JPWO2004005330A1 - 糖鎖アスパラギンを有する糖ペプチドの製造法及び該糖ペプチド - Google Patents

Abstract

（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基をエステル化反応させ、
（２）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（３）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸又は糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とアミド化反応させ、
（４）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（５）上記（３）及び（４）の工程を１回以上繰り返し、
（６）酸で樹脂（レジン）を切断することを特徴とする少なくとも１以上の糖鎖アスパラギンを有するペプチドの製造方法、及び上記製造方法により取得可能な糖ペプチド。

Description

本発明は糖鎖アスパラギンを有する糖ペプチドの製造法及び該製造法により取得可能な糖ペプチドに関する。

近年、核酸（ＤＮＡ）、タンパク質に続く第三の鎖状生命分子として、糖鎖分子が注目されてきている。ヒトの体は、約６０兆個の細胞から成っている一大細胞社会であり、全ての細胞表面は糖鎖分子によって覆われている。例えば、ＡＢＯ式血液型は細胞表面の糖鎖の違いにより決定されている。
糖鎖は、細胞間の認識や相互作用に関わる働きをもち、細胞社会を成り立たせる要となっている。細胞社会の乱れは、癌、慢性疾患、感染症、老化などにつながる。
例えば、細胞が癌化すると糖鎖の構造変化が起こることが分かっている。また、コレラ菌やインフルエンザウイルスなどは、ある特定の糖鎖を認識し結合することにより、細胞に侵入し感染することが知られている。
糖鎖機能の解明は、新しい原理に基づく医薬品や食品の開発などをもたらし、病気の予防、治療に貢献するなど、幅広い応用が期待されている。
糖鎖は単糖の配列、結合様式・部位、鎖の長さ・分岐様式、全体の高次構造などの多様性から、核酸やタンパク質の構造と比べると非常に複雑な構造である。従って、その構造に由来する生物学的な情報は核酸やタンパク質に比べて多種多様である。糖鎖は、研究の重要性を認識されながらも、その構造の複雑さや多様性により、核酸やタンパク質に比べて研究の推進が遅れている状況にある。
上記のように細胞膜表面や血清などに存在するタンパク質の多くは糖鎖が結合している。糖鎖がタンパク質に共有結合した分子は糖タンパク質とよばれ、糖とタンパク質との結合様式の違いから２つのグループに分けることができる。一つはアスパラギン（Ａｓｎ）の側鎖のアミノ基と糖鎖が結合したアスパラギン結合型糖鎖（Ｎ−グリコシド結合型）である。もう一方はセリン（Ｓｅｒ）やトレオニン（Ｔｈｒ）のアルコールに糖鎖が結合したムチン結合型糖鎖（Ｏ−グリコシド結合型）である。すべてのアスパラギン結合型糖鎖は５つの糖残基からなる基本骨格をもち、結合する糖鎖の非還元末端の糖残基の種類によって高マンノース型、複合型、混成型のサブグループに分類される。一方ムチン結合型糖鎖は基本骨格（コア）の違いから４グループに分類される。
ペプチド合成法として現在広く用いられているのは、１９６３年にＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄによって開発された固相合成法である。固相合成法は樹脂（レジン）とよばれる固相上にアミノ酸をつなげ、ペプチド鎖を伸長していく。ペプチド鎖の伸長が終了したら、固相からペプチド鎖を切り出し、目的物を得る。この応用としてペプチド鎖伸長の際、糖鎖を結合させたアミノ酸を組み込むことで糖ペプチド鎖の合成が可能となる。
そこでＡｓｎやＳｅｒ（Ｔｈｒ）に糖鎖を結合させた糖鎖アミノ酸をペプチド合成に応用し、糖ペプチド鎖の合成が盛んに行なわれるようになった。しかし化学合成の技術進歩にもかかわらず大きな糖鎖を持ったペプチド鎖を化学的に合成した例は少ない。
そのひとつめの問題点として、アスパラギン残基と結合させる糖鎖の絶対量の不足である。糖鎖を得る手段として、生体内に存在する糖タンパク質から糖鎖だけを遊離させる方法がある。しかし糖タンパク質から糖鎖を切り出す際に用いる、ヒドラジンは危険であり、大量に糖鎖を合成するのは困難である。また生体内には構造が酷似した糖鎖が多く存在し、単一の糖鎖のみを得るのは難しい。さらにヒドラジン分解により糖鎖とアスパラギン残基が解離するため、遊離させた糖鎖とアスパラギン残基を再び結合させなくてはならないので、行程数が増えてしまう。
また糖鎖を化学合成により合成する場合、１０個程度の糖残基が連結した糖鎖を合成された例はあるが、その多くが、目的物である糖鎖を１年間で数ミリグラム程度しか合成できていない。このため化学合成により糖鎖を得るのは困難となっている。
ふたつめの問題として、ペプチド固相合成の後にペプチド鎖を固相から切り出すためのＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）処理である。例えば糖鎖の非還元末端に存在するシアル酸は酸性条件下で容易に加水分解されてしまうため、ＴＦＡ処理によってシアル酸が合成した糖ペプチドから切りはなされてしまう可能性がある。このためにシアル酸を有する糖鎖を固相合成に用いた例はほとんどない。この問題の解決法として、ペプチド合成後にシアル酸転移酵素によりシアル酸を、糖鎖に転移させる方法が報告されている。しかしこの方法はシアル酸を導入する方法としては有用であるが、糖転移酵素が高価であるため、糖ペプチドの大量合成は困難という問題も残っている。
しかしながら、以下に述べるように本発明では糖ペプチドを人工的に容易に大量に合成可能となったので、上記シアル酸転移酵素を用いてシアル酸もしくはその誘導体を導入することも工業的に可能となった。
また従来シアル酸そのものの結合した糖鎖は天然に存在するが、シアル酸の誘導体の結合した糖鎖は天然には存在しないため、シアル酸誘導体を糖鎖に導入するためにはいずれにしてもシアル酸転移酵素を用いるしか方法がなかった。
本発明の課題は少なくとも１以上の糖鎖アスパラギンまたはムチン結合型糖鎖をペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを人工的に容易に大量に合成可能な糖ペプチドの製造法を提供することにある。
また本発明の課題はシアル酸を有する糖鎖アルパラギンであっても、酸処理によってシアル酸が糖ペプチドから切断されず、容易にシアリル糖ペプチドを得る方法を提供することにある。
また本発明の課題は糖残基が任意に除去された各種の新規な糖鎖アスパラギンの少なくとも１以上をペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを人工的に容易に大量に合成可能な糖ペプチドの製造法を提供することにある。
また本発明の課題は糖ペプチドにシアル酸転移酵素を用いてシアル酸もしくはその誘導体を導入することにより、シアル酸もしくはその誘導体が導入された糖ペプチドの製造法を提供することにある。
また本発明の課題は上記各種の糖ペプチドの製造法により、取得可能な糖ペプチドを提供することにある。

本発明は（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性（ｆａｔ−ｓｏｌｕｂｌｅ）保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基をエステル化反応させ、
（２）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（３）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
（４）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（５）上記（３）及び（４）の工程を１回以上繰り返し、
（６）脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とアミド化反応させ、
（７）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（８）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
（９）上記（７）及び（８）の工程を１回以上繰り返し
（１０）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（１１）酸で樹脂（レジン）を切断することを特徴とする少なくとも１以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドの製造法に係る。
本発明は（６）の、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とアミド化反応させ、（７）の、上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程を、適宜追加する少なくとも２以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドの製造法に係る。
本発明は（６）の、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とアミド化反応させ、（７）の、上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程を、最終工程で行う少なくとも１以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖に有する糖ペプチドの製造法に係る。
本発明は（６）の工程に代えて、或いは（６）の工程に加えて、（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基をエステル化反応させる、糖ペプチドの製造法に係る。
本発明は（６）の糖鎖アスパラギンが、６以上の糖残基を有するものである糖ペプチドの製造法に係る。
本発明は（６）の糖鎖アスパラギンが、９〜１１の糖残基を有するものである糖ペプチドの製造法に係る。
本発明は（６）の糖鎖アスパラギンが、６以上の糖残基を有し、２分岐型糖鎖を結合したものである糖ペプチドの製造法に係る。
本発明は（６）の糖鎖アスパラギンが、ジシアロ糖鎖アスパラギンもしくはモノシアロ糖鎖アスパラギンであって、該シアル酸のカルボキシル基が保護基により保護されたものである記載の糖ペプチドの製造法に係る。
本発明は（６）の糖鎖アスパラギンが、アシアロ糖鎖アスパラギンである糖ペプチドの製造法に係る。
本発明は糖鎖アスパラギンの一部又は全部の代わりにムチン結合型糖鎖を用いる糖ペプチドの製造法に係る。
本発明は上記製造法により、取得可能な少なくとも１以上の糖鎖アスパラギンまたはムチン結合型糖鎖をペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドに係る。
本発明は糖鎖アスパラギンまたはムチン結合型糖鎖が、６以上の糖残基を有し、２分岐型糖鎖を結合したものである糖ペプチドに係る。
本発明は糖鎖アスパラギンとしてジシアロ糖鎖アスパラギン及びモノシアロ糖鎖アスパラギンから選ばれる少なくとも１種以上を結合した糖ペプチドに係る。
本発明は（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基をエステル化反応させ、
（２）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（３）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
（４）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（５）上記（３）及び（４）の工程を１回以上繰り返し、
（６）脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とアミド化反応させ、
（７）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（８）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
（９）上記（７）及び（８）の工程を１回以上繰り返し
（１０）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（１１）酸で樹脂（レジン）を切断し、
（１２）得られた糖ペプチドにシアル酸転移酵素を用いてシアル酸もしくはその誘導体を転移させることを特徴とする少なくとも１以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有し、且つ末端にシアル酸もしくはその誘導体残基を有する糖ペプチドの製造法に係る。
本発明は上記工程（１１）の酸で樹脂（レジン）を切断する前に、標識剤を反応させる糖ペプチドの製造法に係る。
本発明は標識剤がダンシルハライドである糖ペプチドの製造法に係る。
本発明はＮ−アセチル−４−デオキシ−４−フルオロ−Ｄ−マンノサミン、ピルビン酸ナトリウム、牛血清アルブミン、シアル酸アルドラーゼを反応させることを特徴とする５−アセタミド−３，５，７−トリデオキシ−７−フルオロ−Ｄ−グリセロ−β−Ｄ−ラクト−２−ノヌロピラノシドニック アシッドの製造法に係る。
本発明はベンジル ２−アジド−２，４−ジデオキシ−４−フルオロ−β−Ｄ−マンノピラノシドを、無水酢酸の存在下、水素添加して、Ｎ−アセチル−４−デオキシ−４−フルオロ−Ｄ−マンノサミンを得て、次いでこれとピルビン酸ナトリウム、牛血清アルブミン、シアル酸アルドラーゼを反応させることを特徴とする５−アセタミド−３，５，７−トリデオキシ−７−フルオロ−Ｄ−グリセロ−β−Ｄ−ラクト−２−ノヌロピラノシドニック アシッドの製造法に係る。
本発明者は、先に特願２００１−１８５６８５号（以下、先願という）において、種々の単離された糖鎖アスパラギン誘導体を従来に比べて非常に容易かつ大量に得ることができる、糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン、糖鎖の製造方法、更には糖残基が任意に欠失した糖鎖が結合した新規な糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン、糖鎖を開発した。
この先願の方法は例えば
（１） （ａ）１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、
ならびに
（ｂ）該糖鎖アスパラギン誘導体混合物または該糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、
を含む、糖鎖アスパラギン由来の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（２） （ｂ’）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程をさらに含む前記（１）記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（３） １種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物が、下記式（Ａ）の化合物および／または該化合物において１以上の糖残基が欠失した化合物を含むものである、前記（１）または（２）記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（４） 脂溶性の保護基がフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である前記（１）〜（３）いずれか記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（５） 工程（ａ）が、非還元末端にシアル酸残基を有する１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンにＦｍｏｃ基を導入し、かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程である、前記（１）〜（３）いずれか記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（６） （ａ）１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、
（ｂ）該糖鎖アスパラギン誘導体混合物または該糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去して糖鎖アスパラギンを得る工程、
を含む、糖鎖アスパラギンの製造方法、
（７） （ｂ’）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程、および／または
（ｃ’）工程（ｃ）で得られた糖鎖アスパラギンを糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程、
をさらに含む、前記（６）記載の糖鎖アスパラギンの製造方法、
（８） １種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物が、下記式（Ａ）の化合物および／または該化合物において１以上の糖残基が欠失した化合物を含むものである、前記（６）または（７）記載の糖鎖アスパラギンの製造方法、
（９） 脂溶性の保護基がＦｍｏｃ基である前記（６）〜（８）いずれか記載の糖鎖アスパラギンの製造方法、
（１０） 工程（ａ）が、非還元末端にシアル酸残基を有する１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンにＦｍｏｃ基を導入し、かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程である、前記（６）〜（８）いずれか記載の糖鎖アスパラギンの製造方法などである。

ここで上記糖鎖アスパラギン誘導体は例えば式（６）で表される。

〔式中、Ｒ^１およびＲ^２は、水素原子、式（２）〜（５）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｒ^１およびＲ^２が共に式（３）である場合を除く。〕

また上記他の糖鎖アスパラギン誘導体は例えば式（７）で表される。

〔式中、Ｒ^ＸおよびＲ^Ｙは、一方が式（８）で示される基であり、他方が、水素原子、式（８）、または式（２）〜（５）で示される基である。〕

また上記糖鎖アスパラギンは例えば式（１）で表される。

〔式中、Ｒ^３およびＲ^４は、水素原子、式（２）〜（５）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｒ^３およびＲ^４が共に式（２）または式（３）である場合を除く。〕
これら糖鎖アスパラギン誘導体及び糖鎖アスパラギンの製造についての詳細は、上記先願に述べられているので、これを引用する。しかし若干先願の内容について述べると、先願の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法は、たとえば、天然の糖タンパク質に由来する糖鎖アスパラギン、好ましくはアスパラギン結合型糖鎖から得られる糖鎖アスパラギンの混合物に含まれる当該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入（結合）して糖鎖アスパラギン誘導体の混合物を得た後に当該混合物を各糖鎖アスパラギン誘導体に分離することを１つの大きな特徴とする。なお、本明細書において、「糖鎖アスパラギン」とはアスパラギンが結合した状態の糖鎖をいう。また、「アスパラギン結合型糖鎖」とはタンパク質のポリペプチド中のアスパラギン（Ａｓｎ）の酸アミノ基に、還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミンがＮ−グリコシド結合した糖鎖群であって、Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮａｃ（β１−４）ＧｌｃＮａｃを母核とする糖鎖群をいう。「糖鎖アスパラギン誘導体」とはアスパラギン残基に脂溶性の保護基が結合した状態の糖鎖アスパラギンをいう。また、化合物の構造式中、「ＡｃＨＮ」はアセトアミド基を示す。
前記するように、天然の糖タンパク質に由来する糖鎖は非還元末端の糖残基がランダムに欠失した糖鎖の混合物である。本発明者らは、意外にも天然の糖タンパク質に由来する糖鎖、具体的には糖鎖アスパラギンの混合物に含まれる当該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入することで、当該保護基が導入された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物を公知のクロマトグラフィーの手法を用いて容易に個々の糖鎖アスパラギン誘導体に分離することができることを見出した。それにより、種々の構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体をそれぞれ大量に調製することが可能となった。たとえば、従来分離が困難であった類似構造の糖鎖アスパラギン誘導体同士の分離が可能となり、それらの化合物を各々、容易かつ大量に調製することができる。また、得られた糖鎖アスパラギン誘導体を元に、たとえば、糖加水分解酵素を順次作用させて糖残基を除去することにより、さらに様々な糖鎖アスパラギン誘導体を合成することもできる。
このように、糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して誘導体化することにより個々の糖鎖アスパラギン誘導体の分離が可能となったが、これは、脂溶性の保護基を導入したことにより糖鎖アスパラギン誘導体の全体の脂溶性が高まり、たとえば、好適に使用される逆相系カラムとの相互作用が格段に向上し、その結果、より鋭敏に糖鎖構造の差を反映して個々の糖鎖アスパラギン誘導体が分離されるようになったことによると考えられる。
さらに先願によれば、得られた糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去することにより種々の糖鎖アスパラギンを、人工的に容易かつ大量に得ることができる。
本発明では上記先願で得られた各種の糖鎖アスパラギンを用いて、本発明の上記方法により、目的とする糖ペプチドを得るものである。
本発明の方法においては先ず、（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基をエステル化反応させる。
この場合アミノ酸のアミノ基窒素を脂溶性保護基で保護しているので、アミノ酸同士の自己縮合は防止され、レジンの水酸基とアミノ酸のカルボキシル基が反応してエステル化が起こる。
次に（２）上記で得られたエステルの脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（３）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
（４）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（５）上記（３）及び（４）の工程を１回以上繰り返すことにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有するペプチドが得られる。
（６）次に、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基と上記遊離アミノ基をアミド化反応させ、
（７）更に上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（８）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
（９）上記（７）及び（８）の工程を１回以上繰り返し、
（１０）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させることにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有し、中間に糖鎖アスパラギンを有する糖ペプチドが得られる。
（１１）そして、酸で樹脂（レジン）を切断することにより、糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することができる。
更に、上記（６）の脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基と上記遊離アミノ基をアミド化反応させる工程を、適宜追加することにより少なくとも２以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することができる。またこの時、異なる糖鎖アスパラギンを用いることにより２種以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することもできる。
また、この糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の端部に導入することもできる。
更には、糖鎖アスパラギンのようなアスパラギン結合型糖鎖の一部又は全部の代わりにムチン結合型糖鎖を用いることもできる。
本発明において水酸基を有する樹脂（レジン）としては、通常、固相合成で使用する水酸基を有する樹脂（レジン）であればよく、例えばＷａｎｇレジン（メルク社製）、ＨＭＰＡ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）等を用いることができる。
アミノ酸としては全てのアミノ酸を用いることができ、例えばセリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）を挙げることができる。
脂溶性保護基としては、例えば９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基などの、カーボネート系またはアミド系の保護基等を挙げることができる。脂溶性保護基を導入するには、例えばＦｍｏｃ基を導入する場合には９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１〜５時間程度行うのが良い。
脂溶性保護基で保護したアミノ酸としては、上記のアミノ酸を上記の方法で製造するができる。また、市販のものも使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−ＡＩａ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏを挙げることができる。
エステル化触媒として、例えば１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）などの脱水縮合剤を用いることができる。エステル化反応は例えば固相カラムにレジンを入れ、溶媒で洗浄し、その後アミノ酸の溶媒溶液を加えることにより行うのが好ましい。洗浄用溶媒としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２−プロパノール、塩化メチレン等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０分〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。
この時固相上の未反応の水酸基を無水酢酸等を用いてアセチル化しキャッピングすることも好ましい。
脂溶性保護基の脱離は、例えば塩基で処理することにより行うことができる。塩基としては、例えばピペリジン、モルホリン等を挙げることができる。その際、溶媒の存在下行うのが好ましい。溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール等を挙げることができる。
遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させる反応、活性化剤および溶媒の存在下行うのが好ましい。
活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ／ＨＣｌ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウム（ＤＩＰＣＩ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ヒドロキシフタルイミド（ＨＯＰｈｔ）、ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ−ＯＨ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロジ−４−オキサ−１，２，３−ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ）等を挙げることができる。
活性化剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、１〜２０当量、好ましくは１〜１０当量、さらに好ましくは、１〜５当量とするのが好ましい。
溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。この際にも固相上の未反応の水酸基を無水酢酸等を用いてアセチル化しキャッピングするのが好ましい。脂溶性保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。
樹脂（レジン）からペプチド鎖を切断するには酸で処理するのが好ましい。酸としては、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、弗化水素（ＨＦ）等を挙げることができる。
本発明においては上記（６）の、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とアミド化反応させ、（７）の、上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程を、適宜追加することにより、少なくとも２以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することができる。
また本発明においては上記（６）の、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とアミド化反応させ、（７）の、上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程を、最終工程で行うことにより、少なくとも１以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖に有する糖ペプチドを製造することができる。
また本発明においては上記（６）の工程に代えて、或いは（６）の工程に加えて、（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基をエステル化反応させることにより、端部に糖鎖アスパラギンを有する糖ペプチドを製造することができる。
本発明において用いる糖鎖アスパラギンは任意の数の糖残基を有するものが使用できるが、特に従来にない６以上の糖残基を有する糖鎖アスパラギンあるいはムチン結合型糖鎖を使用することもでき、本発明の特異な特徴を構成する。特に９〜１１の糖残基を有する糖鎖アスパラギンを使用することも可能である。
更には６以上の糖残基を有し、２分岐型糖鎖を結合した糖鎖アスパラギンを使用することも可能である。例えば糖鎖アスパラギンが、ジシアロ糖鎖アスパラギンもしくはモノシアロ糖鎖アスパラギンを使用することも可能である。このようなジシアロ糖鎖アスパラギンもしくはモノシアロ糖鎖アスパラギンが結合した糖ペプチドは本発明の好ましい糖ペプチドである。
糖鎖アスパラギンが、ジシアロ糖鎖アスパラギンもしくはモノシアロ糖鎖アスパラギンであって、該シアル酸のカルボキシル基が保護基により保護されたものを使用することも可能である。
本発明において用いる糖鎖アスパラギンあるいはムチン結合型糖鎖は、該糖鎖の水酸基を保護してもよい。保護基としては、例えば、アセチル基、トリエチルシリル基等を挙げることができる。好ましくは、合成した糖ペプチドから切断する時に同時に酸で処理できる保護基が好ましい。例えば、トリエチルシリル基を挙げることができる。
糖鎖アスパラギンが、ジシアロ糖鎖アスパラギンもしくはモノシアロ糖鎖アスパラギンである場合、該シアル酸は酸により切断される恐れがあるので、上記のような該シアル酸のカルボキシル基が保護基により保護されたものは、該シアル酸が切断されることが防止され好ましい。この保護基としては、例えばベンジル基、アリル基、ジフェニルメチル基等を挙げることができる。
シアル酸のカルボキシル基に保護基を導入する反応は、公知の方法、例えばＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ＩＮＣ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９１，ＩＳＢＮ ０−４７１−６２３０１−６ 参照）により行うことができる。
本発明において、シアル酸の誘導体としては、シアル酸の７位、８位或いは９位の炭素に結合している水酸基を水素原子或いはハロゲン原子で置換したものを挙げることができる。ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素等を挙げることができるが、好ましくはフッ素がよい。
本発明において、シアル酸転移酵素としては、一般に市販されているシアル酸転移酵素を用いることができ、転移させるシアル酸或いはシアル酸の誘導体の種類、結合様式により適宜選択することができる。具体的には、Ｒａｔ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来のもの、Ｒａｔ Ｌｉｖｅｒ由来のものを挙げることができる。また、シアリターゼを用いてｐＨ調整等により平衡をずらすことにより、シアル酸或いはシアル酸の誘導体を転移させてもよい。
本発明の糖ペプチドは医薬品開発等の分野において非常に有用である。たとえば、医薬品開発における応用例としては、たとえば、ガンのワクチン合成があげられる。細胞がガン化すると体内にはなかった糖鎖が発現することが知られている。また、当該糖鎖を化学的に合成し、ワクチンとして個体に投与すると、ガンの増殖が抑制されることも知られている。そこで、本発明により所望の糖ペプチドを製造することができれば、ガンの治療に有効なワクチンの合成を行うことが可能である。また、本発明により得られる糖ペプチドを、さらに化学的な反応および糖転移酵素による反応などを組み合わせて新たな糖残基を結合させて誘導体化し、新規なワクチンの合成を行うことも可能である。
糖ペプチドは、糖の結合していないペプチドに比べて水に対する溶解度が高くなり、また、水溶液及び血中等での安定性も高くなる。
非還元末端のシアル酸の誘導体化は糖鎖自身の分解を防ぐことができ、そのことにより糖ペプチドの安定性をより高めることができる。
さらに非還元末端のシアル酸誘導体化は非天然型糖鎖であるので、ワクチン製造にも有効な場合がある。

以下に実施例を挙げて説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。
まず、以下で用いるＦｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｏｐｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｏｐｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｏｐｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）は公知の物質であり、それぞれ購入したものを用いた。ここで例えば、Ｌｅｕ−ＯｐｆｐのＯｐｆｐとは、ロイシン（Ｌｅｕ）のカルボキシル基がペンタフルオロフェニル（ｐｆｐ）基により保護されたもの、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨとは、セリン（Ｓｅｒ）の水酸基がベンジル（Ｂｚｌ）基により保護されたもの、Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨとは、セリン（Ｓｅｒ）のＯＨ基がｔ−ブチル（ｔＢｕ）基により保護されたものを意味する。
参考例１
ジシアロ糖鎖アスパラギン（１０）の合成
粗精製のＳＧＰ（シアリルグリコペプチド）５００ｍｇとアジ化ナトリウム１０ｍｇ（３１９μｍｏｌ）をトリス−塩酸・塩化カルシウム緩衝溶液（ＴＲＩＺＭＡ ＢＡＳＥ ０．０５ｍｏｌ／ｌ、塩化カルシウム０．０１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ＝７．５）２５ｍｌに溶解させた。これにアクチナーゼ−Ｅ（タンパク質分解酵素、科研製薬）５０ｍｇをトリス−塩酸・塩化カルシウム緩衝溶液５ｍｌに溶かした溶液を加え、３７℃で静置した。１１５時間後、この溶液を凍結乾燥した。この残留物をゲルろ過カラムクロマトグラフィーで２回精製し、目的のジシアロ糖鎖アスパラギン１０を２５２ｍｇ得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃） δ５．１３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．６０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ５，５−Ｈ−１），４．４４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｇａｌ６，６−Ｈ−１），４．２５（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．２０（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．１２（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．９４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６７，２．６６（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１２．４Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７−Ｈ−３_ｅｑ），２．０７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０６（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．０２（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．０１（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．７１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１２．４Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７−Ｈ−３_ａｘ．
参考例２
Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシアロ糖鎖アスパラギン（１１）の合成
参考例１で得られたジシアロ糖鎖アスパラギン（１０）８０ｍｇ（０．０３４ｍｍｏｌ）を蒸留水２．７ｍｌとアセトン４．１ｍｌ混合溶液に溶解させ、これに９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミジルカーボネート（Ｆｍｏｃ−ＯＳｎ）３４．７ｍｇ（０．１０３ｍｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム１１．５ｍｇ（０．１３７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。ＴＬＣで反応終了を確認後この溶液を減圧濃縮し、アセトンを除去した。残渣をオクタデシルシリル基を結合したシリカゲルを充填したカラム（ＯＤＳカラム）にかけ精製し、目的のＦｍｏｃ−ジシアロ糖鎖アスパラギン（１１）６０．１ｍｇ 収率６８％を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
８．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．８０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．６０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．２３（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ_１），５．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ_１），５．０４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ_１），４．８６（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ_１），４．７０〜４．６６（ｍ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ_１ ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ_１），４．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ_１），４．４４（１Ｈ，ｄ，ＦｍｏｃＣＨ），４．３４（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ３−Ｈ_２），４．２９，（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ_２），４．２０（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ４−Ｈ_２），２．７７（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ_３ｅｑ），２．８０（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６２（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１４（１８Ｈ，ｓ×６，−Ａｃ），１．８０（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ_３ａｘ）
参考例３
Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護され、且つシアル酸のカルボキシル基がベンジル基で保護されたジシアロ糖鎖アスパラギン（１２）の合成
４℃に冷やしたＤｏｗｅｘ−５０Ｗｘ８（Ｈ^＋）のカラム（φ０．５ｃｍ×５ｃｍ）に、Ｆｍｏｃ−アスパラギン結合型二分岐糖鎖（２０ｍｇ）の冷水溶液を流し、溶出した水溶液を凍結乾燥した。
得られたＦｍｏｃ−アスパラギン結合型二分岐糖鎖を４℃の冷水に溶かし、これにＣｓ_２ＣＯ_３水溶液（２．５ｍｇ／１ｍｌ）を加え水溶液のｐＨが５〜６になるよう調整し、その後、糖鎖水溶液を凍結乾燥した。凍結乾燥後のＦｍｏｃ−ジシアロ糖鎖試料を乾燥ＤＭＦ（１．３ｍｌ）に溶かし、ベンジルブロミド（５．１μｌ）を加えてアルゴン気流下室温で４５時間攪拌した。ＴＬＣで反応終了を確認後、反応溶液を０℃に冷やしジエチルエーテル１０ｍｌを加え目的物を析出させた。これをろ紙でろ過した。残った目的物に蒸留水を加えろ液として溶出させ、続いてこれを減圧濃縮した。得られた残渣をＯＤＳカラムにかけ精製し目的のジベンジルＦｍｏｃ−ジシアロ糖鎖アスパラギン（１２）１８．２ｍｇ（収率８５％）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃），
７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．７０（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．５３−７．４０（ｍ，９Ｈ，Ｂｎ，Ｆｍｏｃ），５．３６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１．６，Ｈｚ，ＣＨ_２），５．３０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，ＣＨ_２），５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ_１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ_１），４．９３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ_１），４．７５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ_１），４．５７（ｍ，３Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ_１，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ_１），４．３２（ｄ，２Ｈ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ_１），４．２４（ｄ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ_２），４．１８（ｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ_２），４．１０（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ_２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６７（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ_３ｃｑ），２．５１（ｂｄｄ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０６（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０３，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ６Ｈ，Ａｃ×２），１．８９（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．２，１２．２Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ_３ａｘ）
ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_１１７Ｈ_１６５Ｎ_８Ｎａ_２Ｏ_６６［Ｍ＋Ｎａ^＋］２７８３．９５９７，ｆｏｕｎｄ ２７８３．９５０１
参考例４
特願２００１−１８５６８５号に準じてモノシアロ糖鎖アスパラギンを得た。
参考例５
ＨＯＯＣ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ_２（１３）の合成
Ｉ 樹脂（レジン）への導入
固相合成用カラムにＷａｎｇレジン１．６ｇを入れ、メチレンクロライド、次いでメタノールで十分に洗浄し乾燥させた。Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ ４０９．２ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ・Ｈ_２Ｏ）１２１．５ｍｇ（０．９ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）４．５ｍｌに溶解させ、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）２４７．５ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）を加え、０℃で１５分攪拌してアミノ酸溶液を得る。樹脂をＤＭＦで膨潤させる。上記アミノ酸溶液を固相合成用カラムに入れ室温で１７時間攪拌した。攪拌後、樹脂をメチレンクロライド、イソプロパノール、メタノールの順で洗浄し、乾燥させた。
乾燥させた樹脂をカラム内でＤＭＦで膨潤させた後、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液約１０ｍｌを加え、室温で１５分間攪拌してＦｍｏｃ基を脱保護してレジン−Ｖａｌ−ＮＨ_２を得た。次いでＤＭＦで洗浄し、乾燥させた。
ＩＩ ペプチド鎖の伸長
乾燥させた樹脂（レジン−Ｖａｌ−ＮＨ_２）をカラム内でＤＭＦで膨潤させた後、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ３１８．６ｍｇ（０．９ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ_２Ｏ １２１．５ｍｇ（０．９ｍｍｏｌ）を加え樹脂が浸るくらいにＤＭＦを加えた。ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）１３８．５μｌ（０．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。攪拌後、ＤＭＦで洗浄し、乾燥させた。
乾燥させた樹脂をカラム内でＤＭＦで膨潤させた後、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液約１０ｍｌを加え、室温で１５分間攪拌してＦｍｏｃ基を脱保護してレジン−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＮＨ_２を得た。次いでＤＭＦで洗浄し、乾燥させた。
乾燥させた樹脂をカラム内でＤＭＦで膨潤させた後、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ ３１８．６ｍｇ（０．９ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ_２Ｏ １２１．５ｍｇ（０．９ｍｍｏｌ）を加え樹脂が浸るくらいにＤＭＦを加えた。ＤＩＰＣＤＩ １３８．５μｌ（０．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。攪拌後、ＤＭＦで洗浄し、乾燥させた。
乾燥させた樹脂をカラム内でＤＭＦで膨潤させた後、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液約１０ｍｌを加え、室温で１５分間攪拌してＦｍｏｃ基を脱保護してレジン−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＮＨ_２を得た。次いでＤＭＦで洗浄し、乾燥させた。
乾燥させた樹脂をカラム内でＤＭＦで膨潤させた後、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ ２９３．４ｍｇ（０．９ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ_２Ｏ １２１．５ｍｇ（０．９ｍｍｏｌ）を加え樹脂が浸るくらいにＤＭＦを加えた。ＤＩＰＣＤＩ １３８．５μｌ（０．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。攪拌後、ＤＭＦで洗浄し、乾燥させた。
乾燥させた樹脂をカラム内でＤＭＦで膨潤させた後、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液約１０ｍｌを加え、室温で１５分間攪拌してＦｍｏｃ基を脱保護してレジン−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ_２を得た。次いでＤＭＦで洗浄し、乾燥させた。
ＩＩＩ 固相からの切り出し
ＨＯＯＣ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ_２の合成
乾燥させた樹脂にＴＦＡ５％水溶液を加え、室温で３時間攪拌した。攪拌後、溶液をナスフラスコに移し取り氷中でジエチルエーテルを加え、目的物を沈殿させ、これをろ過した。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
８．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｌｅｕ−２ＮＨ），８．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，Ｌｅｕ−１ＮＨ），８．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，Ｖａｌ ＮＨ），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｖａｌ−α），４．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ａｌａ−α），２．２７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｖａｌ−β），１．６９〜１．５８（ｍ，１１Ｈ，Ｌｅｕ−１，Ｌｅｕ−２），１．５９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ａｌａ−β），１．０１〜０．９６（ｍ，２５Ｈ，Ｌｅｕ−１，Ｌｅｕ−２，Ｖａｌ）

参考例４の固相から切り出す前の乾燥したレジン−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ_２からなる樹脂１７ｍｇをエッペンチューブに取った。参考例３で得られたジベンジルＦｍｏｃ−ジシアロ糖鎖アスパラギン（１２）３５ｍｇ（１４．８μｍｏｌ）とＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−ｙｌ）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）０．６４ｍｇ（２．７μｍｏｌ）を加え、ＤＭＦを１５０μｌ加えた。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）０．３１μｌを加え、室温で２４時間攪拌した。攪拌後、ＤＭＦで洗浄し乾燥させた。
乾燥させた樹脂をエッペンチューブ内で膨潤させた後、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液約１ｍｌを加え、室温で１５分間攪拌し攪拌してＦｍｏｃ基を脱保護してレジン−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ（ｏｌｉｇｏ）−ＮＨ_２を得た。次いでＤＭＦで洗浄し、乾燥させた。ここでＡｓｎ（ｏｌｉｇｏ）とは参考例３で得られたジベンジルＦｍｏｃ−ジシアロ糖鎖アスパラギン（１２）からＦｍｏｃ基の脱離したジベンジル−ジシアロ糖鎖アスパラギンである。
（固相からの切り出し）
ＨＯＯＣ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ（ｏｌｉｇｏ）−ＮＨ_２の合成
乾燥させた上記樹脂にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）９５％水溶液を加え、室温で３時間攪拌した。攪拌後、溶液をエッペンチューブに移し取り氷中でジエチルエーテルを加え、目的物を沈殿させた。沈殿物を０．１％ＴＦＡ水溶液に溶かし、逆相カラムクロマトグラフィーで精製した。（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ２５０×３．０ｍｍ 流速０．４５ｍｌ／ｍｉｎ 展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ：０．１％ＴＦＡ アセトニトリル：水＝９０：１０を用いた。
グラジエント Ａのみ１０分 Ａ１００％→Ｂ１００％ ３０分），
上記Ａｓｎ（ｏｌｉｇｏ）の構造を下記に示す。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
７．５９〜７．５５（ｍ，１０Ｈ，Ｂｎ），５．４５（４Ｈ，ｄｄ，Ｂｎ−ＣＨ_２×２），５．２３（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ_１），５．１５（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ_１），５．０３（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ_１），４．８７（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ_１），４．６７（３Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ_１，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ_１），４．４２（２Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ_１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ_２），４．２８（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ_２），４．２０（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ_２），２．８２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６８Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ_３ｅｑ），２．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．６９Ｈｚ，６．８３Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１３（１８Ｈ，ｓ×６，−Ａｃ），１．９４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．２４Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ_３ａｘ），１．４１〜１．２６（ｍ，２５Ｈ，Ｌｅｕ−１，Ｌｅｕ−２，Ｖａｌ）

ＨＯＯＣ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ｏｌｉｇｏ）−ＮＨ_２の合成
Ｉ 樹脂（レジン）への導入
固相合成用カラムにＰＥＧＡレジン５０ｍｇを入れ、メチレンクロライド、次いでメタノールで十分に洗浄し乾燥させた。
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ ８０ｍｇ（１８０μｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ_２Ｏ １９ｍｇ（１３５μｍｏｌ）をＤＭＦ １０ｍｌに溶解させ、ＤＣＣ３７ｍｇ（１８０μｍｍｏｌ）を加え、０℃で１５分攪拌してアミノ酸溶液を得る。樹脂をＤＭＦで膨潤させる。上記アミノ酸溶液を固相合成用カラムに入れ室温で１７時間攪拌した。攪拌後、樹脂をメチレンクロライド、イソプロパノール、メタノールの順で洗浄し、乾燥させた。
乾燥させた樹脂をカラム内でＤＭＦで膨潤させた後、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液約２．０ｍｌを加え、室温で１５分間攪拌してＦｍｏｃ基を脱保護してレジン−Ｓｅｒ−ＮＨ_２を得た。次いでイソプロパノールとＤＭＦで洗浄し、乾燥させた。
ＩＩ ペプチド鎖の伸長
乾燥させた樹脂をカラム内でＤＭＦで膨潤させた後、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ ４０．０ｍｇ（８９．８μｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ_２Ｏ １２ｍｇ（８９．８μｍｏｌ）を加えＤＭＦ ２．０ｍｌ加えた。ＤＩＰＣＤＩ １４μｌ（８９．８μｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。攪拌後、ＤＭＦで洗浄し、乾燥させた。
乾燥させた樹脂をカラム内でＤＭＦで膨潤させた後、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液約２．０ｍｌを加え、室温で１５分間攪拌してＦｍｏｃ基を脱保護してレジン−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ＮＨ_２を得た。次いでイソプロパノールとＤＭＦで洗浄し、乾燥させた。
乾燥させた樹脂をカラム内でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で膨潤させた後、参考例３で得られたジベンジル−Ｆｍｏｃ−ジシアロ糖鎖アスパラギン（１２）１３．５ｍｇ（５．７μｍｏｌ）をＤＭＦに溶かしカラムに移し入れた。これにＨＡＴＵ １．６ｍｇ（６．８μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ ０．８３μｌを加え、室温で２４時間攪拌した。攪拌後、イソプロパノールとＤＭＦで洗浄し乾燥させた。
乾燥させた樹脂をエッペンチューブ内で膨潤させた後、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液約１ｍｌを加え、室温で１５分間攪拌し、Ｆｍｏｃ基を脱保護してレジン−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ｏｌｉｇｏ）−ＮＨ_２を得た。次いでＤＭＦで洗浄し、乾燥させた。ここでＡｓｎ（ｏｌｉｇｏ）は実施例１のものと同じものである。
ＩＩＩ 固相からの切り出し
乾燥させた樹脂にＴＦＡ９５％水溶液を加え、室温で３時間攪拌した。反応溶液を、逆相カラムクロマトグラフィーで精製した。（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ ２５０×３．０ｍｍ 流速０．３５ｍｌ／ｍｉｎ 展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ：０．１％ＴＦＡ アセトニトリル：水＝９０：１０を用いた。グラジエントＡ １００％→Ｂ１００％ １２０分）
^１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
７．６０〜７．４５（ｍ，２０Ｈ，Ｂｎ），５．３５（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，Ｂｎ−ＣＨ_２−），５．２１（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ_１），５．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ_１），５．０３（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ_１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ_２），４．２８（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ_２），４．２０（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ_２），２．８２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６８Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ_３ｅｑ），２．１３（１８Ｈ，ｓ×６，−Ａｃ），１．９３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．２４Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ_３ａｘ）

ＨＯＯＣ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ_２の合成
上記目的糖ペプチドにおけるＡｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）とは、ベンジル基で保護されていないシアル酸を有するジシアロオリゴアスパラギンを意味する。
固相合成用カラムにＨＭＰＡ−ＰＥＧＡレジン５０ｍｇを入れ、ＣＨ_２Ｃｌ_２，ＤＭＦで十分に洗浄し乾燥させた。
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ），Ｎ−メチルイミダゾールをＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解させ５分間撹拌した後、樹脂の入った固相合成用カラムに入れ室温で３時間攪拌した。攪拌後、樹脂をメチレンクロライド、イソプロパノール、ＤＭＦで洗浄し乾燥させた。その後、２０分間２０％無水酢酸ＤＭＦ溶液を用いて固相上の未反応のアミノ基をアセチル化しキャッピングした。ＤＭＦで樹脂を洗浄後、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を用いて２０分撹拌することによりＦｍｏｃ基を脱保護しレジン−Ｓｅｒ−ＮＨ_２を得た。ＤＭＦで洗浄後、乾燥させた。
次に、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨを用いＨＯＢｔ・Ｈ_２ＯとＤＩＰＣＤＩによって縮合させた。
次に、参考例３で得られたジベンジルＦｍｏｃ−ジシアロ糖鎖アスパラギン（１２）をＤＭＳＯ、ＤＭＦ１対１の混合溶媒に溶かし、ＨＡＴＵとＤＩＰＥＡを用いて室温２４時間攪拌させて縮合させた。ＤＭＦで洗浄後１０％無水酢酸／２−プロパノール：メタノールで２０分間攪拌しキャッピングした。樹脂を２−プロパノール、ＤＭＦで洗浄後、２０％ピペリジン／ＤＭＦで２０分間攪拌しＦｍｏｃ基を脱保護しＤＭＦで樹脂を洗浄した。
この樹脂に、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、アラニン（Ａｌａ）を同様に縮合およびＦｍｏｃ基の脱保護を行って、レジン−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ジベンジルｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ_２を得た。ここでＡｓｎ（ジベンジルｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）とは、ベンジル基で保護されたシアル酸を有するジシアロオリゴアスパラギンを意味する。
バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、アラニン（Ａｌａ）のアミノ酸はカルボキシル基をｐｆｐエステル化したＦｍｏｃ−ＡＡ−Ｏｐｆｐ（ＡＡ＝アミノ酸）を用い、３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−ｙｌ（Ｄｈｂｔ）によって縮合させた。すべての縮合はＤＭＦ溶液中で行った。
縮合が終了した樹脂をよく乾燥した後、９５％ＴＦＡ水溶液を加え、室温で３時間攪拌してレジンを切断した。レジンをろ過して除き、反応溶液を室温で減圧濃縮した後、水に溶かし凍結乾燥した。凍結乾燥品をｐＨ１１の水酸化ナトリウム水溶液に溶かし、ベンジルエステルを加水分解してベンジルを脱離した後、酢酸で中和しそのまま凍結乾燥した。凍結乾燥品をＨＰＬＣで精製することで目的とするＨＯＯＣ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ_２を得た。
（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ ２５０×３．０ｍｍ 展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ：０．１％ＴＦＡ アセトニトリル：水＝９０：１０ グラジエントＡ １００％ ０．３５ｍｌ／ｍｉｎ→Ｂ １００％ ０．４０ｍｌ／ｍｉｎ ９０分 流速０．３５ｍｌ／ｍｉｎから０．４０ｍｌ／ｍｉｎ）
^１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ ５．２２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１１（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０４（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８６（１Ｈ，Ａｓｎα），４．７０（ｂｄ，３Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５，５’−Ｈ１），４．６２−４．５７（ｍ，２Ｈ，Ｓｅｒα×２），４．５３（ｄ，２Ｈ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．５２−４．４８（ｍ，２Ｈ，Ｌｅｕα×２），４．３４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．２１−４．１５（ｍ，３Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ２，Ｖａｌα，Ａｌａα），２．９８（ｄｄ，１Ｈ，Ａｓｎβ），２．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ａｓｎβ），２．７５（ｂｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），２．１６−２．１０（Ａｃ×６，Ｖａｌβ），１．８２（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ），１．７６−１．６８（ｂｄ，６Ｈ，ＬｅｕβＣＨ_２×２，ＬｅｕγＣＨ×２），１．６０（ｄ，３Ｈ，ＡｌａβＣＨ_３），１．０３−０．９７（ｍ，１８Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ_３×４，Ｖａｌ−ＣＨ_３×２）

ＨＯＯＣ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ（ａｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ_２の合成
上記目的糖ペプチドにおけるＡｓｎ（ａｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）とは、下記で示される糖鎖アスパラギンである。

実施例３の固相から切り出す前のレジン−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ジベンジルｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ_２に、更にＡｓｎ（ａｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、アラニン（Ａｌａ）を用いて縮合させ、次いで実施例３と同様にペプチド鎖を固相から切り出し、次いでベンジル基を脱離してＨＯＯＣ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ（ａｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ_２からなる糖ペプチドを得た。
バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、アラニン（Ａｌａ）のアミノ酸はカルボキシル基をｐｆｐエステル化したＦｍｏｃ−ＡＡ−Ｏｐｆｐ（ＡＡ＝アミノ酸）を用い、３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−ｙｌ（Ｄｈｂｔ）によって縮合させた。すべての縮合はＤＭＦ溶液中で行った。そして２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を加え室温２０分攪拌しＦｍｏｃ基を脱保護した。
糖鎖アスパラギンの次にくるアミノ酸（Ｖａｌ）を導入後は２０％無水酢酸／２−プロパノール、メタノール１対１溶液で糖鎖アスパラギンの未反応のアミノ基をキャッピングした後にＦｍｏｃ基の脱保護を行った。樹脂をイソプロパノールとＤＭＦ洗浄し、乾燥した。Ｆｍｏｃ−アシアロ糖鎖アスパラギンの縮合は、実施例３のジベンジルＦｍｏｃ−ジシアロ糖アスパラギンの縮合と同様に行った。
得られたＨＯＯＣ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ（ａｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ_２からなる糖ペプチドの^１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）を以下に示す。
δ ５．２２，５．２１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ １Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１，ＭａｎＤ−Ｈ１），５．１１（ｄ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１，ＧｌｃＮＡｃＡ−Ｈ１），５．０３，５．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ １Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ１，ＭａｎＤ’−Ｈ−１），４．８６（２Ｈ，Ａｓｎα），４．６９−４．６６（ＧｌｃＮＡｃ２，Ｂ，５，５’，Ｅ，Ｅ’−Ｈ１），４．６１−４．４８（Ｌｅｕα×４，Ｓｅｒα×２，Ｇａｌ６，６’，Ｆ，Ｆ’−Ｈ１），４．３３（ｂｓ，２Ｈ，Ｍａｎ３，Ｃ−Ｈ２），４．２８（ｂｓ，２Ｈ，Ｍａｎ４，Ｄ−Ｈ２），４．２０（ｂｓ，２Ｈ，Ｍａｎ４’，Ｄ’−Ｈ２），４．２０−４．１７（Ｖａｌα×２，Ａｌａα×２），３．００（ｄｄ，２Ｈ，Ａｓｎβ×２），２．８３（ｄｄ，２Ｈ，Ａｓｎβ×２），２．７６（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），１．８２（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ），２．１６−２．１０（Ａｃ×１０，Ｖａｌβ），１．７０−１．６０（ｍ，Ｌｅｕβ，γ），１．６０，１．４９（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｌａβ），１．０２−０．９６（ｍ，３６Ｈ，Ｖａｌ−ＣＨ_３×４，Ｌｅｕ−ＣＨ_３×８）
参考例６
上記Ａｓｎ（ａｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）で示される糖鎖アスパラギンは、特願２００１−１８５６８５号の実施例に準じて合成した。そのＮＭＲデータを下記に示す。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ ５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．５８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ−１），４．４７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ−１），４．２４（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１９（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１．４Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．１２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１．４Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．９３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．９３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０５（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．０１（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）
また、参考例２と同様にしてＦｍｏｃ−アシアロ糖鎖アスパラギンを合成した。そのＮＭＲデータを下記に示す。
^１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ、３０℃）
δ ７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９３（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（２Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），３．０３（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），３．００（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１５（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ）
参考例７
（ベンジル ３，６−ジ−Ｏ−ピバロイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド Ｂｅｎｚｙｌ ３，６−ｄｉ−Ｏ−ｐｉｖａｌｏｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ １８の合成）

（１）化合物１７の合成
無水酢酸（６０ｍｌ）に酢酸ナトリウム（５ｇ，６９ｍｍｏｌ）を溶かし、加熱した後にＤ−ガラクトース（１６）（１０ｇ，５５ｍｍｏｌ）を少しずつ加える。２時間加熱還流した後ＴＬＣ（トルエン：酢酸エチル＝５：１）にて反応が終了したことを確認した。反応溶液を室温に戻した後に、氷水３００ｃｃに注ぐ。ろ過して沈殿物を集める。沈殿物をエタノール（１４ｍｌ）に溶かし再結晶を行い、化合物１７を９．０ｇ（収率４１％）得た。
（２）化合物１８の合成
化合物１７（４．３ｇ，１１ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１２０ｍｌ）の溶かした後、アルゴン気流下−２０℃まで冷却した。続いて、反応溶液に四塩化スズ（３．１ｇ，１２ｍｍｏｌ）を加え２０分撹拌した後、ベンジルアルコール（２．３ｇ，２２ｍｍｏｌ）を加え反応温度を室温に戻した。ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で反応終了を確認後、反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ、塩化メチレンで抽出した。塩化メチレン層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ろ過、減圧濃縮した。残渣をデシケータで乾燥後、蒸留したメタノール（８０ｍｌ）に溶かしナトリウムメトキシド（４３１ｍｇ，５．５ｍｍｏｌ）を加えアルゴン気流下撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：メタノール：水＝１０：５：１）で反応終了を確認した後、陽イオン交換樹脂ＩＲ−１２０（＋）で中和し反応を終了させた。樹脂をろ過して取り除いた後、濾液を減圧濃縮した。残渣をデシケータで乾燥後、ピリジン（４４ｍｌ）に溶かし、反応溶液を０℃に冷却した。反応溶液にピバロイルクロライド（４．６ｇ，３８．５ｍｍｏｌ）を加えた後、室温に戻しアルゴン気流下１時間撹拌した。反応終了をＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で確認し０℃に冷却後メタノールを加え反応を終了させた。反応溶液をそのまま減圧濃縮した後、残渣を酢酸エチルに溶かし飽和食塩水溶液、水で洗浄し無水硫酸マグネシウムで酢酸エチルを乾燥させた。硫酸マグネシウムをろ過して取り除いた後、濾液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し化合物１８（２．８ｇ，収率５８％）を得た。
参考例８
（ベンジル ２−Ｏ−クロロアセチル−４−デオキシ−４−フルオロ−３，６−ジ−Ｏ−ピバロイル−β−Ｄ−グルコピラノシド Ｂｅｎｚｙｌ ２−Ｏ−ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｙｌ−４−ｄｅｏｘｙ−４−ｆｌｕｏｒｏ−３，６−ｄｉ−Ｏ−ｐｉｖａｌｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｕｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ ２０の合成）

（１）ベンジル ２−Ｏ−クロロアセチル−３，６−ジ−Ｏ−ピバロイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド Ｂｅｎｚｙｌ ２−Ｏ−ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｙｌ−３，６−ｄｉ−Ｏ−ｐｉｖａｌｏｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１９）の合成
化合物１８（２００ｍｇ，０．４５５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（７．８ｍｌ）とピリジン（１．３ｍｌ）に溶かし、無水クロロ酢酸（１５５ｍｇ，０．９１ｍｍｏｌ）を加えて、アルゴン気流下−１５℃で攪拌しながら１５分間反応させた。反応終了を確認後、メタノール（５ｍｌ）で無水クロロ酢酸をクエンチし、トルエンで３回共沸しながら減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：４）で精製し、化合物１９（収量１７２ｍｇ，収率７３．５％）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）
δ ７．３７−７．２９（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），５．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_１，２＝８．０Ｈｚ，Ｊ_２，３＝１０．４Ｈｚ，Ｈ−２），４．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_３，４＝３．４Ｈｚ，Ｈ−３），４．８９，４．６２（２ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，ＯＣＨ _２Ｐｈ），４．５３（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１），４．３７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{６ａ，６ｂ}＝１１．５Ｈｚ，Ｊ_６ａ，５＝６．０Ｈｚ，Ｈ−６ａ），４．３２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_６ｂ，５＝６．６Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），４．００（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），３．９２（ｓ，２Ｈ，ＣＯＣＨ _２Ｃｌ），３．７５（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５），１．２３，１．１９〔２ｓ，１８Ｈ，ＣＯＣ（ＣＨ _３）_３〕
^１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）
δ １７８．３３，１７７．５７，１６５．９２，（Ｃ＝Ｏ），１３６．６６，１２８．４８，１２８．０７，１２７．８９（Ｐｈ），９９．１６（Ｃ−１），７２．８２（Ｃ−３），７２．３５（Ｃ−５），７０．９２（Ｃ−２），７０．４９（ＯＣＨ_２Ｐｈ），６７．２９（Ｃ−４），６２．３０（Ｃ−６），４０．４０（ＣＯＣＨ_２Ｃｌ），３８．９５，３８．８０〔ＣＯＣ（ＣＨ_３）_３〕，２７．１４，２６．９８〔ＣＯＣ（ＣＨ_３）_３〕
^１Ｈ−ＮＭＲ、^１３Ｃ−ＮＭＲはＢｒｕｋｅｒのＡＶＡＮＣＥ ４００（４００ＭＨｚと表記）で測定した。溶媒が重クロロホルムの時は内部標準としてトリメチルシランを用いた。その他の重溶媒を用いたときは溶媒ピークを基準とした。化学シフトは、δ（ｐｐｍ）で、結合定数はＪ（Ｈｚ）示した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーには、Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０，７０−２３０ｍｅｓｈ又は２３０−４００ｍｅｓｈを、球状シリカゲルは関東化学社製のＳｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）を、反応検出用（以下ＴＬＣ）としてはＥ．Ｍｅｒｋ社製ＤＣ−Ｐｌａｔｔｅｎ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ２５４（Ａｒｔ１，０５７１５）を使用した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のカラムはナカライテスク社製 ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ_１８−ＡＲ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ（φ４．６×１５０ｍｍ），を使用し、分光蛍光光度計は、ＪＡＳＣＯ社製のＦＰ−２１０ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用いた。
（２）ベンジル ２−Ｏ−クロロアセチル−４−デオキシ−４−フルオロ−３，６−ジ−Ｏ−ピバロイル−β−Ｄ−グルコピラノシド（２０）の合成
化合物１９（３００ｍｇ，０．５８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５．８ｍｌ）に溶かし、アルゴン気流下−１５℃で攪拌しながらジエチルアミノスルファートリフルオリド（ＤＡＳＴ）を加えた。ＤＡＳＴを加え１０分後室温に戻し１時間反応させた。ＴＬＣで原料消失を確認し、メタノール（３ｍｌ）でＤＡＳＴをクエンチ後減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：６）で精製し化合物２０（収量２１１ｍｇ、収率７０％）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）
δ ７．３７−７．２７（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），５．３１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_３，Ｆ＝１４．３Ｈｚ，Ｊ_３，４＝９．６９Ｈｚ，Ｊ_２，３＝９．６３Ｈｚ，Ｈ−３），５．０４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_１，２＝７．９３Ｈｚ，Ｈ−２），４．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，ＯＣＨ _２Ｐｈ），４．６０（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１），４．５９（ｄ，１Ｈ，ＯＣＨ _２Ｐｈ），４．４４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_４，５＝９．０４Ｈｚ，Ｊ_４，Ｆ＝５０．６Ｈｚ，Ｈ−４），４．４３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{６ａ，６ｂ}＝１２．１Ｈｚ，Ｊ_６ａ，５＝２．４１Ｈｚ，Ｊ_６ａ，Ｆ＝２．２３Ｈｚ，Ｈ−６ａ），４．２４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{６ｂ， ５}＝５．６７Ｈｚ，Ｊ_６ｂ，Ｆ＝１．２８Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），３．９３（ｓ，２Ｈ，ＯＣＯＣＨ _２Ｃｌ），３．７５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），１．２５，１．１８〔２ｓ，１８Ｈ，ＯＣＯＣ（ＣＨ_３）_３〕
^１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）
δ １７７．９４，１１７．４３，１６５．８８（Ｃ＝Ｏ），１３６．３４，１２８．５５，１３８．２３，１２７．９２（Ｐｈ），９８．６８（Ｃ−１），８７．３５（ｄ，Ｊ_４，Ｆ＝１８８．６２Ｈｚ，Ｃ−４），７２．６５（ｄ，Ｊ_２，Ｆ＝７．９６Ｈｚ，Ｃ−２），７２．０５（ｄ，Ｊ_３，Ｆ＝２０．０２Ｈｚ，Ｃ−３），７１．４９（ｄ，Ｊ_{５， Ｆ}＝２３．０９Ｈｚ，Ｃ−５），７０．８０（ＯＣＨ_２Ｐｈ），６２．１２（Ｃ−６），４０．３０（ＯＣＯＣＨ_２Ｃｌ），３８．８７〔ＯＣＯＣ（ＣＨ_３）_３〕，２７．１７，２６．９２〔ＯＣＯＣ（ＣＨ_３）_３〕
参考例９
（ベンジル ２−アジド−２，４−ジデオキシ−４−フルオロ−３，６−ジ−Ｏ−ピバロイル−β−Ｄ−マンノピラノシド Ｂｅｎｚｙｌ ２−ａｚｉｄｏ−２，４−ｄｉｄｅｏｘｙ−４−ｆｌｕｏｒｏ−３，６−ｄｉ−Ｏ−ｐｉｖａｌｏｙｌ−β−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ ２２の合成）

（１）ベンジル ４−デオキシ−４−フルオロ−３，６−ジ−Ｏ−ピバロイル−β−Ｄ−グルコピラノシド Ｂｅｎｚｙｌ ４−ｄｅｏｘｙ−４−ｆｌｕｏｒｏ−３，６−ｄｉ−Ｏ−ｐｉｖａｌｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｕｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２１）の合成
化合物２０（６２５ｍｇ，１．２１ｍｍｏｌ）をメタノール（２４．２ｍｌ）に溶かし、アルゴン気流下−１５℃で攪拌しながら、ナトリウムメトキシド（１３．１ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ）を加えた。３０分後ＴＬＣで原料消失を確認後陽イオン交換樹脂ＩＲ−１２０（＋）で中和（ｐＨ６−７）し、樹脂を濾過後減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：４）で精製し化合物２１（収量３９５ｍｇ，収率７４％）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）
δ ７．３８−７．２９（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），５．１８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_３，Ｆ＝１４．８Ｈｚ，Ｊ_３，４＝９．５１Ｈｚ，Ｊ_２，３＝８．９９Ｈｚ，Ｈ−３），４．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７，ＯＣＨ _２Ｐｈ），４．６３（ｄ，１Ｈ，ＯＣＨ _２Ｐｈ），４．４７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_５，６ａ＝２．４３Ｈｚ，Ｊ_６ａ，Ｆ＝２．２Ｈｚ，Ｈ−６ａ），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ_１，２＝７．７Ｈｚ，Ｈ−１），４．３８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_４，５＝８．９６Ｈｚ，Ｊ_３，４＝９．６７Ｈｚ，Ｊ_４，Ｆ＝５０．８Ｈｚ，Ｈ−４），４．２３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{６ａ，６ｂ}＝１２．０Ｈｚ，Ｊ_６ｂ，５＝６．０５Ｈｚ，Ｊ_６ｂ，Ｆ＝１．２６Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），３．７５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），３．５４（ｍ，１Ｈ，Ｊ_２，ＯＨ＝２．７０Ｈｚ，Ｈ−２），１．２７，１．２６〔２ｓ，１８Ｈ，ＯＣＯＣ（ＣＨ_３）_３〕
^１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）
δ １７８．１７，１７７．９４（Ｃ＝Ｏ），１３６．５４，１２８．５４，１２８．１７，１２８．１２（Ｐｈ），１０１．３１（Ｃ−１），８７．４５（ｄ，Ｊ_４，Ｆ＝１８７．３９Ｈｚ，Ｃ−４），７４．１７（ｄ，Ｊ_３，Ｆ＝１８．８８Ｈｚ，Ｃ−３），７２．４５（ｄ，Ｊ_２，Ｆ＝７．５６Ｈｚ，Ｃ−２），７１．４５（ｄ，Ｊ_５，Ｆ＝２３．２６Ｈｚ，Ｃ−５），７１．０９（ＯＣＨ_２Ｐｈ），６２．４４（Ｃ−６），３８．９０，３８．８５〔ＯＣＯＣ（ＣＨ_３）_３〕，２７．１４，２６．９９〔ＯＣＯＣ（ＣＨ_３）_３〕
（２）ベンジル ２−アジド−２，４−ジデオキシ−４−フルオロ−３，６−ジ−Ｏ−ピバロイル−β−Ｄ−マンノピラノシド（２２）の合成
ピリジン（２２．２μｌ，０．２７４ｍｍｏｌ）を溶かしたジクロロメタン（３７０μｌ）溶液に０℃で無水トリフルオロメタンスルフォン酸（４６μｌ，０．２７４ｍｍｏｌ）を滴下し、１５分後、化合物２１をジクロロメタン（１ｍｌ）に溶かしたものを０℃で滴下した。ＴＬＣで原料消失を確認し、反応混合物をジクロロメタンで希釈した。有機層を飽和重曹水、飽和食塩水、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後濃縮した。残渣を真空ポンプでさらに乾燥後ベンゼン（１ｍｌ）に溶かし、アルゴン気流下室温でアジ化ナトリウム（１３ｍｇ，０．２０６ｍｍｏｌ）、テトラアンモニウムクロライド（５７ｍｇ，０．２０６ｍｍｏｌ）を加え４０℃で反応させた。２時間後ＴＬＣで原料消失を確認後減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水、水で洗浄し無水硫酸マグネシウムで乾燥後濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：４）で精製して化合物２２（収量３０．４ｍｇ，収率９５％）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）
δ ７．３９−７．３２（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），４．９９（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_３，Ｆ＝１３．１８Ｈｚ，Ｊ_３，４＝９．２７Ｈｚ，Ｊ_２，３＝３．８７Ｈｚ，Ｈ−３），４．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．０７Ｈｚ，ＯＣＨ _２Ｐｈ），４．６７（ｄ，１Ｈ，Ｊ_１，２＝１．１８Ｈｚ，Ｈ−１），４．６３（ｄ，１Ｈ，ＯＣＨ _２Ｐｈ），４．５１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{６ａ，６ｂ}＝１１．９５Ｈｚ，Ｊ_６ａ，５＝２．５４Ｈｚ，Ｊ_６ａ，Ｆ＝２．０８Ｈｚ，Ｈ−６ａ），４．２３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_６ｂ，５＝６．１４Ｈｚ，Ｊ_６ｂ，Ｆ＝１．１４Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），４．０８（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２），３．６４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），１．２６〔２ｓ，１８Ｈ，ＯＣＯＣ（ＣＨ _３）_３〕
^１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）
δ １７８．０１，１７７．６８（Ｃ＝Ｏ），１３６．０６，１２８．６３，１２８．３１，１２８．１４（Ｐｈ），９７．２５（Ｃ−１），８５．５１（ｄ，Ｊ_４，Ｆ＝１８３．９７，Ｃ−４），７２．０１（ｄ，Ｊ_５，Ｆ＝２３．８９，Ｃ−５），７１．７３（ｄ，Ｊ_３，Ｆ＝１８．９８，Ｃ−３）
７０．５７（ＯＣＨ_２Ｐｈ），６２．４２（Ｃ−２，Ｃ−６），３９．０８，３８．９０〔ＯＣＯＣ（ＣＨ_３）_３〕，２７．１８，２６．９５〔ＯＣＯＣ（ＣＨ_３）_３〕
参考例１０
（Ｎ−アセチル−４−デオキシ−４−フルオロ−Ｄ−マンノサミン Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−４−ｄｅｏｘｙ−４−ｆｌｕｏｒｏ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ２４の合成）

（１）ベンジル ２−アジド−２，４−ジデオキシ−４−フルオロ−β−Ｄ−マンノピラノシド Ｂｅｎｚｙｌ ２−ａｚｉｄｏ−２，４−ｄｉｄｅｏｘｙ−４−ｆｌｕｏｒｏ−β−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２３）の合成
化合物２２（１８０ｍｇ，０．３８７ｍｍｏｌ）をメタノール（８ｍｌ）に溶かしナトリウムメトキシド（９２２ｍｇ，９．６７ｍｍｏｌ）を加え攪拌し４０℃で反応させた。４．５時間後ＴＬＣで１スポットにまとまったことを確認し陽イオン交換樹脂ＩＲ−１２０（＋）で中和後、濾過し濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１）で精製し化合物２３（収量１０５．３ｍｇ，収率９１．６％）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）
δ ７．４０−７．３１（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），４．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．１３Ｈｚ，ＯＣＨ _２Ｐｈ），４．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ_１，２＝１．３３Ｈｚ，Ｈ−１），４．６９（ｄ，１Ｈ，ＯＣＨ _２Ｐｈ），４．４９（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_４，Ｆ＝５１．０６Ｈｚ，Ｊ_４，５＝９．１９Ｈｚ，Ｊ_３，４＝９．２０Ｈｚ，Ｈ−４），４．０２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２），３．９３（ｄｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{６ａ，６ｂ}＝１２．１９Ｈｚ，Ｊ_６ａ，５＝２．３１Ｈｚ，Ｊ_６ａ，Ｆ＝２．３２Ｈｚ，Ｊ_{６ａ，ＯＨ}＝６．２０Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．８９−３．７７（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−６ｂ），３．３９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５）
^１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）
δ １３６．３９，１２８．６２，１２８．２４，１２７．８３（Ｐｈ），９８．６３（Ｃ−１），８８．１９（ｄ，Ｊ_４，Ｆ＝１７８．９１Ｈｚ，Ｃ−４），７３．９５（ｄ，Ｊ_５，Ｆ＝２５．４８Ｈｚ，Ｃ−５），７１．１８（ＯＣＨ_２Ｐｈ），７１．１６（ｄ，Ｊ_３，Ｆ＝１９．６９Ｈｚ，Ｃ−３），６４．４８（ｄ，Ｊ_２，Ｆ＝８．４２Ｈｚ，Ｃ−２），６１．３９（Ｃ−６）
（２）Ｎ−アセチル−４−デオキシ−４−フルオロ−Ｄ−マンノサミン Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−４−ｄｅｏｘｙ−４−ｆｌｕｏｒｏ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ（２４）の合成
化合物２３（１０５ｍｇ，０．３５３ｍｍｏｌ）をメタノール（７ｍｌ）に溶かし無水酢酸（３３３μｌ，３．５３ｍｏｌ）を加えた後、アルゴン気流下で触媒量の１０％ Ｐｄ／Ｃを加え水素置換してから室温で攪拌した。２時間後ＴＬＣで原料消失を確認し、活性炭濾過後濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝５：１）で精製し化合物２４（収量５７ｍｇ，収率７２％）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）
δ ５．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_１，２＝２．６９Ｈｚ，Ｊ_１，Ｆ＝１．４４Ｈｚ，Ｈ−１−α），４．６５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_４，Ｆ＝５０．９４Ｈｚ，Ｊ_３，４＝９．０６Ｈｚ，Ｊ_４，５＝９．５８Ｈｚ，Ｈ−４−α），４．４７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２−α），４．４３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_３，Ｆ＝１４．２８Ｈｚ，Ｊ_２，３＝４．９Ｈｚ，Ｈ−３−α），４．１６（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５−α），３．９５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−６ａ−α，Ｈ−６ｂ−α），２．１４（ｓ，３Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ _３−α）
^１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）
δ １７５．２７（Ｃ＝Ｏ−α），９３．４６（Ｃ−１−α），８８．３０（ｄ，Ｊ_４，Ｆ＝１７７．００Ｈｚ，Ｃ−４−α），６９．９１（ｄ，Ｊ_５，Ｆ＝２４．４１Ｈｚ，Ｃ−５−α），６７．６０（ｄ，Ｊ_３，Ｆ＝１８．７４Ｈｚ，Ｃ−３−α），６０．３６（Ｃ−６），５４．１２（ｄ，Ｊ_２，Ｆ＝８．６８Ｈｚ，Ｃ−２−α），２２．３１（ＮＨＣＯＣＨ_３−α）
参考例１１
（５−アセタミド−３，５，７−トリデオキシ−７−フルオロ−Ｄ−グリセロ−β−Ｄ−ラクト−２−ノヌロピラノシドニック アシッド
５−Ａｃｅｔａｍｉｄｅ−３，５，７−ｔｒｉｄｅｏｘｙ−７−ｆｌｕｏｒｏ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏ−２−ｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ２５の合成）

化合物２４（５０ｍｇ，０．２２４ｍｍｏｌ）ピルビン酸ナトリウム（１２３ｍｇ，１．１２ｍｍｏｌ）と牛血清アルブミン（５ｍｇ）をリン酸ナトリウム緩衝溶液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５，３．４ｍｌ）に溶かし、その後シアル酸アルドラーゼ（５０Ｕ）を加え室温で反応を開始した。２４時間後反応溶液を凍結乾燥させ、少量の水に溶かし陰イオン交換樹脂カラム（ＡＧ １−Ｘ８，２００−４００ｍｅｓｈ，ｆｏｒｍａｔｅ ｆｏｒｍ）にのせた。水３００ｍｌ流した後、１Ｍギ酸で目的物を溶出させ減圧濃縮し、ゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５，水）で精製し化合物２５（収量４０ｍｇ，収率５８．９％）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）
δ ４．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_７，８＝８．９７Ｈｚ，Ｊ_７，Ｆ＝４５．５６Ｈｚ，Ｈ−７），４．１８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_５，６＝１０．６３Ｈｚ，Ｊ_６，Ｆ＝２９．８６Ｈｚ，Ｈ−６），４．１５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），４．０７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−８），４．０２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_４，５＝１０．１０Ｈｚ，Ｈ−５），３．９０（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{９ ａ９ｂ}＝１２．１８Ｈｚ，Ｊ_９ａ，８＝２．７７Ｈｚ，Ｊ_９ａ，Ｆ＝２．８６Ｈｚ，Ｈ−９ａ），３．７６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_９ｂ，ｓ＝５．３３Ｈｚ，Ｊ_９ｂ，Ｆ＝２．０６Ｈｚ，Ｈ−９ｂ），２．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{３ｃｑ，３ａｘ}＝１３．００，Ｊ_{３ｅｑ，４}＝４．８８Ｈｚ，Ｈ−３ｅｑ），２．１５（ｓ，３Ｈ，ＯＣＯＣＨ _３），２．００（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{３ａｘ，４}＝１１．７０Ｈｚ，Ｈ−３ａｘ）
^１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）
δ １７５．１７，１７３．６８（Ｃ＝Ｏ），９６．０１（Ｃ−１），８９．１２（ｄ，Ｊ_７，Ｆ＝１７９．２３Ｈｚ，Ｃ−７），６９．６７（ｄ，Ｊ_６，Ｆ＝１７．４１Ｈｚ，Ｃ−６），６８．３１（ｄ，Ｊ_８，Ｆ＝２６．５０Ｈｚ，Ｃ−８），６７．２６（Ｃ−４），６２．７０（Ｃ−６），５２．１７（Ｃ−５），３９．１９（Ｃ−３），２２．６１（ＮＨＣＯＣＨ_３）
参考例１２
（５−アセタミド−３，５，８−トリデオキシ−８−フルオロ−Ｄ−グリセロ−β−Ｄ−ラクト−２−ノヌロピラノシドニック アシッド ５−Ａｃｅｔａｍｉｄｅ−３，５，８−ｔｒｉｄｅｏｘｙ−８−ｆｌｕｏｒｏ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏ−２−ｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ２７の合成）
下記のスキームに従ってシアル酸（２６）から５−アセタミド−３，５，８−トリデオキシ−８−フルオロ−Ｄ−グリセロ−β−Ｄ−ラクト−２−ノヌロピラノシドニック アシッド（２７）を合成した。

（ａ）（１）Ｄｏｗｅｘ ５０−Ｘ８，ｄｉｓｔ．ＭｅＯＨ，（２）Ａｃｅｔｏｎｅ ｄｉｍｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｌ，Ｃａｍｐｈｏｒ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＭｅＣＮ，ｙ＝７３％；
（ｂ）（１）ＢａＯ，Ｂａ（ＯＨ）_２，ＢｎＢｒ，ＤＭＦ，（２）ＣＨ_２Ｎ_２，（３）６０％ ＡｃＯＨ，ｙ＝６１．８％；
（ｃ）（１）Ｄｉｂｕｔｙｌｔｉｎ ｏｘｉｄｅ，ｔｏｌｕｅｎｅ ： ＭｅＯＨ＝５：１，（２）ｔｅｔｒａ−ｎ−ｂｕｔｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ，ＢｎＢｒ，ｔｏｌｕｅｎｅ，ｙ＝７４．３％；
（ｄ）（１）ＤＭＳＯ，Ｏｘａｌｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＴＥＡ，ＣＨ_２Ｃｌ_２，（２）ＢＨ_３ＮＨ_３，ＭｅＯＨ，ｙ＝７３．２％；
（ｅ）ＤＡＳＴ，ＣＨ_２Ｃｌ_２，ｙ＝２９．８％；
（ｆ）Ｐｄ／Ｃ，ＡｃＯＨ，ｙ＝７４．２％；
（ｇ）（１）０．３Ｎ ＮａＯＨ，（２）Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ １５Ｈ（＋），０．０１６Ｎ ＨＣｌ，ｙ＝７２．６％
（ａ）（１）シアル酸（２６）（１．０２ｇ，３．３１ｍｍｏｌ）を蒸留したメタノール（１５０ｍｌ）に溶かし、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ−Ｘ８（２．０ｇ）を加えて、加熱還流下２４時間反応させた。反応の終点は、反応溶液を一部取りＮＭＲを用いて確認した。反応溶液を濾過し、樹脂に再びメタノール（１００ｍｌ）を加え１時間撹拌して樹脂に吸着した化合物を回収した。溶液を再び濾過し、先ほどの濾液と合わせて減圧濃縮し、化合物を得た。
（２）上記で得られた化合物（５．０５ｇ，１４．９７ｍｍｏｌ）を蒸留したアセトニトリル（７５ｍｌ）に溶かし、アルゴン気流下室温で撹拌しながらカンファースルホン酸（４９８ｍｇ，２．１４ｍｍｏｌ）を加えた。その後アセトンジメチルアセタール（２．７５ｍｌ，２２．３６ｍｍｏｌ）を少しずつ滴下して３０分間反応させた。反応終了を確認後、トリエチルアミン（２ｍｌ）を加えて反応を止め、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝２０：１）で精製し、アセトナイド誘導体を得た（α：β＝１：１０、収量５．２９ｇ）。
（ｂ）（１）上記で得られたアセトナイド誘導体（３．２ｇ，８．４８ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４３ｍｌ）に溶かし、酸化バリウム（９．３ｇ，６０．６５ｍｍｏｌ）と水酸化バリウム８水和物（２．４ｇ，７．６１ｍｍｏｌ）を加えた。その後、ベンジルブロミド（１０ｍｌ，８４．１ｍｍｏｌ）を加え室温で撹拌した。ＴＬＣで原料が消失したことを確認後、ジクロロメタンで希釈し１％ギ酸水溶液、水で洗浄後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。無水硫酸マグネシウムをろ過して取り除いた後、有機層を減圧濃縮した。
（２）残渣をエタノール（２５ｍｌ）、ベンゼン（５０ｍｌ）の混合溶媒に溶かし、ジアゾメタン（４２．５ｍｍｏｌ）が溶解したエーテル溶液を加えた。この際ジアゾメタンは、エーテルとエタノールの混合溶液にｐ−トルエンスルフォニル−Ｎ−ニトロスアミドを加え５０％水酸化カリウムを滴下することで発生させた。ジアゾメタンを加えた後、室温で１０分間反応させた。ＴＬＣで原料消失を確認してから酢酸（１２ｍｌ）で過剰のジアゾメタンをクエンチし、そのまま減圧濃縮した。
（３）続いて、残渣を６０％酢酸水溶液に溶かし６０度で１２時間反応させた。ＴＬＣで原料消失を確認後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝１５：１）で精製し化合物を得た（α：β＝１：２４、収量２．７ｇ）。
（ｃ）（１）上記で得た化合物（１．０８ｇ，２．０８ｍｍｏｌ）をトルエン（３０ｍｌ）とメタノール（６．５ｍｌ）に溶かしジブチル酸化錫（７８０ｍｇ，３．４８ｍｍｏｌ）を加え、８５度で２時間反応させた。その後、反応溶液を減圧濃縮しよく脱水したトルエンで３回共沸した。
（２）残渣をトルエン（２４ｍｌ）に再び溶かし、テトラブチルアンモニウムブロミド（１．００ｇ，３．４８ｍｍｏｌ）とベンジルブロミド（９７７ｍｌ，１０．４ｍｍｏｌ）を加え、８０度で４時間反応させた。ＴＬＣで原料消失を確認後、室温に戻し減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝４：１）で精製し４，７，９−ベンジル体を得た（α：β＝１：１０、収量１．１５ｇ）。
（ｄ）（１）ジクロロメタン（１３ｍｌ）にオキザリルクロリド（１．８２ｇ，１４．３ｎｎｏｌ）を加え−７８度に冷却した。１５分後この溶液にジメチルスルフォキシド（１．３ｍｌ，１７．９ｍｍｏｌ）とジクロロメタン（５ｍｌ）の混合溶液を加え−７８度で再び撹拌した。そして２０分後、ジクロロメタン（１８ｍｌ）に溶かした上記で得られた４，７，９−ベンジル体（２．１８ｍｇ，３．５９ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。−７８度で２０分間撹拌した後、トリエチルアミン（４．００ｍｌ，２８．７ｍｍｏｌ）を加え１０分間撹拌した後、反応温度を室温に戻した。ＴＬＣで原料消失を確認後、ジクロロメタンで希釈し飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水溶液で洗浄し有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。無水硫酸マグネシウムをろ過して取り除いた後、有機層を減圧濃縮した。
（２）残渣を精製することなくそのままメタノール（１６ｍｌ）に溶かし−１５度に冷却後、ＢＨ_３ＮＨ_３（１２２ｍｇ，３．９５ｍｍｏｌ）を加え反応温度を室温にもどした。ＴＬＣで原料消失を確認後反応溶液をそのまま減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝２：１）で精製し８−エピマー体を得た（収量１．０５ｇ）。
（ｅ）上記で得られた８−エピマー体（５３３ｍｇ，０．８７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１３ｍｌ）に溶かしアルゴン気流下−１５度に冷却した。ジメチルアミノスルファートリフルオリド（５８０ｍｌ，３．５１ｍｍｏｌ）をゆっくり加え３０分撹拌した後、反応温度を４０度に上げ、さらに１６時間撹拌した。メタノールを加え反応を止めた後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝２：３）で精製し８−フルオロ体を得た（収量１４４ｍｇ）。
（ｆ）上記で得られた８−フルオロ体（１２０ｍｇ，０．１９７ｍｍｏｌ）を酢酸（４ｍｌ）に溶かしアルゴン気流下で１０％ Ｐｄ／Ｃ（１２０ｍｇ）を加え、水素置換した後室温で撹拌した。２時間後ＴＬＣで反応終了を確認し、活性炭ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝６：１）で精製し化合物を得た（収量５７ｍｇ）。
（ｇ）（１）上記で得られた化合物（５０ｍｇ，０．１４７ｍｍｏｌ）をメタノール（２ｍｌ）に溶かし０．３Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（２ｍｌ）を加え室温で撹拌した。ＴＬＣで反応終了を確認後、ＩＲ−１２０（＋）で反応溶液を中和した。ＩＲ−１２０（＋）をろ過し取り除いた後、ろ液を減圧濃縮した。
（２）残渣をそのまま０．０１６Ｎ塩酸水溶液（５ｍｌ）に溶かしＡｍｂｅｒｌｙｓｔ１５（Ｈ＋）（１５０ｍｇ）を加え７５度で２４時間反応させた。反応終了をＮＭＲによって確認し、反応溶液を減圧濃縮した。残渣をＡＧ１×Ｘ８（２００〜４００ｍｅｓｈ，ｆｏｒｍａｔｅ ｆｏｒｍ）にのせ、水１５０ｍｌ流した後１Ｍギ酸水溶液で溶出させることで８−フルオロ−シアル酸（２７）を得た（収量３３ｍｇ）。
８−フルオロシアル酸のＮＭＲデータを以下に示す。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）
δ ４．６９（ｄｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_８，Ｆ＝４８．７Ｈｚ，Ｊ_８，９ａ＝５．０Ｈｚ，Ｊ_８，９ｂ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−８），４．０３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_４，５＝１０．０Ｈｚ，Ｊ_{３ａｘ，４}＝１１．１Ｈｚ，Ｊ_{３ｅｘ，４}＝４．７Ｈｚ，Ｈ−４），３．９５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_４，５＝１０．０Ｈｚ，Ｊ_５，６＝９．９Ｈｚ，Ｈ−５），３．９４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_６，７＝〜０Ｈｚ，Ｊ_７，８＝６．８Ｈｚ，Ｊ_７，Ｆ＝１４．０Ｈｚ，Ｈ−７），３．８８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_９ａ９ｂ＝１３．３Ｈｚ，Ｊ_９ａ，８＝３．５Ｈｚ，Ｊ_９ｂ，Ｆ＝２８．０Ｈｚ，Ｈ−９ｂ），３．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_５，６＝９．９Ｈｚ，Ｊ_{６， ７}＝〜０Ｈｚ，Ｈ−６），３．７２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{９ａ，９ｂ}＝５．３３Ｈｚ，Ｊ_９ａ，８＝５．０Ｈｚ，Ｊ_９ａ，Ｆ＝３０．６Ｈｚ，Ｈ−９ａ），２．２８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{３ｅｑ，３ａｘ}＝１３．００，Ｊ_{３ｅｑ，４}＝４．６Ｈｚ，Ｈ−３ｅｑ），２．０５（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{３ａｘ，４}＝１１．１Ｈｚ，Ｊ_{３ｅｑ，３ａｘ}＝１３．００，Ｈ−３ａｘ）
参考例１３
（５−アセタミド−３，５，９−トリデオキシ−９−フルオロ−Ｄ−グリセロ−β−Ｄ−ラクト−２−ノヌロピラノシドニック アシッド ５−Ａｃｅｔａｍｉｄｅ−３，５，９−ｔｒｉｄｅｏｘｙ−９−ｆｌｕｏｒｏ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏ−２−ｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ２８の合成）
下記のスキームに従ってシアル酸（２６）から５−アセタミド−３，５，９−トリデオキシ−９−フルオロ−Ｄ−グリセロ−β−Ｄ−ラクト−２−ノヌロピラノシドニック アシッド（２８）を合成した。

（ａ）（１）Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ−Ｘ８，ＭｅＯＨ，ｒｅｆｌｕｘ，（２）ＴｒＣｌ，ｐｙｒｉｄｉｎｅ，７２％
（ｂ）（１）ＢａＯ，Ｂａ（ＯＨ），（２）ＤＭＦ，（３）ＣＨ_２ＣＮ_２，８８％
（ｃ）ＡｃＯＨ，１００℃，７８％
（ｄ）（１）Ｔｆ_２Ｏ，ｐｙｒｉｄｉｎｅ，ＣＨ_２Ｃｌ_２，（２）ＴＡＳＦ，ＣＨ_２Ｃｌ_２，５２％
（ｅ）Ｈ_２，Ｐｄ／Ｃ（１０％），ＡｃＯＨ，８６％
（ｆ）ＮａＯＨａｑ．
（ｇ）０．０２Ｎ ＨＣｌａｑ．，Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ １５（Ｈ＋），８６％
上記反応は下記文献に準じて行った。
Ｔ．Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｔ．Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，Ｈ．Ｓａｔｏ，Ｙ．Ｋａｊｉｈａｒａ；Ｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ９−Ｄｅｏｘｙ−９−ｆｌｕｏｒｏ−［３−１３Ｃ］−ＮｅｕＡｃ−ａ−（２，６）−［Ｕ−１３Ｃ］−Ｇａｌ−ｂ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｎ Ａｎ Ｉｎｔａｃｔ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，１４１１−１４１２（１９９９）．
参考例１４
（ＣＭＰ−７−フルオロシアル酸誘導体の合成）

（ａ）（１）Ｄｏｗｅｘ ５０−Ｘ８，ＭｅＯＨ，（２）Ａｃ_２Ｏ，６０％ＨＣｌＯ_４；
（ｂ）（１）１Ｈ−Ｔｅｔｒａｚｏｌｅ，ＣＨ_３ＣＮ，（２）ｔ−ＢｕＯＯＨ，ＣＨ_３ＣＮ，（３）ＤＢＵ，ＣＨ_３ＣＮ，（４）ＮａＯＭｅ，ＭｅＯＨ，Ｈ_２Ｏ
フルオロシアル酸誘導体である化合物（２５）（０．０７４ｍｍｏｌ）を蒸留メタノール（３ｍｌ）に溶かし、アルゴン気流下室温で撹拌しながらＤｏｗｅｘ−５０Ｗ−Ｘ８（６５ｍｇ）を加え、３時間反応させた。反応終了を確認し、濾過後減圧濃縮した。残渣を無水酢酸（２００μｌ）に溶かし、−２０℃で撹拌しながら無水酢酸：６０％過塩素酸＝１５：１溶液（２２μｌ）を加え、１０℃にて４０分反応させた。反応終了を確認後、反応溶液を酢酸エチルで希釈して、飽和重曹水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後減圧濃縮して、化合物（２９）を含む残渣を得た。残渣とＣＭＰ−５’−ホスホロアミダイト誘導体（３０）（１３６ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）をベンゼンで別々に３回共沸し、蒸留したアセトニトリル（１００μｌ）にそれぞれ溶かし混ぜた。アルゴン気流下氷水中で撹拌しながら１Ｈ−テトラゾール（１７ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）を加えた。５分後に室温に戻し、さらに１０分間反応させた。反応終了を確認後、溶液を酢酸エチルで希釈し、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後３０℃以下で濃縮した後さらにトルエンで２回共沸し水を取り除いた。残渣に蒸留したアセトニトリル（４００μｌ）を加え、アルゴン気流下氷冷しながら２．５Ｍのｔ−ＢｕＯＯＨトルエン溶液（２９０μｌ）を滴下した。５分後に室温に戻し、さらに２０分間撹拌した。反応終了を確認後、ジメチルスルフィド（５３μｌ）を滴下し１０分間撹拌してｔ−ＢｕＯＯＨをクエンチした。その後、ＤＢＵ（１８μｌ）を滴下して２０分間室温で撹拌した。反応終了を確認後、メタノール（０．６７ｍｌ）、水（１．３５ｍｌ）、ナトリウムメトキシド（３６０ｍｇ）を加え室温で１６時間反応させた。反応終了を確認後水で抽出し、ジクロロメタンで洗浄した。水層を２５℃以下で８ｍｌ程度まで減圧濃縮した。この水溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５（１．８φ×９０ｃｍ）を用いるゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：２０ｍＭアンモニア水、流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ）で精製し、ＣＭＰ−フルオロ−シアル酸誘導体（３１）を得た。
ＣＭＰ−７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアル酸（３１）のＮＭＲデータを以下に示す。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，５０ｍＭ ＮＤ_４ＤＣＯ_３ ｉｎ Ｄ_２Ｏ），
δ８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ_５，６＝７．６Ｈｚ，Ｈ−６），６．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ_{６， ５}＝７．６Ｈｚ，Ｈ−５），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ_{１’，２’}＝４．５Ｈｚ，Ｈ−１’），４．５４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{７”，８”}＝９．５Ｈｚ，Ｊ_７”，Ｆ＝４５．９Ｈｚ，Ｈ−７”），４．４２〜４．２０（ｍ，７Ｈ，Ｈ−２’，Ｈ−３’，Ｈ−４’，Ｈ−５’ａ，Ｈ−５’ｂ，Ｈ−６”，Ｈ−８”），４．１６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{４”， ３”ｅｑ}＝４．７Ｈｚ，Ｊ_{４”，３”ａｘ}＝１１．３Ｈｚ，Ｊ_４，５＝１０．３Ｈｚ，Ｈ−４”），４．０３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{５”，４”}＝Ｊ_{５”，６”}＝１０．３Ｈｚ，Ｈ−５”），３．９１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{９”ａ，９”ｂ}＝１２．２Ｈｚ，Ｊ_{９”ａ，８”}＝２．８Ｈｚ，Ｊ_{９”ａ，Ｆ}＝２．８Ｈｚ，Ｈ−９”ａ），３．７５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{９”，ａ，９”ｂ}＝１２．２Ｈｚ，Ｊ_{９”ｂ，ｓ”}＝５．４Ｈｚ，Ｊ_{９”ｂ，Ｆ}＝２．１Ｈｚ，Ｈ−９”ｂ），２．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{３”ｅｑ，４”}＝４．７Ｈｚ，Ｊ_ｇｅｍ＝１３．３Ｈｚ，Ｈ−３”ｅｑ），２．１４（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．７６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{３”ａｘ，４”}＝１１．５Ｈｚ，Ｊ_ｇｅｍ＝１３．３Ｈｚ，Ｊ_{３”ａｘ，Ｐ}＝５．６Ｈｚ，Ｈ−３”ａｘ）
参考例１５
ＣＭＰ−８”−デオキシ−８”−フルオロ−シアル酸の合成
化合物（２５）の代わりに化合物（２７）を用いた以外は参考例１４と同様にしてＣＭＰ−８”−デオキシ−８”−フルオロ−シアル酸を合成した。ＮＭＲデータを以下に示す。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，５０ｍＭ ＮＤ_４ＤＣＯ_３ ｉｎ Ｄ_２Ｏ）
δ８．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ_５，６＝７．６Ｈｚ，Ｈ−６），６．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ_６，５＝７．６Ｈｚ，Ｈ−５），６．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ_{１’，２’}＝４．１Ｈｚ，Ｈ−１’），４．９０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−８”），４．４２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{３’，２’}＝Ｊ_{３’，４’}＝４．９Ｈｚ，Ｈ−３’），４．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{２’，１’}＝４．１Ｈｚ，Ｊ，_{２’，３’}＝４．９Ｈｚ，Ｈ−２’），４．３１−４．２８（ｍ，３Ｈ，Ｈ−４’，Ｈ−５’ａ，Ｈ−５’ｂ），４．１５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{４”，３”ｅｑ}＝４．４Ｈｚ，Ｊ_{４”，３”ａｘ}＝１１．５Ｈｚ，Ｊ_４，５＝１０．５Ｈｚ，Ｈ−４”），４．１０−３．９０（ｍ，５Ｈ，Ｈ−５”，Ｈ−６”，Ｈ−７”，Ｈ−９”ａ，Ｈ−９”ｂ），２．６０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{３”ｅｘ，４”}＝４．４Ｈｚ，Ｊ_ｇｅｍ＝１３．１Ｈｚ，Ｈ−３”ｅｑ），２．１３（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．７７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ_{３”ａｘ，４”}＝１１．５Ｈｚ，Ｊ_ｇｅｍ＝１３．１Ｈｚ，Ｊ_{３”ａｘ，Ｐ}＝４．５Ｈｚ，Ｈ−３”ａｘ）
参考例１６
ＣＭＰ−９”−デオキシ−９”−フルオロ−シアル酸の合成
化合物（２５）の代わりに化合物（２８）を用いた以外は参考例１４と同様にしてＣＭＰ−９”−デオキシ−９”−フルオロ−シアル酸を合成した。

〔ＨＯＯＣ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ａｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ−Ｄａｎｓｙｌの合成〕
固相合成用カラムにＨＭＰＡ−ＰＥＧＡレジン３７０ｍｇを入れ、ＣＨ_２Ｃｌ_２，ＤＭＦで十分に洗浄し反応に用いた。
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）、Ｎ−メチルイミダゾールをＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解させ５分間撹拌した後、樹脂の入った固相合成用カラムに入れ室温で３時間攪拌した。攪拌後、樹脂をメチレンクロライド、イソプロパノール、ＤＭＦで洗浄し乾燥させた。その後、２０分間２０％無水酢酸ＤＭＦ溶液を用いて固相上の未反応の水酸基をアセチル化しキャッピングした。ＤＭＦで樹脂を洗浄後、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を用いて２０分撹拌することによりＦｍｏｃ基を脱保護しレジン−Ｓｅｒ−ＮＨ_２を得た。ＤＭＦで洗浄後、乾燥させた。
次に、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨを用いＨＯＢｔ・Ｈ_２ＯとＤＩＰＣＤＩによって縮合させた。
次に、Ｆｍｏｃ−アシアロ糖鎖アスパラギンをＤＭＳＯ、ＤＭＦ１対１の混合溶媒に溶かし、ＨＡＴＵとＤＩＰＥＡを用いて室温２４時間攪拌させて縮合させた。ＤＭＦで洗浄後１０％無水酢酸／２−プロパノール：メタノールで２０分間攪拌しキャッピングした。樹脂を２−プロパノール、ＤＭＦで洗浄後、２０％ピペリジン／ＤＭＦで２０分間攪拌しＦｍｏｃ基を脱保護しＤＭＦで樹脂を洗浄した。
この樹脂に、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、アラニン（Ａｌａ）、を同様に縮合およびＦｍｏｃ基の脱保護を行って、レジン−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ａｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ_２を得た。
バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、アラニン（Ａｌａ）のアミノ酸はカルボキシル基をｐｆｐエステル化したＦｍｏｃ−ＡＡ−Ｏｐｆｐ（ＡＡ＝アミノ酸）を用い、３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−イル（Ｄｈｂｔ）によって縮合させた。すべての縮合はＤＭＦ溶液中で行った。
次に蛍光標識するためにダンシルクロリドとジイソプロピルエチルアミンを用いてＤＭＦ中３０分反応させた。ダンシル化が終了した後、ＤＭＦ，ＣＨ_２Ｃｌ_２で樹脂を洗浄した。
樹脂を洗浄後、９５％ＴＦＡ水溶液を加え、室温で３時間攪拌してレジンを切断した。レジンをろ過して除き、反応溶液を室温で減圧濃縮した後、水に溶かし凍結乾燥した。凍結乾燥品をＨＰＬＣで精製することで目的とするＨＯＯＣ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ａｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ−Ｄａｎｓｙｌを得た。
（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ａ−３１４ Ｓ−５ ＯＤＳ ３００×６．０ｍｍ 展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ：０．１％ＴＦＡ アセトニトリル：水＝９０：１０ グラジエントＡ １００％ ０．６０ｍｌ／ｍｉｎ→Ｂ １００％ ０．６０ｍｌ／ｍｉｎ ６０分）

〔ＨＯＯＣ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ａｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ_２の合成〕
実施例５において、蛍光標識するためダンシル化を省略した以外は同様にしてＨＯＯＣ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ（ａｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＮＨ_２を合成した。

実施例５で得られたＤａｎｓｙｌ化したアシアロ糖鎖ペプチドにシアル酸転移酵素を用いて参考例１４のシアル酸誘導体を転移させた。
シアル酸転移酵素としてα２，３転移酵素である市販のＲａｔ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来のものを用いた。
酵素反応条件はＤａｎｓｙｌ化アシアロ糖鎖ペプチドに対しＣＭＰ−シアル酸誘導体４当量を使用し、反応溶媒には５０ｍＭカコジル酸緩衝溶液（ｐＨ５．０）を用い、反応溶液には燐酸加水分解酵素と牛血清アルブミンを加えておく。反応が終了した後、そのまま凍結乾燥した。凍結乾燥品をＨＰＬＣで精製することにより下記に示すＤａｎｓｙｌ化したジ−７−シアロ誘導体の結合した糖鎖ペプチドを得た。
（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ａ−３１４ Ｓ−５ ＯＤＳ ３００×６．０ｍｍ 展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ：０．１％ＴＦＡ アセトニトリル：水＝９０：１０ グラジエントＡ １００％ ０．６０ｍｌ／ｍｉｎ→Ｂ １００％ ０．６０ｍｌ／ｍｉｎ ６０分）

シアル酸転移酵素としてα２，６転移酵素である市販のＲａｔ Ｌｉｖｅｒ由来のものを用い、カコジル酸緩衝溶液のｐＨを６．０とした以外は実施例７と同様にして下記に示すＤａｎｓｙｌ化したジ−７−シアロ誘導体の２，６−結合した糖鎖ペプチドを得た。

参考例１４のシアル酸誘導体の代わりに、参考例１５のシアル酸誘導体を用いた以外は実施例７と同様にして下記に示すジ−８−シアロ誘導体の２，３−結合した糖鎖ペプチドを得た。

参考例１４のシアル酸誘導体の代わりに、参考例１５のシアル酸誘導体を用いた以外は実施例８と同様にして下記に示すジ−８−シアロ誘導体の２，６−結合した糖鎖ペプチドを得た。

参考例１４のシアル酸誘導体の代わりに、参考例１６のシアル酸誘導体を用いた以外は実施例７と同様にして下記に示すジ−９−シアロ誘導体の２，３−結合した糖鎖ペプチドを得た。

参考例１４のシアル酸誘導体の代わりに、参考例１６のシアル酸誘導体を用いた以外は実施例８と同様にして下記に示すジ−９−シアロ誘導体の２，６−結合した糖鎖ペプチドを得た。

実施例６で得られたＤａｎｓｙｌ化しないアシアロ糖鎖ペプチドを用いた以外は実施例７と同様にして下記に示すジ−７−シアロ誘導体の２，３−結合した糖鎖ペプチドを得た。

実施例６で得られたＤａｎｓｙｌ化しないアシアロ糖鎖ペプチドを用いた以外は実施例８と同様にして下記に示すジ−７−シアロ誘導体の２，６−結合した糖鎖ペプチドを得た。

実施例６で得られたＤａｎｓｙｌ化しないアシアロ糖鎖ペプチドを用いた以外は実施例９と同様にして下記に示すジ−８−シアロ誘導体の２，３−結合した糖鎖ペプチドを得た。

実施例６で得られたＤａｎｓｙｌ化しないアシアロ糖鎖ペプチドを用いた以外は実施例１０と同様にして下記に示すジ−８−シアロ誘導体の２，６−結合した糖鎖ペプチドを得た。

実施例６で得られたＤａｎｓｙｌ化しないアシアロ糖鎖ペプチドを用いた以外は実施例１１と同様にして下記に示すジ−９−シアロ誘導体の２，３−結合した糖鎖ペプチドを得た。

実施例６で得られたＤａｎｓｙｌ化しないアシアロ糖鎖ペプチドを用いた以外は実施例１２と同様にして下記に示すジ−９−シアロ誘導体の２，６−結合した糖鎖ペプチドを得た。

ＨＯＯＣ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−ＮＨ_２の合成
上記目的糖ペプチドにおけるＡｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）とは、ベンジル基で保護されていないシアル酸を有するジシアロオリゴアスパラギンを意味する。
固相合成用カラムにＨＭＰＡ−ＰＥＧＡレジン５０ｍｇを入れ、ＣＨ_２Ｃｌ_２，ＤＭＦで十分に洗浄し乾燥させた。
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ），Ｎ−メチルイミダゾールをＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解させ５分間撹拌した後、樹脂の入った固相合成用カラムに入れ室温で３時間攪拌した。攪拌後、樹脂をメチレンクロライド、イソプロパノール、ＤＭＦで洗浄し乾燥させた。その後、２０分間２０％無水酢酸ＤＭＦ溶液を用いて固相上の未反応の水酸基をアセチル化しキャッピングした。ＤＭＦで樹脂を洗浄後、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を用いて２０分撹拌することによりＦｍｏｃ基を脱保護しレジン−Ｓｅｒ−ＮＨ_２を得た。ＤＭＦで洗浄後、乾燥させた。
次に、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨの順にＨＯＢｔ・Ｈ_２ＯとＰｙＢＯＰ・ＤＩＰＥＡによって縮合させた。各アミノ酸縮合後、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を用いて２０分撹拌することによりＦｍｏｃ基を脱保護した。
次に、ジベンジルＦｍｏｃ−ジシアロ糖鎖アスパラギンをＤＭＳＯ、ＤＭＦ１対１の混合溶媒に溶かし、ＨＡＴＵとＤＩＰＥＡを用いて室温２４時間攪拌させて縮合させた。ＤＭＦで洗浄後１０％無水酢酸／２−プロパノール：メタノールで２０分間攪拌しキャッピングした。ＤＭＦで洗浄後、樹脂にＤＭＦ：２，６−Ｌｕｔｉｄｉｎｅ＝１：１の混合溶媒を加え、各糖水酸基に対し３当量のＴＥＳＯＴｆを加えた後１時間反応させることで糖水酸基をＴＥＳ（Ｔｒｉｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）基で保護した。
樹脂をＤＭＦ，ＴＨＦで洗浄後、２０％ピペリジン／ＴＨＦで２０分間攪拌しＦｍｏｃ基を脱保護しＴＨＦで樹脂を洗浄した。
この樹脂に、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）をＴＨＦ溶媒中、ＨＯＢｔ・Ｈ_２ＯとＰｙＢＯＰ・ＤＩＰＥＡを用いて縮合し、２０％ピペリジン／ＴＨＦでＦｍｏｃ基の脱保護を行って、レジン−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ（ＴＥＳ化ジベンジルｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−ＮＨ_２を得た。ここでＡｓｎ（ＴＥＳ化ジベンジルｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）とは、シアル酸のカルボキシル基がベンジル基、糖水酸基がＴＥＳ基で保護されたシアル酸を有するジシアロオリゴアスパラギンを意味する。
縮合が終了した樹脂をよく乾燥した後、９５％ＴＦＡ水溶液を加え、室温で３時間攪拌してアミノ酸の保護基・ＴＥＳ基およびレジンを切断した。レジンをろ過して除き、反応溶液を室温で減圧濃縮した後、水に溶かし凍結乾燥した。凍結乾燥品をｐＨ１１の水酸化ナトリウム水溶液に溶かし、ベンジルエステルを加水分解してベンジルを脱離した後、酢酸で中和しそのまま凍結乾燥した。凍結乾燥品をＨＰＬＣで精製することで目的とするＨＯＯＣ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ）−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−ＮＨ_２を得た。
（Ｍｉｇｈｔｓｙｌ ＯＤＳ−Ｃ１８ ２５０×２０ｍｍ 展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ：０．１％ＴＦＡ アセトニトリル：水＝９０：１０グラジエントＡ １００％ ０→Ｂ １００％ ６０分 流速２．５０ｍｌ／ｍｉｎ）

本発明によれば、少なくとも１以上の糖鎖アスパラギンまたはムチン結合型糖鎖をペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを人工的に容易に大量に合成可能な糖ペプチドの製造法を提供することができる。
また本発明によれば、シアル酸を有する糖鎖アルパラギンであっても、酸処理によってシアル酸が糖ペプチドから切断されず、容易にシアリル糖ペプチドを得ることができる。
また本発明によれば、糖残基が任意に除去（欠失）された各種の新規な糖鎖アスパラギンの少なくとも１以上をペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを人工的に容易に大量に合成可能である。
また本発明によれば、糖ペプチドにシアル酸転移酵素を用いてシアル酸もしくはその誘導体を導入することにより、シアル酸もしくはその誘導体が導入された糖ペプチドを得ることができる。

Claims (21)

1. （１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基をエステル化反応させ、
   （２）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
   （３）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
   （４）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
   （５）上記（３）及び（４）の工程を１回以上繰り返し、
   （６）脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とアミド化反応させ、
   （７）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
   （８）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
   （９）上記（７）及び（８）の工程を１回以上繰り返し
   （１０）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
   （１１）酸で樹脂（レジン）を切断することを特徴とする少なくとも１以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドの製造法。
2. （６）の、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とアミド化反応させ、（７）の、上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程を、適宜追加する少なくとも２以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドの製造法。
3. （６）の、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とアミド化反応させ、（７）の、上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程を、最終工程で行う少なくとも１以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖に有する糖ペプチドの製造法。
4. （６）の工程に代えて、或いは（６）の工程に加えて、（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基をエステル化反応させる、請求の範囲第１項に記載の糖ペプチドの製造法。
5. 請求の範囲第１項（６）の糖鎖アスパラギンが、６以上の糖残基を有するものである請求の範囲第１〜４項に記載の糖ペプチドの製造法。
6. 請求の範囲第１項（６）の糖鎖アスパラギンが、９〜１１の糖残基を有するものである請求の範囲第１〜４項に記載の糖ペプチドの製造法。
7. 請求の範囲第１項（６）の糖鎖アスパラギンが、６以上の糖残基を有し、２分岐型糖鎖を結合したものである請求の範囲第１〜４項に記載の糖ペプチドの製造法。
8. 請求の範囲第１項（６）の糖鎖アスパラギンが、ジシアロ糖鎖アスパラギンもしくはモノシアロ糖鎖アスパラギンであって、該シアル酸のカルボキシル基が保護基により保護されたものである請求の範囲第１〜４項に記載の糖ペプチドの製造法。
9. 請求の範囲第１項（６）の糖鎖アスパラギンが、アシアロ糖鎖アスパラギンである請求の範囲第１〜４項に記載の糖ペプチドの製造法。
10. シアル酸のカルボキシル基の保護基がベンジル基である請求の範囲第８項に記載の糖ペプチドの製造法。
11. 脂溶性保護基が９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である請求の範囲第１〜４項に記載の糖ペプチドの製造法。
12. 糖鎖アスパラギンの一部又は全部の代わりにムチン結合型糖鎖を用いる請求の範囲第１〜１１項に記載の糖ペプチドの製造法。
13. 請求の範囲第１〜１２項に記載の製造法により、取得可能な少なくとも１以上の糖鎖アスパラギンまたはムチン結合型糖鎖をペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチド。
14. 糖鎖アスパラギンまたはムチン結合型糖鎖が、６以上の糖残基を有し、２分岐型糖鎖を結合したものである請求の範囲第１３項に記載の糖ペプチド。
15. 糖鎖アスパラギンとしてジシアロ糖鎖アスパラギン及びモノシアロ糖鎖アスパラギンから選ばれる少なくとも１種以上を結合した糖ペプチドである請求の範囲第１３項に記載の糖ペプチド。
16. 糖鎖アスパラギンが式（１）で表されるものである請求の範囲第１３項に記載の糖ペプチド。
    

    

    〔式中、Ｒ^３およびＲ^４は、水素原子、式（２）〜（５）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。〕
    

    

    
17. （１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基をエステル化反応させ、
    （２）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
    （３）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
    （４）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
    （５）上記（３）及び（４）の工程を１回以上繰り返し、
    （６）脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とアミド化反応させ、
    （７）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
    （８）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
    （９）上記（７）及び（８）の工程を１回以上繰り返し
    （１０）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
    （１１）酸で樹脂（レジン）を切断し、
    （１２）得られた糖ペプチドにシアル酸転移酵素を用いてシアル酸もしくはその誘導体を転移させることを特徴とする少なくとも１以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有し、且つ末端にシアル酸もしくはその誘導体残基を有する糖ペプチドの製造法。
18. 上記工程（１１）の酸で樹脂（レジン）を切断する前に、標識剤を反応させる請求の範囲第１７項に記載の糖ペプチドの製造法。
19. 標識剤がダンシルハライドである請求の範囲第１８項に記載の糖ペプチドの製造法。
20. Ｎ−アセチル−４−デオキシ−４−フルオロ−Ｄ−マンノサミン、ピルビン酸ナトリウム、牛血清アルブミン、シアル酸アルドラーゼを反応させることを特徴とする５−アセタミド−３，５，７−トリデオキシ−７−フルオロ−Ｄ−グリセロ−β−Ｄ−ラクト−２−ノヌロピラノシドニック アシッドの製造法。
21. ベンジル ２−アジド−２，４−ジデオキシ−４−フルオロ−β−Ｄ−マンノピラノシドを、無水酢酸の存在下、水素添加して、Ｎ−アセチル−４−デオキシ−４−フルオロ−Ｄ−マンノサミンを得て、次いでこれとピルビン酸ナトリウム、牛血清アルブミン、シアル酸アルドラーゼを反応させることを特徴とする５−アセタミド−３，５，７−トリデオキシ−７−フルオロ−Ｄ−グリセロ−β−Ｄ−ラクト−２−ノヌロピラノシドニック アシッドの製造法。