクログロブリン及びｖＷＦはそれぞれ、抗Ａ抗体、ＵＥＡ−Ｉと特異的に結合した。
Ｂ型血液より調製、分離したα２ −マクログロブリン及びｖＷＦはそれぞれ、抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉと特異的に結合した。
ＡＢ型血液より調製、分離したα２ −マクログロブリン及びｖＷＦは抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体と結合した。
Ｏ型血液より調製、分離したα２ −マクログロブリン及びｖＷＦは抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体とは結合せず、抗Ｈ（Ｏ）レクチンと結合した。
【０１６５】
（ｂ）上記（ａ）記載のＡ型血液より調製した血漿（１ｍｌ）に抗Ａモノクローナル抗体（オルソー社製、マウスＩｇＭ）０．５ｍｌ、抗α２ −マクログロブリン血清（ダコー社製、ウサギＩｇＧ）１００μｌ、抗ｖＷＦ血清（奈良医大、宮田博士より供与、ウサギＩｇＧ）１００μｌのいずれかを添加し、２４時間、４℃に保持した。免疫凝集物を遠心分離後、数回ＴＢＳで洗浄し、血漿成分の各免疫凝集物を調製した。１００μｌのＳＤＳ−緩衝液（２％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタノール、１０％グリセリン、５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ６．８）に溶解した２〜５μｌの免疫凝集物は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後ＰＶＤＦ膜に転写した。
【０１６６】
Ａ型血液より調製した血漿より抗Ａ抗体で凝集した沈殿物の１８０ｋＤａ、２７０ｋＤａの位置の泳動物はそれぞれ抗Ａ抗体と結合し、抗Ｂ抗体とは結合しなかった。なお、抗α２ −マクログロブリン血清で凝集した沈殿物の１８０ｋＤａの位置の泳動物は抗Ａ抗体と結合し、抗ｖＷＦ血清で凝集した沈殿物の２７０ｋＤａの位置の泳動物は抗Ａ抗体と結合した。また、１８０ｋＤａ、２７０ｋＤａともＵＥＡ−Ｉと結合した。
【０１６７】
このほか、上記（ａ）記載のＢ型、Ｏ型、ＡＢ型の各血液型血漿より抗ｖＷＦ抗体で免疫凝集し、各ｖＷＦ凝集物を調製した。次に、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写し、各ｖＷＦの抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉとの結合性を測定した。
【０１６８】
Ｂ型血液の血漿より分離、調製したｖＷＦは抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉと結合し、ＡＢ型血液の血漿より分離、調製したｖＷＦは抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉと結合し、Ｏ型血液の血漿より分離、調製したｖＷＦは抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体とは結合せず、ＵＥＡ−Ｉと結合した。
【０１６９】
同様に、各血液型の血漿より抗α２ −マクログロブリン抗体を用い調製したα２ −マクログロブリンは、抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉに対し、上記と同様の結果を示した。
【０１７０】
なお、前記のＡ型血液の血漿より抗α２ −マクログロブリン抗体で調製した、免疫凝集物５μｌ、精製ｖＷＦ１０μｇをそれぞれ１００ｍＵのエンドグリコシダーゼＦ（ベーリンガー マンハイム社製）を含む５０μｌの溶液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、４０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ｎ−オクチルグルコシド、２％２−メルカプトエタノール、０．１％ＳＤＳ、０．２５％窒化ナトリウム）中で１０時間、３７℃で反応させ、等量のＳＤＳ−緩衝液を添加後、１００℃、５分間熱処理を行い、反応を停止した場合、各エンドグリコシダーゼＦ処理されたα２ −マクログロブリン、ｖＷＦはＡＢＨ（Ｏ）血液型抗原性を消失した。
【０１７１】
（ｃ）血液型Ａ型、Ｂ型、Ｏ型、ＡＢ型の健常人、各１０名より採血し、血液型別の血漿を調製した。
次に、２０μｇ／ｍｌの抗ｖＷＦ抗体〔ＭＢＬ社製、ヤギＩｇＧ：５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）〕でＥＬＩＳＡプレート（ベクトン アンド ディクソン社製）を２４時間、４℃処理し、プレートを抗ｖＷＦ抗体でプレコートし、次いで１％ＢＳＡを含むＴＢＳでブロッキングした。次いで上記の血液型別血漿の段階希釈物を、９０分、該プレートと、室温で反応させた。次にプレートをＴＷ／ＴＢＳで洗浄後、抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体（オルソー社製、ＴＷ／ＴＢＳで１／２０に希釈）、ビオチン−ＵＥＡ−Ｉ（５μｇ／ｍｌ）とそれぞれ４５分、反応させた。抗体、レクチンとの結合性はオルトフェニレンジアミン塩酸塩、Ｈ２ Ｏ２ を基質とし、ＨＲＰ結合の二次抗体、又はアビジンなどを用い測定した。ＨＲＰの反応は、暗所で３０分行い、硫酸で反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１７２】
結果を図８に示す。Ａ型血液より分離、調製したｖＷＦは抗Ａ抗体、ＵＥＡ−Ｉと結合し、Ｂ型血液より分離、調製したｖＷＦは抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉと結合し、ＡＢ型血液より分離、調製したｖＷＦは抗Ａ、抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉと結合し、Ｏ型血液より分離、調製したｖＷＦはＵＥＡ−Ｉと結合した。なお図中、横軸は希釈前の血漿濃度を１とした時の、血漿希釈濃度、縦軸は４９０ｎｍの吸光度、黒丸印は抗Ａ抗体の結合、白丸印は抗Ｂ抗体の結合、黒三角印はＵＥＡ−Ｉの結合をそれぞれ示す。
【０１７３】
（ｄ）α２ −マクログロブリン（シグマ社）、実施例１−（１）の精製ｖＷＦをそれぞれＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写した。上記α２ −マクログロブリンは各血液型の混合血漿由来であり、抗Ａ抗体、ＵＥＡ−Ｉと結合性を示した。また、抗Ｂ抗体とも弱い結合性を示した。また、ｖＷＦも同様な結果を示した。このα２ −マクログロブリンを抗Ａ抗体結合カラム、抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体結合カラム、抗Ｂ抗体結合カラムでそれぞれ処理し、抗Ｂ糖鎖抗原、抗Ａ及び抗Ｂ糖鎖抗原、抗Ａ糖鎖抗原がそれぞれ除去されたα２ −マクログロブリンを調製した。また同様に該精製ｖＷＦも処理し、各糖鎖抗原別のｖＷＦを調製した。
【０１７４】
（ｅ）各ＡＢＯ型血液より調製した血漿の混合物を抗Ａ抗体結合カラムに通し、Ａ型糖鎖抗原の除去された血漿を調製した。また、該混合物を抗Ｂ抗体結合カラムに通し、Ｂ型糖鎖抗原の除去された血漿を調製した。更にまた、同混合物を抗Ａ、抗Ｂ抗体結合カラムに通し、Ａ型、Ｂ型糖鎖抗原の除去された血漿を調製した。また、抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体を用いる凝集法により、生じる免疫複合体を除去し、各血漿を調製した。
【０１７５】
【発明の効果】
本発明により、ＡＢＨ（Ｏ）型糖鎖抗原の特定された血漿由来製剤が提供される。本製剤は長期間、反復使用した場合においても、血液凝固に起因する副作用が生ずることなく、血友病、ｖＷ病等の治療、血漿由来成分の輸血等において安全な製剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｖＷＦのＮ結合糖鎖の電気泳動を示す図である。
【図２】アシアロ糖鎖のレクチンカラム処理工程を示す図である。
【図３】レクチンカラム処理糖鎖のバイオ−ゲルＰ−４溶出パターンを示す図である。
【図４】酵素処理前後の糖鎖のバイオ−ゲルＰ−４溶出パターンを示す図である。
【図５】酵素処理前後の糖鎖のバイオ−ゲルＰ−４溶出パターンを示す図である。
【図６】酵素処理前後の糖鎖のバイオ−ゲルＰ−４溶出パターンを示す図である。
【図７】酵素処理前後の糖鎖のバイオ−ゲルＰ−４溶出パターンを示す図である。
【図８】血液型別血漿由来のｖＷＦの抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体、ＵＥＡ−Ｉとの結合性を示す図である。
Claims (2)
- 精製されたフォンビルブランド因子を有効成分として使用する血漿由来製剤において、ａ）Ａ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原、ｂ）Ｂ型糖鎖抗原及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原、ｃ）Ａ型糖鎖抗原、Ｂ型糖鎖抗原、及びＨ（Ｏ）型糖鎖抗原、ｄ）Ｈ（Ｏ）型糖鎖抗原より成る群より選択される糖鎖抗原を実質上一種含有する精製されたフォンビルブランド因子を有効成分として使用することを特徴とする血漿由来製剤。
- 精製されたフォンビルブランド因子を有効成分として使用する血漿由来製剤において、血漿中のＡ型糖鎖抗原及びＢ型糖鎖抗原を除去した血漿成分より調製されてなることを特徴とする血漿由来製剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10382492A JP3575770B2 (ja) | 1992-03-31 | 1992-03-31 | 血漿由来製剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10382492A JP3575770B2 (ja) | 1992-03-31 | 1992-03-31 | 血漿由来製剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06281650A JPH06281650A (ja) | 1994-10-07 |
| JP3575770B2 true JP3575770B2 (ja) | 2004-10-13 |
Family
ID=14364166
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10382492A Expired - Fee Related JP3575770B2 (ja) | 1992-03-31 | 1992-03-31 | 血漿由来製剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3575770B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0896824A1 (en) * | 1997-08-05 | 1999-02-17 | Octapharma Ag | A universally applicable blood plasma |
| JP2007297429A (ja) * | 2006-04-27 | 2007-11-15 | Institute Of Physical & Chemical Research | 糖鎖ライブラリの作製方法及びその利用 |
-
1992
- 1992-03-31 JP JP10382492A patent/JP3575770B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06281650A (ja) | 1994-10-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5925349A (en) | Treating inflammation via the administration of specific sulfatase enzymes and/or sulfation inhibitor | |
| Kornfeld et al. | Assembly of asparagine-linked oligosaccharides | |
| Carroll et al. | Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins. | |
| Pontes de Carvalho et al. | Characterization of a novel trans-sialidase of Trypanosoma brucei procyclic trypomastigotes and identification of procyclin as the main sialic acid acceptor. | |
| Tulsiani et al. | Swainsonine causes the production of hybrid glycoproteins by human skin fibroblasts and rat liver Golgi preparations. | |
| Perkins et al. | Erythrocyte receptor recognition varies in Plasmodium falciparum isolates | |
| Vaysse et al. | Adhesion and erythrophagocytosis of human senescent erythrocytes by autologous monocytes and their inhibition by beta-galactosyl derivatives. | |
| Ahrens et al. | The role of asparagine-linked carbohydrate in natural killer cell-mediated cytolysis. | |
| Fukuda | HEMPAS disease: genetic defect of glycosylation | |
| AU2008203095B2 (en) | Conversion of red blood cells A. B. and AB using a-n-acetylgalactosaminidases and a-galactosidase | |
| Schweden et al. | Characterization of trimming Man9-mannosidase from pig liver. Purification of a catalytically active fragment and evidence for the transmembrane nature of the intact 65 kDa enzyme | |
| Irimura et al. | Interaction of pokeweed mitogen with poly (N-acetyllactosamine)-type carbohydrate chains | |
| Zhou et al. | Effect of genetic background on glycosylation heterogeneity in human antithrombin produced in the mammary gland of transgenic goats | |
| JP5395747B2 (ja) | α−ガラクトシダーゼ | |
| Kahane et al. | The erythrocyte membranes in β-thalassemia. Lower sialic acid levels in glycophorin | |
| Endo et al. | Carbohydrate heterogeneity of human myeloma proteins of the IgA1 and IgA2 subclasses | |
| Takamoto et al. | Structures of asparagine-linked oligosaccharides of human placental fibronectin | |
| JP3575770B2 (ja) | 血漿由来製剤 | |
| Watzlawick et al. | Structure of the N-and O-glycans of the A-chain of human plasma. alpha. 2HS-glycoprotein as deduced from the chemical compositions of the derivatives prepared by stepwise degradation with exoglycosidases | |
| Ceriello et al. | Non-enzymatic glycation reduces heparin cofactor II anti-thrombin activity | |
| Dubernard et al. | Characterization of the binding of thrombospondin to human platelets and its association with the platelet cytoskeleton | |
| De Lisle | Characterization of the major sulfated protein of mouse pancreatic acinar cells: a high molecular weight peripheral membrane glycoprotein of zymogen granules | |
| Furukawa et al. | Structural study of the sugar chains of human platelet thrombospondin | |
| Reid et al. | Abnormal minor human erythrocyte membrane sialoglycoprotein (β) in association with the rare blood-group antigen Webb (Wb) | |
| AU700369B2 (en) | Treating inflammation via the administration of specific sulfatase enzymes and/or sulfation inhibitor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040705 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080716 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080716 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090716 Year of fee payment: 5 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |