CN106659821A - 止血用药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明解决了提供止血用药物组合物的问题,所述药物组合物具有与各自利用生物凝胶的常规止血剂相比更高的可用性,并且在宽pH范围内可形成透明的和均质的水凝胶。提供了包含糖链‑多肽复合物的止血用药物组合物,所述止血用药物组合物的特征在于,糖链‑多肽复合物中的多肽是包含极性氨基酸残基和非极性氨基酸残基交替排列的氨基酸序列的多肽,其中一条或多条糖链与所述多肽结合。

Description

止血用药物组合物
技术领域
本发明涉及包含糖链-多肽复合物的止血用药物组合物。
背景技术
生物凝胶例如水凝胶和血纤蛋白胶被用作用于三维培养等的研究基质、外科基质例如手术期间/手术后止血剂或伤口愈合片材、药物递送系统(DDS)等。
然而,因为这些生物凝胶中许多使用生物来源的材料,随其使用而存在风险,例如来自微生物例如病毒的感染、免疫原性和疾病传播。例如,尽管血纤蛋白胶作为手术期间的止血剂而具有高的效用价值,但因为来源材料源自于人血,在实际使用时在患者手术期间已存在被已污染了血纤蛋白胶的肝炎病毒感染的多个病例,从而引起重大的社会问题。还存在用生物来源的生物凝胶不能总是提供均质品质的凝胶的问题。
与生物来源的生物凝胶相比,通过化学合成生产的生物凝胶已知没有感染风险和能够提供均质品质的凝胶(专利文献1)。然而,迄今为止已知的生物凝胶要求例如当形成凝胶时缓冲液交换或置换和混合多种试剂等程序,操作复杂。此外,不仅因为根据pH范围导致溶解度低,组合使用的试剂或溶剂受到限制,而且还存在问题,例如可施用部位(受累部位)受限和在使用时注射器或管阻塞。此外,低溶解度(即,不透明的),特别是在接近于生物pH的中性范围内,在要求可见的情况(例如手术视野)下会使利用复杂化。
引用文献列表
[专利文献1] 美国专利号5670483。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是提供止血用药物组合物,其与利用常规生物凝胶的止血剂相比具有更高的可用性,并可在宽pH内形成透明的和均质的水凝胶。
解决问题的手段
作为本发明人为解决所述问题而广泛研究的结果,不仅令人惊讶地发现,通过结合糖链与包含极性和非极性氨基酸残基交替排列的氨基酸序列的多肽生产的糖链-多肽复合物显示高的水溶性,并在宽pH范围内,特别是在中性范围内形成透明的和均质的水凝胶,而且还发现,该水凝胶作为止血剂极为有用,从而导致本发明的完成。
换句话说,本发明提供包含糖链-多肽复合物的止血用药物组合物,其特征在于,所述糖链-多肽复合物中的所述多肽是包含极性和非极性氨基酸残基交替排列的氨基酸序列的多肽,且一条或多条糖链与所述多肽结合。
此外,本发明的一个实施方案的特征在于,所述糖链-多肽复合物中的所述多肽是包含由8-34个氨基酸残基组成的极性和非极性氨基酸残基交替排列的氨基酸序列的多肽。
此外,本发明的一个实施方案的特征在于,所述糖链-多肽复合物可通过在具有大约中性pH的水性溶液中自组装而形成包含β片结构的水凝胶。
此外,本发明的一个实施方案的特征在于,在所述止血用药物组合物中包含的所述糖链-多肽复合物的浓度是0.1%重量-20%重量。
此外,本发明的一个实施方案的特征在于,在与所述多肽结合的一条或多条糖链中存在的糖残基的总数量是5以上。
此外,本发明的一个实施方案的特征在于,与所述多肽结合的糖链数是1、2或3。
此外,本发明的一个实施方案的特征在于,糖链与自位于所述多肽的N末端的氨基酸残基计数直至x位的每个氨基酸和自位于C末端的氨基酸残基计数直至y位的每个氨基酸结合(其中x和y是整数,x ≥ 0,y ≥ 0,且x + y是与多肽结合的糖链的总数量)。
此外,本发明的一个实施方案的特征在于,所述糖链是具有支链的糖链。
此外,本发明的一个实施方案的特征在于,所述药物组合物呈水凝胶状态。
本领域技术人员应认识到,上述本发明的一个或多个特征的任何组合的发明也包括在本发明的范围内。
发明效果
因为本发明的止血用药物组合物在宽pH范围(包括中性范围)内具有高的水溶性和形成均匀的和透明的水凝胶,因此较少限制组合使用的试剂或溶剂,和可用作具有高的可用性的止血剂。此外,因为其可在宽pH范围内使用,因此较少限制可施用的部位(受累部位)。
此外,因为本发明的止血用药物组合物中包含的糖链-多肽复合物在宽pH范围内(包括中性范围)具有高的水溶性和形成均匀的和透明的水凝胶,溶胶和凝胶状态可以在中性pH下可逆存在。换句话说,糖链-多肽复合物可一度形成凝胶状态,然后通过机械搅拌呈溶胶状态,并且再次仍呈凝胶状态。因此,其可以凝胶状态分配(即,即用型状态)和不需要如其它肽凝胶那样的复杂操作,例如在适合于胶凝的pH (例如酸性pH)下形成凝胶后进行缓冲液交换(或置换)以实现中性pH。换句话说,本发明的糖链-多肽复合物在操作性方面非常优于其它肽凝胶。此外,因为本发明的止血用药物组合物可使用的pH范围宽,所以较少发生在使用时注射器和管的阻塞等问题。
此外,因为本发明的止血用药物组合物中包含的糖链-多肽复合物被动物体内存在的糖链修饰,所以与没有任何修饰的肽相比抗原性降低。此外,本发明的止血用药物组合物中包含的糖链-多肽复合物几乎没有产生毒性的风险,例如用例如聚乙二醇(PEG)修饰的化合物所见到的风险。因此,本发明的止血用药物组合物对于生物应用具有高安全性。
此外,因为本发明的止血用药物组合物在生理条件下(中性范围)形成均匀的和透明的水凝胶和具有低的抗原性,所以作为用于体内动物应用的水凝胶是优选的。
附图说明
图1显示对溶于超纯水、盐水或磷酸盐缓冲液的C(DiGlcNAc)-(RADA)4的各组合物进行圆二色性(CD)测量的结果。
图2显示对溶于超纯水、盐水或磷酸盐缓冲液的(RADA)4的各组合物进行圆二色性(CD)测量的结果。
图3是C(DiGlcNAc)-(RADA)4和(RADA)4形成纤维结构的能力的比较。
图4显示C(DiGlcNAc)-(RADA)4和(RADA)4在水性溶液状态中的贮存弹性模量。
图5显示加入盐之后C(DiGlcNAc)-(RADA)4和(RADA)4的贮存弹性模量。
图6显示当C(DiGlcNAc)-(RADA)4或(RADA)4施用于大鼠肝穿刺模型时,在施用后3分钟时止血效果评分的分布。
具体实施方式
本发明的止血用药物组合物中包含的糖链-多肽复合物可具有生物来源或可通过化学合成产生,但在安全稳定性或糖链的品质和均匀性方面优选地通过化学合成产生。
本发明的止血用药物组合物中包含的糖链-多肽复合物可例如在水性溶液中通过相互作用(例如肽分子之间的静电相互作用、氢键合和疏水相互作用)而自装配。本文使用的糖链-多肽复合物在水性溶液中"自装配"意指多肽彼此通过某种相互作用(例如静电相互作用、氢键合、范德华力和疏水相互作用)在水性溶液中自发装配,不应解释为具有限制性含义。
本发明的止血用药物组合物中包含的糖链-多肽复合物可在水性溶液中自装配和形成β片结构。此外,水凝胶可通过所述β片结构多次成层而形成。用于证实糖链-多肽复合物在水性溶液中形成β片结构的方法不特别受到限制,其可通过例如测量包含糖链-多肽复合物的水性溶液的圆二色性(CD)得到证实。因为一般而言作为具有β片结构的分子的特征,在197 nm附近波长见到最大值,和在216 nm附近波长见到最小值,所以β片结构形成可通过圆二色性测量验证在这些波长附近的峰而得到证实。
因为本发明的止血用药物组合物中包含的糖链-多肽复合物包含极性和非极性氨基酸残基交替排列的氨基酸序列,因此当在水性溶液中形成β片结构时,仅极性氨基酸残基可排列在β片结构的一侧上,而仅非极性氨基酸残基可排列在另一侧上。因此,所述β片结构可以将疏水侧(仅具有非极性氨基酸残基排列的一侧)隐藏的方式装配,以形成双层结构。随后,该β片层化结构将随分子自组装进行而延伸,因此可形成三维构象(例如,水凝胶)。
本文使用的"大约中性的pH"意指pH在7.0附近,更特别是pH在5.0 - 9.0的范围内,优选地pH在6.0 - 8.0的范围内。
本发明的止血用药物组合物中包含的糖链-多肽复合物的浓度可由本领域技术人员根据可适用的症状或可施用的部位而适当地调整,例如可以是0.1%重量-20%重量,优选地0.2%重量-15%重量,和进一步优选地是0.5%重量-10%重量。当止血用药物组合物中包含的糖链-多肽复合物的浓度是0.1%重量以下时,存在将不适当地形成水凝胶的可能性。注意,本文的水凝胶广义上是指分散介质主要是水的凝胶或溶胶组合物,不应解释为具有限制性含义。
本发明的止血用药物组合物可以水性溶液状态或水凝胶状态使用。用于制备所述水性溶液或所述水凝胶的方法不受到限制。例如,呈水性溶液状态的止血用药物组合物可通过将糖链-多肽复合物溶于超纯水而获得,或呈水凝胶状态的止血用药物组合物可通过进一步加入包含盐的溶剂(例如生理盐水、PBS等)至溶于超纯水的糖链-多肽复合物的水性溶液中而获得。
此外,止血用药物组合物不限于仅包含糖链-多肽复合物和溶剂(水、PBS、生理盐水等)的那些,可包含各种其它组分。例如,通过包含具有消毒/灭菌组分的试剂,不仅可停止自伤口出血,而且还可同时进行伤口的消毒/灭菌。
如本说明书的实施例中所示,本发明的止血用药物组合物在水性溶液状态下具有低的贮存弹性模量和在水凝胶状态下具有高的贮存弹性模量。此外,本发明的止血用药物组合物在包括中性范围的宽pH范围内形成具有均匀的纤维结构的澄清的水凝胶。本发明的止血用药物组合物的可适用的症状或可施用的部位不特别受到限制,根据上述性质,可优选地特别用于当目视确认例如手术期间受累部位的状态有必要时的止血、盲点的出血部位的止血、宽出血部位的止血、立体或复杂形状的出血部位的止血等。
本发明的一个实施方案的特征在于,止血用药物组合物中包含的糖链-多肽复合物可在具有大约中性的pH的水性溶液中自装配以形成包含β片结构的水凝胶。甚至在具有并非大约中性的pH的水性溶液中可自装配以形成包含β片结构的水凝胶的那些并未排除在外,只要它们具有所述特征。
本发明的止血用药物组合物中包含的糖链-多肽复合物包含含有极性和非极性氨基酸残基交替排列的氨基酸序列的多肽。所述氨基酸序列的长度不受限制,优选地其可为由8-34个氨基酸残基组成的氨基酸序列,更优选地为由12-25个氨基酸残基组成的氨基酸序列,和进一步优选地为由16-21个氨基酸残基组成的氨基酸序列。
本发明的止血用药物组合物中包含的糖链-多肽复合物包含含有极性和非极性氨基酸残基交替排列的氨基酸序列的多肽。本文使用的"氨基酸"以其最广泛的含义使用,不仅包含构成蛋白质的氨基酸,而且包含非构成蛋白质的氨基酸,例如氨基酸变体和衍生物。本领域技术人员应认识到,根据该广泛的定义,本文的氨基酸的实例包括构成蛋白质的L-氨基酸;D-氨基酸;化学修饰的氨基酸,例如氨基酸变体和衍生物;非构成蛋白质的氨基酸,例如正亮氨酸、β-丙氨酸和鸟氨酸;以及化学合成的具有本领域众所周知的氨基酸特有的性质的化合物。非构成蛋白质的氨基酸的实例包括α-甲基氨基酸(例如α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(例如2-氨基组氨酸、β-羟基组氨酸、同型组氨酸、α-氟甲基组氨酸和α-甲基组氨酸)、在侧链上具有过量亚甲基的氨基酸("同型"氨基酸)和在侧链上羧酸官能团氨基酸被磺酸基团取代的氨基酸(例如磺基丙氨酸)。在本发明的优选方面,本文使用的氨基酸可以是构成蛋白质的氨基酸。
本文使用的极性氨基酸残基不特别受到限制,只要它是侧链可具有极性的氨基酸残基,其实例包括酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基。本文使用的酸性氨基酸残基的实例包括天冬氨酸(Asp:D)残基和谷氨酸(Glu:E),和碱性氨基酸的实例包括精氨酸(Arg:R)、赖氨酸(Lys:K)和组氨酸(His:H)。
注意,例如本文使用的描述例如"天冬氨酸(Asp:D)"意指,三字母描述"Asp"和单字母描述"D"可用作天冬氨酸的缩写。
此外,在本说明书中,在中性氨基酸残基中,包含羟基、酰胺基、硫醇基等的氨基酸残基包括在极性氨基酸残基内,因为它们具有极性。例如,在本说明书中,酪氨酸(Tyr:Y)、丝氨酸(Ser:S)、苏氨酸(Thr:T)、天冬酰胺(Asn:N)、谷氨酰胺(Gln:Q)和半胱氨酸(Cys:C)包括在极性氨基酸残基内。
本文使用的非极性氨基酸残基不特别受到限制,只要它是侧链不具有极性的氨基酸,其实例包括丙氨酸(Ala:A)、缬氨酸(Val:V)、亮氨酸(Leu:L)、异亮氨酸(Ile:I)、甲硫氨酸(Met:M)、苯丙氨酸(Phe:F)、色氨酸(Trp:W)、甘氨酸(Gly:G)和脯氨酸(Pro:P)。
本发明的止血用药物组合物中包含的糖链-多肽复合物中,"极性和非极性氨基酸残基交替排列的氨基酸序列"优选地为其中所述氨基酸序列可以是重复序列"RADA" (2-8个重复,优选地3-6个重复)的那些序列,和更优选地其中所述氨基酸序列可为RADARADARADARADA (SEQ ID NO. 1)或RADARADARADARADARADA (SEQ ID NO. 2)的那些序列。
本文使用的"糖链"是指由一个或多个单位糖(单糖和/或其衍生物)的串构成的化合物。当其是二个单位糖的串时,各单位糖通过脱水缩合经由糖苷键彼此结合。这样的糖链的实例包括但不限于一个宽范围,例如体内包含的单糖和多糖(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、木糖、N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、唾液酸和其复合物和衍生物)以及从复杂生物分子(例如降解的多糖、糖蛋白、蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖和糖脂)降解或诱导的糖链。糖链可以是线性的或支链的。
本文使用的"糖链"还包括糖链衍生物。糖链衍生物的实例包括但不限于构成糖链的糖是例如下述糖的糖链:具有羧基的糖(例如,醛糖酸,其中C-1位置被氧化以变成羧酸(例如D-葡糖酸,其为氧化的D-葡萄糖)和糖醛酸,其中末端C原子变成羧酸(D-葡糖醛酸,其是氧化的D-葡萄糖))、具有氨基或氨基衍生物的糖(例如D-葡糖胺和D-半乳糖胺)、具有氨基和羧基两者的糖(例如N-糖基神经氨酸和N-乙酰基胞壁酸)、脱氧化的糖(例如2-脱氧-D-核糖)、包含硫酸基团的硫酸化糖和包含磷酸基团的磷酸化糖。
在本发明的糖链-多肽复合物中,与多肽结合的糖链不特别受到限制,但关于生物相容性,优选地是作为糖缀合物(例如糖肽(或糖蛋白)、蛋白聚糖和糖脂)体内存在的糖链。这样的糖链包括N-连接的糖链、O-连接的糖链等,其是体内与肽(或蛋白质)结合为糖肽(或糖蛋白)的糖链。
在本发明的糖链-多肽复合物中,例如二唾液酸糖链、去唾液酸糖链、diGlcNAc糖链、二甘露糖(DiMan)糖链、GlcNAc糖链、麦芽三糖糖链、麦芽糖糖链、麦芽四糖糖链、麦芽七糖糖链、β-环糊精糖链和γ-环糊精糖链可用于与多肽结合的糖链。
更特别的是,用于本发明的糖链可以是下式(1)所示的二唾液酸糖链、下式(2)所示的去唾液酸糖链、下式(3)所示的diGlcNAc糖链、下式(4)所示的二甘露糖糖链、下式(5)所示的GlcNAc糖链、下式(6)所示的麦芽三糖糖链、下式(7)所示的麦芽糖糖链、下式(8)所示的麦芽四糖糖链、下式(9)所示的麦芽七糖糖链、下式(10)所示的β-环糊精糖链或下式(11)所示的γ-环糊精糖链。
[化学式1]
式(1) 二唾液酸糖链
[化学式2]
式(2) 去唾液酸糖链
[化学式3]
式(3) diGlcNAc糖链
[化学式4]
式(4) 二甘露糖糖链
[化学式5]
式(5) GlcNAc糖链
[化学式6]
式(6) 麦芽三糖糖链
[化学式7]
式(7) 麦芽糖糖链
[化学式8]
式(8) 麦芽四糖糖链
[化学式9]
式(9) 麦芽七糖糖链
[化学式10]
式(10) β-环糊精糖链
[化学式11]
式(11) γ-环糊精糖链。
在本发明中,也可使用一个或多个糖从上述二唾液酸糖链、去唾液酸糖链、diGlcNAc糖链、二甘露糖糖链或麦芽七糖糖链的非还原端丢失的糖链。
在本发明中,与糖链结合的氨基酸残基不特别受到限制。例如,糖链可与半胱氨酸(Cys:C)或天冬酰胺(Asn:N)结合,优选地与半胱氨酸(Cys:C)结合。
在本发明中,用于结合糖链至氨基酸的方法不特别受到限制。例如,糖链可直接结合至氨基酸残基,或糖链可经过接头结合至氨基酸残基。
此外,在本发明中,与糖链结合的氨基酸残基可直接结合至"极性和非极性氨基酸残基交替排列的氨基酸序列",或可通过例如接头结合。
这样的接头的实例可包括在两端具有氨基和羧基的烷基链或PEG链,使得其可与氨基酸形成肽键。这样的接头的实例可包括-NH-(CH2)n-CO- (其中n是整数和不受到限制,只要其不抑制目的接头功能,优选地1 – 15的整数)或-NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-CO- (其中m是整数和不受到限制,只要其不抑制目的接头功能,优选地1 – 7的整数),更特别是-NH-(CH2)11-CO-(C12接头)或-NH-(CH2CH2O)3-CH2CH2-CO-(PEG接头)等。
用于本发明的糖链-多肽复合物可通过将糖基化步骤整合至本领域技术人员众所周知的多肽合成方法中来制备。尽管利用由转谷氨酰胺酶代表的酶的方法可用于糖基化,但在该情况下存在问题,例如需要加入大量的糖链,最后步骤后纯化的复杂化,和对可加入的糖基化蛋白质和糖链的限制。因此,尽管有可能在小规模合成中使用该方法(例如用于分析),但不能认为其是用于大规模生产的实用方法。
作为用于本发明的糖链-多肽复合物的容易生产方法的具体实例,将在下文说明:通过使用与糖链结合的Asn (糖基化Asn)和应用众所周知的肽合成方法例如固相和液相合成而用于生产糖链-多肽复合物的方法(方法A),和根据众所周知的肽合成方法通过生产任意氨基酸残基是Cys的多肽和然后通过化学合成将Cys糖基化而用于生产糖链-多肽复合物的方法(方法B)。参考这些生产方法,本领域技术人员将能够通过各种方法生产糖链-多肽复合物。
这些方法A和B也可以两种以上种组合进行。在用于分析等的小规模合成的情况下,上述方法可进一步与通过转移酶的糖链延伸反应组合使用。方法A描述于国际公开号2004/005330 (US2005222382 (A1))和方法B描述于国际公开号2005/010053(US2007060543 (A1)),其公开内容通过引用以其整体结合到本文中。此外,在方法A和B中使用的具有均匀的糖链结构的糖链的生产见述于例如国际公开号03/008431(US2004181054 (A1))、国际公开号2004/058984 (US2006228784 (A1))、国际公开号2004/058824 (US2006009421 (A1))、国际公开号2004/070046 (US2006205039 (A1))和国际公开号2007/011055,其公开内容通过引用以其整体结合到本文中。
用于生产糖链-多肽复合物的方法(方法A)
如下文所示,糖链-多肽复合物可通过例如使用与糖链结合的Asn的固相合成生产。
(1) 氨基氮被亲脂保护基保护的氨基酸的羧基与树脂结合。在该情况下,因为氨基酸的氨基氮被亲脂保护基保护,所以防止氨基酸彼此的自缩合,树脂和氨基酸反应形成键。
(2) 得到的反应物的亲脂保护基经分离以形成游离的氨基。
(3) 该游离的氨基和氨基氮受亲脂保护基保护的任何氨基酸的羧基进行酰胺化反应。
(4) 上述亲脂保护基经分离以形成游离的氨基。
(5) 上述步骤(3)和(4)重复一次或多次,以得到连接在一起的任何数量的任何氨基酸的肽,其一端结合了树脂,另一端具有游离的氨基。
(6) 当在上述(5)中合成的肽的游离的氨基欲用乙酰基保护时,其也优选用乙酸酐、乙酸等乙酰化。
(7) 最后,用酸切割树脂,可获得具有所需氨基酸序列的肽。
此处,通过使用氨基氮用亲脂保护基保护的糖基化Asn代替氨基氮用亲脂保护基保护的氨基酸,和使所述天冬酰胺部分的羧基与(1)中的树脂的羟基反应,可获得在C末端具有糖基化Asn的肽。
此外,在(2)之后,或在重复(3)和(4)任何次数(一次或多次)之后,在(3)中通过使用氨基氮用亲脂保护基保护的糖基化Asn代替氨基氮用亲脂保护基保护的氨基酸,可在多肽的任何位置结合糖链。
以这种方式,在步骤(1)和(3)的任一者中通过使用氨基氮用亲脂保护基保护的糖基化Asn代替氨基氮用亲脂保护基保护的氨基酸两次以上,可在多肽的任何两个以上位置结合糖链。
如果在结合糖基化Asn后,亲脂保护基经分离和形成游离的氨基,和步骤(7)紧接其后进行,则可获得在N末端具有糖基化Asn的多肽。
提供C末端为酰胺基的树脂可以是通常用于固相合成的树脂。例如,优选使用Rink-Amide-树脂(获自Merck & Co., Inc.)、Rink-Amide-PEGA树脂(获自Merck & Co.,Inc.)或NH-SAL-树脂(获自Watanabe Chemical Industries,Ltd.),其用氨基官能化。此外,Fmoc-NH-SAL-树脂-接头(获自Watanabe Chemical Industries,Ltd.)等可结合用氨基官能化的氨基-PEGA-树脂(获自Merck & Co., Inc.)等。肽的C末端氨基酸可通过用酸切割该树脂和肽而酰胺化。
此外,可使用的使C末端为羧酸的树脂的实例为用氯官能化的2-氯三甲苯基氯化物树脂(来自Merck & Co., Inc.)、用氨基官能化的氨基-PEGA树脂(来自Merck & Co.,Inc.)、具有羟基的NovaSyn TGT醇树脂(来自Merck & Co., Inc.)、Wang树脂(来自Merck &Co., Inc.)、HMPA-PEGA树脂(来自Merck & Co., Inc.)等。此外,接头可存在于氨基-PEGA树脂和氨基酸之间,这样的接头的实例可包括4-羟基甲基苯氧乙酸(HMPA)、4-(4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基)-丁基乙酸(HMPB)等。也可使用C末端氨基酸与树脂提前结合的H-Cys(Trt)-Trityl Nova PEG树脂(来自Merck & Co., Inc.)等。
关于树脂和氨基氮用亲脂保护基保护的氨基酸之间的结合,例如为了使用具有羟基的树脂或用氯官能化的树脂,氨基酸的羧基与树脂进行酯结合。此外,当使用用氨基官能化的树脂时,氨基酸的羧基通过酰胺键与树脂结合。
注意,2-氯三苯甲基氯化物树脂是优选的,因为当在固相合成中延伸肽链时其可防止末端Cys的外消旋作用。
用于生产糖链-多肽复合物的方法 - 2 (方法A)
如下所示,糖链-多肽复合物可通过例如使用与糖链结合的Asn的液相合成来生产。
(1) 氨基氮用亲脂保护基保护的氨基酸的羧基与具有游离的氨基和经保护或酰胺化的羧基的氨基酸结合。
(2) 获得的反应物的亲脂保护基经分离以形成游离的氨基。
(3) 该游离的氨基和氨基氮用亲脂保护基保护的任何氨基酸的羧基在溶液中进行酰胺化反应。在该情况下,因为氨基酸在N末端侧上的氨基氮用亲脂保护基保护,和在C末端侧上的羧基被保护或酰胺化,因此防止了氨基酸彼此的自缩合,游离的氨基和羧基反应形成键。
(4) 上述亲脂保护基经分离以形成游离的氨基。
(5) 上述步骤(3)和(4)重复一次或多次,以得到连接在一起的任何数量的任何氨基酸的肽,其具有被保护或酰胺化的C末端羧基和在N末端具有游离的氨基。
(6) 当在上述(5)中合成的肽的游离的氨基欲用乙酰基保护时,也优选用乙酸酐、乙酸等乙酰化。
(7) 最后,侧链亲脂保护基用酸切下,可获得具有所需氨基酸序列的肽。
用于生产糖链-多肽复合物的方法 - 3 (方法A)
如下所示,糖链-多肽复合物可通过例如使用与糖链结合的Asn的片段合成方法生产。
(1) 氨基氮用乙酰基或亲脂保护基保护的多肽或糖链-多肽复合物在树脂上通过用于生产糖链-多肽复合物的上述方法(方法A)的(1)-(6)合成。
(2) 在不使侧链保护基脱保护的条件下将多肽或糖链-多肽复合物从树脂上切下,以获得在C末端具有游离的羧基和在N末端具有用乙酰基或亲脂保护基保护的氨基氮的多肽或糖链-多肽复合物。
(3) 获得的氨基氮用乙酰基或亲脂保护基保护的多肽或糖链-多肽复合物通过固相或液相合成与树脂或多肽连接。
(4) 上述亲脂保护基经分离以形成游离的氨基。
(5) 上述步骤(3)和(4)重复一次或多次,以得到连接在一起的任何数量的任何氨基酸的肽。
(6) 最后,树脂用酸切下,可获得具有所需氨基酸序列的肽。
亲脂保护基的实例可包括基于碳酸酯或酰胺的保护基等,例如9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、苄基、烯丙基、烯丙基氧基羰基和乙酰基。为了引入亲脂保护基至氨基酸,例如引入Fmoc基团,可通过加入9-芴基甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯和碳酸氢钠并允许反应而进行引入。反应可在0-50℃下、优选地室温下进行大约1 – 5小时。
市售可得的那些也可用作用亲脂保护基保护的氨基酸,其实例可包括Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys-OH、Fmoc-Arg-OH、Fmoc-His-OH、Fmoc-Asp-OH、Fmoc-Glu-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Trp-OH和Fmoc-Pro-OH。
此外,具有保护基引入至侧链的用亲脂保护基保护的氨基酸的实例可包括Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH和Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
此外,当需要加入接头至糖链-多肽缀合物的氨基酸序列时,在固相合成过程中接头可使用用亲脂保护基保护的接头代替上述用亲脂保护基保护的氨基酸在优选的位置上插入。
当使用2-氯三甲苯基氯化物树脂时,酯化可通过使用碱例如二异丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺、吡啶和2,4,6-三甲基吡啶进行。此外,当使用具有羟基的树脂时,例如,众所周知的脱水缩合剂例如1-均三甲苯磺酰基-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)、二环己基碳二亚胺(DCC)和二异丙基碳二亚胺(DIC)可用作酯化催化剂。氨基酸和脱水缩合剂之间的使用比例是1当量的前者与通常1 – 10当量、优选地2 – 5当量的后者。
酯化反应优选地通过例如下述方法进行:将树脂置于固相柱中,用溶剂洗涤该树脂和然后加入氨基酸溶液。洗涤溶剂的实例可包括二甲基甲酰胺(DMF)、2-丙醇、二氯甲烷等。用于溶解氨基酸的溶剂的实例可包括二甲基亚砜(DMSO)、DMF、二氯甲烷等。酯化反应可在0 - 50℃、优选地在室温下进行约10分钟 - 30小时,优选地15分钟 - 24小时。
此时还优选通过用乙酸酐等乙酰化来掩蔽固相上的未反应基团。
亲脂保护基的分离可通过例如用碱处理进行。碱的实例可包括哌啶、吗啉等。优选在溶剂的存在下进行。溶剂的实例可包括DMSO、DMF、甲醇等。
游离氨基和氨基氮用亲脂保护基保护的任何氨基酸的羧基之间的酰胺化反应优选地在活化剂和溶剂的存在下进行。
活化剂的实例可包括二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(WSC/HCl)、二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)、羰基二咪唑(CDI)、二乙基氰基膦酸酯(DEPC)、苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻(DIPCI)、苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)、羟基邻苯二甲酰亚胺(HOPht)、五氟苯酚(Pfp-OH)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HCTU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟膦酸盐(HATU)、O-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)、3,4-二氢-3-氢二-4-氧杂-1,2,3-苯并三嗪(Dhbt)、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物n-水合物(DMT-MM)等。
优选的是,对氨基氮用亲脂保护基保护的任何氨基酸,使用的活化剂的量是1 –20当量,优选地1 – 10当量和进一步优选地1 – 5当量。
溶剂的实例可包括DMSO、DMF、二氯甲烷等。反应可在0 - 50℃、优选地室温下进行约10分钟 - 30小时,优选地15分钟 - 24小时。亲脂保护基的分离可类似于上述进行。
当引入C末端氨基酸至用氨基官能化的Rink-Amide-树脂(来自Merck & Co.,Inc.)、Rink-Amide-PEGA树脂(来自Merck & Co., Inc.)或NH-SAL-树脂(来自WatanabeChemical Industries,Ltd.)或者与NH-SAL-树脂-接头结合的氨基-PEGA-树脂(来自Merck& Co., Inc.)等时,引入可通过使用上述酰胺化反应进行。
优选用酸处理以从树脂切下肽链。酸的实例可包括三氟乙酸(TFA)、氟化氢(HF)等。
以该方式,可获得在需要的位置上具有糖基化Asn的糖链-多肽复合物。
在本发明的一个实施方案中,当在用于固相合成的糖基化Asn中糖链的非还原端包含唾液酸时,优选所述唾液酸的羧基被保护基保护以防止唾液酸被酸处理切下。保护基的实例可包括苄基、烯丙基、二苯甲基、苯甲酰甲基等。用于引入保护基和分离保护基的方法可通过众所周知的方法进行。
用于生产糖链-多肽复合物的方法(方法B)
糖链-多肽复合物也可通过首先合成多肽和然后随后将合成的多肽糖基化的方法生产。具体而言,通过下述方法生产在欲糖基化的位置上包含Cys的多肽:固相或液相合成方法、通过细胞合成的方法、分离和提取天然存在的那些多肽的方法等。当多肽通过固相或液相合成方法合成时,可按一次一个残基连接氨基酸,或可连接多肽。不欲糖基化的Cys例如在预定形成二硫键的位置上的Cys此时用例如乙酰胺基甲基(Acm)保护。此外,当引入不欲糖基化和不用于形成二硫键的Cys至糖链-多肽复合物时,可通过在糖基化步骤和二硫键形成步骤期间用保护基保护该Cys,和然后将其去保护来引入。这样的保护基的实例可包括叔丁基(tBu)或4-甲氧基苄基等。
此外,当在一个多肽中添加不同的糖链至Cys时,不同的糖链可如下引入:使用于首先引入糖链的Cys未保护,和通过StBu等保护用于接着引入不同糖链的Cys。具体而言,当通过固相合成等合成多肽时,使用于引入第一糖链的Cys未保护,和用于引入第二糖链的Cys为具有Fmoc-Cys(StBu)-OH等保护基的Cys。然后,将糖链引入至未保护的Cys,而保护基例如StBu仍保留。通过将StBu基团等去保护,不同的糖链然后可引入至未保护的Cys。用于引入第一糖链的Cys和用于引入第二糖链的Cys可以是一个或多个。
StBu基团的去保护可通过与还原剂例如三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)和三丁基膦反应进行。上述反应可通常在0 - 80℃、优选地5 - 60℃和还优选地10 - 35℃进行。优选地,反应时间通常为约30分钟 - 5小时。在反应完成时,合适时,这可用众所周知的方法纯化(例如高效液相柱色谱(HPLC))。
当引入不同的糖链时,优选用对在Cys的去保护步骤中的还原条件或在纯化步骤例如HPLC中的酸性条件更稳定的糖链开始引入。具体而言,当引入包含唾液酸的糖链时,优选首先引入不具有唾液酸的糖链或具有较少唾液酸残基的糖链。
此外,当需要添加接头至糖链-多肽复合物的氨基酸序列中时,接头可在固相合成过程中在合成多肽的优选位置上插入,例如通过使用用亲脂保护基保护的接头代替用亲脂保护基保护的氨基酸。
接着,通过使卤代乙酰化的糖链衍生物与包含上述获得的未保护的Cys反应,糖链与未保护的Cys的硫醇基反应和结合至肽。上述反应可在磷酸盐缓冲液、tris-盐酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或其混合溶液中通常在0 - 80℃、优选地10 - 60℃和进一步优选地15- 35℃进行。反应时间通常为10分钟 - 24小时,和优选地通常大约30分钟- 5小时。在反应完成时,合适时,这可用众所周知的方法纯化(例如HPLC)。
卤代乙酰化的糖链衍生物的实例为与天冬酰胺连接的糖链的1位的碳结合的羟基被-NH-(CH2)a-(CO)-CH2X置换的化合物(其中X是卤素原子,和a是整数并不受到限制,只要其不抑制目的接头功能,优选地为0 – 4的整数)。
具体而言,将卤代乙酰化的复合物糖链衍生物和包含Cys的多肽在磷酸盐缓冲液中在室温下反应。在反应完成时,具有与糖链结合的Cys的糖链-多肽复合物可通过用HPLC纯化而获得。
反应也可在有机溶剂(例如DMSO、DMF、甲醇和乙腈)与上述缓冲液的混合溶液中进行。在该情况下,有机溶剂可按范围0 - 99% (v/v)的比例添加至上述缓冲液。对于对所述缓冲液具有低溶解度的包含未保护的Cys的肽,这是优选的,因为加入这样的有机溶剂可提高针对反应溶液的溶解度。
反应也可在有机溶剂例如DMSO、DMF、甲醇和乙腈或其混合溶液中进行。优选在碱的存在下进行。碱的实例可包括DIPEA、三乙胺、吡啶、2,4,6-三甲基吡啶等。反应也可在盐酸胍或尿素添加至所述缓冲液溶液的混合溶液中进行。盐酸胍或尿素可添加至上述缓冲液,使得终浓度为1 M - 8 M。这是优选的,因为添加盐酸胍或尿素也可提高对所述缓冲液具有低溶解度的肽的溶解度。
此外,反应还可通过加入三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)至缓冲液中进行,以防止包含未保护的Cys的多肽通过二硫键形成二聚体。TCEP或DTT可添加至缓冲液中,使得终浓度为10 μM - 10 mM。
此外,当生产在肽序列中具有多个包含唾液酸的糖链(例如二唾液酸或单唾液酸糖链)的糖链-多肽复合物时,可使用在欲引入的糖链上唾液酸的羧基被苄基(Bn)、烯丙基、二苯甲基、苯甲酰甲基等保护的包含唾液酸的糖链。
当引入唾液酸羧基保护的糖链时,将唾液酸保护基去保护的步骤可在下文描述的糖链-多肽复合物形成二硫键的步骤后进行。
以此方式,通过用苄基等保护唾液酸的羧基,将利于在生产步骤中通过HPLC等的分离/纯化步骤。保护唾液酸的羧基还将能够防止对酸敏感的唾液酸的分离。
在糖链上唾液酸的羧基的保护反应可通过本领域技术人员众所周知的方法进行。此外,在糖链-多肽复合物中,唾液酸的羧基的保护基可通过在碱性条件下水解来去保护。上述反应可通常在0 - 50℃、优选地0 - 40℃和进一步优选地0 - 30℃进行。优选地,反应时间通常为大约5分钟 - 5小时。在反应完成时,合适时,在用弱酸例如磷酸或乙酸中和后,这可用众所周知的方法纯化(例如HPLC)。
此外,在方法B中,与卤代乙酰化的复合物糖链衍生物反应的氨基酸不特别受到限制,只要它是含硫醇基的氨基酸,和例如D-半胱氨酸(D-Cys)、同型半胱氨酸、去甲半胱氨酸、青霉胺等也可类似于Cys使用。
与本发明的止血用药物组合物中包含的糖链-多肽复合物结合的糖链的类型不特别受到限制,但优选的是,与糖链-多肽复合物结合的糖链中存在的糖残基的总数量是5以上。例如,可加入一个或多个五糖以上的糖链,或可加入多个五糖以下的糖链,使得添加至一个糖链-多肽复合物的糖链上存在的糖残基的数量为5以上。当加入多个糖链时,与一个肽结合的糖链的类型可以是相同的,或可组合结合不同类型的糖链,但优选它们是相同的。
例如,当与糖链-多肽复合物结合的糖链中存在的糖残基的总数量是5时,可结合具有两个糖残基的麦芽糖糖链和具有三个糖残基的麦芽三糖糖链的各一个。此外,当与糖链-多肽复合物结合的糖链中存在的糖残基的总数量为6时,可结合三个麦芽糖糖链,或可结合两个麦芽三糖糖链。此外,当与糖链-多肽复合物结合的糖链中存在的糖残基的总数量为7时,可结合两个麦芽糖糖链和一个麦芽三糖糖链,或可结合具有七个糖残基的一个diGlcNAc糖链。类似地,对于其中与糖链-多肽复合物结合的糖链中存在的糖残基的总数量为8以上的情况,可结合各种糖链的组合。
与本发明的止血用药物组合物中包含的糖链-多肽复合物结合的糖链数不受到限制,只要糖链-多肽复合物未丢失通过在具有大约中性的pH的水性溶液中自组装形成β片结构的特征。例如,其可以是1、2、3、4、5或6条链,优选地1、2或3条链。
在本发明的止血用药物组合物中包含的糖链-多肽复合物中,糖链结合的氨基酸残基的位置不受到限制,只要糖链-多肽复合物未丢失通过在具有大约中性的pH的水性溶液中自组装形成β片结构的特征。例如,糖链结合的氨基酸残基的位置可以是多肽的N和/或C末端侧,或其可以是并非N和C末端侧的位置。
优选地,糖链可与从位于多肽的N末端的氨基酸残基计数直至x位的每个氨基酸和从位于C末端的氨基酸残基计数直至y位的每个氨基酸结合(其中x和y是整数,x ≥ 0,y ≥0,和x + y是与多肽结合的糖链的总数量)。
更具体而言,当与多肽结合的糖链数为1时,所述一条糖链可结合至位于所述多肽的N末端的氨基酸残基或位于C末端的氨基酸残基。
此外,当与多肽结合的糖链数为2时,所述两条糖链可结合至选自下文(1) - (3)的氨基酸残基:
(1) 从位于多肽的N末端的氨基酸残基计数的第一个和第二个氨基酸残基
(2) 从位于多肽的C末端的氨基酸残基计数的第一个和第二个氨基酸残基,和
(3) 位于多肽的N末端的氨基酸残基和位于所述多肽的C末端的氨基酸残基。
此外,当与多肽结合的糖链数为3时,所述三条糖链可结合至选自下文(1) - (4)的任何氨基酸残基:
(1) 从位于多肽的N末端的氨基酸残基计数的第一个、第二个和第三个氨基酸残基
(2) 从位于多肽的C末端的氨基酸残基计数的第一个、第二个和第三个氨基酸残基
(3) 从位于多肽的N末端的氨基酸残基计数的第一个和第二个氨基酸残基,和位于多肽的C末端的氨基酸残基,和
(4) 位于多肽的N末端的氨基酸残基,和从多肽的C末端计数的1位和2位的氨基酸残基。
优选的是,添加至本发明的止血用药物组合物中包含的糖链-多肽复合物的糖链是支链的。此处,本文使用的与多肽结合的糖链是"具有支链的糖链"不限于例如在一条糖链中具有支链的那些糖链,例如二唾液酸糖链、去唾液酸糖链或diGlcNAc糖链,而且还包括例如多个线性糖链添加至一个多肽以产生糖链在肽中作为整体是支链的状态的那些糖链。例如,与一个多肽结合的具有两条以上条线性糖链(例如麦芽糖糖链或麦芽三糖糖链)的那些,也包括在本文的"具有支链的糖链"中。
在本发明中,用于评价水凝胶的强度或性质的方法不特别受到限制,例如可通过钢球负荷试验或动态粘度测量进行评价。在钢球负荷试验中,例如水凝胶的强度可如下评价:将给定重量的钢球负载到在Durham氏管内侧形成的水凝胶的表面上,并观察钢球是停留在水凝胶的表面上或下沉。此外,在钢球负荷试验中,可目视确认水凝胶的透明度或不溶物质或沉淀的存在或不存在。在水凝胶的动态粘度测量中,水凝胶的强度随时间的变化可通过用流变仪测量受试水凝胶的动态粘度进行测量。
本文使用的术语用于描述具体实施方案,和不旨在限制本发明。
此外,本文使用的术语"包含",除非上下文清楚表明不同地理解,否则意指所述项(例如组分、步骤、要素和数量)的存在,和不排除其它项(例如组分、步骤、要素和数量)的存在。
除非另外定义,否则本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属技术领域的技术人员广泛理解的相同含义。本文使用的术语,除非明确另外定义,否则应解释为具有与本文和相关技术领域中的含义一致的含义,而不应解释为具有理想化或过度形式化的含义。
术语例如第一和第二有时用于表示各种要素,应认识到,这些要素不受这些术语的限制。这些术语仅用于区分一个要素与另一个要素的目的,例如在未脱离本发明的范围的情况下,有可能描述第一个要素为第二个要素,和同样地,描述第二个要素为第一个要素。
现在将通过实施例更具体地描述本发明。然而,本发明可通过各种实施方案具体化,不应解释为受限于本文所述的实施例。
例如,本文所示的DiGlcNAc-BrAc表示溴代乙酰化的diGlcNAc糖链。此外,例如本文所示的C(DiGlcNAc)-(RADA)4表示与diGlcNAc糖链结合的半胱氨酸残基结合至具有氨基酸序列RADARADARADARADA的多肽的N末端。
实施例
(合成实施例1) C(DiGlcNAc)-(RADA)4的合成
(合成实施例1-1) DiGlcNAc-BrAc的合成
用类似于描述于WO2005/010053的方法进行合成,以获得由下式(12)表示的DiGlcNAc-BrAc。
[化学式12]
式(12)
(合成实施例1-2) Ac-C(RADA)4-NH 2 的合成
将Rink amide PEGA树脂(100 μmol)吸收至用于固相合成的柱中,用DMF和二氯甲烷洗涤,接着加入Fmoc-Ala-OH (124.5 mg, 400 μmol)、1-双二甲基氨基亚甲基-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HCTU) (157.2 mg, 380 μmol)和二异丙基乙胺(DIPEA)(104.5 μL, 600 μmol)在DMF (2.5 mL)中的溶液,和将其摇振15分钟。用二氯甲烷和DMF洗涤后,通过用20%哌啶/DMF处理除去Fmoc保护基。用DMF洗涤后,用PreludeTM肽合成仪合成:用基于Fmoc方法的肽固相合成方法保护的由下式(13) (SEQ ID NO. 3)表示的树脂-结合的多肽。在DMF中使用HCTU作为缩合剂进行缩合反应。
[化学式13]
式(13)
Fmoc保护基通过用20%哌啶/DMF处理而除去。用DMF和二氯甲烷洗涤后,加入乙酸酐和吡啶,摇振1小时。用DMF和二氯甲烷洗涤后,加入三氟乙酸(TFA):水:三异丙基甲硅烷:乙烷二硫醇(= 90:2.5:5:2.5),和将其在室温下摇振4小时。滤除树脂,加入冷乙醚至滤液,作为沉淀物获得粗肽。一部分粗肽用HPLC纯化[柱:SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x 250 mm,流速:7.0 mL/min,展开溶剂A:0.1% aq. TFA,B:0.09% TFA/10%水/90%乙腈,梯度A:B = 88:12 -> 78:22,11 min。线性浓度梯度洗脱],以获得由下式(14)(SEQ ID NO. 4)表示的多肽(32.7 mg)。
[化学式14]
式(14)
(合成实施例1-3) C(DiGlcNAc)-(RADA)4的合成
在合成实施例1-2中合成的多肽(SEQ ID NO. 4) (25.3 mg, 13.9 μmol)和在合成实施例1-1中合成的DiGlcNAc-BrAc (30.0 mg, 20.9 μmol, 对肽1为1.5当量)溶于包含33 μM TCEP和8 M盐酸胍的0.2 M磷酸盐缓冲液(pH 7.3, 4.7 mL),和在室温下反应3小时。
反应溶液用HPLC纯化[柱:SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120 (5 μm), φ 20 x250 mm, 流速: 7.0 mL/min, 展开溶剂A: 0.1% aq. TFA, B: 0.09% TFA/10%水/90%乙腈, 梯度A:B = 88:12 -> 81:19, 10 min。线性浓度梯度洗脱],以获得由下式(15) (SEQID NO. 5)表示的糖链-多肽复合物(23.9 mg, 7.53 μmol, 收率54%)。
[化学式15]
式(15)
(实施例1) 圆二色性(CD)的测量和分析
已知自装配的肽例如(RADA)4由于分子间相互作用而形成β片结构,此外该结构在离子的存在下分层为许多层,形成水凝胶。CD测量已知为证实该β片结构的有效工具。一般而言,当β片结构存在时CD谱在大约197 nm显示正最大和在大约216 nm显示负最大。因此,通过进行CD测量,证实了本发明的组合物是否在宽pH内形成β片结构。
在合成实施例1中合成的C(DiGlcNAc)-(RADA)4和作为对照的(RADA)4 (产品名:PuraMatrix,来自3D Matrix,产品号:354250)各自溶于超纯水,以制备1%重量的水性溶液。向这些水性溶液中加入等量的超纯水、1.8%盐水或0.3 M磷酸盐缓冲液(pH 7.4),以分别产生水性溶液和0.5%重量的水凝胶。然后用超纯水将这些稀释,使得各溶液的肽浓度为100mM。将这些溶液转移至具有0.1 cm的光路长度的石英池。然后用圆二色性分光计(J-805,Jasco)以190 - 260 nm的波长测量CD谱。平均残基椭圆率θ用下式计算:
[θ] = (θobs/10・l・c)/r
其中θobs表示单位毫度的椭圆率,l表示池长度(cm),c表示浓度(M),和r表示氨基酸残基数。
对于包含C(DiGlcNAc)-(RADA)4的组合物的测量结果显示于图1,和对于包含(RADA)4的组合物的测量结果显示于图2。
在水性溶液和生理盐水中,C(DiGlcNAc)-(RADA)4和(RADA)4两者均在大约197 nm显示正最大和在大约216 nm显示负最大,因此证实了两种肽均形成β片结构。另一方面,在磷酸盐缓冲液中,β片结构的形成仅对C(DiGlcNAc)-(RADA)4得到证实。
(实施例2) 纤维结构的形成的证实
在合成实施例1中合成的C(DiGlcNAc)-(RADA)4和作为对照的(RADA)4各自溶于超纯水,以制备1%重量的水性溶液。制备的各水性溶液各自用超纯水、1.8%盐水或磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释,以获得0.5%重量。1微升的稀释溶液各自滴加到劈开的云母衬底(产品名:MICA Grade V-4,来自SPI supplies)。然后用100 μL的双蒸水洗去在所述云母衬底上的过量化合物。然后将衬底在室温下(25℃)空气干燥。
干燥后,用原子力显微镜(产品名:Nanoscale Hybrid Microscope VN-8000,来自Keyence)观察云母衬底上的肽。结果显示于图1。
如图3所示,发现C(DiGlcNAc)-(RADA)4在任一条件下自装配和形成纤维结构。另一方面,对于(RADA)4,发现在磷酸盐缓冲液中观察到聚集物样物质,和未形成纤维结构。
(实施例3) 动态粘度的测量和分析
配备有缝隙高度0.3 mm和40 mm直径的不锈钢平行板的流变仪(Discovery HR-2,来自TA Instruments)用于测量动态粘度。C(DiGlcNAc)-(RADA)4溶于超纯水,以制备0.5 - 5%重量的水性肽溶液。作为对照的(RADA)4也溶于超纯水,以制备0.5 - 1%重量的水性肽溶液。这些水性溶液然后在25℃转移至流变仪装置。以转速100 S-1施加预剪切30秒,之后随时间监测各种物理性质数据(频率= 1Hz,变形= 10%)。该测量结果显示于图4。
在将C(DiGlcNAc)-(RADA)4溶于超纯水后,加入等量的磷酸盐缓冲液(300 mM, pH7.4)以产生0.5 - 5%重量的水凝胶。此外,在将(RADA)4溶于超纯水后,加入等量的1.8%盐水以产生0.5 - 1%重量的水凝胶。注意,(RADA)4在2%重量以上的浓度时不完全溶解,导致处理困难,由此试验未能进行。这些水凝胶的动态粘度在类似于上述的条件下测量。该测量结果显示于图5。
图4显示C(DiGlcNAc)-(RADA)4和(RADA)4在水性溶液状态下的贮存弹性模量。比较1%重量的C(DiGlcNAc)-(RADA)4和1%重量的(RADA)4在水性溶液状态下的贮存弹性模量,C(DiGlcNAc)-(RADA)4显示更低的值。另一方面,类似地比较如图5所示的在添加盐后各自在水凝胶状态下的贮存弹性模量,C(DiGlcNAc)-(RADA)4和(RADA)4显示相当的值。根据这些结果,发现C(DiGlcNAc)-(RADA)4具有下述特征:在水性溶液状态下具有低贮存弹性模量和容易处理,同时在加入盐时立即胶凝。此外,因为C(DiGlcNAc)-(RADA)4具有高的水溶性,所以甚至当肽浓度增加时不会产生聚集体,和可提供具有高贮存弹性模量的水凝胶。
(实施例4) 止血作用的评价
为了证实本发明的水凝胶是否具有体内止血作用,在通过大鼠肝穿刺的出血模型中进行了评价试验。
9周龄的Crlj:SD大鼠用异氟烷麻醉,和自尾静脉给予肝素钠注射液(200 U/大鼠,来自Ajinomoto Pharmaceuticals Co., Ltd.)。将大鼠腹部剖开,和将可塑石蜡膜置于肝的侧左叶和中右叶下以暴露肝表面。肝叶的相同位点用针装置穿刺三次(针束约7 mm直径,以进行穿刺至3 - 4 mm的深度),以得到肝穿刺模型。出血直至穿刺后10秒,用吸收棉除去,和然后立即局部逐滴给予100 μL的各测试物(C(DiGlcNAc)-(RADA)4、(RADA)4)和溶媒(纯化水、PBS)至穿刺位点。在给予后1.5和3分钟,通过下文的评分标准证实止血和出血状态,以评价测试物的止血效果。C(DiGlcNAc)-(RADA)4溶于PBS (pH 7.4, 磷酸盐缓冲盐水)至0.5%重量,并用于评价。(RADA)4溶于纯化水至0.5%重量,并用于评价。
[表1]
表1:止血和出血状态的验证评分
评估 评分 穿刺位点的状态
○:止血 2 其中未观察到出血的状态
△:大部分止血 1 其中见到稍微出血的状态,即使仅间断性的
×:出血 0 其中见到间断性出血的状态
止血效果的评价结果显示于表2。此外,3分钟后止血效果的评分分布显示于图6。直至3分钟后仍观察到持续出血的个体数对于PBS施用组为12/16个病例(75%),和对于纯化水施用组为13/15个病例(87%)。另一方面,直至3分钟后仍观察到持续出血的个体数对于C(DiGlcNAc)-(RADA)4施用组为4/15个病例(27%),而直到3分钟后仍观察到持续出血的个体数对于(RADA)4施用组为3/15个病例(20%)。到穿刺后3分钟,余下的个体形成凝胶样固体或涂膜等,从出血位点的血流停止,或流量减少。
因为在该试验系统中在给予测试物之前给予肝素至大鼠,以在内源性血液凝固系统受到抑制的条件下进行检查,所以上述结果表明测试物具有的止血效果。
[表2]
表2
处理 C(DiGlcNAc)-(RADA)4 PBS (RADA)4 纯化水
1.5分钟 持续出血(评分0) 9/15 (60%) 16/16 (100%) 11/15 (73%) 14/15 (93%)
大部分止血(评分1) 4/15 (27%) 0/16 (0%) 3/15 (20%) 0/15 (0%)
止血(评分2) 2/15 (13%) 0/16 (0%) 1/15 (7%) 1/15 (7%)
3分钟 持续出血(评分0) 4/15 (27%) 12/16 (75%) 3/15 (20%) 13/15 (87%)
大部分止血(评分1) 1/15 (7%) 1/16 (6%) 2/15 (13%) 0/15 (0%)
止血(评分2) 10/15 (67%) 3/16 (19%) 10/15 (67%) 2/15 (13%)
根据以上结果,发现(C(DiGlcNAc)-(RADA)4与(RADA)4相比具有较高的可用性,同时显示等同于(RADA)4的止血效果。换句话说,显示本发明的水凝胶作为止血用药物组合物具有特别高的效用价值。

Claims (9)

1. 包含糖链-多肽复合物的止血用药物组合物,其特征在于,
所述糖链-多肽复合物中的所述多肽是包含极性和非极性氨基酸残基交替排列的氨基酸序列的多肽,和
一条或多条糖链与所述多肽结合。
2.权利要求1的止血用药物组合物,其特征在于,所述糖链-多肽复合物中的所述多肽是包含由8-34个氨基酸残基组成的极性和非极性氨基酸残基交替排列的氨基酸序列的多肽。
3.权利要求1或2的止血用药物组合物,其特征在于,所述糖链-多肽复合物可通过在具有大约中性的pH的水性溶液中自组装而形成包含β片结构的水凝胶。
4.权利要求1的止血用药物组合物,其特征在于,所述止血用药物组合物中包含的所述糖链-多肽复合物的浓度是0.1%重量-20%重量。
5.权利要求1的止血用药物组合物,其特征在于,与所述多肽结合的一条或多条糖链中存在的糖链残基的总数量为5以上。
6.权利要求5的止血用药物组合物,其特征在于,与所述多肽结合的糖链数为1、2或3。
7. 权利要求5的止血用药物组合物,其特征在于,糖链与自位于所述多肽的N末端的氨基酸残基计数直至x位的每个氨基酸和自位于C末端的氨基酸残基计数直至y位的每个氨基酸结合,其中x和y为整数,x ≥ 0,y ≥ 0,且x + y为与所述多肽结合的糖链的总数量。
8.权利要求1的止血用药物组合物,其特征在于,所述糖链是具有支链的糖链。
9.权利要求1-8中任一项的止血用药物组合物,其特征在于,所述药物组合物呈水凝胶状态。
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