KR20160142843A - 지혈용 약학 조성물 - Google Patents

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KR20160142843A
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하야토 사이조
히로후미 오치아이
타이지 시모다
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오츠카 가가쿠 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 기존의 바이오 겔을 이용한 지혈제와 비교하여, 사용성이 높고 광범위한 pH에서 투명하고 균질한 하이드로겔을 형성할 수 있는 지혈용 약학 조성물을 제공하는 것을 과제로 했다. 당사슬-폴리펩티드 복합체를 포함하는 지혈용 약학 조성물로서, 상기 당사슬-폴리펩티드 복합체의 상기 폴리펩티드가, 극성 아미노산 잔기와 비극성 아미노산 잔기가 번갈아 배치된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, 상기 폴리펩티드에 하나 이상의 당사슬이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 지혈용 약학 조성물을 제공한다.

Description

지혈용 약학 조성물{HEMOSTATIC PHARMACEUTICAL COMPOSITION}
본 발명은 당사슬-폴리펩티드 복합체를 포함하는 지혈용 약학 조성물에 관한 것이다.
하이드로겔과 피브린 글루(fibrin glue) 등의 바이오 겔은, 삼차원 배양 등을 위한 연구용 기재, 수술 중/수술 후의 지혈제나 창상 치유 시트 등의 외과용 기재, 드러그 딜리버리 시스템(DDS) 등에 이용되고 있다.
그러나, 이들 대부분은 생물 유래 재료를 사용하기 때문에, 사용시에는, 바이러스 등 미생물의 감염, 면역 원성, 질환의 전파 등의 위험이 존재한다. 예를 들면, 피브린 글루는 수술 시 지혈제로 이용 가치가 높지만, 원료가 인간 혈액으로부터 유래되어서, 실제로 수술 시 사용했을 때, 환자가 피브린 글루에 혼입되어 있던 간염 바이러스에 감염되는 사고가 잦아서, 큰 사회적 문제가 되고 있다. 또한, 생물 유래의 바이오 겔에서는, 반드시 균질한 품질의 겔을 공급할 수 없다는 문제점도 존재한다.
생물 유래의 바이오 겔에 비해, 화학 합성에 의해서 제조된 바이오 겔은, 감염 위험이 없고, 균질한 품질의 겔이 제공될 수 있는 것으로 알려져 있다(특허 문헌 1). 그러나, 이제까지 알려진 바이오 겔은, 겔을 형성할 때 버퍼 교환이나 치환, 여러가지 약재의 혼합 등의 절차가 필요하거나, 조작이 복잡하다. 또한, pH 범위에 따라 어려운 용해성이 되기 때문에, 병용하는 시약이나 용매가 한정될 뿐만 아니라, 적용할 수 있는 부위(환부)가 제한되거나, 사용시에 주사기와 튜브가 막히는 등의 문제가 있다. 또한, 특히, 생체 pH에 가까운 중성 범위에서 낮은 용해성(즉, 투명하지 않음)이기 때문에, 예를 들면 수술 분야 등의 시야를 필요로 하는 상황에 이용하는 것이 어렵다.
선행기술문헌
특허문헌: 미국 특허 제5670483호
본 발명의 목적은, 그동안의 바이오 겔을 이용한 지혈제와 비교하여, 사용성이 높고, 광범위한 pH에서 투명하고 균질한 하이드로겔을 형성할 수 있는 지혈용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 열심히 연구한 결과, 극성 아미노산 잔기와 비극성 아미노산 잔기가 번갈아 배치된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에, 당사슬을 결합시킴으로써 제조된 당사슬-폴리펩티드 복합체가, 놀랍게도, 광범위한 pH 범위, 특히 중성 범위에서 높은 수용성을 보이고, 투명하고 균질한 하이드로겔을 형성할 뿐 아니라, 이 하이드로겔이 지혈제로서 매우 유용함을 찾아, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 당사슬-폴리펩티드 복합체를 포함하는 지혈용 약학 조성물에 관한 것이며, 상기 당사슬-폴리펩티드 복합체의 상기 폴리펩티드는, 극성 아미노산 잔기와 비극성 아미노산 잔기가 번갈아 배치된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, 상기 폴리펩티드에 하나 이상의 당사슬이 결합되고 있는 것을 특징으로 하는, 지혈용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 실시양태는, 상기 당사슬-폴리펩티드 복합체의 상기 폴리펩티드가, 극성 아미노산 잔기와 비극성 아미노산 잔기가 번갈아 배치된 8 내지 34개의 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 실시양태는, 상기 당사슬-폴리펩티드 복합체가 pH가 중성 부근인 수용액 중에서 자가-조립함으로써, β 시트 구조를 포함하는 하이드로겔을 형성함을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 실시양태는, 상기 지혈용 약학 조성물에 포함된 상기 당사슬-폴리펩티드 복합체의 농도가 0.1중량% 내지 20중량%임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 실시양태는, 상기 폴리펩티드에 결합된 하나 이상의 당사슬에 존재하는 당 잔기의 총 수가 5 이상임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 실시양태는, 상기 폴리펩티드에 결합된 당사슬의 수가 1개, 2개 또는 3개임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 실시양태는, 상기 폴리펩티드의 N 말단에 위치한 아미노산 잔기로부터 x번째까지의 모든 아미노산, 및 C 말단에 위치한 아미노산 잔기로부터 y번째까지의 모든 아미노산(여기에서, x 및 y는 정수이며, x는 0 이상이며, y는 0 이상이고, x+y는 폴리펩티드에 결합된 당사슬의 총 수이다)에 당사슬이 결합함을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 실시양태는, 상기 당사슬이 분지를 갖는 당사슬임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 실시양태는, 상기 약학 조성물이, 하이드로겔의 상태에 있음을 특징으로 한다.
전술한 본 발명의 하나 이상의 특징을 임의로 조합한 발명도 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자라면 이해할 것이다.
본 발명에 따른 지혈용 약학 조성물은, 중성 범위를 포함하는 광범위한 pH 범위에서 높은 수용성을 갖고, 균일하고 투명한 하이드로겔을 형성하기 때문에, 병용하는 시약 및 용매의 제한을 받기 어렵고, 사용성이 높은 지혈제로서 사용할 수 있다. 또한, 광범위한 pH 범위에서 이용될 수도 있어서, 처리 부위(환부)가 제한되기 어렵다
또한, 본 발명에 따른 지혈용 약학 조성물에 포함된 당사슬-폴리펩티드 복합체는, 중성 범위를 포함하는 광범위한 pH 범위에서 높은 수용성을 갖고, 균일하고 투명한 하이드로겔을 형성하므로, 중성 pH에서 졸(sol) 상태와 겔 상태가 가역적으로 존재할 수도 있다. 즉, 당사슬-폴리펩티드 복합체는, 일단 겔 상태를 형성한 후에, 기계적 교반에 의해서 졸 상태가 되어도, 다시 겔 상태가 될 수 있다. 그러므로, 겔 상태(즉, 사용 준비 상태)에서 유통시킬 수 있어서, 다른 펩티드성 겔처럼 겔화에 적합한 pH(예를 들면, 산성 pH)에서 겔을 형성시킨 뒤, 중성 pH를 위한 버퍼 교환(또는 치환)을 하는 등의, 번잡한 조작을 필요로 하지 않는다. 즉, 본 발명에 따른 당사슬-폴리펩티드 복합체는, 다른 펩티드성 겔과 비교하여, 조작성이 매우 뛰어나다. 또한, 본 발명에 따른 지혈용 약학 조성물은, 사용할 수 있는 pH 범위가 넓어, 사용시에 주사기와 튜브가 막히는 등의 문제가 발생하기 어렵다.
또한, 본 발명에 따른 지혈용 약학 조성물에 포함된 당사슬-폴리펩티드 복합체는, 동물의 생체 내에 존재하는 당사슬로 개질되기 때문에, 아무런 개질을 갖지 않는 펩티드와 비교하여, 항원성이 저감된다. 또한, 본 발명에 따른 지혈용 약학 조성물에 포함된 당사슬-폴리펩티드 복합체는, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등으로 개질된 화합물에서 볼 수 있는 것과 같이, 독성이 생기는 위험성도 거의 없다. 그러므로, 본 발명에 따른 지혈용 약학 조성물은, 생체에서의 사용에 있어서 안전성이 높다
또한, 본 발명에 따른 지혈용 약학 조성물은, 생리적 조건(중성 범위)에서 균일하고 투명한 하이드로겔을 형성하고, 항원성도 적으므로, 동물의 생체에서 이용하는 지혈제로서 바람직하다.
도 1은, C(DiGlcNAc)-(RADA)4가 초순수, 식염수 또는 인산 완충액에 용해된 조성물에 대해, 각각 원편광 이색성(CD)을 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는, (RADA)4가 초순수, 식염수, 또는 인산 완충액에 용해된 조성물에 대해, 각각 원편광 이색성(CD)을 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은, C(DiGlcNAc)-(RADA)4와 (RADA)4의 섬유상 구조 형성 능력을 비교한 도면을 제시한다.
도 4는, C(DiGlcNAc)-(RADA)4 및 (RADA)4의 수용액 상태에서의 저장 탄성률을 보여준다.
도 5는, C(DiGlcNAc)-(RADA)4 및 (RADA)4의 염 첨가 후 저장 탄성률을 보여준다.
도 6은, 생쥐 간 천자 모델에서, C(DiGlcNAc)-(RADA)4 또는 (RADA)4를 적용했을 경우의, 적용 3분 후의 지혈 효과 점수 분포를 나타낸다.
본 발명에 따른 지혈용 약학 조성물에 포함된 당사슬-폴리펩티드 복합체는, 생물 유래일 수도 있거나, 화학 합성에 의해서 제조된 것일 수도 있지만, 안전성과 품질의 안정성 및 당사슬의 균일성 측면에서, 화학 합성에 의해서 제조된 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 지혈용 약학 조성물에 포함된 당사슬-폴리펩티드 복합체는, 예를 들어, 수용액 중에서, 펩티드 분자 간의 정전기적 상호 작용, 수소 결합 및 소수성 상호 작용 등의 상호 작용을 통해서 자가-조립할 수 있다. 본 명세서에서, 당사슬-폴리펩티드 복합체가 수용액 중에서, "자가-조립하다"는, 수용액 중의 폴리펩티드들이 어떤 상호 작용(예를 들면, 정전기적 상호 작용, 수소 결합, 반 데르 발스 힘, 소수성 상호 작용 등)을 통해서 자발적으로 집합하는 것을 의미하고, 한정적인 의미로 해석되어서는 안된다.
본 발명에 따른 지혈용 약학 조성물에 포함된 당사슬-폴리펩티드 복합체는, 수용액 중에서 자가-조립되고 β 시트 구조를 형성할 수 있다. 게다가, 그 β 시트 구조가 층층이 겹침으로써 하이드로겔을 형성할 수 있다. 수용액 중에서 당사슬-폴리펩티드 복합체가 β 시트 구조를 형성하는 것의 확인 방법은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 당사슬-폴리펩티드 복합체를 포함한 수용액의 원편광 이색성(CD)을 측정함으로써 확인할 수 있다. 일반적으로 β 시트 구조를 갖는 분자의 특징으로서, 197nm 부근의 파장에 최대치가 보이며 216nm 부근의 파장에 최소치가 보이기 때문에, 원편광 이색성의 측정으로 이들의 파장 부근의 정점을 확인함으로써, β 시트 구조의 형성을 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 지혈용 약학 조성물에 포함된 당사슬-폴리펩티드 복합체는, 극성 아미노산 잔기와 비극성 아미노산 잔기가 번갈아 배치된 아미노산 서열을 포함하는 것으로서, 수용액 중에서 β 시트 구조를 형성했을 때, β 시트 구조의 한쪽 면에는 극성 아미노산 잔기만이 배치될 수 있고, 다른 쪽 면에는 비극성 아미노산 잔기만이 배치될 수 있다. 그러므로, 이러한 β 시트 구조는, 소수면(비극성 아미노산 잔기만이 배치된 면)을 숨기는 듯이 모여들고 이층 구조를 형성할 수 있다. 그리고, 분자의 자가-조립이 진행되면서 이 β 시트의 층 구조가 신장되어, 삼차원의 입체 구조(예를 들면, 하이드로겔)를 형성할 수 있다.
본 발명에서, "pH가 중성 부근"이라고 하면, pH가 7.0 부근임을 의미하고, 보다 구체적으로는 pH가 5.0 내지 9.0의 범위, 바람직하게는 pH가 6.0 내지 8.0의 범위임을 의미한다.
본 발명의 지혈용 약학 조성물에 포함된 당사슬-폴리펩티드 복합체의 농도는, 본 발명의 적용 증상이나 적용 부위에 따라서 당업자가 적절히 조절할 수 있지만, 예를 들면, 0.1중량% 내지 20중량%, 바람직하게는 0.2중량% 내지 15중량%, 보다 더욱 바람직하게는 0.5중량% 내지 10중량%이다.지혈용 약학 조성물에 포함된 당사슬-폴리펩티드 복합체의 농도는, 0.1중량%이하이면 적절하게 하이드로겔이 형성되지 않을 가능성이 있다. 또한, 본 명세서에서, 하이드로겔은 분산매가 실질적으로 물인, 겔형 또는 졸형 조성물을 넓게 의미하고, 한정적인 의미로 해석되서는 안 된다.
본 발명의 지혈용 약학 조성물은 수용액 상태에 사용할 수도 있고, 하이드로겔 상태로 사용할 수도 있다. 상기 수용액과 상기 하이드로겔의 제조 방법은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 당사슬-폴리펩티드 복합체를 초순수에 용해함으로써 수용액 상태의 지혈용 약학 조성물을 수득할 수도 있고, 당사슬-폴리펩티드 복합체가 초순수에 용해된 수용액에, 추가로 염을 포함하는 용매(예를 들어, 생리 식염수, PBS 등)를 넣어, 하이드로겔 상태의 지혈용 약학 조성물을 수득할 수도 있다.
또한, 지혈용 약학 조성물은, 당사슬-폴리펩티드 복합체와 용매(물, PBS, 생리 식염수 등)만을 포함하는 것으로 국한되지 않지만, 그 외 각종 성분을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 소독·살균 성분을 갖는 약제를 포함함으로써, 상처에서의 출혈을 멈추는 것 뿐만 아니라 동시에 상처의 살균, 소독도 할 수 있다.
본 명세서의 실시예에서도 나타났듯이, 본 발명의 지혈용 약학 조성물은 수용액 상태에서 저장 탄성률이 낮고, 하이드로겔 상태에서 저장 탄성률이 높다. 또한, 본 발명의 지혈용 약학 조성물은, 중성 범위를 포함하는 폭넓은 pH 범위에서 균일한 섬유 구조를 갖는 투명한 하이드로겔을 형성한다. 본 발명의 지혈용 약학 조성물의 적용 증상이나 처리 부위는 특별히 제한되지 않지만, 상기와 같은 성질 때문에, 특히 수술 중 등의, 환부 상황이 눈이 필요한 경우의 지혈, 사각에 해당하는 출혈 부위의 지혈, 광범위한 출혈 부위의 지혈, 입체 또는 복잡한 형상의 출혈 부위의 지혈 등에 알맞게 사용될 수 있다.
본 발명의 실시양태는, 지혈용 약학 조성물에 포함된 당사슬-폴리펩티드 복합체가, pH가 중성 부근인 수용액 중에서 자가-조립하고 β 시트 구조를 포함하는 하이드로겔을 형성할 수 있는 것임을 특징으로 하지만, 상기 특징을 갖고 있는 한, pH가 중성 부근 이외의 수용액 중에서도 자가-조립하고 β 시트 구조를 포함하는 하이드로겔을 형성할 수 있는 것을 제외하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 지혈용 약학 조성물에 포함된 당사슬-폴리펩티드 복합체는, 극성 아미노산 잔기와 비극성 아미노산 잔기가 번갈아 배치된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하지만, 상기 아미노산 서열의 길이는 제한되지 않고 바람직하게는 8 내지 34개의 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열, 보다 바람직하게는 12 내지 25개의 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열, 보다 더욱 바람직하게는 16 내지 21개의 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열일 수도 있다.
본 발명에 따른 지혈용 약학 조성물에 포함된 당사슬-폴리펩티드 복합체는, 극성 아미노산 잔기와 비극성 아미노산 잔기가 번갈아 배치된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하지만, 본 발명에서, "아미노산"은 그의 가장 넓은 의미에 사용되며, 단백질 구성 아미노산 뿐만 아니라 아미노산 변이체 및 유도체와 같은 단백질-비-구성 아미노산을 포함한다. 당업자라면, 그의 넓은 정의를 고려하여, 본 발명의 아미노산으로서, 예를 들면, 단백질 구성 L-아미노산; D-아미노산; 아미노산 변이체 및 유도체 등의 화학 개질된 아미노산; 노르류신, β-알라닌, 오르니틴 등의 단백질-비-구성 아미노산; 및 아미노산의 특징인 당업계에 공지된 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물 등을 포함하는 것으로, 이해할 것이다. 단백질-비-구성 아미노산의 예로는, α-메틸 아미노산(α-메틸알라닌 등), D-아미노산, 히스티딘형 아미노산(2-아미노-히스티딘, β-하이드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로 메틸-히스티딘 및 α-메틸-히스티딘 등), 측쇄에 여분의 메틸렌을 갖는 아미노산("호모"아미노산), 및 측쇄 내 카복실산 작용기 아미노산이 설포네이트 기로 치환되는 아미노산(시스테인산 등)을 포함한다. 본 발명의 바람직한 양상에서, 본 발명에 이용되는 아미노산은 단백질 구성 아미노산이다.
본 발명에서, 극성 아미노산 잔기는, 측쇄가 극성을 가질 수 있는 아미노산 잔기이면, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 산성 아미노산 잔기와 염기성 아미노산 잔기가 포함된다. 본 명세서에서, 산성 아미노산 잔기는, 예를 들면, 아스파르트산(Asp:D) 잔기 및 글루탐산(Glu:E) 등을 포함하고, 염기성 아미노산이란 아르기닌(Arg:R), 리신(Lys:K), 및 히스티딘(His:H) 등을 포함한다.
또한, 본원 명세서에서, 예를 들면 "아스파르트산(Asp:D)" 등의 표기는, 아스파르트산의 약칭으로, 세 글자 표기로 "Asp", 한 문자 표기로 "D"가 이용될 수가 있음에 주목한다.
또한, 본 명세서에서, 중성 아미노산 잔기 중에서, 하이드록실기, 산 아미드기, 티올기 등을 포함하는 아미노산 잔기는, 극성을 갖는 것으로서, 극성 아미노산 잔기에 포함된다. 예컨대, 본 명세서에서, 티로신(Tyr:Y), 세린(Ser:S), 트레오닌(Thr:T), 아스파라긴(Asn:N), 글루타민(Gln:Q), 및 시스테인(Cys:C)이, 극성 아미노산 잔기에 포함된다.
본 명세서에 사용된 비극성 아미노산 잔기는, 측쇄가 극성을 갖지 않는 아미노산이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 알라닌(Ala:A), 발린(Val:V), 류신(Leu:L), 이소류신(Ile:I), 메티오닌(Met:M), 페닐알라닌(Phe:F), 트립토판(Trp:W), 글리신(Gly:G), 및 프롤린(Pro:P) 등을 포함한다.
본 발명에 따른 지혈용 약학 조성물에 포함된 당사슬-폴리펩티드 복합체에서 "극성 아미노산 잔기와 비극성 아미노산 잔기가 번갈아 배치된 아미노산 서열"은, 바람직하게는 상기 아미노산 서열이 "RADA"의 반복 서열(반복이 2 내지 8회, 바람직하게는 반복이 3 내지 6회)이고, 보다 바람직하게는 상기 아미노산 서열은 RADARADARADARADA(서열 번호 1) 또는 RADARADARADARADARADA(서열 번호 2)일 수도 있다.
본 발명에서 "당사슬"이란, 단위 당(단당류 및/또는 그 유도체)이 하나 이상 모여서 생긴 화합물을 지칭한다. 단위 당이 2개 이상 이어지는 경우, 각각의 단위 당 사이는, 글리코시드 결합에 의한 탈수 축합에 의해서 결합된다. 이러한 당사슬로는, 예를 들어, 생체 중에 함유된 단당류 및 다당류(포도당, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 자일로스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 시알산, 및 그의 복합체 및 유도체), 뿐만 아니라, 분해된 다당류, 당 단백질, 프로테오글리칸, 글리코스아미노글리칸, 및 당지질 등의 복합 생체 분자로부터 분해 또는 유도된 당사슬 등 광범위한 것을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 당사슬은 직쇄형 또는 분지쇄일 수도 있다.
또한, 본 발명에 사용될 때, "당사슬"에는 당사슬의 유도체도 포함되며, 당사슬의 유도체로는 당사슬을 구성하는 당이, 카복시기를 갖는 당(예를 들어, C-1위치가 산화되어 카복실산이 된 알돈산(예를 들어, D-글루코스가 산화된 D-글루콘산), 말단의 C원자가 카복실산이 된 우론산(D-글루코스가 산화된 D-글루쿠론산), 아미노기 또는 아미노기의 유도체를 갖는 당(예를 들어, D-글루코사민, D-갈락토사민 등), 아미노기 및 카복시기를 모두 갖는 당(예를 들면, N-글리코일뉴르아민산, N-아세틸무람산 등), 데옥실화된 당(예를 들면, 2-데옥시-D-리보스), 설포네이트기를 포함하는 설페이트화 당, 및 포스페이트기를 포함하는 포스포릴화 당 등인 당사슬을 들 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 당사슬-폴리펩티드 복합체에서, 폴리펩티드에 결합된 당사슬은 특별히 제한되지 않으나, 생체 적합성의 관점에서, 생체 내에서 복합 당질(당 펩티드(또는 당단백질), 프로테오글리칸, 당지질 등)로서 존재하는 당사슬인 것이 바람직하다. 이러한 당사슬은, 생체 내에서 당 펩티드(또는 당단백질)로서 펩티드(또는 단백질)에 결합되어 있는 당사슬인, N-결합형 당사슬, O-결합형 당사슬 등을 포함한다.
본 발명에 따른 당사슬-폴리펩티드 복합체에서, 폴리펩티드에 결합된 당사슬은, 예컨대 다이시아로 당사슬, 아시알로 당사슬, DiGlcNAc 당사슬, 다이만노스(DiMan) 당사슬, GlcNAc 당사슬, 말토트리오스 당사슬, 말토스 당사슬, 말토테트라오스 당사슬, 말토헵타오스 당사슬, β-시클로덱스트린 당사슬, γ-시클로덱스트린 당사슬을 사용할 수 있다
보다 구체적으로는, 본 발명에 이용되는 당사슬은, 하기 화학식 1로 도시된 다이시알로 당사슬, 하기 화학식 2로 도시된 아시알로 당사슬, 하기 화학식 3으로 도시된 DiGlcNAc 당사슬, 하기 화학식 4로 도시된 다이만노스 당사슬, 하기 화학식 5로 도시된 GlcNAc 당사슬, 하기 화학식 6으로 도시된 말토트리오스 당사슬, 하기 화학식 7로 도시된 말토스 당사슬, 하기 화학식 8로 도시된 말토테트라오스 당사슬, 하기 화학식 9로 도시된 말토헵타오스 당사슬, 하기 화학식 10으로 도시된 β-시클로덱스트린 당사슬, 또는 하기 화학식 11로 도시된 γ-시클로덱스트린 당사슬일 수도 있다.
[화학식 1]
다이시알로 당사슬
Figure pct00001
[화학식 2]
아시알로 당사슬
Figure pct00002
[화학식 3]
DiGlcNAc 당사슬
Figure pct00003
[화학식 4]
다이만노스 당사슬
Figure pct00004
[화학식 5]
GlcNAc 당사슬
Figure pct00005
[화학식 6]
말토트리오스 당사슬
Figure pct00006
[화학식 7]
말토스 당사슬
Figure pct00007
[화학식 8]
말토테트라오스 당사슬
Figure pct00008
[화학식 9]
말토헵타오스 당사슬
Figure pct00009
[화학식 10]
β-시클로덱스트린 당사슬
Figure pct00010
[화학식 11]
γ-시클로덱스트린 당사슬
Figure pct00011
본 발명에서, 상기 다이시알로 당사슬, 아시알로 당사슬, DiGlcNAc 당사슬, 다이만노스 당사슬, 또는 말토헵타오스 당사슬의 비-환원 말단으로부터 하나 이상의 당을 잃은 당사슬도 사용할 수 있다.
본 발명에서, 당사슬이 결합되는 아미노산 잔기는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 당사슬을 시스테인(Cys:C) 또는 아스파라긴(Asn:N)에 결합할 수도 있고, 바람직하게는 시스테인(Cys:C)에 결합할 수도 있다.
본 발명에서, 아미노산에 당사슬을 결합하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 예컨대 아미노산 잔기에 당사슬을 직접 결합할 수도 있거나, 아미노산 잔기에 연결기를 통해 당사슬을 결합할 수도 있다.
또한, 본 발명에서, 당사슬이 결합된 아미노산 잔기는, "극성 아미노산 잔기와 비극성 아미노산 잔기가 번갈아 배치된 아미노산 서열"에 대해 직접 결합할 수도 있거나, 예를 들어, 연결기를 통해 결합될 수도 있다.
이러한 연결기의 예는, 아미노산과 펩티드 결합할 수 있도록, 두 말단에 아미노기 및 카복시기를 갖는 알킬쇄 또는 PEG 고리 등을 들 수 있다. 이러한 연결기로는, 예를 들어 -NH-(CH2)n-CO-(여기서, n은 정수이며, 목적으로 하는 연결 기능을 저해하지 않는 한, 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게는 1 내지 15의 정수를 나타낸다) 또는 -NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-CO-(여기서, m은 정수이며, 목적으로 하는 연결기 기능을 저해하지 않는 한, 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게는 1 내지 7의 정수를 나타낸다)등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, -NH-(CH2)11-CO-(C12 연결기) 또는 -NH-(CH2CH2O)3-CH2CH2-CO-(PEG 연결기) 등을 들 수 있다.
본 발명에 이용되는 당사슬-폴리펩티드 복합체는, 당업자에게 공지된 폴리펩티드 합성 방법에, 당사슬 부가 공정을 짜넣는 것으로 제조할 수 있다. 당사슬 부가에 있어서는, 트랜스글루타미나제로 표현되는 효소를 이용하는 방법도 이용할 수 있지만, 이 경우, 첨가된 당사슬이 대량으로 필요한 경우에는, 최종 공정 후의 정제가 복잡하고 당사슬 부가 위치 및 첨가가능한 당사슬의 제한 등의 문제가 있기 때문에, 검정용 등의 소량의 합성에 이용되는 것은 가능하지만, 대규모 제조에는 실용적인 방법이라고 말할 수 없다.
본 발명에 이용되는 당사슬-폴리펩티드 복합체의 간단한 제조 방법의 구체적인 예로서, 이하, 당사슬이 결합된 Asn(당사슬-부가(glycosylated) Asn)을 사용하고, 고상 합성, 액상 합성 등의 공지된 펩티드 합성 방법을 적용함으로써 당사슬-폴리펩티드 복합체를 만드는 방법(A법), 및 임의의 아미노산 잔기가 Cys인 폴리펩티드를, 공지된 펩티드 합성 방법에 따라 제조하고, 그 후 Cys를 화학 합성에 의해 당사슬 부가함으로써, 당사슬-폴리펩티드 복합체를 만드는 방법(B법)을 예시한다. 이들의 제조 방법을 참고하여, 당업계의 숙련자라면 여러가지 방법으로 당사슬-폴리펩티드 복합체를 제조할 수 있다.
또한, 이들 A법 및 B법은 2개 이상을 조합하여 수행할 수도 있다. 검정 등에 이용하는 소량의 합성의 경우, 또한 상기의 방법에 전이 효소에 의한 당사슬 신장 반응을 조합하는 것도 가능하다. 또한, A법은 국제특허 공개공보 제2004/005330호(US2005222382(A1))에, B법은 국제특허 공개공보 제2005/010053호(US2007060543(A1))에 각각 기재되어 있고, 상기 공개공보는 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함된다. 또한, A법 및 B법에 이용되는 당사슬 구조가 균일한 당사슬의 제조에 관해서는, 국제특허 공개공보 제03/008431호(US2004181054(A1)), 국제특허 공개공보 제2004/058984호(US2006228784(A1)), 국제특허 공개공보 제2004/058824호(US2006009421(A1)), 국제특허 공개공보 제2004/070046호(US2006205039(A1)), 국제특허 공개공보 제2007/011055호 등에 기재되어 있고, 상기 공개공보는 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함된다.
당사슬 -폴리펩티드 복합체를 만드는 방법( A법 )
당사슬-폴리펩티드 복합체는, 예를 들어, 하기에서 개요를 서술한 것과 같이, 당사슬이 결합된 Asn을 이용하는 고상 합성에 의해서 제조할 수 있다.
(1) 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산 카복시기를, 수지(레진)에 결합시킨다. 이 경우, 아미노산의 아미노기 질소를 지용성 보호기에서 보호하고 있으므로, 아미노산 간의 축합은 자기-방지되고, 레진과 아미노산이 반응하여 결합이 일어난다.
(2) 수득된 반응물의 지용성 보호기를 제거하고 유리 아미노기를 형성한다.
(3) 상기 유리 아미노기와, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산의 카복시기를, 아미드화 반응시킨다.
(4) 상기 지용성 보호기를 제거하고 유리 아미노기를 형성한다.
(5) 상기 (3) 및 (4)의 공정을 1회 이상 반복함으로써, 임의의 수의 임의의 아미노산이 연결된, 말단에 수지를 결합하고, 다른 말단에 유리 아미노기를 갖는 펩티드를 수득할 수 있다.
(6) 상기 (5)에서 합성된 펩티드의 유리 아미노기가 아세틸기로 보호되는 경우, 아세트산 무수물, 아세트산 등을 이용하여 아세틸화하는 것이 바람직하다.
(7) 마지막으로, 산에서 레진을 절단함으로써, 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 수득할 수 있다.
여기에서, (1)에서, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산 대신에, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당사슬 부가 Asn을 사용하고, 상기 아스파라긴 부분의 카복시기와 레진의 하이드록실기를 반응시킴으로써, C-말단에서 당사슬 부가 Asn을 갖는 펩티드를 수득할 수 있다.
또한, (2) 후에, 또는 (3)과 (4)를 1회 이상의 임의의 회수만큼 반복한 뒤, (3)에서, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산 대신에, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당사슬 부가 Asn을 사용하면, 폴리펩티드의 임의 부분에 당사슬을 결합시킬 수 있다.
이처럼, (1) 및 (3)의 하나의 공정에서, 2회 이상, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산 대신에, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당사슬 부가 Asn을 이용하면, 폴리펩티드의 임의의 2곳 이상에 당사슬을 결합시킬 수 있다.
당사슬 부가 Asn을 결합시킨 뒤, 지용성 보호기를 제거하여 유리 아미노기를 형성시키고, 그 직후에 공정(7)을 하면, N-말단에 당사슬 부가 Asn을 갖는 폴리펩티드를 수득할 수 있다.
C-말단을 아미드기로 하여 공급하는 수지(수지)로는, 통상, 고상 합성에 사용하는 수지(레진)일 수 있으며, 예를 들면, 아미노기로 작용화된 링크-아미드-레진(Rink-Amide-resin; 머크 앤드 캄파니 인코포레이티드(Merck & Co., Inc.)로부터), 링크-아미드-PEGA 레진(머크 앤드 캄파니 인코포레이티드로부터), 또는 NH-SAL-수지(와타나베 케미칼 인더스트리즈 리미티드(Watanabe Chemical Industries, Ltd.))를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 아미노기로 작용화된 아미노-PEGA-수지(머크 앤드 캄파니 인코포레이티드로부터) 등에 Fmoc-NH-SAL-레진-연결기(와타나베 케미칼 인더스트리즈 리미티드)가 연결될 수도 있다. 상기 수지와 펩티드를 산으로 절단함으로써, 펩티드의 C-말단 아미노산을 아미드화할 수 있다.
또한, C-말단을 카복실산으로 하는 경우의 수지(레진)로서는, 예를 들어, 염소로 작용화된 2-클로로트리틸클로라이드 수지(머크 앤드 캄파니., 인코포레이티드로부터), 아미노기로 작용화된 아미노-PEGA 레진(머크 앤드 캄파니., 인코포레이티드로부터), 하이드록실기를 갖는 노바신(NovaSyn) TGT 알콜 수지(머크 앤드 캄파니., 인코포레이티드로부터), 왕(Wang) 레진(머크 앤드 캄파니., 인코포레이티드로부터), HMPA-PEGA 레진(머크 앤드 캄파니., 인코포레이티드로부터) 등을 이용할 수 있다. 또한, 아미노-PEGA 레진과 아미노산 사이에 연결기를 사용할 수도 있고, 이런 연결기로서, 예를 들면, 4-하이드록시 메틸페녹시아세트산(HMPA), 4-(4-하이드록시메틸-3-메톡시 페녹시)-부틸 아세트산(HMPB) 등을 들 수 있다. C-말단 아미노산이 수지에 미리 결합된 H-Cys(Trt)-트리틸 노바 PEG 수지(머크 앤드 캄파니., 인코포레이티드로부터) 등도 사용할 수 있다.
수지와, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산의 결합에서, 예를 들면, 하이드록실기를 갖는 수지나 염소로 작용화된 수지를 사용하려면, 아미노산의 카복시기를 수지와 에스테르 결합시킨다. 또한, 아미노기로 작용화된 수지를 사용할 경우에는, 아미노산의 카복시기를 수지에 아미드 결합으로 결합시킨다.
또한 2-클로로트리틸클로라이드 수지는, 고상 합성에서 펩티드 사슬을 신장할 때, 말단 Cys의 라세미화를 방지할 수 있는 점에서, 바람직하다.
당사슬 -폴리펩티드 복합체를 만드는 방법-2( A법 )
당사슬-폴리펩티드 복합체는, 예를 들어, 하기에서 개요를 서술한 것과 같이, 당사슬이 결합된 Asn을 이용하는 액상 합성에 의해서 제조할 수 있다.
(1) 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산 카복시기를, 아미노기가 유리되고 카복시기가 보호 또는 아미드화된 아미노산에 결합시킨다.
(2) 수득된 반응물의 지용성 보호기를 제거하고 유리 아미노기를 형성한다.
(3) 상기 유리 아미노기와, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산 카복시기를, 용액 중에서 아미드화 반응시킨다. 이 경우 N-말단 측의 아미노산의 아미노기 질소를 지용성 보호기로 보호할 수 있으며, C-말단 측 카복시기는 보호 또는 아미드화되어 있으므로, 아미노산 간의 축합은 방지되고, 유리 아미노기 및 카복시기가 반응하고 결합이 일어난다.
(4) 상기 지용성 보호기를 제거하고 유리 아미노기를 형성한다.
(5) 상기 (3) 및 (4) 공정을 1회 이상 반복함으로써, 임의의 수의 임의의 아미노산이 연결된, C-말단 카복시기가 보호 또는 아미드화되고, N-말단에 유리 아미노기를 갖는 펩티드를 수득할 수 있다.
(6) 상기 (5)에서 합성한 펩티드의 유리 아미노기를 아세틸기로 보호할 경우, 아세트산 무수물, 아세트산 등을 이용하여 아세틸화하는 것이 바람직하다.
(7) 마지막으로, 산으로 측쇄의 지용성 보호기를 절단함으로써, 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 수득할 수 있다.
당사슬 -폴리펩티드 복합체를 만드는 방법-3( A법 )
당사슬-폴리펩티드 복합체는, 예를 들어, 하기에서 개요를 서술한 바와 같이, 당사슬이 결합된 Asn을 이용한 분절 합성법에 의해서 제조할 수 있다.
(1) 상기 당사슬-폴리펩티드 복합체를 만드는 방법(A법)의 (1) 내지 (6)으로, 아세틸기 또는 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 폴리펩티드 또는 당사슬-폴리펩티드 복합체를 수지 위에 합성한다.
(2) 측쇄 보호기가 탈-보호되지 않는 조건으로, 레진으로부터 폴리펩티드 또는 당사슬-폴리펩티드 복합체를 절단하고, C-말단에 유리 카복시를 갖고 N-말단이 아세틸기 또는 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 폴리펩티드 또는 당사슬-폴리펩티드 복합체를 수득한다.
(3) 수득된 아세틸기 또는 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 폴리펩티드 또는 당사슬-폴리펩티드 복합체를, 고상 합성법 또는 액상 합성법으로 수지 또는 폴리펩티드와 연결한다.
(4) 상기 지용성 보호기를 제거하고 유리 아미노기를 형성한다.
(5) 상기 (3) 및 (4) 공정을 1회 이상 반복함으로써, 임의의 수의 임의의 아미노산이 연결된 펩티드를 수득할 수 있다.
(6) 마지막으로, 산으로 수지를 절단함으로써, 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 수득할 수 있다.
지용성 보호기로는, 예를 들어, 9-플루오렌일메톡시카보닐(Fmoc)기, t-부틸옥시 카보닐(Boc)기, 벤질기, 알릴기, 알릴옥시카보닐, 아세틸기 등 카보네이트 또는 아미드계 보호기 등을 들 수 있다. 아미노산에 지용성 보호기를 도입하려면, 예를 들면 Fmoc기를 도입하는 경우에는, 9-플루오레닐메틸-N-숙신이미딜 카보네이트, 탄산수소 나트륨을 첨가하여 반응함으로써 도입할 수 있다. 반응은 0 내지 50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 1 내지 5 시간 정도 하는 것이 바람직하다.
지용성 보호기로 보호된 아미노산으로는, 시판하는 것도 사용할 수 있다. 예를 들어, Fmoc-Ser-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-AIa-OH, Fmoc-Tyr-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys-OH, Fmoc-Arg-OH, Fmoc-His-OH, Fmoc-Asp-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Pro-OH를 들 수 있다.
또한, 지용성 보호기로 보호된 아미노산으로서, 측쇄에 보호기를 도입한 것은, 예를 들어, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Cys(StBu)-OH, Fmoc-Cys(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH를 들 수 있다.
또한, 당사슬-폴리펩티드 결합체의 아미노산 서열에 연결기를 첨가하고자 하는 경우에는, 고상 합성 과정에서, 상기 지용성 보호기로 보호된 아미노산 대신에, 지용성 보호기로 보호된 연결기를 사용함으로써, 바람직한 위치에 연결기를 삽입할 수 있다.
2-클로로트리틸클로라이드 수지를 이용하는 경우, 다이이소프로필에틸아민(DIPEA), 트리에틸아민, 피리딘, 2,4,6-콜리딘 등의 염기를 이용함으로써 에스테르화할 수 있다. 또한, 하이드록실기를 갖는 수지를 이용하는 경우, 에스테르화 촉매로서, 예를 들면 1-메시틸렌설포닐-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT), 다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC), 및 다이이소프로필카보다이이미도(DIC) 등의 공지된 탈수 축합제를 사용할 수 있다. 아미노산과 탈수 축합제의 사용 비율은, 전자 1당량에 대해서, 후자가 보통 1 내지 10당량, 바람직하게는 2 내지 5 당량이다.
에스테르화 반응은, 예를 들면, 고상 컬럼에 레진을 넣고, 이 레진을 용매로 세척하고, 그 후 아미노산 용액을 추가함으로써 수행하는 것이 바람직하다. 세척 용매로는, 다이메틸 포름아미드(DMF), 2-프로판올, 다이클로로 메탄 등을 들 수 있다. 아미노산을 용해하는 용매로는, 다이메틸설폭사이드(DMSO), DMF, 다이클로로 메탄 등을 들 수 있다. 에스테르화 반응은 0 내지 50℃, 바람직하게는 실온에서 약 10분 내지 30시간 정도, 바람직하게는 15분 내지 24시간 정도 수행될 수도 있다.
이 고상 위의 미반응 기를, 아세트산 무수물 등을 이용하여 아세틸화하고 캡핑하는 것도 바람직하다.
지용성 보호기의 제거는, 예를 들면 염기로 처리함으로써 할 수 있다. 염기로는, 피페리딘, 모르폴린 등을 들 수 있다. 이 때, 용매의 존재 하에서 수행하는 것이 바람직하다. 용매로는, 예를 들면, DMSO, DMF, 메탄올 등을 들 수 있다.
유리 아미노기와, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산 카복시기와의 아미드화 반응은, 활성화제 및 용매의 존재 하에서 수행하는 것이 바람직하다.
활성화제로는, 다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-다이메틸 아미노프로필)카보다이이미드 하이드로클로라이드 염(WSC/HCl), 다이페닐포스포릴아지드(DPPA), 칼보닐다이이미다졸(CDI), 다이에틸시아노포스포네이트(DEPC), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스피롤리디노포스포늄(DIPCI), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP), 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt), 하이드록시숙신이미드(HOSu), 다이메틸아미노피리딘(DMAP), 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt), 하이드록시프탈이미드(HOPht), 펜타플루오로페놀(Pfp-OH), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), 1-[비스(다이메틸아미노)메틸렌]-5-클로로-1H-벤조트리아졸리움 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HCTU), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라 메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU), O-벤조트리아졸-1-일-1,1,3,3-테트라 메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU), 3,4-다이하이드로-3-하이드로다이-4-옥사-1,2,3-벤조트리아진(Dhbt), 4-(4,6-다이메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모폴리늄 클로라이드 n-하이드레이트(DMT-MM) 등을 들 수 있다.
활성화제의 사용량은, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산에 대해서, 1 내지 20당량, 바람직하게는 1 내지 10당량, 보다 바람직하게는 1 내지 5당량으로 하는 것이 바람직하다.
용매로는, DMSO, DMF, 다이클로로메탄 등을 들 수 있다. 반응은 0 내지 50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 10분 내지 30시간 정도, 바람직하게는 15분 내지 24시간 정도 하는 것이 바람직하다. 지용성 보호기의 제거는, 상기와 같이 할 수 있다.
아미노기로 작용화된 링크-아미드-레진(머크 앤드 캄파니., 인코포레이티드로부터), 링크-아미드-PEGA 레진(머크 앤드 캄파니., 인코포레이티드로부터), NH-SAL-레진(와타나베 케미칼 인더스트리즈 리미티드), NH-SAL-레진-연결기가 결합된 아미노-PEGA-레진(머크 앤드 캄파니., 인코포레이티드로부터) 등에 C-말단 아미노산을 도입하는 경우, 상기의 아미드화 반응을 이용하여 도입할 수 있다.
수지(레진)으로부터 펩티드 사슬을 절단하기 위해서는 산으로 처리하는 것이 바람직하다. 산으로서는 예를 들어, 트리플루오로아세트산(TFA), 플루오르화수소(HF) 등을 들 수 있다.
이러한 방식으로, 소정의 위치에 당사슬 부가 Asn을 갖는 당사슬-폴리펩티드 복합체를 수득할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시양태에서, 고상 합성에 이용되는 당사슬 부가 Asn에서의 당사슬 위의 비환원 말단에 시알산을 포함하는 경우에는, 산 처리에 의해 시알산이 절단되는 것을 막기 위해서, 상기 시알산의 카복시기를 보호기에 의해 보호하는 것이 바람직하다. 보호기로는, 예를 들어, 벤질기, 알릴기, 다이페닐메틸기, 펜아실기 등을 들 수 있다. 보호기의 도입 및 보호기의 제거 방법은, 공지된 방법으로 수행할 수 있다.
당사슬 -폴리펩티드 복합체를 만드는 방법( B법 )
당사슬-폴리펩티드 복합체는, 우선 폴리펩티드를 합성하고, 나중에 합성한 폴리펩티드에 당사슬을 부가하는 방법에 의해서 제조할 수 있다. 구체적으로는, 당사슬을 부가하고 싶은 위치에 Cys를 포함하는 폴리펩티드를, 고상 합성법, 액상 합성법, 세포에 의한 합성법, 천연에 존재하는 것을 분리 추출하는 방법 등에 의해 제조한다. 폴리펩티드를 고상 합성법 또는 액상 합성법에 의해 합성하는 경우, 아미노산은 하나의 잔기씩 연결될 수도 있거나, 폴리펩티드가 연결될 수도 있다. 여기서, 다이설파이드 결합을 형성할 예정인 위치에 있는 Cys 등, 당사슬을 부가하지 않은 Cys에 대해서는, 예를 들면 아세토아미도메틸(Acm) 기로 보호된다. 또한 당사슬을 부가하지 않으면서 또한 다이설파이드 결합의 형성에도 사용되지 않은 Cys를 당사슬-폴리펩티드 복합체에 도입할 경우에는, 당사슬 부가 공정 및 다이설파이드 결합 형성 공정 동안, Cys를 보호기에 의해서 보호했다가, 이후 탈보호하도록 하고 Cys를 도입할 수 있다. 이런 보호기로는, 예를 들면, 3급-부틸(tBu)과 4-메톡시 벤질을 들 수 있다.
또한, 1개의 폴리펩티드 내 Cys에, 상이한 당사슬을 첨가할 경우에는, 처음 당사슬을 도입하는 Cys를 무-보호로 하고 다음에 상이한 당사슬을 도입하는 Cys를, StBu 등으로 보호하는 것으로, 상이한 당사슬을 도입할 수 있다. 구체적으로는, 고상 합성 등에 의해 폴리펩티드를 합성할 때, 첫번째 당사슬을 도입하고 싶은 Cys을 무-보호로 하고, 두번째 당사슬을 도입하고 싶은 Cys를 Fmoc-Cys(StBu)-OH 등을 이용하여 보호기를 갖는 Cys로 한다. 그 뒤, StBu 등의 보호기를 보유한 채, 무-보호의 Cys에 당사슬을 도입한다. 다음에, StBu기 등을 탈보호함으로써 무-보호된 Cys에 다른 당사슬을 도입할 수 있다. 또한, 첫번째 당사슬을 도입하고 싶은 Cys 및 두번째 당사슬을 도입하고 싶은 Cys는, 1개 또는 여러개로 할 수 있다.
또한, StBu기의 탈보호는, 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드 염(TCEP), 다이티오트레이톨(DTT) 및 트라이부틸포스핀과 같은 환원제를 사용하여 반응시킴으로써 탈보호될 수 있다. 상기 반응은 통상 0 내지 80℃, 바람직하게는 5 내지 60℃, 더욱 바람직하게는 10 내지 35℃에서 수행될 수 있다. 반응 시간은 바람직하게는 통상 30분 내지 5시간 정도이다. 반응 후에는 적절한 공지된 방법(예를 들어, 고속 액체 컬럼 크로마토 그래피(HPLC))으로 정제할 수도 있다.
상이한 당사슬을 도입할 때는, Cys의 탈보호 공정에서의 환원 환경과 HPLC 등의 정제 공정에 있어서 산성 조건에 대해 보다 안정된 당사슬부터 도입하는 것이 바람직하다. 특히 시알산 함유 당사슬을 도입할 때에는, 시알산을 보유하지 않는 당사슬 또는 시알산 잔류 수가 적은 당사슬부터 도입하는 것이 바람직하다.
또한, 당사슬-폴리펩티드 복합체의 아미노산 서열에 연결기를 첨가하고자 하는 경우에는, 예를 들면 고상 합성 과정에서 지용성 보호기로 보호된 아미노산 대신, 지용성 보호기로 보호된 연결기를 사용하는 것으로, 합성한 폴리펩티드의 바람직한 위치에 연결기를 삽입할 수 있다.
다음에, 할로아세틸화 당사슬 유도체를, 상기에서 수득한 무보호 Cys를 포함하는 펩티드와 반응시킴으로써, 당사슬을 무보호의 Cys의 티올기와 반응시키고 펩티드에 결합시킨다. 상기 반응은 인산 완충액, 트리스-염산 완충액, 시트르산 완충액 또는 이들의 혼합 용액 안에서 통상 0 내지 80℃, 바람직하게는 10 내지 60℃, 더욱 바람직하게는 15 내지 35℃에서 수행할 수도 있다. 반응 시간은 통상 10분 내지 24시간, 바람직하게는 통상 30분 내지 5시간 정도이다. 반응 후에는 적절한 공지된 방법(예를 들어, HPLC)에서 정제하는 것이 바람직하다.
할로아세틸화 당사슬 유도체는, 예를 들면, 아스파라긴 결합형 당사슬의 제1위치의 탄소에 결합하는 하이드록실기를, -NH-(CH2)a-(CO)-CH2X(상기 식에서, X는 할로겐 원자이고, a는 정수이며, 목적으로 연결기 기능을 저해하지 않는 한, 제한되는 것은 아니지만 바람직하게는 0 내지 4의 정수를 나타낸다)로 치환한 화합물이다.
구체적으로는 할로아세틸화 복합형 당사슬 유도체와 Cys 함유 폴리펩티드를 인산 완충액 중, 실온에서 반응시킨다. 반응 후, HPLC로 정제함으로써 당사슬이 결합된 Cys을 갖는 당사슬-폴리펩티드 복합체를 수득할 수 있다.
또한, DMSO, DMF, 메탄올, 아세토니트릴과 같은 유기 용매와, 전술한 완충액과 혼합 용액 안에서 반응을 수행할 수 있다. 이때, 유기 용매의 비율은 0 내지 99%(v/v)의 범위에서, 상기 완충액에 첨가할 수 있다. 완충액에 대한 용해성이 낮은 무보호의 Cys를 포함하는 펩티드는, 이러한 유기 용매를 첨가함으로써 반응 용액에 용해성을 향상시킬 수 있어, 바람직하다.
또는, DMSO, DMF, 메탄올, 아세토니트릴과 같은 유기 용매, 또는 이들의 혼합 용액 안에서 반응을 수행할 수 있다. 이때 염기의 존재하에서 하는 게 바람직하다. 염기로는 DIPEA, 트리에틸아민, 피리딘, 2,4,6-글리신 등을 들 수 있다. 또한, 구아니딘 염산염 또는 요소를, 완충액에 첨가한 혼합 용액 중에도 반응을 할 수 있으며, 구아니딘 염산염이나 요소는 최종 농도가 1M 내지 8M이 되도록 상기 완충액에 더할 수 있다. 구아니딘 염산염이나 요소의 첨가는 완충액에 대한 용해성이 낮은 펩티드의 가용성을 향상시킬 수 있기 때문에 바람직하다.
또한, 무보호의 Cys를 포함하는 폴리펩티드는, 다이설파이드 결합을 통한 2량체를 형성하는 것을 방지하기 위해서, 트리스(2-카복시 에틸)포스핀 염산염(TCEP)과 다이티오트레이톨(DTT)을 완충액에 첨가하여 반응시킬 수도 있다. TCEP나 DTT는, 최종 농도가 10μM 내지 10mM이 되도록 완충액에 더할 수 있다.
또한, 다이시알로 당사슬이나, 모노시아로 당사슬 등의 시알산 함유 당사슬을 펩티드 서열 중에 복수 보유한 당사슬-폴리펩티드 복합체를 만들 때는, 도입되는 당사슬의 시알산의 카복시기가, 벤질(Bn)기, 알릴기, 다이페닐 메틸기, 펜아실기 등에 따른 보호된 시알산 함유 당사슬을 사용할 수 있다.
시알산의 카복시기가 보호된 당사슬을 도입했을 때는, 후술하는 당사슬-폴리펩티드 복합체의 다이설파이드 결합의 형성 공정 후, 시알산 보호기의 탈보호 공정을 수행할 수 있다.
이와 같이, 시알산의 카복시기를 벤질기 등에서 보호함으로써. 제조 공정에서의 HPLC 등에 의한 분리 정제 공정이 쉬워진다. 또한, 시알산의 카복시기의 보호는, 산성에 불안정한 시알산의 이탈을 막을 수도 있다.
당사슬 위의 시알산의 카복시기의 보호 반응은, 당업자에게 공지된 방법으로 할 수 있다. 또한, 당사슬-폴리펩티드 복합체에서, 시알산의 카복시기의 보호기는, 염기성 조건 하에서 가수 분해함으로써 탈보호될 수 있다. 상기 반응은 통상 0 내지 50℃, 바람직하게는 0 내지 40℃, 더욱 바람직하게는 0 내지 30℃에서 수행할 수도 있다. 반응 시간은 바람직하게는 보통 5분 내지 5시간 정도이다. 반응 종료 후에는, 인산과 초산 등의 약산으로 중화한 뒤, 적당히 공지된 방법(예를 들어, HPLC)으로 정제하는 것이 바람직하다.
또한, B법에서 할로아세틸화 복합형 당사슬 유도체와 반응시키는 아미노산은, 티올기 함유 아미노산이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, D체의 시스테인(D-Cys), 호모시스테인, 노르시스테인, 페닐실라민 등도 Cys와 같이 이용하는 것이 가능하다.
본 발명에 따른 지혈용 약학 조성물에 포함된 당사슬-폴리펩티드 복합체에 결합된 당사슬의 종류는 특별히 제한되지 않지만, 당사슬-폴리펩티드 복합체에 결합된 당사슬에 존재하는 당 잔기의 총 수가 5 이상인 것이 바람직하다. 예를 들어, 5개 당 이상의 당사슬을 1개 이상 첨가할 수도 있고, 5개 당 이하의 당사슬을 복수로 첨가함으로써, 1개의 당사슬-폴리펩티드 복합체에 첨가된 당사슬에 존재하는 당 잔기의 수가 5 이상 되도록 할 수도 있다. 당사슬을 복수로 첨가하는 경우에는 1개의 펩티드로 결합되는 당사슬의 종류는 동일할 수도 있고, 상이한 종류의 당사슬을 조합하고 결합할 수도 있지만, 동일한 것이 바람직하다.
예를 들어, 당사슬-폴리펩티드 복합체에 결합된 당사슬에 존재하는 당 잔기의 총 수가 5인 경우, 2개의 당 잔기를 갖는 말토스 당사슬과 3개의 당 잔기를 갖는 말토트리오스 당사슬 중 각각 1개씩 결합할 수도 있다. 또한, 당사슬-폴리펩티드 복합체에 결합된 당사슬에 존재하는 당 잔기의 총 수가 6인 경우, 말토스 당사슬이 3개 결합될 수도 있거나, 말토트리오스 당사슬이 2개 결합될 수도 있다. 또한, 당사슬-폴리펩티드 복합체에 결합된 당사슬에 존재하는 당 잔기의 총 수가 7인 경우, 말토스 당사슬이 2개이고 말토트리오스 당사슬이 1개 결합할 수도 있거나, 7개의 당 잔기를 갖는 DiGlcNAc 당사슬이 1개 결합할 수도 있다. 마찬가지로, 당사슬-폴리펩티드 복합체에 결합된 당사슬에 존재하는 당 잔기의 합계가 8 이상인 경우에도 다양한 조합의 당사슬이 결합될 수도 있다.
본 발명에 따른 지혈용 약학 조성물에 포함된 당사슬-폴리펩티드 복합체에 결합된 당사슬의 수는, 당사슬-폴리펩티드 복합체가 pH가 중성 부근인 수용액 중에서 자가-조립함으로써, β 시트 구조를 형성하는 특징을 잃지 않는 한, 제한되지 않는다. 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 사슬이고, 바람직하게는 1개, 2개 또는 3개의 사슬일 수도 있다.
본 발명에 따른 지혈용 약학 조성물에 포함된 당사슬-폴리펩티드 복합체에서, 당사슬이 결합되는 아미노산 잔기의 위치는, 당사슬-폴리펩티드 복합체가 pH가 중성 부근인 수용액 중에서 자가-조립함으로써, β 시트 구조를 형성할 수 있다는 특징을 잃지 않는 한, 제한되지 않는다. 예를 들어, 당사슬이 결합되는 아미노산 잔기의 위치는 폴리펩티드의 N-말단 측 및/또는 C-말단 측일 수도 있거나, N-말단 측 및 C-말단측 이외의 위치일 수도 있다.
바람직하게, 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 x번째까지의 모든 아미노산, 및 C-말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 y번째까지의 모든 아미노산(여기에서, x 및 y는 정수이고, x은 0 이상이며, y는 0 이상이고, x+y는 폴리펩티드에 결합된 당사슬의 총 수이다)에 당사슬이 결합될 수도 있다.
더욱 구체적으로는, 폴리펩티드에 결합된 당사슬의 수가 1개인 경우에는, 상기 1개의 당사슬이, 상기 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는 아미노산 잔기 또는 C-말단에 위치하는 아미노산 잔기와 결합할 수도 있다.
또한, 폴리펩티드에 결합된 당사슬의 수가 2개인 경우에는, 상기 2개의 당사슬이, 하기 (1) 내지 (3)으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 잔기와 결합할 수도 있다:
(1) 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 첫번째 및 2번째 아미노산 잔기;
(2) 폴리펩티드의 C-말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 첫번째 및 2번째 아미노산 잔기;
(3) 폴리펩티드의 N-말단에 위치한 아미노산 잔기 및 상기 폴리펩티드의 C-말단에 위치한 아미노산 잔기.
또한, 폴리펩티드에 결합된 당사슬의 수가 3개인 경우에는, 상기 3개의 당사슬이, 하기 다음의 (1) 내지 (4)로 구성된 군에서 선택되는 몇몇의 아미노산 잔기와 결합할 수도 있다:
(1) 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 첫번째, 2번째 및 3번째 아미노산 잔기;
(2) 폴리펩티드의 C-말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 첫번째, 2번째 및 3번째 아미노산 잔기;
(3) 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 첫번째 및 2번째 아미노산 잔기, 및 폴리펩티드의 C-말단에 위치한 아미노산 잔기;
(4) 폴리펩티드의 N-말단에 위치한 아미노산 잔기, 및 폴리펩티드의 C-말단부터 첫번째 및 2번째에 위치한 아미노산 잔기.
본 발명에 따른 지혈용 약학 조성물에 포함된 당사슬-폴리펩티드 복합체에 첨가되는 당사슬은, 분지를 갖는 것이 바람직하다. 여기서, 본 발명에서, 폴리펩티드에 결합된 당사슬이 "분지를 갖는 당사슬"이란, 예를 들어 다이시알로 당사슬, 아시알로 당사슬, DiGlcNAc 당사슬과 같이, 1개 당사슬의 안에 분지를 갖고 있는 경우로 국한되지 않고, 예를 들어, 1개의 폴리펩티드에 복수 직쇄형 당사슬이 부가됨으로써, 펩티드 전체적으로 당사슬이 분지를 갖고 있는 상태도 포함된다. 예를 들어, 1개의 펩티드가 말토스 당사슬, 말토트리오스 당사슬 등의 직쇄형 당사슬을 2개 이상 결합하고 있는 경우도, 본 발명에서 "분지를 갖는 당사슬"에 포함된다.
본 발명에서, 하이드로겔의 강도나 성질에 대한 평가 방법은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 스틸 볼 적하 시험(steel ball loading test) 또는 동점도 측정에 의해서 평가될 수 있다. 스틸 볼 적하 시험에서는, 예를 들면, 더햄(Durham) 관 내에 형성된 하이드로겔의 표면에 소정의 중량의 스틸 볼을 싣고, 스틸 볼이 하이드로겔의 표면에 있는지 가라앉는지를 관찰함으로써 하이드로겔의 강도를 평가할 수 있다. 또한, 스틸 볼 적하 시험에서는, 하이드로겔 중의 투명도나, 불용물·침전의 유무를 눈으로 확인할 수 있다. 하이드로겔의 동점도 측정에서는, 대상이 되는 하이드로겔에 대해서, 검류계를 이용하여 동점도를 측정함으로써, 시간의 경과에 따른 하이드로겔의 강도의 변화를 측정할 수 있다.
또한, 본 명세서에 이용되는 용어는, 특정의 실시양태를 설명하기 위해서 이용되는 것이며, 발명을 한정할 의도는 아니다.
또한, 본 명세서에 이용되는 "포함"이라는 용어는, 문맥상 분명하게 다르게 이해될 경우를 제외하고는, 기술된 사항(부재, 스텝, 요소, 숫자 등)이 존재함을 의도하는 것이며, 이외의 사항(부재, 스텝, 요소, 숫자 등)이 존재함을 배제하지는 않는다.
다른 정의가 없는 한, 여기에 이용되는 모든 용어(기술 용어 및 과학 용어를 포함한다)는, 본 발명이 속하는 기술의 당업자에 의해 널리 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 여기에 이용되는 용어는, 다른 정의가 명시되지 않는 한, 본 명세서 및 관련 기술 분야에서의 의미와 정합하는 의미를 갖는 것으로 해석해야 하고, 이상화되거나 지나치게 형식적인 의미로 해석되어서는 안 된다.
첫째, 둘째 등의 용어가 여러가지 요소를 표현하기 위해서 이용되는 경우가 있는데, 이들 요소는 이것들의 용어에 의해 제한되어서는 안되는 것으로 이해된다. 이들 용어는 하나의 요소를 다른 요소와 구별하기 위해서만 이용되는 것으로서, 예를 들어, 첫번째 요소를 두번째 요소로 기록하거나, 역시 두번째 요소를 첫번째 요소로 표기하는 것은, 본 발명의 범위를 일탈하지 않고 가능하다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 그러나 본 발명은 여러가지 형태로 구현할 수 있고, 여기에 기재된 실시예로 한정될 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서에서, 예를 들면, DiGlcNAc-BrAc로 나타내는 경우에는, 브로모아세틸화된 DiGlcNAc 당사슬을 나타낸다. 또한, 예를 들어, C(DiGlcNAc)-(RADA)4로 표현된 경우에는 RADARADARADARADA의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 N-말단에, DiGlcNAc 당사슬이 결합된 시스테인 잔기가 결합하고 있는 것이다.
실시예
( 합성례 1) C( DiGlcNAc )-( RADA )4의 합성
( 합성례 1-1) DiGlcNAc - BrAc의 합성
WO2005/010053에 기재된 방법과 같은 방법으로 합성하여, 하기 화학식 12로 표현되는 DiGlcNAc-BrAc을 수득하였다.
[화학식 12]
Figure pct00012
( 합성례 1-2) Ac-C( RADA )4-NH 2 의 합성
고상 합성용 컬럼에 링크 아마이드 PEGA 수지(100μmol)를 받아, DMF 및 다이클로로메탄으로 세척한 후, Fmoc-Ala-OH(124.5mg, 400μmol)와 1-비스다이메틸아미노메틸렌-5-클로로-1H-벤조트리아졸리움 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HCTU)(157.2mg, 380μmol), 및 다이이소프로필에틸아민(DIPEA)(104.5μL, 600μmol)의 DMF(2.5mL) 용액을 첨가하고 15분간 진탕하였다. 다이클로로메탄 및 DMF로 세척한 후, Fmoc 보호기를, DMF 내 20%의 피페리딘으로 처리함으로써, 제거했다. DMF로 세척한 후, 프레루드(Prelude; 상표) 펩티드 합성기를 이용하여, Fmoc법에 의해 펩티드 고상 합성법으로 보호된 화학식 13으로 표현된, 수지에 결합한 상태에 있는 폴리펩티드(서열 번호 3)를 합성하였다. 축합 반응은, 응집제로서 HCTU을 사용하여 DMF 중에서 수행하였다.
[화학식 13]
Figure pct00013
Fmoc 보호기를, DMF 내 20%의 피페리딘으로 처리함으로써, 제거하였다. DMF및 다이클로로메탄으로 세척한 후, 아세트산 무수물 및 피리딘을 첨가하고 1시간 동안 진탕하였다. DMF 및 다이클로로메탄으로 세척한 후, 트리플루오로아세트산(TFA):물:트리이소프로필실란:에탄다이티올(=90:2.5:5:2.5)을 첨가하여, 4시간 동안 실온에서 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 여액에 냉각된 다이에틸에테르를 첨가하여, 조질의 펩티드를 침전으로 수득하였다. 조질의 펩티드의 일부를 HPLC[컬럼: 시세이도 캡셀 팩(SHISEIDO CAPCELL PAK) C18 UG-120(5μm), φ 20x250mm, 유속: 7.0mL/분, 전개 용매 A: 0.1% TFA 물, B: 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A:B=88:12→ 78:22 11분 직선 농도 기울기 용리]을 이용하여 정제하고, 하기 화학식 14로 표현되는 폴리펩티드(서열 번호 4)(32.7mg)를 수득하였다.
[화학식 14]
Figure pct00014
( 합성례 1-3) C( DiGlcNAc )-( RADA )4의 합성
합성례 1-2로 합성된 폴리펩티드(서열 번호 4)(25.3mg, 13.9μmol)와, 합성례 1-1로 합성한 DiGlcNAc-BrAc(30.0mg, 20.9μmol, 펩티드 1에 대해 1.5 당량)을, 33μM의 TCEP 및 8M 구아니딘 염산염을 포함하는 0.2M 인산 완충액(pH7.3, 4.7mL)에 녹이고, 실온에서 3시간 동안 반응시켰다.
반응 용액을, HPLC[컬럼: 시세이도 캡셀 팩 C18 UG-120(5μm), φ 20x250mm, 유속: 7.0mL, 전개 용매 A: 0.1% TFA물 B: 0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 구배 A:B=88:12→ 81:19 10분 직선 농도 기울기 용리]를 이용하여 정제하여, 하기 화학식 15로 표현되는 당사슬-폴리펩티드 복합체(서열 번호 5)(23.9mg, 7.53μmol, 수량 54%)를 수득하였다.
[화학식 15]
Figure pct00015
( 실시예 1) 원편광 이색성 (CD) 측정 및 분석
(RADA)4 등의 자가-조립화 펩티드는 분자간 상호 작용에 의해 β 시트 구조를 형성하고, 추가로 그 구조가 이온 존재 하에서, 겹겹이 겹치면서 하이드로겔이 형성되는 것으로 알려졌다. 이 β 시트 구조를 확인하는 효과적인 방법으로서, CD측정이 알려져 있다. 일반적으로, β 시트 구조를 갖는 경우의 CD 스펙트럼은 197nm 부근의 양의 최대치와 216nm 부근의 음의 최대치를 나타낸다. 거기에서, CD 측정을 실시함으로써 본 발명의 조성물이 광범위한 pH에서 β 시트 구조를 형성하는 것을 확인하였다.
합성례 1로 합성한 C(DiGlcNAc)-(RADA)4 및 대조(RADA)4(상품명: 푸라매트릭스(PuraMatrix), 3D 매트릭스(3D Matrix), 제품 번호: 354250)을 각각 초순수에 녹여, 1중량%의 수용액을 제조하였다. 이 수용액에, 동량의 초순수, 1.8% 식염수 또는 0.3M 인산 완충액(pH7.4)을 첨가하여, 각각 0.5중량% 수용액 및 하이드로겔을 제조하였다. 그 후, 각각의 용액의 펩티드 농도가 100mM이 되도록 초순수로 희석하였다. 이 용액을, 광로의 길이 0.1cm인 석영 셀로 옮겼다. 그리고, 원편광 이색성 분광측정기(J-805, 자스코(Jasco))를 이용하여, 파장 190 내지 260nm에서 CD 스펙트럼을 측정하였다. 평균 잔기 타원율(Mean residue ellipticity) θ를, 하기 수학식 1을 이용하여 산출했다.
[수학식 1]
［θ］＝（θｏｂｓ／１０·ｌ·ｃ）／ｒ
상기 식에서, θobs는 밀리도로 측정된 타원율이고, l은 셀 길이(cm)이고, c는 농도(M)이고, r는 아미노산 잔기 수를 나타낸다.
도 1에 C(DiGlcNAc)-(RADA)4를 포함하는 조성물 측정 결과를, 도 2에(RADA)4를 포함하는 조성물의 측정 결과를 각각 나타낸다.
수용액 내, 및 생리 식염수 용액 내에서는, C(DiGlcNAc)-(RADA)4 및 (RADA)4와 함께, 197nm부근의 양의 최대치와 216nm부근의 음의 최대치를 나타내면서, 두 펩티드는 β 시트 구조를 형성하고 있는 것으로 확인되었다. 한편, 인산 완충액 안에서는, C(DiGlcNAc)-(RADA)4의 경우에만, β 시트 구조의 형성이 확인됐다.
( 실시예 2) 섬유상 구조 형성의 확인
합성례 1로 합성한 C(DiGlcNAc)-(RADA)4 및 대조군인 (RADA)4를 각각 초순수에 녹여, 1중량% 수용액을 제조하였다. 만든 각각의 수용액을 0.5중량%가 되도록 초순수, 1.8% 식염수 또는 인산 완충액(pH7.4)을 이용하여 각각 희석하였다. 수득된 희석액 1μL을, 벽개시킨 마이카 기판(상품명: 마이카 등급(MICA Grade) V-4, SPI 서플라이즈(SPI supplies)로부터) 위에 각각 적하하였다. 그 후, 상기 마이카 기판 위의 여분의 화합물을 100μL의 증류수로 씻어냈다. 이어, 실온(25℃)에서 기판을 공기 건조시켰다.
건조 후, 마이카 기판 위의 펩티드를 원자간력 현미경(상품명: 나노 스케일 하이브리드 현미경 VN-8000, 키엔스(Keyence)로부터)을 이용하여 관찰하였다. 그 결과를 도 1에 나타낸다.
도 3에 나타낸 바와 같이, C(DiGlcNAc)-(RADA)4는, 모든 조건에 있어서도 자가-조립화하고 섬유상 구조를 형성하는 것으로 나타났다. 한편 (RADA)4는, 인산 완충액 중에서는 응집물 같은 것이 관찰되었고, 섬유상 구조를 형성하지 않는 것으로 나타났다.
( 실시예 3) 동점도 측정 및 해석
동점도 측정에는 0.3mm의 갭 높이를 갖고 지름 40mm인 스테인레스 평행 평판을 갖춘 검류계(TA 인스트루먼트(TA Instruments)로부터의 디스커버리(Discovery) HR-2)를 이용하였다. C(DiGlcNAc)-(RADA)4를 초순수에 녹여 0.5 내지 5중량%의 펩티드 수용액을 제조하였다. 또한, 대조군인 (RADA)4도 초순수에 녹여, 0.5 내지 1중량%의 펩티드 수용액을 제조하였다. 그 후, 이들의 수용액을 25℃로 설정한 검류계로 옮기고 예비전단(Preshear)을 30초 동안 100S-1의 회전 속도에서 수행한 뒤, 각종 물성 데이터를 시간 경과에 따라 모니터링하였다(주파수=1Hz, 변형=10%). 이 측정 결과를 도 4에 나타낸다.
C(DiGlcNAc)-(RADA)4를 초순수에 용해한 후, 동량의 인산 완충액(300mM, pH7.4)을 첨가함으로써, 0.5 내지 5중량% 하이드로겔을 수득하였다. 또, (RADA)4를 초순수에 용해한 후, 동량의 1.8%의 식염수를 첨가함으로써, 0.5 내지 1중량% 하이드로겔을 수득하였다. 또한 (RADA)4는 2중량% 이상의 농도에서 완전히 용해되지 않고, 조작이 어렵고, 시험을 실시할 수 없었다. 이들의 하이드로겔의 동점도를 상기와 같은 조건에서 측정하였다. 이 측정 결과를 도 5에 나타낸다.
도 4에서는 C(DiGlcNAc)-(RADA)4 및 (RADA)4의 수용액 상태에서의 저장 탄성률을 보이고 있다. 1중량%의 C(DiGlcNAc)-(RADA)4와 1중량%(RADA)4의 수용액 상태에 있어서의 저장 탄성률을 비교하면, C(DiGlcNAc)-(RADA)4가 낮은 값을 나타냈다. 한편, 도 5에 나타낸, 염을 첨가한 후 하이드로겔 상태에서의 각각의 저장 탄성률을 유사하게 비교하면, C(DiGlcNAc)-(RADA)4 및 (RADA)4이 동등한 값을 나타냈다. 이들 결과로부터, C(DiGlcNAc)-(RADA)4는 수용액 상태에서는 저장 탄성률이 낮고 취급이 용이한 반면, 염을 첨가하면, 바로 겔화한다는 특징을 갖고 있는 것으로 나타났다. 또한, C(DiGlcNAc)-(RADA)4은 수용성이 높기 때문에, 펩티드 농도를 높이고도 응집물을 일으키는 일 없이 높은 저장 탄성률을 갖는 하이드로겔을 제공할 수 있다.
( 실시예 4) 지혈 작용의 평가
본 발명의 하이드로겔이 생체에 있어서 지혈 작용을 갖는지를 확인하기 위해서, 래트의 간장 천자에 의한 출혈 모델에서의 평가 시험을 수행하였다.
9주령 Crlj:SD 래트를, 이소플루란으로 마취하고, 꼬리 정맥에서 헤파린 나트륨 주사(200 U/래트, 아지노모토 파마슈티칼 캄파니 리미티드(Ajinomoto Pharmaceuticals Co. Ltd.))를 투여하였다. 래트를 개복하고, 간의 외측 좌엽 또는 내측 우엽의 아래쪽에 플라스틱 파라핀 필름을 놓고, 간장 표면을 노출시켰다. 간엽의 동일 부위를 바늘 장치(핀을 지름 7mm 정도에 묶어 깊이 3 내지 4mm까지 박히도록 한 것)로 3차례 찔러서 간 천자 모델로 했다. 천자 후부터 10초간의 출혈은 탈지면으로 제거하고, 그 뒤 곧바로 피험 물질(C(DiGlcNAc)-(RADA)4, (RADA)4), 또는 비히클(정제수, PBS)을 각 100μL, 천자 부위에 적하에서 국소 투여하였다. 투여 후, 1.5분 및 3분의 시점에서 다음의 점수 기준에 의한 지혈 및 출혈 상태를 확인하는 피험 물질의 지혈 효과를 평가하였다. C(DiGlcNAc)-(RADA)4는 PBS(pH 7.4, 포스페이트 완충된 염수)에 의해서, 0.5중량%가 되도록 용해하여 평가에 사용하였다. (RADA)4는 정제수로 0.5중량%가 되도록 용해하여 평가에 사용하였다.
지혈 및 출혈 상태의 확인 점수
평가 점수 천자 부위의 상태
○: 지혈 2 출혈이 관찰되지 않는 상태
△: 거의 지혈 1 간혈적으로지만, 약간의 출혈이 보이는 상태
×: 출혈 0 출혈이 간혈적으로 보이는 상태
지혈 효과의 평가 결과를 하기 표 2에 나타냈다. 또한, 3분 후 지혈 효과에 대해서 점수 분포를 도 6에 나타냈다. 3분 후까지 지속적인 출혈이 인정된 개체는 PBS적용 군에서는 16개의 예 중 12개의 예(75%)이며, 정제수 적용군에서는 15개의 예 중 13개의 예(87%)였다. 한편, C(DiGlcNAc)-(RADA)4 적용군에서는 3분 후까지 지속적인 출혈이 인정된 개체는 15개의 예 중 4개의 예(27%)이며, (RADA)4 적용군에서는 3분 후까지 지속적인 출혈이 인정된 개체는 15개의 예 중 3개의 예(20%)였다. 그 이외의 개체는 천자 후 3분까지 겔 모양의 고형물 또는 피막 등을 형성하고 출혈 부위로부터 혈액의 유출이 멈추거나 유출량이 감소하였다.
본 시험계에서는 래트에 피험 물질을 투여하기 전에 헤파린을 투여하여, 내인성 혈액 응고계를 억제한 상황을 검토하고 있는 것이기 때문에, 상기의 결과는 피험 물질 자체가 갖는 지혈 효과를 나타내고 있다.
처치 C(DiGlcNAc)-(RADA)4 PBS (RADA)4 정제수
1.5분 연속적인 출혈
(점수 0)		 9/15(60%) 16/16(100%) 11/15(73%) 14/15(93%)
거의 출혈
(점수 1)		 4/15(27%) 0/16(0%) 3/15(20%) 0/15(0%)
출혈
(점수 2)		 2/15(13%) 0/16(0%) 1/15(7%) 1/15(7%)
3분 연속 출혈
(점수 0)		 4/15(27%) 12/16(75%) 3/15(20%) 13/15(87%)
거의 출혈
(점수 1)		 1/15(7%) 1/16(6%) 2/15(13%) 0/15(0%)
출혈
(점수 2)		 10/15(67%) 3/16(19%) 10/15(67%) 2/15(13%)
이상의 결과로부터 C(DiGlcNAc)-(RADA)4는, (RADA)4와 비교하여, 높은 사용성을 갖추고 있으며 (RADA)4와 동등한 지혈 효과를 나타내는 것으로 나타났다. 즉, 본 발명의 하이드로겔은 지혈용 약학 조성물로서 매우 높은 이용 가치를 지닌 것으로 나타났다.
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Claims (9)

  1. 당사슬-폴리펩티드 복합체를 포함하는 지혈용 약학 조성물로서,
    상기 당사슬-폴리펩티드 복합체의 상기 폴리펩티드가, 극성 아미노산 잔기와 비극성 아미노산 잔기가 번갈아 배치된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, 상기 폴리펩티드에 하나 이상의 당사슬이 결합되어 있는, 지혈용 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 당사슬-폴리펩티드 복합체의 상기 폴리펩티드가, 극성 아미노산 잔기와 비극성 아미노산 잔기가 번갈아 배치된, 8 내지 34개의 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인, 지혈용 약학 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 당사슬-폴리펩티드 복합체가, pH가 중성 부근인 수용액 중에서 자가-조립함으로써 β 시트 구조를 포함하는 하이드로겔을 형성할 수 있는, 지혈용 약학 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 지혈용 약학 조성물에 포함된 상기 당사슬-폴리펩티드 복합체의 농도가 0.1중량% 내지 20중량%인, 지혈용 약학 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드에 결합된 하나 이상의 당사슬에 존재하는 당사슬 잔기의 총 수가 5 이상인, 지혈용 약학 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드에 결합된 당사슬의 수가 1개, 2개 또는 3개인, 지혈용 약학 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 x번째까지의 모든 아미노산, 및 C-말단에 위치하는 아미노산 잔기로부터 y번째까지의 모든 아미노산(여기에서, x 및 y는 정수이고, x는 0 이상이며, y는 0 이상이고, x+y는 폴리펩티드에 결합된 당사슬의 총 수이다)에 당사슬이 결합되어 있는, 지혈용 약학 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 당사슬이, 분지를 갖는 당사슬인, 지혈용 약학 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학 조성물이, 하이드로겔의 상태에 있는, 지혈용 약학 조성물.
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