CN105085635A

CN105085635A - 一种乳腺癌靶向多肽偶联阿霉素的制备及应用

Info

Publication number: CN105085635A
Application number: CN201510564401.4A
Authority: CN
Inventors: 郑学敏; 龚珉; 孔维苓; 黄长江; 袁静; 徐为人
Original assignee: Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Co Ltd
Current assignee: Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Co Ltd
Priority date: 2015-09-07
Filing date: 2015-09-07
Publication date: 2015-11-25

Abstract

一种乳腺癌靶向多肽偶联阿霉素的制备及应用。本发明所述的细胞穿膜肽，由9个氨基酸组成，而且是亲水性和疏水性交替组合的，本发明通过固相合成的方法得到所需多肽，并且通过化学合成的方法与阿霉素偶联，本发明还提供连接物的肿瘤靶向作用。

Description

一种乳腺癌靶向多肽偶联阿霉素的制备及应用

技术领域：本发明涉及肿瘤相关的药物领域，具体而言，本发明涉及一种环形多肽与阿霉素连接形成一种新的药物，该多肽本身不具有生理活性，但是具有靶向的作用，本发明还涉及该多肽的制备方法及其应用。

技术背景：

根据肿瘤细胞中分子的生物学特征与正常细胞中分子生物学特征的区别而研发的药物统称为分子靶向药物，是随着当代分子生物学、细胞生物学的发展产生的高科技药物。靶向药物治疗癌症，不仅效果好，而且副作用要比常规的化疗方法小得多。使用靶向药物的治疗方法称为靶向治疗(targetedtherapy)。

阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。对机体可产生广泛的生物化学效应，具有强烈的细胞毒性作用。

目前关于阿霉素的改造很多，本专利的目的是通过小分子多肽与阿霉素连接得到乳腺癌靶向的药物。

发明内容

以下是本发明的详细描述：

(1)本发明所述的靶向环肽

本发明所述的靶向多肽，由9个氨基酸组成的环形多肽，而且是亲水性和疏水性交替组合的，所述的靶向肽序列为下述所示的氨基酸序列：

SEQ:CRGDKGPDC

其中N末端的半胱氨酸和C末端的半胱氨酸通过二硫键连接成环。

(2)本发明所述的靶向多肽的制备方法

本发明所需多肽是采用固相的方法制备的，固相合成是以固相载体树脂为载体，从C端即羧基端向N端即氨基端逐渐添加氨基酸的过程。

本发明中优选树脂：Fmoc-wang树脂、2-cl-trt树脂，树脂取代度0.5～1。

本发明所使用的保护氨基酸为：Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Asp-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Phe-OH反应过程中保护氨基酸3倍以上过量。

本发明所使用的脱保护试剂为：哌啶/N,N-二甲基甲酰胺，比例为30:70。

本发明所使用的偶联试剂为：①苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐/1-羟基苯并三唑(HOBT)，②2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基苯并三唑(HOBT),③N,N'-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑(HOBT)。

本发明中，若使用第①或者第②种偶联试剂，那么反应中过程中应添加缚酸剂：DIEA/NMP。

本发明中所使用的切割试剂为：TFA/茴香硫醚/水/苯酚/1,2-乙二硫醇，比例为：82.5:5:5:5:2.5。

切割后经乙醚沉淀，沉淀体积为切割剂的5～10倍，搅拌促进沉淀。

本发明中所使用MS-IT-TOF确定分子量，使用HPLC纯化粗肽。

本发明中靶向多肽的成环方法为：空气氧化法。

将纯化后的多肽溶于水中，浓度1mg/ml，在弱碱性条件下(pH值8.4)，采用空气自然氧化，反应时间24小时。冻干得纯品备用。

(3)本发明所述的环形多肽与阿霉素的连接方法

1)化合物II的合成

50m反应瓶中加入1.00g(1.72mmol)阿霉素，0.52g(5.20mmol)丁二酸酐，30mlTHF，滴加0.66g(5.12mmol)N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，27℃搅拌6h，蒸干溶剂得蜡状物，加水搅拌，有黄色固体析出，抽滤，水洗两次，干燥，得黄色固体1.15g。

2)化合物I的合成

50m反应瓶中加入0.22g(0.32mmol)化合物II，0.10g(0.31mmol)O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)，5mlDMF，氮气保护，滴加0.08g(0.62mmol)N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，27℃搅拌1h后，加入0.10g多肽，27℃搅拌3h后，终止反应。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，

图1：环肽纯化后分析图

图2：环肽偶联阿霉素后对乳腺癌靶向作用图

具体实施方式

实施例1:多肽的固相合成

使用Fmoc策略的固相多肽合成方法(使用的氨基酸购自上海吉尔公司)，使用CEM公司生产的Liberitity型仪器进行本发明的靶向多肽的合成。操作方法按照生产商的仪器说明书进行。先进性直链多肽的合成。

SEQ:CRGDKGPDC合成所用试剂选择：

(1)载体树脂：Rink2-cl-trt，替代度：0.8

(2)所选用的保护氨基酸：Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Asp-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Phe-OH，反应中所用保护氨基酸3倍过量。

(3)本发明所使用的脱保护试剂为：哌啶/N,N-二甲基甲酰胺，比例为20:80。

(4)本发明所使用的偶联试剂为：N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)/1-羟基苯并三唑(HOBT)。

(5)本发明中所使用的切割试剂为：TFA/茴香硫醚/水/苯酚/1,2-乙二硫醇，比例为：82.5:5:5:5:2.5。用10倍体积乙醚搅拌沉淀，HPLC确定纯度大于90％，用水溶解至浓度1mg/ml直接通空气氧化。最后将制得的多肽使用HPLCC18制备柱(购自Waters公司)进行纯化，检测条件为：检测波长：214nm，流动相A：乙腈(含0.1％三氟乙酸)，流动相B：水(含0.1％三氟乙酸)，洗脱条件：30分钟内由15％A～50％A,利用MS-IT-TOF确定所得纯品分子量，用HPLC确定样品纯度，纯度大于95％经脱盐及冷冻干燥得到多肽冻干粉，制得环肽(见图1)。

实施例2：环肽偶联阿霉素后对乳腺癌靶向作用

(1)无菌条件下,按合适的比例,利用单克隆抗体LM609与钆双胺制备抗体造影剂；

(2)制备20只SD大鼠乳腺癌模型,将成瘤大鼠随机分为试验组B(环肽连阿霉素)和对照组A组,每组各10只,实验组经大鼠颈静脉注射不同浓度的药物,对照组注射与前者相同浓度的普通造影剂钆双胺以备扫描；

(3)MRI扫描,分别于注射造影剂前、注射造影剂1小时,6小时,12小时,24小时,36小时,48小时不同时刻记录各组瘤体的信号强度变化。绘制信号强度-时间强化曲线(图2)。

结果:实验B大鼠注射连接药物后造影剂6小时后瘤体强化信号值逐渐提高,在24小时后肿瘤的强化值达到了最高,增强后各时间点信号强度有统计学意义。对照组A组瘤体内造影剂则表现为快进快出的方式。

Claims

1.一种靶向环肽，其特征在于，所述靶向环肽由9个氨基酸组成，亲水性和疏水性交替组合，所述的靶向肽序列为下述所示的氨基酸序列：SEQ:CRGDKGPDC。

2.根据权利要求1所述的靶向环肽，其特征在于，所述环肽的合成优选固相合成法。

3.如权利要求1所述，SEQ优选通过二硫键形成环肽。

4.一种由权利要求1所述的环肽与阿霉素通过化学键形成一种连接物。

5.如权利要求4所述，连接环肽与药物的化学键优选酰胺键。

6.如权利要求4-5任一项所述，连接物具有乳腺癌靶向作用。