ES2854674T3 - Tratamiento de uniones estrechas con fugas o dañadas y mejora de la matriz extracelular - Google Patents

Abstract

Una formulación que comprende una cantidad eficaz de péptidos que se autoensamblan para formar una estructura de barrera para prevenir o limitar el movimiento de fluidos corporales; en el que los péptidos de autoensamblaje tienen una longitud de 8 a 16 residuos de aminoácidos y comprenden una secuencia que se ajusta a una o más de las Fórmula I-IV: ((Xaaneu-Xaa+)x(Xaaneu-Xaa-)y)n (I) ((Xaaneu-Xaa-)x(Xaaneu-Xaa+)y)n (II) ((Xaa+-Xaaneu)x(Xaa--Xaaneu)y)n (III) ((Xaa--Xaaneu)x(Xaa+-Xaaneu)y)n (IV) en las que cada Xaaneu es un residuo de aminoácido seleccionado de alanina, leucina, isoleucina, fenilalanina o tirosina; Xaa+ es arginina o lisina; Xaa- es ácido aspártico o ácido glutámico; x e y son números enteros que tienen un valor de 1, 2, 3 o 4, independientemente; y n es un número entero que tiene un valor de 1-4; para su uso en un procedimiento para el tratamiento de trastornos que implican uniones estrechas con fugas o dañadas o una matriz extracelular débil, enferma o lesionada que comprende administrar la formulación como un líquido en el torrente sanguíneo de un sujeto que lo necesite.

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento de uniones estrechas con fugas o dañadas y mejora de la matriz extracelular

La presente solicitud pertenece al campo de los materiales para alterar o mejorar la deposición de la matriz celular alrededor de los tejidos, especialmente los vasos sanguíneos, el tejido conectivo y los tejidos con uniones estrechas.

Antecedentes de la invención

Hay una serie de trastornos asociados con fugas alrededor de los vasos sanguíneos y dentro de las uniones estrechas entre las células. Dicha fuga puede llevar a que el líquido invada los tejidos, provocando una pérdida de la presión arterial, disfunción o insuficiencia de órganos y la muerte. Muchos de estos trastornos son el resultado de la muerte celular masiva, como la asociada con la quimioterapia de un tumor grande, la sepsis después de una infección bacteriana sistémica, la inflamación asociada con quemaduras y las resecciones quirúrgicas grandes.

La sepsis grave es el resultado de la respuesta excesiva sistémica del cuerpo a la infección. Esta respuesta excesiva altera la homeostasis a través de una cascada incontrolada de inflamación, coagulación y alteración de la fibrinólisis. La función microcirculatoria alterada conduce a hipoxia tisular global y daño tisular directo. En última instancia, esto da como resultado una falla orgánica y, a menudo, la muerte. Los antiinfecciosos, la reanimación y la atención de apoyo no previenen necesariamente la disfunción orgánica progresiva que ocurre en muchos pacientes. La disfunción microcirculatoria puede persistir a pesar de los valores globales adecuados de suministro de oxígeno, lo que hace que los procedimientos de reanimación sean ineficaces.

La hipótesis del "intestino permeable" propone que la fuga de bacterias entéricas al cuerpo como resultado de la ruptura de la barrera epitelial es un paso crítico en la fisiopatología de varios trastornos como la enfermedad inflamatoria intestinal y la sepsis.

Un tercio de las mujeres sometidas a mastectomía con evacuación axilar por cáncer de mama primario padecen seromas posoperatorios que generan costes y complicaciones innecesarios, como infecciones y nuevas operaciones. Se han probado diferentes procedimientos para prevenir la formación de seromas sin éxito permanente.

Otra condición para la que no existen tratamientos suficientes es la pérdida de líquido que se produce por sepsis o quemaduras, donde las uniones entre las células comienzan a filtrar líquido intersticial, provocando deshidratación, desequilibrio electrolítico y muerte celular.

Estos trastornos pueden conducir a complicaciones adicionales cuando la liberación de moléculas inflamatorias del tejido dañado provoca más daño tisular.

Las Patentes de Estados Unidos No 5,670,483, 6,548,630 y 7,098,028 de Zhang et al. describen péptidos anfifílicos que tienen residuos hidrófobos e hidrófilos alternos. Zhang alega que las membranas son potencialmente útiles en aplicaciones de biomateriales, como sistemas de administración de fármacos de difusión lenta, piel artificial y matrices de separación, y como modelos experimentales para la enfermedad de Alzheimer y la infección por scrapie. Sin embargo, Zhang no divulga el uso de dichos materiales para el tratamiento y soporte de trastornos asociados con uniones estrechas con fugas, dañadas y una matriz extracelular débil, enferma o dañada.

WO 2007/142757 y U.S.S.N. 11/411,745 describen composiciones que incluyen péptidos con monómeros hidrófilos e hidrófobos alternos que les permiten el autoensamblaje en condiciones fisiológicas que se formulan para su aplicación en heridas. Sin embargo, estas solicitudes no describen el uso de tales materiales para el tratamiento y soporte de trastornos asociados con uniones estrechas dañadas y con fugas y una matriz extracelular débil, enferma o dañada.

El documento WO 2006/116524 se refiere a péptidos de autoensamblaje para controlar la hemostasis, proteger las heridas de la contaminación, descontaminar un sitio e inhibir el movimiento de fluidos corporales distintos de la sangre. Sin embargo, esta solicitud no describe la administración de los materiales como un líquido en el torrente sanguíneo de un sujeto para el tratamiento de uniones estrechas con fugas o dañadas y matriz extracelular débil, enferma o dañada.

El documento US 2006/0088510 se refiere al uso de péptidos de autoensamblaje para formar una membrana que promueve el crecimiento y la diferenciación de células. La membrana y las células en crecimiento se pueden implantar en un sitio que necesite reparación de tejido. El documento US 2006/0148703 se refiere a un gel formado a partir de péptidos de autoensamblaje unidos a p Dg F que puede implantarse in vivo para promover la liberación sostenida de PDGF. Ninguna de estas aplicaciones describe la administración de péptidos de autoensamblaje al sujeto antes del autoensamblaje. En ambos casos, se produce una membrana o gel ex vivo y luego se administra al sujeto.

El documento US 2005/0181973 se refiere a péptidos que contienen un dominio peptídico de autoensamblaje y un segundo dominio de aminoácidos que no se autoensambla en forma aislada. Esta solicitud no divulga péptidos de autoensamblaje sin modificar para su uso en el tratamiento de trastornos que implican uniones estrechas con fugas o dañadas o una matriz extracelular débil, enferma o dañada.

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar procedimientos y composiciones para tratar afecciones que implican no solo fugas de líquido sino también fisiopatología de las uniones entre células.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar procedimientos y composiciones para aumentar la matriz extracelular alrededor de las células vasculares. Otro objeto más de la presente invención es proporcionar procedimientos y composiciones para reparar o fortalecer uniones estrechas.

Sumario de la invención

La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.

La invención proporciona una formulación que comprende una cantidad eficaz de péptidos autoensamblables para formar una estructura de barrera para prevenir o limitar el movimiento de los fluidos corporales;

en el que los péptidos de autoensamblaje tienen una longitud de 8 a 16 residuos de aminoácidos y comprenden una secuencia conforme a una o más de Fórmula I-IV:

((Xaaneu-Xaa+)x(Xaaneu-Xaa')y)n (I)

((Xaaneu-Xaa')x(Xaaneu-Xaa+)y)n (II)

((Xaa+-Xaaneu)x(Xaa--Xaaneu)y)n (III)

((Xaa--Xaaneu)x(Xaa+-Xaaneu)y)n (IV)

en el que cada Xaaneu es un residuo de aminoácido seleccionado de alanina, leucina, isoleucina, fenilalanina o tirosina; Xaa+ es arginina o lisina; Xaa- es ácido aspártico o ácido glutámico; x e y son números enteros que tienen un valor de 1, 2, 3 o 4, independientemente; y n es un número entero que tiene un valor de 1-4;

para su uso en un procedimiento para el tratamiento de trastornos que implican uniones estrechas con fugas o dañadas 0 una matriz extracelular débil, enferma o lesionada que comprende administrar la formulación como un líquido en el torrente sanguíneo de un sujeto que lo necesite.

Los péptidos y peptidomiméticos de autoensamblaje se pueden utilizar para el tratamiento y soporte de trastornos asociados con uniones estrechas con fugas, dañadas y una matriz extracelular débil, enferma o dañada. Los materiales de autoensamblaje pueden anclar o interactuar con la matriz extracelular estructural (ECM) en los bordes de los vasos sanguíneos y/o tejidos.

Los materiales de autoensamblaje generalmente tienen residuos hidrófilos o hidrófobos alternos o secciones hidrófobas y/o hidrófilas que permiten que el material reaccione o interactúe con las glicoproteínas que se encuentran en el ECM. Por ejemplo, los péptidos de autoensamblaje pueden tener un segmento de residuos que tienen una carga positiva en condiciones fisiológicas unidos a un segmento de residuos que tienen una carga negativa en condiciones fisiológicas.

En otra realización, el péptido de autoensamblaje tiene una primera región hidrófoba unida operativamente a una primera región hidrófila. La primera región hidrófoba puede incluir un segmento de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrófobas en condiciones fisiológicas y la primera región hidrófila puede incluir un segmento de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrófilas en condiciones fisiológicas.

En otra realización más, el material de autoensamblaje se forma mezclando un segmento de residuos que tienen cargas positivas en condiciones fisiológicas con un segmento de residuos que tienen cargas negativas en condiciones fisiológicas.

En otra realización más, los péptidos de autoensamblaje contienen residuos de aminoácidos polares hidrófilos y residuos de aminoácidos no polares hidrófobos en condiciones fisiológicas. Se apreciará que la partición del péptido de autoensamblaje en un ambiente polar o no polar puede controlarse alterando la proporción de residuos de aminoácidos hidrófobos con respecto a los residuos de aminoácidos hidrófilos, en la que una proporción mayor de 1: 1 indica que el péptido se divide más en condiciones hidrófobas en comparación con condiciones hidrófilas. Una relación de menos de 1: 1 indica que el péptido se divide más en condiciones hidrófilas en comparación con las condiciones hidrófobas.

Los materiales descritos anteriormente pueden administrarse solos o en combinación entre sí u otros materiales de autoensamblaje.

Los materiales de autoensamblaje preferiblemente no causan ninguna toxicidad secundaria cuando se degradan en el cuerpo. Además, el producto de descomposición de los materiales de autoensamblaje puede mejorar el crecimiento y la reparación de los tejidos circundantes. Las formulaciones pueden administrarse mediante inyección o mediante catéter.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la extensión de la matriz extracelular utilizando péptidos de autoensamblaje. Los péptidos contienen uno o más restos de la cola que se unen o interactúan con la matriz extracelular de un vaso o tejido, tal como un vaso sanguíneo, anclando así los péptidos al vaso.

La figura 2 muestra péptidos de autoensamblaje que unen el espacio entre las células de la pared de los vasos sanguíneos. Los péptidos pueden contener una cola, tal como una cola hidrófoba o hidrófila, que se une o interactúa con la matriz extracelular del vaso sanguíneo que ancla los péptidos a la pared del vaso. Tras el autoensamblaje, los péptidos pueden juntar los extremos del vaso, permitiendo que la herida o lesión sane.

Las figuras 3a-d muestran gráficos de barras del tiempo necesario para lograr la hemostasia. Estos gráficos ilustran la duración del sangrado en los casos tratados con una solución al 1 % de RADA16-I (SEQ ID NO: 60) (NHS-1), una solución de autoensamblaje en comparación con los controles tratados con cauterio y solución salina para cortes de cerebro, cortes en la arteria femoral y el hígado (a), punciones en el hígado (b) y punciones en la piel (c). Cada barra muestra el tiempo medio en segundos para los casos tratados con NHS-1 en (rojo), los controles de solución salina en (azul) y los controles de cauterización en (amarillo). (a) Cerebro de rata. Las duraciones se midieron desde el inicio de la aplicación de NHS-1 autoensamblaje hasta la finalización de la hemostasia después de la sección de las venas que conducen al seno sagital superior en el cerebro de ratas adultas. La hemostasia completa se logró en 8,4 2,1 segundos. En los controles salinos, el sangrado continuó hasta 227,0 36,6 segundos. Cerebro de hámster. La hemostasia completa se logró en 9,0 1,8 segundos. En los controles salinos, el sangrado continuó hasta 187,6 34,7 segundos. Arteria femoral. La hemostasia completa se logró en 10,5 4,1 segundos. En los controles salinos, el sangrado continuó hasta 367,5 37,7 segundos. Corte sagital de hígado. La hemostasia completa se logró en 8,6 1,7 segundos. En el control de cauterización (amarillo), el sangrado continuó hasta 90,0 5,0 segundos, y los controles salinos sangraron durante 301,6 33,2 segundos. (b) Biopsia por punción de hígado de 4 mm. Se extrajo un núcleo de 4 mm del lóbulo hepático izquierdo y el orificio se trató con NHS-1, cauterización térmica o solución salina. El tratamiento de NHS-1 al 3 % produjo una hemostasia completa en 9,7 1,2 segundos. En los controles de cauterización (amarillo), el sangrado continuó durante 81,2 6,7 segundos y los controles de solución salina sangraron 204,3 49,6 segundos. (c) Biopsia cutánea con sacabocados de 4 mm. Se realizó una biopsia por punción de 4 mm en la espalda de ratones desnudos. La biopsia se extendió por la dermis y se extrajo el núcleo. Se tuvo cuidado de no romper el músculo subyacente. Las tres heridas de un lado se trataron con NHS-1 al 1 % y se logró la hemostasia completa en 6,4 1,5 segundos. En el lado opuesto del animal no se trataron las heridas. El sangrado continuó hasta que se produjo una coagulación normal a los 75,5 16,3 segundos. (d) Curvas de respuesta a la concentración de NHS-1 y eAK-16 (TM-3). El lóbulo lateral izquierdo del hígado recibió un corte transversal que seccionó una porción del lóbulo hepático y una rama de la vena porta. Una concentración más alta de NHS-1 (círculos abiertos) es más eficaz en sangrados de mayor presión y volumen. Las concentraciones de NHS-1 al 4 %, 3 % y 2 % fueron efectivas para lograr la hemostasia en 11,0 1,0 segundos, 10,0 1,0 segundos y 10,3 0,5 segundos, respectivamente. 1 % NHS-1 tomó 86,6 20,8 segundos en el área de la hemorragia más severa. M-3 (diamantes) no fue eficaz a ninguna concentración; en los controles salinos el sangrado continuó hasta 377,5 85,0 segundos y murió un animal. El eje X es el tiempo (segundos); El eje y es la concentración.

Las figuras 4a-d son esquemas de procedimientos quirúrgicos. Rostral está arriba y caudal está abajo en todas las figuras. (a) Vista dorsal del cerebro de rata. Las líneas azules representan los vasos sanguíneos superficiales a la corteza. El área enmarcada corresponde a la ubicación de la lesión y el tratamiento. (b) Dibujo de la vista ventral del miembro inferior de una rata con la arteria femoral en rojo y el nervio ciático en amarillo. (c y d) Dibujos de una vista ventral de una rata con el abdomen abierto, las estructuras superpuestas se han eliminado exponiendo el hígado. El lóbulo se seccionó con un corte (representado en rojo) en direcciones sagital (c) y transversal (d).

Descripción detallada de la invención

I. Definiciones

"Biocompatible", como se usa en la presente memoria, se refiere a la compatibilidad con tejido o un sistema vivos al no ser tóxico, nocivo o fisiológicamente reactivo y no causar rechazo inmunológico.

"Complementario" significa que tiene la capacidad de formar interacciones iónicas o de enlace de hidrógeno entre residuos hidrófilos de péptidos adyacentes en una estructura. Cada residuo hidrófilo en un péptido se une por enlaces de hidrógeno o se empareja iónicamente con un residuo hidrófilo en un péptido adyacente, o se expone a un disolvente. El emparejamiento también puede involucrar fuerzas de van der Waals.

"Cantidad eficaz", en referencia a un agente activo tal como un péptido o biomolécula de autoensamblaje, agente farmacéutico, etc. se refiere a la cantidad necesaria para provocar una respuesta biológica deseada. Como apreciarán los expertos en esta técnica, la cantidad eficaz de un agente puede variar dependiendo de factores tales como el punto final biológico deseado, el agente a administrar, la naturaleza del sitio al que se administra el agente, la naturaleza de las condiciones para las que se administra el agente, etc. Por ejemplo, la cantidad eficaz de una composición para el tratamiento de la retinopatía diabética puede ser una cantidad suficiente para promover la recuperación en mayor medida de lo que ocurriría en ausencia de la composición.

"Hemostasia" se refiere al cese del sangrado.

"Prevenir" se refiere a causar una afección, estado o enfermedad, o síntoma o manifestación de tal, o empeoramiento de la gravedad de tal, que no ocurra. La prevención incluye reducir el riesgo de que ocurra una afección, estado o enfermedad, o síntoma o manifestación de tal, o un empeoramiento de su gravedad.

"Reparación", como se usa en referencia a la reparación de tejido en diversas realizaciones, puede incluir cualquier aspecto de la restauración anatómica o funcional del estado del tejido antes de una lesión, deterioro u otro daño. Por ejemplo, puede incluir la restauración de la continuidad física entre porciones de tejido que fueron separadas por una lesión, deterioro u otro daño. Preferiblemente, tal restauración de la continuidad física incluye el reposicionamiento o reconexión de las porciones de tejido sin una separación apreciable por tejido de un tipo que no estaba presente antes de la lesión, tal como tejido cicatricial. La reparación puede incluir el crecimiento o desarrollo de tejido nuevo, aunque no es necesario. "Reparación" y "Curación" se usan indistintamente en la presente memoria.

II. Materiales de autoensamblaje

En la presente memoria se describen materiales de autoensamblaje que pueden anclar o interactuar con la matriz extracelular estructural (ECM) en los bordes de los vasos sanguíneos y/o tejidos. Estos materiales de autoensamblaje típicamente tienen secciones o residuos hidrófobos y/o hidrófilos que permiten que el material reaccione o interactúe con las glicoproteínas que se encuentran en el ECM.

Preferiblemente, los materiales de autoensamblaje no causan ninguna toxicidad secundaria cuando se descomponen. Además, el producto de descomposición de los materiales de autoensamblaje puede mejorar el crecimiento y la reparación de los tejidos circundantes.

A. Péptidos de autoensamblaje

El término "péptido", como se usa en la presente memoria, incluye "polipéptido", "oligopéptido" y "proteína" y se refiere a una cadena de al menos dos residuos de a-aminoácidos unidos entre sí por enlaces covalentes (por ejemplo, enlaces peptídicos). Los péptidos útiles pueden variar en longitud siempre que retengan la capacidad de autoensamblaje hasta un grado útil para uno o más de los propósitos descritos en la presente memoria. Los péptidos que se autoensamblan tienen una longitud de 8 a 16 residuos de aminoácidos. "Péptido" puede referirse a un péptido individual o a una colección de péptidos que tienen secuencias iguales o diferentes, cualquiera de las cuales puede contener residuos de a-aminoácidos de origen natural, residuos de a-aminoácidos de origen no natural y combinaciones de estos. Los análogos de a-aminoácidos también se conocen en la técnica y se pueden emplear alternativamente. En particular, pueden usarse residuos de D-a-aminoácidos.

Además, uno o más de los residuos de aminoácidos en un péptido de autoensamblaje se pueden alterar o derivar mediante la adición de una o más entidades químicas que incluyen, pero no se limitan a, grupos acilo, grupos carbohidrato, cadenas carbohidrato, grupos fosfato, grupos farnesilo, grupos isofarnesilo, grupos de ácidos grasos o un enlazador que permite la conjugación o funcionalización del péptido. Por ejemplo, se pueden modificar uno o ambos extremos de un péptido dado. Por ejemplo, el grupo carboxilo y/o amino de los restos carboxilo y amino terminales, respectivamente, pueden protegerse o no protegerse. El cargo en una terminal también se puede modificar. Por ejemplo, un grupo o radical como un grupo acilo (RCO-, donde R es un grupo orgánico (por ejemplo, un grupo acetilo (CH3CO-)) puede estar presente en el extremo N-terminal de un péptido para neutralizar una "extra" carga positiva que de otro modo podría estar presente (por ejemplo, una carga que no resulta de la cadena lateral del aminoácido N-terminal). De manera similar, un grupo como un grupo amina (RNH-, donde R es un grupo orgánico (por ejemplo, un grupo amino -NH2)) se puede usar para neutralizar una carga negativa "adicional" que de otro modo podría estar presente en el extremo C (por ejemplo, una carga que no es el resultado de la cadena lateral del residuo de aminoácido C-terminal). Cuando se usa una amina, el extremo C lleva una amida (-CONHR). La neutralización de cargas en una terminal puede facilitar el autoensamblaje. Un experto en la técnica podrá seleccionar otros grupos adecuados.

Los péptidos útiles también pueden estar ramificados, en cuyo caso contendrán al menos dos polímeros de aminoácidos, cada uno de los cuales consta de al menos tres residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Los dos polímeros de aminoácidos pueden estar unidos por un enlace distinto del enlace peptídico.

Si bien las secuencias de los péptidos pueden variar, las secuencias útiles incluyen aquellas que transmiten una naturaleza anfifílica a los péptidos (por ejemplo, los péptidos pueden contener aproximadamente el mismo número de residuos de aminoácidos hidrófobos e hidrófilos) y los péptidos pueden ser complementarios y estructuralmente compatibles. Puede usarse cualquier residuo hidrófilo o hidrófobo de origen natural o no natural. Los residuos hidrófilos son aquellos residuos que normalmente contienen un grupo funcional polar o un grupo funcional que está cargado en condiciones fisiológicas. Los grupos funcionales ejemplares incluyen, pero no se limitan a, grupos de ácido carboxílico, grupos amino, grupos sulfato, grupos hidroxi, grupos halógeno, grupos nitro, grupos fosfato, etc. Los residuos hidrófobos son aquellos residuos que contienen grupos funcionales apolares. Los grupos funcionales ejemplares incluyen, pero no se limitan a, grupos alquilo, grupos alqueno, grupos alquino y grupos fenilo.

En una realización, el residuo hidrófilo tiene la fórmula -NH-CH (X) -COO-, en la que X tiene la fórmula (CH2)y Z, en la que y = 0-8, preferiblemente 1-6, más preferiblemente 1-4 y más preferiblemente 1-3, y Z es un grupo funcional polar o cargado, tal como un grupo ácido carboxílico, grupo amino, grupo sulfato, grupo hidroxi, grupo halógeno, grupo nitro, grupo fosfato, o grupo funcional que contiene una amina cuaternaria. La cadena de alquilo puede estar en una disposición lineal, ramificada o cíclica. X también puede contener uno o más heteroátomos dentro de la cadena de alquilo y/o X puede estar sustituido con uno o más sustituyentes adicionales. En una realización preferida, Z es un grupo de ácido carboxílico o un grupo amino. En una realización, el residuo hidrófobo tiene la fórmula -NH-CH (X) -COO-, en la que X tiene la fórmula (CH2)y Z, en la que y = 0-8, preferiblemente 1-6, más preferiblemente 1-4, y más preferiblemente 1-3, y Z es un grupo funcional apolar tal como un grupo alquilo, un grupo alquileno, un grupo alquino 0 un grupo fenilo. La cadena de alquilo puede estar en una disposición lineal, ramificada o cíclica. X también puede contener uno o más heteroátomos dentro de la cadena de alquilo y/o X puede estar sustituido con uno o más sustituyentes adicionales. En una realización preferida, X es un grupo alquilo, tal como un grupo metilo.

Los péptidos complementarios tienen la capacidad de formar enlaces iónicos o de hidrógeno entre residuos (por ejemplo, residuos hidrófilos) en péptidos adyacentes en una estructura. Por ejemplo, uno o más residuos hidrófilos en un péptido pueden unirse por enlace de hidrógeno o emparejarse iónicamente con uno o más residuos hidrófilos en un péptido adyacente. Los residuos no apareados pueden interactuar (por ejemplo, formar enlaces de hidrógeno, etc.) con el disolvente. Las interacciones péptido-péptido también pueden involucrar fuerzas de van der Waals y/o fuerzas que no constituyen enlaces covalentes. Los péptidos son estructuralmente compatibles cuando son capaces de mantener una distancia intrapeptídica suficientemente constante para permitir el autoensamblaje y la formación de estructuras. La distancia entre péptidos puede variar. "Distancia intrapéptido", como se usa en la presente memoria, se refiere al promedio de un número representativo de distancias entre residuos de aminoácidos adyacentes. En una realización, la distancia intrapéptido es menos de aproximadamente 4 angstroms, preferiblemente menos de aproximadamente 3, más preferiblemente menos de aproximadamente 2 angstroms y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 1 angstrom. Sin embargo, la distancia intrapéptido puede ser mayor. Estas distancias se pueden calcular basándose en modelos moleculares o basándose en un procedimiento simplificado descrito en la Patente de Estados Unidos No 5,670,483 de Zhang et al.

Las estructuras descritas en la presente memoria pueden formarse mediante el autoensamblaje de los péptidos descritos en las Patentes de Estados Unidos No 5,670,483; 5,955,343; 6,548,630; y 6.800.481 de Zhang et al .; Holmes y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 6728 - 6733 (2000); Zhang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 3334 - 3338 (1993); Zhang y col., Biomaterials, 16: 1385-1393 (1995); Caplan y col., Biomaterials, 23: 219-227 (2002); Leon y col., J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 9: 297-312 (1998); y Caplan y col., Biomacromolecules, 1: 627-631 (2000).

Pueden usarse péptidos de autoensamblaje que contienen residuos amino hidrófobos e hidrófilos alternos. En la Tabla 1 se enumeran ejemplos de péptidos hidrófobos e hidrófilos.

Tabla 1. Péptidos autoensamblables

No. Secuencia (N ^ C)

1. n-SGSGSGSGSGSGSGSG-c (SEQ ID NO: 5)

2. n-SASASASASASASASA-c (SEQ ID NO: 6)

3. n-SVSVSVSVSVSVSVSV-c (SEQ ID NO: 7)

4. n-SLSLSLSLSLSLSLSL-c (SEQ ID NO: 8)

5. n-SISISISISISISISI-c (SEQ ID NO: 9)

(continuación)

No. Secuencia (N ^ C)

n-SMSMSMSMSMSMSMSM-c (SEQ ID NO: 10) 7. n-SFSFSFSFSFSFSFSF-c (SEQ ID NO: 11)

8. n-SWSWSWSWSWSWSWSW-c (SEQ ID NO: 12) 9. n-SPSPSPSPSPSPSPSP-c (SEQ ID NO: 13) 10. n-TGTGTGTGTGTGTGTG-c (SEQ ID NO: 14) 11. n-TATATATATATATATA-c (SEQ ID NO: 15) 12. n-TVTVTVTVTVTVTVTV-c (SEQ ID NO: 16) 13. n-TLTLTLTLTLTLTLTL-c (SEQ ID NO: 17)

14. n-TITITITITITITITI-c (SEQ ID NO: 18)

15. n-TMTMTMTMTMTMTMTM-c (SEQ ID NO: 19) 16. n-TFTFTFTFTFTFTFTF-c (SEQ ID NO: 20)

17. n-TWTWTWTWTWTWTWTW-c (SEQ ID NO: 21) 18. n-TPTPTPTPTPTPTPTP-c (SEQ ID NO: 22) 19. n-CGCGCGCGCGCGCGCG-c (SEQ ID NO: 23) 20. n-CACACACACACACACA-c (SEQ ID NO: 24) 21. n-CVCVCVCVCVCVCVCV-c (SEQ ID NO: 25) 22. n-CLCLCLCLCLCLCLCL-c (SEQ ID NO: 26) 23. n-CICICICICICICICI-c (SEQ ID NO: 27)

24. n-CMCMCMCMCMCMCMCM-c (SEQ ID NO: 28) 25. n-CFCFCFCFCFCFCFCF-c (SEQ ID NO: 29) 26. n-CWCWCWCWCWCWCWC-c (SEQ ID NO: 30) 27. n-CPCPCPCPCPCPCPCP-c (SEQ ID NO: 31) 28. n-YGYGYGYGYGYGYGYG-c (SEQ ID NO: 32) 29. n-YAYAYAYAYAYAYAYA-c (SEQ ID NO: 33) 30. n-YVYVYVYVYVYVYVYV-c (SEQ ID NO: 34) 31. n-YLYLYLYLYLYLYLYL-c (SEQ ID NO: 35) 32. n-YIYIYIYIYIYIYIYI-c (SEQ ID NO: 36)

33. n-YMYMYMYMYMYMYMYM-c (SEQ ID NO: 37) 34. n-YFYFYFYFYFYFYFYF-c (SEQ ID NO: 38) 35. n-YWYWYWYWYWYWYWYW-c (SEQ ID NO: 39) 36. n-YPYPYPYPYPYPYPYP-c (SEQ ID NO: 40) 37. n-NGNGNGNGNGNGNGNG-c (SEQ ID NO: 41) (continuación)

No. Secuencia (N ^ C)

~ 38. n-NANANANANANANANA-c (SEQ ID NO: 42)

39. n-NVNVNVNVNVNVNVNV-c (SEQ ID NO: 43)

40. n-NLNLNLNLNLNLNLNL-c (SEQ ID NO: 44)

41. n-NINININININININI-c (SEQ ID NO: 45)

42. n-NMNMNMNMNMNMNMNM-c (SEQ ID NO: 46)

43. n-NFNFNFNFNFNFNFNF-c (SEQ ID NO: 47)

44. n-NWNWNWNWNWNWNWNW-c (SEQ ID NO: 48)

45. n-NPNPNPNPNPNPNPNP-c (SEQ ID NO: 49)

46. n-QGQGQGQGQGQGQGQG-c (SEQ ID NO: 50)

47. n-QAQAQAQAQAQAQAQA-c (SEQ ID NO: 51)

48. n-QVQVQVQVQVQVQVQV-c (SEQ ID NO: 52)

49. n-QLQLQLQLQLQLQLQL-c (SEQ ID NO: 53)

50. n-QIQIQIQIQIQIQIQI-c (SEQ ID NO: 54)

51. n-QMQMQMQMQMQMQMQM-c (SEQ ID NO: 55)

52. n-QFQFQFQFQFQFQFQF-c (SEQ ID NO: 56)

53. n-QWQWQWQWQWQWQWQW-c (SEQ ID NO: 57)

54. n-QPQPQPQPQPQPQPQP-c (SEQ ID NO: 58)

55. n-AEAKAEAKAEAKAEAK-c (SEQ ID NO: 59)

56. n-RADARADARADARADA-c (SEQ ID NO: 60)

57. n-RAEARAEARAEARAEA-c (SEQ ID NO: 61)

58. n-KADAKADAKADAKADA-c (SEQ ID NO: 62)

Se pueden usar otros péptidos o proteínas en combinación o alternancia con los péptidos o composiciones de autoensamblaje divulgados. Se apreciará que los péptidos adicionales pueden incluir otros péptidos o proteínas de autoensamblaje. Alternativamente, los péptidos pueden ser péptidos que no se autoensamblan. Los péptidos, proteínas o variantes modificadas químicamente de los mismos adicionales representativos incluyen, pero no se limitan a, los péptidos proporcionados en la Tabla 2.

Tabla 2. Péptidos adicionales

1. Pmp-Y(Me)-I-T-N-C-P-Orn-Y-NH2 (SEQ ID NO: 63)

2. Mpr-Y-F-Q-N-C-P-R (SEQ ID NO: 64)

3. C-Y-F-Q-N-C-P-R-G-NH2 (SEQ ID NO: 65)

4. C-Y-F-Q-N-C-P-R (SEQ ID NO: 66)

5. C-Y-Ile-Q-N-C-P-R-G-NH2 (SEQ ID NO: 67)

6. Y-F-Q-N-Asu-P-R-G-NH2 (SEQ ID NO: 68)

7. Y-Ile-Q-N-Asu-P-R-G-NH2 (SEQ ID NO: 69)

(continuación)

) (continuación)

41. RGDC (SEQ ID NO: 102)

42. RGDS (SEQ ID NO: 103)

43. RGDSPASSKP (SEQ ID NO: 104)

44. RGDT (SEQ ID NO: 105)

45. RGDV (SEQ ID NO: 106)

46. RGES (SEQ ID NO: 107)

47. SDGR (SEQ ID NO: 108)

48. SDGRG (SEQ ID NO: 109)

49. YRGDS (SEQ ID NO: 110)

50. EGVNDNEEGFFSAR (SEQ ID NO: 111)

51. YADSGEGDFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 112)

52. Glp-GVNDNEEGFFSARY (SEQ ID NO: 113)

Pmp = fosfato de piridoxamina

Mpr = 3-mercaptopropionilo

Deamino-Pen = deamino penicilamina

Pen = penicilamina

Se pueden generar otros péptidos de autoensamblaje útiles, por ejemplo, que difieren de los ejemplificados por un único residuo de aminoácido o por múltiples residuos de aminoácido (por ejemplo, por inclusión o exclusión de un cuarteto repetido). Por ejemplo, pueden incorporarse uno o más residuos de cisteína a los péptidos, y estos residuos pueden unirse entre sí mediante la formación de enlaces disulfuro. Las estructuras unidas de esta manera pueden tener una mayor resistencia mecánica en relación con las estructuras preparadas con péptidos comparables que no incluyen residuos de cisteína y, por lo tanto, no pueden formar enlaces disulfuro.

Los residuos de aminoácidos en los péptidos de autoensamblaje pueden ser residuos de aminoácidos de origen natural o no natural. Los aminoácidos naturales pueden incluir residuos de aminoácidos codificados por el código genético estándar, así como aminoácidos no estándar (por ejemplo, aminoácidos que tienen la configuración D en lugar de la configuración L), así como aquellos aminoácidos que pueden formarse mediante modificaciones de aminoácidos estándar (por ejemplo, pirrolisina o selenocisteína). Los aminoácidos no naturales no se encuentran en la naturaleza, pero pueden incorporarse en una cadena de péptidos. Los aminoácidos de origen no natural adecuados incluyen, entre otros, ácido D-aloisoleucina (2R,3S)-2-amino-3-metilpentanoico, ácido L-ciclopentilglicina (S)-2-amino-2-ciclopentil acético. Otros ejemplos de aminoácidos no naturales se pueden encontrar en libros de texto o en la web mundial (por ejemplo, el Instituto de Tecnología de California mantiene un sitio que muestra estructuras de aminoácidos no naturales que se han incorporado con éxito en proteínas funcionales). Los residuos de aminoácidos y derivados de aminoácidos no naturales se describen en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. No 2004/0204561 de Ellison.

Los péptidos de autoensamblaje se pueden sintetizar o purificar químicamente a partir de fuentes naturales o producidas de manera recombinante mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los péptidos pueden sintetizarse usando química f-moc estándar y purificarse usando cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Cuando se utilizan péptidos de autoensamblaje, se cree que sus cadenas laterales (o grupos R) se dividen en dos caras, una cara polar con cadenas laterales que tienen grupos polares (por ejemplo, cadenas laterales que contienen grupos -OH, -NH, -CO2H o -SH) y una cara no polar con cadenas laterales que contienen grupos no polares (por ejemplo, la cadena lateral de un resto de alanina o restos que tienen otros grupos hidrófobos).

Péptidos autocomplementarios tales como EAKA16-I (SEQ ID NO: 114), RADA16-I (SEQ ID NO: 60), RAEA16-I (SEQ ID NO: 61) y KADA16-I (SEQ ID NO: 62) se describen en Zhang, S., et al. ((1999) Autoensamblaje de péptidos en ciencia e ingeniería de polímeros funcionales. Reactive & Functional Polymers, 41, 91-102). Los péptidos de autoensamblaje tienen una longitud de 8 a 16 residuos de aminoácidos y comprenden una secuencia que se ajusta a una o más de las fórmulas I-IV:

((Xaaneu-Xaa+)x(Xaaneu-Xaa")y)n (I)

((Xaaneu-Xaa-)x(Xaaneu-Xaa+)y)n (II)

((Xaa+-Xaaneu)x(Xaa--X aaneu)y)n (III)

((Xaa--Xaaneu)x(Xaa+-X aaneu)y)n (IV)

en el que cada Xaaneu es un residuo de aminoácido seleccionado de alanina, leucina, isoleucina, fenilalanina o tirosina; Xaa+ es arginina o lisina; Xaa' es ácido aspártico o ácido glutámico; x e y son números enteros que tienen un valor de 1, 2, 3 o 4, independientemente; y n es un número entero que tiene un valor de 1-4. Los péptidos con módulo I (es decir, péptidos que tienen grupos R con carga positiva y negativa alternos en un lado (por ejemplo, la cara polar de la hoja p) se describen en cada una de las fórmulas IIV, dondex e y son 1. Los péptidos de módulo II (es decir, péptidos que tienen dos residuos que llevan un tipo de carga (por ejemplo, una carga positiva) seguidos de dos residuos que llevan otro tipo de carga (por ejemplo, una carga negativa)) se describen mediante las mismas fórmulas donde tanto x como y son 2. Ejemplos de péptidos de módulo III (es decir, péptidos que tienen tres residuos que llevan un tipo de carga (por ejemplo, una carga positiva) seguidos de tres residuos que llevan otro tipo de carga (por ejemplo, una carga negativa)) incluyen, pero no se limitan a, RARARADADADA (SEQ ID NO: 118).

Si los residuos de alanina en los péptidos se cambian a residuos más hidrófobos, como leucina, isoleucina, fenilalanina o tirosina, los péptidos resultantes tienen una mayor tendencia al autoensamblaje y formar matrices de péptidos con mayor fuerza. Algunos péptidos que tienen composiciones de aminoácidos y longitudes similares a los péptidos descritos aquí forman hélices alfa y espirales aleatorias en lugar de hojas beta y no forman estructuras macroscópicas. Por tanto, además de la autocomplementariedad, es probable que otros factores sean importantes para la formación de estructuras macroscópicas, como la longitud del péptido, el grado de interacción intermolecular y la capacidad de formar conjuntos escalonados.

Las estructuras basadas en péptidos se pueden formar a partir de mezclas heterogéneas de péptidos (es decir, mezclas que contienen más de un tipo de péptido que se ajusta a una fórmula dada o a dos o más de las fórmulas). En algunas realizaciones, cada uno de los tipos de péptidos en la mezcla puede autoensamblarse solo. En otras realizaciones, uno o más de cada tipo de péptido no se autoensamblará, por sí solo, pero la combinación de péptidos heterogéneos se puede autoensamblar (es decir, los péptidos en la mezcla son complementarios y estructuralmente compatibles entre sí). Por tanto, puede usarse una mezcla homogénea de péptidos autocomplementarios y autocompatibles de la misma secuencia o que contienen la misma subunidad repetida, o una mezcla heterogénea de diferentes péptidos que son complementarios y estructuralmente compatibles entre sí.

Las composiciones descritas en la presente memoria independientemente de la forma precisa (por ejemplo, ya sea en forma líquida o moldeada) e independientemente de las composiciones generales (por ejemplo, si se combinan con otro agente, si están contenidas en un dispositivo o empaquetadas en un kit) puede incluir una mezcla de una o más cadenas peptídicas.

Se pueden formar estructuras autoensambladas que tengan diversos grados de rigidez o elasticidad. Las estructuras tienen típicamente un módulo de elasticidad bajo (por ejemplo, un módulo en el intervalo de 0,01 a 1000 kPa, preferiblemente de 1 a 10 kPa medido por procedimientos estándar, como en un reómetro de placa cónica estándar). Pueden ser preferibles valores bajos, ya que permiten la deformación de la estructura como resultado del movimiento, en respuesta a la presión, en caso de contracción de la celda. Más específicamente, la rigidez se puede controlar de diversas formas, incluso cambiando la longitud, secuencia y/o concentración de las moléculas precursoras (por ejemplo péptidos de autoensamblaje). También se pueden emplear otros procedimientos para aumentar la rigidez. Por ejemplo, se pueden unir, a los precursores, moléculas de biotina o cualquier otra molécula que pueda reticularse posteriormente o unirse de otro modo entre sí. Las moléculas (por ejemplo, biotina) pueden incluirse en un extremo N o C de un péptido o unirse a uno o más residuos entre los extremos. Cuando se usa biotina, la reticulación se puede lograr mediante la adición posterior de avidina. Los péptidos que contienen biotina o los péptidos que contienen otras moléculas reticulables son representativos de péptidos reticulables. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos con grupos polimerizables, como los grupos vinilo, pueden incorporarse y reticularse mediante exposición a luz UV. El grado de reticulación se puede controlar con precisión aplicando la radiación durante un período de tiempo predeterminado a péptidos de secuencia y concentración conocidas. La extensión de la reticulación se puede determinar mediante dispersión de luz, filtración en gel o microscopía electrónica de barrido usando procedimientos estándar. Además, la reticulación se puede examinar mediante HPLC o análisis de espectrometría de masas de la estructura después de la digestión con una proteasa, como las metaloproteasas de matriz. La resistencia del material se puede determinar antes y después de la reticulación. Independientemente de si la reticulación se logra mediante un agente químico o energía luminosa, las moléculas pueden reticularse durante la creación de un molde o cuando se aplican al cuerpo soluciones que contienen péptidos. Además, las cadenas de péptidos de autoensamblaje se pueden reticular para formar un patrón tipo telaraña para reforzar el material in vivo. Los enlaces cruzados sirven para reforzar el material proporcionando mayor rigidez y resistencia. Por ejemplo, el material de autoensamblaje se puede aplicar a una herida, en la que la periferia del material está funcionalizada con grupos polimerizables. Tras la reticulación, la periferia del material se vuelve más rígida, anclando el material al sitio de la herida, mientras que el interior del material permanece flexible para moverse a medida que el cuerpo se mueve.

La vida media (por ejemplo, la vida media in vivo) de las estructuras también se puede modular incorporando sitios de escisión de proteasa o peptidasa en los precursores que posteriormente forman una estructura dada. Las proteasas o peptidasas que se producen naturalmente in vivo o que se introducen (por ejemplo, por un cirujano) pueden promover la degradación escindiendo sus sustratos afines. La vida media también se puede modular mediante reticulación (por ejemplo, polimerización) del material a través de grupos funcionales dentro del material. Estos grupos funcionales pueden ser grupos que se encuentran típicamente en péptidos o grupos funcionales adicionales añadidos a los péptidos. La introducción de enlaces cruzados en el material normalmente aumenta el tiempo de degradación y puede proporcionar diferentes sitios de escisión / enlaces dentro del material.

B. Componentes que mejoran o inducen la formación de materiales peptídicos de autoensamblaje

Antes del autoensamblaje, los péptidos pueden estar contenidos (por ejemplo, disueltos en) una solución que esté sustancialmente libre de iones (por ejemplo, iones monovalentes) o que contenga una concentración de iones suficientemente baja para evitar un autoensamblaje significativo (por ejemplo, una concentración de iones menor de 10, 5, 1 o 0,1 mM). El autoensamblaje puede iniciarse o potenciarse en cualquier momento posterior mediante la adición de un soluto iónico o diluyente a una solución de péptido o mediante un cambio de pH. Por ejemplo, el NaCl a una concentración de entre aproximadamente 5 mM y 5 M inducirá el ensamblaje de estructuras macroscópicas en un corto período de tiempo (por ejemplo, en unos pocos minutos). Las concentraciones más bajas de NaCl también pueden inducir el ensamblaje, pero a una tasa más lenta. Alternativamente, el autoensamblaje puede iniciarse o potenciarse mediante la introducción de péptidos (ya sean secos, en un gel semisólido o disueltos en una solución líquida que esté sustancialmente libre de iones) en un fluido (por ejemplo, un fluido fisiológico como sangre o jugo gástrico) o un área (por ejemplo, una cavidad corporal como la nariz o la boca o una cavidad expuesta por un procedimiento quirúrgico, lesión, trauma, enfermedad o trastorno) que comprende tales iones. Generalmente, se espera que se produzca el autoensamblaje al poner en contacto los péptidos con dicha solución de cualquier manera. El tiempo de montaje se puede reducir para permitir que el material se entremezcle con el tejido o vaso subyacente antes de que el material se ensamble.

Puede usarse una amplia variedad de iones, incluidos aniones y cationes (ya sean divalentes, monovalentes o trivalentes). Por ejemplo, se puede promover una transición de fase mediante la exposición a cationes monovalentes como Li+, Na+, K+ y Cs+, y la concentración de dichos iones requerida para inducir o mejorar el autoensamblaje es típicamente de al menos aproximadamente 5 mM, preferiblemente al menos aproximadamente 10 mM, más preferiblemente al menos aproximadamente 20 mM y lo más preferiblemente aproximadamente 50 mM. Las concentraciones más bajas también pueden facilitar el ensamblaje, aunque a una tasa más lenta. Cuando se desee, los péptidos de autoensamblaje se pueden administrar con un material hidrófobo (por ejemplo, aceite farmacéuticamente aceptable) en una concentración que permita el autoensamblaje, pero a una tasa más lenta. Cuando los péptidos de autoensamblaje se mezclan con un agente hidrófobo, como un aceite o un lípido, el ensamblaje del material forma estructuras diferentes. Las estructuras suelen aparecer como hielo sobre una capa de aceite, pero en algunos casos, cuando se agrega otro material, el material se ensamblará en varias otras estructuras tridimensionales que pueden ser adecuadas para la carga/administración de medicamentos. La parte hidrofílica de la molécula se ensamblará de tal manera que se minimice la interacción hidrofobicidrofílica, creando así una barrera entre los dos entornos. Varios experimentos han demostrado que los péptidos de autoensamblaje se alinearán en la superficie del aceite como el hielo en el agua con la parte hidrofóbica de la molécula hacia la superficie y la parte hidrófila de la molécula alejada del aceite, o formará estructuras de tipo toroidal con el material hidrófobo contenido en su interior. Este tipo de comportamiento permite la encapsulación de agentes terapéuticos u otras moléculas de interés para su liberación en el cuerpo.

Dependiendo de la formulación y las propiedades deseadas de la estructura macroscópica (por ejemplo la rigidez del andamio o la tasa de su formación), la concentración de precursores (por ejemplo, péptidos de autoensamblaje) puede variar desde aproximadamente 0,01 % p/v (0,1 mg/ml) hasta aproximadamente 99,99 % p/v (999,9 mg/ml), inclusive. Por ejemplo, la concentración antes de la formación del armazón puede estar entre aproximadamente 0,1 % (1 mg/ml) y 10 % (100 mg/ml), inclusive (por ejemplo, aproximadamente 0,1 % -5 %; 0,5 % -5 %; 1,0 %; 1,5 %; 2,0 %; 2,5 %; 3,0 % o 4,0 % o más). En algunas realizaciones, la concentración puede ser inferior al 0,1 %. Los precursores (por ejemplo, péptidos de autoensamblaje) pueden formularse como polvos y administrarse en forma resuspendida. En una realización, la concentración de los péptidos de autoensamblaje en cualquier formulación dada puede variar y puede estar entre aproximadamente el 0,1 % (1 mg/ml) y el 10 % (100 mg/ml), inclusive. Por ejemplo, la concentración de los péptidos de autoensamblaje (por ejemplo, en una formulación líquida) puede ser de aproximadamente 0,1-3,0 % (1-30 mg/ml) (por ejemplo, 0,1 -1,0 %; 1,0-2,0 %; 2,0-3,0 % o 1,0-3,0 %). La concentración de péptidos de autoensamblaje puede ser mayor en soluciones madre y en formulaciones sólidas (por ejemplo, en polvo). En preparaciones sólidas, la concentración de péptidos de autoensamblaje puede acercarse al 100 % (por ejemplo, la concentración de péptidos de autoensamblaje puede ser del 95, 96, 97, 98, 99 % o más (por ejemplo, 99,99 %) de la composición). Ya sea en forma líquida o sólida, los péptidos se pueden llevar a la concentración deseada antes de su uso mediante la adición de un diluyente (por ejemplo, agua desionizada), polvo, agente humectante o un agente terapéutico, de diagnóstico o profiláctico.

Los materiales que se ensamblan y/o experimentan una transición de fase (por ejemplo, una transición de un estado líquido a un semisólido, gel, etc.) cuando entran en contacto con el cuerpo son útiles para prevenir el movimiento de sustancias corporales. El autoensamblaje o la transición de fase se desencadena por componentes que se encuentran en el cuerpo de un sujeto (por ejemplo, iones) o por el pH fisiológico y es asistido por temperaturas fisiológicas. El autoensamblaje o la transición de fase puede comenzar cuando las composiciones se exponen o se ponen en contacto con el cuerpo de un sujeto y pueden facilitarse mediante la aplicación local de calor en el área donde se ha depositado (o se depositará) la composición. El sujeto, para cualquier indicación descrita en la presente memoria, puede ser un ser humano. Según los estudios realizados hasta la fecha, el autoensamblaje se produce rápidamente al entrar en contacto con los tejidos corporales internos sin la aplicación de calor adicional. En una realización, el tiempo requerido para el ensamblaje efectivo y/o la transición de fase puede ser de 60 segundos o menos después del contacto con los tejidos internos de un sujeto o en condiciones similares a las que se encuentran dentro del cuerpo (por ejemplo, en 50, 40, 30, 20 o 10 segundos o menos). En algunas circunstancias, como cuando la concentración de agentes autoensamblantes en la composición es baja o cuando el movimiento de la sustancia corporal es sustancial, El autoensamblaje o la transición de fase pueden tardar más en lograr el efecto deseado, por ejemplo, hasta un minuto, 5 minutos, 10 minutos, 30 minutos, una hora o más. Por ejemplo, una solución que contiene un péptido de autoensamblaje aplicado a sitios de sección transversal de vasos sanguíneos en el cerebro, hígado o músculo proporciona una hemostasia completa en tiempos tan cortos como 10 segundos después de la aplicación. Se pueden preferir las soluciones que contienen iones cuando las composiciones se utilizan para proteger a un sujeto de la contaminación, ya que las transiciones de fase no ocurren, o no ocurren fácilmente, cuando las composiciones no iónicas entran en contacto con la piel intacta.

Las composiciones pueden formar estructuras que son sustancialmente rígidas (por ejemplo, sólido o casi sólido) o que asumen una forma y volumen definidos (por ejemplo, estructuras que se ajustan a la forma y el volumen del lugar en el que se administró una composición líquida, ya sea in vivo o ex vivo). El material solidificado puede ser algo deformable o comprimible después del ensamblaje o la transición de fase, pero no fluirá sustancialmente de un área a otra, como pueden hacerlo las composiciones en un punto diferente a lo largo del continuo de líquido a sólido, lo que puede deberse, al menos en parte, a su capacidad para experimentar transiciones de fase. Como resultado, las composiciones se pueden usar para prevenir el movimiento de una sustancia corporal en un sujeto que lo necesite. El autoensamblaje se puede lograr in vivo o ex vivo mediante la exposición a condiciones dentro de un cierto intervalo de valores fisiológicos (por ejemplo, condiciones apropiadas para cultivo celular o tisular) o condiciones no fisiológicas. "Condiciones no fisiológicas" se refiere a condiciones dentro del cuerpo o en un sitio particular que se desvían de las condiciones fisiológicas normales en ese sitio. Tales afecciones pueden resultar de un trauma, cirugía, lesión, infección o una enfermedad, trastorno o afección. Por ejemplo, una herida punzante en el estómago generalmente da como resultado una disminución del pH a medida que el ácido del estómago fluye hacia el lugar de la herida. Los materiales descritos en la presente memoria deben autoensamblarse en tales condiciones.

Independientemente de la naturaleza precisa de los agentes de autoensamblaje, tras la exposición a condiciones como las descritas en la presente memoria, los agentes pueden formar estructuras membranosas bidimensionales o tridimensionales que incluyen una matriz porosa macroscópica estable que tiene nanofibras entretejidas ordenadas o desordenadas (por ejemplo, fibras de aproximadamente 10-20 nm de diámetro, con un tamaño de poro de aproximadamente 50-100 nm o mayor en una dimensión lineal). Las matrices macroscópicas tridimensionales pueden tener dimensiones lo suficientemente grandes como para ser visibles con un aumento bajo (por ejemplo, aproximadamente 10 veces o menos), y las estructuras membranosas pueden ser visibles a simple vista, incluso si son transparentes. Aunque tridimensionales, las estructuras pueden ser excesivamente delgadas, incluyendo un número limitado de capas de moléculas (por ejemplo, 2, 3 o más capas de moléculas). Normalmente, cada dimensión de una estructura dada tendrá un tamaño de al menos 10 jm (por ejemplo, dos dimensiones de al menos 100-1000 |jm de tamaño (por ejemplo, 1-10 mm, 10-100 mm o más)). Las dimensiones relevantes pueden expresarse como largo, ancho, profundidad, ancho, alto, radio, diámetro o circunferencia en el caso de estructuras que tienen una forma sustancialmente regular (por ejemplo, cuando la estructura es una esfera, cilindro, cubo o similar) o una aproximación de cualquiera de los anteriores donde las estructuras no tienen una forma regular.

Los péptidos de autoensamblaje pueden formar un material hidratado cuando se ponen en contacto con agua en condiciones como las descritas en la presente memoria (por ejemplo, en presencia de una concentración suficiente (por ejemplo, concentraciones fisiológicas) de iones (por ejemplo, cationes monovalentes)). Los materiales pueden tener un alto contenido de agua (por ejemplo, aproximadamente 95 % o más (por ejemplo, aproximadamente 97 %, 98 %, 99 % o más)) y las composiciones pueden hidratarse pero no sustancialmente autoensamblarse. Un valor dado puede ser "aproximado" en reconocimiento del hecho de que las mediciones pueden variar dependiendo, por ejemplo, de las circunstancias en las que se realizan y de la habilidad de la persona que realiza la medición. Generalmente, un primer valor es aproximadamente igual a un segundo cuando el primero cae dentro del 10 % del segundo (ya sea mayor o menor que), a menos que el contexto indique claramente que un valor no es aproximado o cuando, por ejemplo, tal valor excedería el 100 % de un valor posible.

Las propiedades y la resistencia mecánica de las estructuras o andamios pueden controlarse según se requiera mediante la manipulación de los componentes que contienen. Por ejemplo, la rigidez de un gel ensamblado se puede incrementar aumentando la concentración de agentes de autoensamblaje (por ejemplo, péptidos) en el mismo. Alternativamente, puede ser deseable que diferentes partes del material tengan diferentes propiedades mecánicas. Por ejemplo, puede ser ventajoso disminuir la estabilidad de todo o parte del material manipulando la secuencia de aminoácidos. Esto puede ser deseable cuando los materiales se utilizan para llenar un vacío, de modo que los bordes del material se autoensamblan para unirse al sitio del tejido mientras el resto del material fluye hacia el vacío.

Las secuencias, características y propiedades de los péptidos y las estructuras formadas por ellos tras el autoensamblaje se describen más adelante.

Las composiciones se pueden formular como reservas concentradas o en forma seca, y estas se pueden diluir o disolver para formar composiciones (por ejemplo, composiciones biocompatibles), que son sustancialmente no tóxicas para las células biológicas in vitro o in vivo. Por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales en cantidades que no provoquen un efecto deletéreo significativo en el cuerpo del receptor (por ejemplo, una reacción inmunológica o inflamatoria prohibitivamente severa, o formación inaceptable de tejido cicatricial).

Cuando se deposita una solución que contiene péptidos no ensamblados sobre un tejido biológico, los péptidos que tienen suficiente proximidad al tejido se ensamblan, haciendo que la solución gelifique. Cualquier solución que permanezca alejada del tejido permanece líquida, ya que los péptidos de autoensamblaje aún no han sido expuestos a condiciones que promuevan su ensamblaje. A medida que se altera el material (por ejemplo, al realizar un procedimiento quirúrgico), el material líquido parece gelificarse cuando entra en contacto suficiente con el cuerpo. A veces, las composiciones pueden adquirir características que van desde un líquido hasta las de un sólido, con apariencia de gel o ungüento o como una suspensión.

C. Modificación de materiales de autoensamblaje para apuntar a tejidos específicos.

Los péptidos de autoensamblaje se pueden modificar para incluir un agente de dirección.

Con referencia a la figura 1, el material de autoensamblaje puede contener además un componente específico de tejido para dirigir el péptido de autoensamblaje a una ubicación, célula, tejido, órgano u orgánulo específicos. Los agentes de dirección representativos incluyen, pero no se limitan a, señales de localización nuclear, señales de localización de mitocondrias, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos, anticuerpos monocatenarios, restos de azúcar, lípidos, glicolípidos, colorantes y glicoproteínas. Los agentes de dirección se pueden unir a los péptidos de autoensamblaje directamente o mediante un enlazador. En algunas realizaciones, el agente de dirección se une de forma liberable al péptido de autoensamblaje, por ejemplo, a través de un enlace escindible o un sitio de escisión enzimática. Por ejemplo, los carbohidratos de la superficie celular son componentes principales de la superficie externa de las células de mamíferos y, muy a menudo, son característicos de los tipos de células. Se supone que los carbohidratos específicos del tipo celular están involucrados en la interacción célula-célula. Por tanto, el componente específico de tejido puede dirigirse a estos carbohidratos de superficie específicos de la célula. El direccionamiento puede ser útil para ubicaciones específicas del cuerpo cuando se inyectan las composiciones.

Además, se pueden agregar colas hidrófobas al material de autoensamblaje. Las colas hidrófobas pueden interactuar con la membrana celular, anclando así el material de autoensamblaje en la superficie celular. La Tabla 3 muestra una lista de péptidos con colas hidrófobas. También se pueden añadir colas hidrófilas al péptido, solas o además de las colas hidrófobas, para facilitar la interacción con la ECM de diferentes vasos o tejidos, como la vejiga.

Tabla 3: Colas hidrofóbicas

No. SEQ ID NO

1 G G G G G D G D G D G D G D G D (126)

2 G G G G G E G E G E G E G E G E (127)

3 G G G G G K G K G K G K G K G K (128)

4 G G G G G R G R G R G R G R G R (129) (continuación)

No. SEQ ID NO 5 G G G G G H G H G H G H G H G H (130) 6 A A A A A D A D A D A D A D A D (131) 7 A A A A A E A E A E A E A E A E (132) 8 A A A A A K A K A K A K A K A K (133) 9 A A A A A R A R A R A R A R A R (134) 10 A A A A A H A H A H A H A H A H (135) 11 V V V V V D V D V D V D V D V D (136) 12 V V V V V E V E V E V E V E V E (137) 13 V V V V V K V K V K V K V K V K (138) 14 V V V V V R V R V R V R V R V R (139) 15 V V V V V H V H V H V H V H V H (140) 16 L L L L L D L D L D L D L D L D (141) 17 L L L L L E L E L E L E L E L E (142) 18 L L L L L K L K L K L K L K L K (143) 19 L L L L L R L R L R L R L R L R (144) 20 L L L L L H L H L H L H L H L H (145) 21 I I I I I D I D I D I D I D I D (146) 22 I I I I I E I E I E I E I E I E (147) 23 I I I I I K I K I K I K I K I K (148) 24 I I I I I R I R I R I R I R I R (149) 25 I I I I I H I H I H I H I H I H (150) 26 M M M M M D M D M D M D M D M D (151) 27 M M M M M E M E M E M E M E M E (152) 28 M M M M M K M K M K M K M K M K (153) 29 M M M M M R M R M R M R M R M R (154) 30 M M M M M H M H M H M H M H M H (155) 31 F F F F F D F D F D F D F D F D (156) 32 F F F F F E F E F E F E F E F E (157) 33 F F F F F K F K F K F K F K F K (158) 34 F F F F F R F R F R F R F R F R (159) 35 F F F F F H F H F H F H F H F H (160) 36 W W W W W D W D W D W D W D W D (161) (continuación)

No. SEQ ID NO 37 W W W W W E W E W E W E W E W E (162) 38 W W W W W K W K W K W K W K W K (163) 39 W W W W W R W R W R W R W R W R (164) 40 W W W W W H W H W H W H W H W H (165) 41 P P P P P D P D P D P D P D P D (166) 42 P P P P P E P E P E P E P E P E (167) 43 P P P P P K P K P K P K P K P K (168) 44 P P P P P R P R P R P R P R P R (169) 45 P P P P P H P H P H P H P H P H (170) 46 A A A A A R A D A D A D A D A D (171) 47 A A A A A R A R A D A D A R A R (172) 48 A A A A A E A K A E A K A E A K (173) 49 A A A A A E A E A K A K A E A E (174) 50 A A A A A R A E A R A E A R A E (175) 51 A A A A A R A R A E A E A R A E (176) 52 A A A A A K A D A K A D A K A D (177) 53 A A A A A E A H A E A H A E A H (178) 54 A A A A A E A E A H A H A E A E (179) 55 A A A A A R A R A R A R A R A R (180) 56 A A A A A R A R A R A R A D A D (181) 57 A A A A A R A R A R A D A D A D (182) 58 A A A A A H A D A H A D A H A D (183) 59 A A A A A H A H A H A H A H A H (184) 60 A A A A A H A D A D A H A D A D (185) 61 A A A A A H A E A E A H A E A E (186) 62 G G G G G R G D G R G D G R G D (187) 63 G G G G G R G R G D G D G R G R (188) 64 G G G G G E G K G E G K G E G K (189) 65 G G G G G E G E G K G K G E G E (190) 66 G G G G G R G E G R G E G R G E (191) 67 G G G G G R G R G E G E G R G E (192) 68 G G G G G K G D G K G D G K G D (193) (continuación)

No. SEQ ID NO 69 G G G G G E G H G E G H G E G H (194) 70 G G G G G E G E G H G H G E G E (195) 71 G G G G G R G R G R G R G R G R (196) 72 G G G G G R G R G R G R G D G D (197) 73 G G G G G R G R G R G D G D G D (198) 74 G G G G G H G D G H G D G H G D (199) 75 G G G G G H G H G H G H G H G H (200) 76 G G G G G H G D G D G H G D G D (201) 77 G G G G G H G E G E G H G R G E (202) 78 V V V V V R V D V R V D V R V D (203) 79 V V V V V R V R V D V D V R V R (204) 80 V V V V V E V K V E V K V E V K (205) 81 V V V V V E V E V K V K V E V E (206) 82 V V V V V R V E V R V E V R V E (207) 83 V V V V V R V R V E V E V R V E (208) 84 V V V V V K V D V K V D V K V D (209) 85 V V V V V E V H V E V H V E V H (210) 86 V V V V V E V E V H V H V E V E (211) 87 V V V V V R V R V R V R V R V R (212) 88 V V V V V R V R V R V R V D V D (213) 89 V V V V V R V R V R V D V D V D (214) 90 V V V V V H V D V H V D V H V D (215) 91 V V V V V H V H V H V H V H V H (216) 92 V V V V V H V D V D V H V D V D (217) 93 V V V V V H V E V E V H V E V E (218) 94 L L L L L R L D L R L D L R L D (219) 95 L L L L L R L R L D L D L R L R (220) 96 L L L L L E L K L E L K L E L K (221) 97 L L L L L E L E L K L K L E L E (222) 98 L L L L L R L E L R L E L R L E (223) 99 L L L L L R L R L E L E L R L E (224) 100 L L L L L K L D L K L D L K L D (225) (continuación)

No. SEQ ID NO 101 L L L L L E L H L E L H L E L H (226) 102 L L L L L E L E L H L H L E L E (227) 103 L L L L L R L R L R L R L R L R (228) 104 L L L L L R L R L R L R L D L D (229) 105 L L L L L R L R L R L D L D L D (230) 106 L L L L L H L D L H L D L H L D (231) 107 L L L L L H L H L H L H L H L H (232) 108 L L L L L H L D L D L H L D L D (233) 109 L L L L L H L E L E L H L E L E (234) 110 I I I I R D I R D I R D (235) 111 I I I I R R I D D I R R (236) 112 I I I I E K I E K I E E (237) 113 I I I I E E I K K I E E (238) 114 I I I I R E I R E I R E (239) 115 I I I I R R I E E I R E (240) 116 I I I I K D I K D I K D (241) 117 I I I I E H I E H I E H (242) 118 I I I I E E I H H I E E (243) 119 I I I I R R I R R I R R (244) 120 I I I I R R I R R I D D (245) 121 I I I I R R I R D I D D (246) 122 I I I I H D I H D I H D (247) 123 I I I I H H I H H I H H (248) 124 I I I I H D I D H I D D (249) 125 I I I I H E I E H I E E (250) 126 M M M M M R M D M R M D M R M D (251) 127 M M M M M R M R M D M D M R M R (252) 128 M M M M M E M K M E M K M E M K (253) 129 M M M M M E M E M K M K M E M E (254) 130 M M M M M R M E M R M E M R M E (255) 131 M M M M M R M R M E M E M R M E (256) 132 M M M M M K M D M K M D M K M D (257) (continuación)

No. SEQ ID NO 133 M M M M M E M H M E M H M E M H (258) 134 M M M M M E M E M H M H M E M E (259) 135 M M M M M R M R M R M R M R M R (260) 136 M M M M M R M R M R M R M D M D (261) 137 M M M M M R M R M R M D M D M D (262) 138 M M M M M H M D M H M D M H M D (263) 139 M M M M M H M H M H M H M H M H (264) 140 M M M M M H M D M D M H M D M D (265) 141 M M M M M H M E M E M H M E M E (266) 142 F F F F F R F D F R F D F R F D (267) 143 F F F F F R F R F D F D F R F R (268) 144 F F F F F E F K F E F K F E F K (269) 145 F F F F F E F E F K F K F E F E (270) 146 F F F F F R F E F R F E F R F E (271) 147 F F F F F R F R F E F E F R F E (272) 148 F F F F F K F D F K F D F K F D (273) 149 F F F F F E F H F E F H F E F H (274) 150 F F F F F E F E F H F H F E F E (275) 151 F F F F F R F R F R F R F R F R (276) 152 F F F F F R F R F R F R F D F D (277) 153 F F F F F R F R F R F D F D F D (278) 154 F F F F F H F D F H F D F H F D (279) 155 F F F F F H F H F H F H F H F H (280) 156 F F F F F H F D F D F H F D F D (281) 157 F F F F F H F E F E F H F E F E (282) 158 W W W W W R W D W R W D W R W D (283) 159 W W W W W R W R W D W D W R W R (284) 160 W W W W W E W K W E W K W E W K (285) 161 W W W W W E W E W K W K W E W E (286) 162 W W W W W R W E W R W E W R W E (287) 163 W W W W W R W R W E W E W R W E (288) 164 W W W W W K W D W K W D W K W D (289) (continuación)

No. SEQ ID NO 165 W W W W W E W H W E W H W E W H (290) 166 W W W W W E W E W H W H W E W E (291) 167 W W W W W R W R W R W R W R W R (292) 168 W W W W W R W R W R W R W D W D (293) 169 W W W W W R W R W R W D W D W D (294) 170 W W W W W H W D W H W D W H W D (295) 171 W W W W W H W H W H W H W H W H (296) 172 W W W W W H W D W D W H Q D W D (297) 173 W W W W W H W E W E W H W E W E (298) 174 P P P P P R P D P R P D P R P D (299) 175 P P P P P R P R P D P D P R P R (300) 176 P P P P P E P K P E P K P E P K (301) 177 P P P P P E P E P K P K P E P E (302) 178 P P P P P R P E P R P E P R P E (303) 179 P P P P P R P R P E P E P R P E (304) 180 P P P P P K P D P K P D P K P D (305) 181 P P P P P E P H P E P H P E P H (306) 182 P P P P P E P E P H P H P E P E (307) 183 P P P P P R P R P R P R P R P R (308) 184 P P P P P R P R P R P R P D P D (309) 185 P P P P P R P R P R P D P D P D (310) 186 P P P P P H P D P H P D P H P D (311) 187 P P P P P H P H P H P H P H P H (312) 188 P P P P P H P D P D P H P D P D (313) 189 P P P P P H P E P E P H P E P E (314) 190 S S S S S R S D S R S D S R S D (315) 191 S S S S S R S R S D S D S R S R (316) 192 S S S S S E S K S E S K S E S K (317) 193 S S S S S E S E S K S K S E S E (318) 194 S S S S S R S E S R S E S R S E (319) 195 S S S S S R S R S E S E S R S E (320) 196 S S S S S K S D S K S D S K S D (321) (continuación)

No. SEQ ID NO 197 S S S S S E S H S E S H S E S H (322) 198 S S S S S E S E S H S H S E S E (323) 199 S S S S S R S R S R S R S R S R (324) 200 S S S S S R S R S R S R S D S D (325) 201 S S S S S R S R S R S D S D S D (326) 202 S S S S S H S D H S D S H S S D (327) 203 S S S S S H S H S H S H S H S H (328) 204 S S S S S H S D S D S H S D S D (329) 205 S S S S S H S E S E S H S E S E (330) 206 T T T T T R T D T R T D T R T D (331) 207 T T T T T R T R T D T D T R T R (332) 208 T T T T T E T K T E T K T E T K (333) 209 T T T T T E T E T K T K T E T E (334) 210 T T T T T R T E T R T E T R T E (335) 211 T T T T T R T R T E T E T R T E (336) 212 T T T T T K T D T K T D T K T D (337) 213 T T T T T E T H T E T H T E T H (338) 214 T T T T T E T E T H T H T E T E (339) 215 T T T T T R T R T R T R T R T R (340) 216 T T T T T R T R T R T R T D T D (341) 217 T T T T T R T R T R T D T D T D (342) 218 T T T T T H T D T H T D T H T D (343) 219 T T T T T H T H T H T H T H T H (344) 220 T T T T T H T D T D T H T D T D (345) 221 T T T T T H T E T E T H T E T E (346) 222 C C C C C R C D C R C D C R R C (347) 223 C C C C C R C R C D C D C R C R (348) 224 C C C C C E C K C E C K C E C K (349) 225 C C C C C E C E C K C K C E C E (350) 226 C C C C C R C E C R C E C R C E (351) 227 C C C C C R C R C E C E C R C E (352) 228 C C C C C K C D C K C D C K D C (353) (continuación)

No. SEQ ID NO 229 C C C C C E C H C E C H C E C H (354) 230 C C C C C E C E C H C H C E C E (355) 231 C C C C C R C R C R C R C R C R (356) 232 C C C C C R C R C R C R C D C D (357) 233 C C C C C R C R C R C D C D C D (358) 234 C C C C C H C D C H C D C H C D (359) 235 C C C C C H C H C H C H C H C H (360) 236 C C C C C H C D C D C H C D C D (361) 237 C C C C C H C E C E C H C E C E (362) 238 Y Y Y Y Y R Y D Y R Y D Y R Y D (363) 239 Y Y Y Y Y R Y R Y D Y D Y R Y R (364) 240 Y Y Y Y Y E Y K Y E Y K Y E Y K (365) 241 Y Y Y Y Y E Y E Y K Y K Y E Y E (366) 242 Y Y Y Y Y R Y E Y R Y E Y R Y E (367) 243 Y Y Y Y Y R Y R Y E Y E Y R Y E (368) 244 Y Y Y Y Y K Y D Y K Y D Y K Y D (410) 245 Y Y Y Y Y E Y H Y E Y H Y E Y H (369) 246 Y Y Y Y Y E Y E Y H Y H Y E Y E (370) 247 Y Y Y Y Y R Y R Y R Y R Y R Y R (371) 248 Y Y Y Y Y R Y R Y R Y R Y D Y D (372) 249 Y Y Y Y Y R Y R Y R Y D Y D Y D (373) 250 Y Y Y Y Y H Y D Y H Y D Y H Y D (374) 251 Y Y Y Y Y H T H Y H Y H Y H Y H (375) 252 Y Y Y Y Y H Y D Y H Y D Y D Y D (376) 253 Y Y Y Y Y H Y E Y E Y H Y E Y E (377) 254 N N N N N R N D N R N D N R N D (378) 255 N N N N N R N R N D N D N R N R (379) 256 N N N N N E N K N E N K N E N K (380) 257 N N N N N E N E N K N K N E N E (381) 258 N N N N N R N E N R N E N R N E (382) 259 N N N N N R N R N E N E N R N E (383) 260 N N N N N K N D N K N D N K N D (384) (continuación)

No. SEQ ID NO

261 N N N N N E N H N E N H N E N H (385)

262 N N N N N E N E N H N H N E N E (386)

263 N N N N N R N R N R N R N R N R (387)

264 N N N N N R N R N R N R N D N D (388)

265 N N N N N R N R N R N D N D N D (389)

266 N N N N N H N D N H N D N H N D (390)

267 N N N N N H N H N H N H N H N H (391)

268 N N N N N H N D N D N H N D N D (392)

269 N N N N N H N E N E N H N E N E (393)

270 Q Q Q Q Q R Q D Q R Q D Q R Q D (394)

271 Q Q Q Q Q R Q R Q D Q D Q R Q R (395)

272 Q Q Q Q Q E Q K Q E Q K Q E Q K (396)

273 Q Q Q Q Q E Q E Q K Q K Q E Q E (397)

274 Q Q Q Q Q R Q E Q R Q E Q R Q E (398)

275 Q Q Q Q Q R Q R Q E Q E Q R Q E (399)

276 Q Q Q Q Q K Q D Q K Q D Q K Q D (400)

277 Q Q Q Q Q E Q H Q E Q H Q E Q H (401)

278 Q Q Q Q Q E Q E Q H Q H Q E Q E (402)

279 Q Q Q Q Q R Q R Q R Q R Q R Q R (403)

280 Q Q Q Q Q R Q R Q R Q R Q D Q D (404)

281 Q Q Q Q Q R Q R Q R Q D Q D Q D (405)

282 Q Q Q Q Q H Q D Q H Q D Q H Q D (406)

283 Q Q Q Q Q H Q H Q H Q H Q H Q H (407)

284 Q Q Q Q Q H Q D Q D Q H Q D Q D (408)

285 Q Q Q Q Q H Q E Q E Q H Q E Q E (409)

Las secuencias descritas en la Tabla 3 son generalmente secuencias lineales. Sin embargo, los materiales pueden estar en forma de secuencias no lineales que contienen colas hidrófobas o hidrófilas, que interactúan con el ECM. En una realización, la secuencia tiene la forma de un "rastrillo", en el que los dientes del rastrillo son las secuencias hidrófilas y/o hidrófobas que interactúan con el ECM para anclar el material al tejido o vaso. El mango del rastrillo contiene una secuencia que se autoensambla.

D. Agentes terapéuticos, profilácticos y de diagnóstico

Las formulaciones de péptidos de autoensamblaje pueden contener uno o más agentes terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico. Los agentes pueden ser péptidos o proteínas, polisacáridos o sacáridos, ácidos nucleicos o nucleótidos, proteoglicanos, lípidos, carbohidratos o moléculas pequeñas, típicamente compuestos orgánicos que tienen múltiples enlaces carbono-carbono. Las moléculas pequeñas tienen pesos moleculares relativamente bajos (por ejemplo, menos de aproximadamente 1500 g/mol) y no son péptidos ni ácidos nucleicos. El (los) agente (s) pueden ocurrir naturalmente o prepararse mediante síntesis química. Por ejemplo, una proteína que tiene una secuencia que no se ha encontrado en la naturaleza (por ejemplo, una que no se encuentra en una base de datos de secuencias disponible públicamente) o que tiene una secuencia conocida modificada de forma no natural por una mano humana (por ejemplo, una secuencia modificada mediante la alteración de un procedimiento postraduccional como la glicosilación) es una molécula sintética. Las moléculas de ácido nucleico que codifican tales proteínas (por ejemplo, un oligonucleótido, opcionalmente contenido dentro de un vector de expresión) pueden incorporarse en las composiciones descritas en la presente memoria. Por ejemplo, una composición puede incluir una pluralidad de péptidos y células de autoensamblaje que expresan, o que están diseñadas para expresar, una proteína (en virtud de que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína).

El uno o más agentes terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico se pueden añadir en combinación o alternando con los péptidos de autoensamblaje. En determinadas realizaciones, el uno o más agentes terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico pueden unirse covalentemente a los péptidos de autoensamblaje, por ejemplo, mediante un enlace tio u otros enlaces adecuados.

En una realización, estos agentes pueden ser antiinflamatorios, agentes vasoactivos, colorantes, antiinfecciosos, anestésicos, factores de crecimiento y/o células. Los vasoconstrictores representativos, cualquiera de los cuales puede formularse con uno o más péptidos de autoensamblaje (por ejemplo, en una composición biocompatible en forma líquida, en polvo o en gel) incluyen, pero no se limitan a, epinefrina y fenilefrina.

Los agentes anestésicos representativos incluyen, pero no se limitan a, benzocaína, bupivacaína, picrato de butamben, cloroprocaína, cocaína, curare, dibucaína, diclonina, etidocaína, lidocaína, mepivacaína, pramoxina, prilocaína, procaína, propoxicaína, ropivacaína, o combinaciones de estos. La aplicación local del agente anestésico puede ser todo lo que se requiere en algunas situaciones, por ejemplo, para una quemadura u otra herida en la piel, incluidas las úlceras por decúbito, o para cirugías mínimamente invasivas. La combinación de anestésicos locales con los péptidos de autoensamblaje ya sea combinados en virtud de estar presentes en la misma formulación o en virtud de la coadministración, puede ayudar a contener el anestésico dentro del cuerpo y reducir la cantidad que ingresa a la circulación.

Pueden incluirse vasoconstrictores como la fenilefrina para prolongar el efecto de la anestesia local (por ejemplo, fenilefrina al 0,1-0,5 %). Agentes analgésicos distintos de un agente anestésico local, como esteroides, agentes antiinflamatorios no esteroideos como indometacina, inhibidores del factor activador de plaquetas (PAF) como lexipafant, CV 3988 y/o inhibidores del receptor de PAF como SRI 63-441.

Puede incluirse un agente antiinfeccioso o antimicrobiano (por ejemplo, un agente antibiótico, antibacteriano, antivírico o antifúngico) para administración sistémica o local. Los ejemplos incluyen antibióticos p-lactámicos como penicilinas y cefalosporinas y otros inhibidores de la síntesis de la pared celular como vancomicina, cloranfenicol, tetraciclinas, macrólidos, clindamicina, estreptograminas, aminoglucósidos, espectinomicina, sulfonamidas, trimetoprim, quinolonas, flulescitosina como anfotericina. ketoconazol, itraconazol, fluconazol, clotrimazol y miconazol, griseofulvina, terbinafina y nistatina. El antimicrobiano también puede ser un agente de amplio espectro. Por ejemplo, se puede usar una cefalosporina de segunda, tercera o cuarta generación. Estos agentes pueden ser activos contra una amplia gama de bacterias, incluidas especies tanto gram positivas como gram negativas. Un experto en la materia podrá seleccionar agentes antimicrobianos apropiados considerando factores tales como el historial del paciente (por ejemplo, cualquier historial de una reacción alérgica a dichos agentes), la ubicación en la que se aplicarán los péptidos, el tipo de agente infeccioso que probablemente esté presente, y así sucesivamente.

Los agentes colorantes adecuados incluyen colorantes alimentarios disponibles comercialmente, colorantes naturales y sintéticos y moléculas fluorescentes. Preferiblemente, el agente colorante no es tóxico o se incluye en concentraciones tan bajas como para minimizar cualquier efecto indeseable (por ejemplo, un efecto tóxico). El uso de un agente colorante permite una mejor visualización de un área que está cubierta por una estructura o andamio y puede facilitar la eliminación, si se desea dicha eliminación. El agente colorante puede ser uno que cambia de color cuando entra en contacto con un área contaminada (por ejemplo, un cambio de color puede ser provocado por la contaminación misma (por ejemplo, por la sangre o bacterias presentes en el sitio de una herida)). Por ejemplo, un producto metabólico de una bacteria puede provocar un cambio de color. También se pueden detectar condiciones como el pH o el estado redox inducidos por contaminantes. Los agentes colorantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, rojo azo, amarillo azo, arsenazo III, clorofosfonazo III, antipirilazo III, murexido, Eriochrome Black T y Eriochrome Blue SE para Mg2+, oxyacetazo I, carboxyazo III, tropolona, azul de metiltimol y Mordant Black 32. AlamarBlue, un indicador redox, y rojo fenol también pueden usarse en las composiciones y procedimientos descritos en la presente memoria.

También se pueden incluir uno o más factores de crecimiento en las composiciones para acelerar uno o más aspectos de la curación (por ejemplo, angiogénesis, migración celular, extensión del procedimiento y proliferación celular). El uno o más factores de crecimiento pueden incorporarse al material de autoensamblaje o pueden coadministrarse con la composición de autoensamblaje. Los ejemplos de factores de crecimiento incluyen, entre otros, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un factor de crecimiento transformante (TGF) como el factor de crecimiento transformante p, un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), un factor de crecimiento epidérmico (EGF), un factor de crecimiento nervioso (NGF), un factor de crecimiento similar a la insulina (por ejemplo, factor de crecimiento similar a la insulina I), un factor de crecimiento glial (GGF), un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), etc. Se apreciará que en muchos casos estos términos se refieren a una variedad de especies moleculares diferentes. Por ejemplo, se conocen en la técnica varias especies de factor de crecimiento transformante p. Un experto en la técnica se guiará en la selección de un factor de crecimiento apropiado considerando, por ejemplo, el sitio en el que se va a administrar la composición. Por ejemplo, se puede incluir un EGF en composiciones aplicadas a la piel; se puede incluir un NGF y/o GGF en composiciones aplicadas a los nervios o al sistema nervioso; y así sucesivamente.

El factor de crecimiento u otro agente puede ser una sustancia quimiotáctica, que tiene la capacidad, in vivo o en cultivo celular, de reclutar células en un sitio en el que está presente la sustancia. Las células reclutadas pueden tener el potencial de contribuir a la formación de tejido nuevo o de reparar tejido dañado existente (por ejemplo, contribuyendo estructural y/o funcionalmente al tejido (por ejemplo, proporcionando factores de crecimiento o contribuyendo a una respuesta inmune deseable)). Ciertas sustancias quimiotácticas también pueden funcionar como agentes de proliferación (por ejemplo, factores neurotrópicos como NGF o BDNF).

Otros agentes activos adecuados incluyen cianoacrilatos, celulosa oxidada, selladores de fibrina, gel de colágeno, polvo de trombina, polvos de polisacáridos microporosos, factores de coagulación (por ejemplo, factor V, factor VIII, fibrinógeno o protrombina) y polvos de zeolita.

Se entenderá que las moléculas terapéuticas se administran generalmente en una cantidad eficaz con el fin de lograr un resultado clínicamente significativo, y se conocen en la técnica dosis y concentraciones eficaces. Estas dosis y concentraciones pueden guiar la selección de dosis y concentraciones en el presente contexto. Las moléculas bioactivas se pueden proporcionar en una variedad de concentraciones adecuadas y en cantidades adecuadas (por ejemplo, en el intervalo de microgramos o miligramos, o más). Para obtener orientación, se pueden consultar textos como The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Ed. De Goodman y Gilman, y Katzung, Basic and Clinical Pharmacology.

Cuando se administran células a un paciente (por ejemplo, para promover la cicatrización de tejidos), se pueden usar células autólogas. En una realización, las células podrían ser células hematopoyéticas del paciente, dispersas en el material e implantadas. En otra realización, las células pueden ser células de sangre del cordón.

E. Excipientes, portadores y dispositivos

La formulación puede incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones también pueden incluir otros agentes terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico.

En una realización, la formulación se suspende o se disuelve en un disolvente, lo más preferiblemente acuoso, y se aplica como inyección.

Una o más de las composiciones descritas en la presente memoria se pueden ensamblar en kits, junto con instrucciones para su uso. El kit también puede incluir una o más de una jeringa (por ejemplo, una jeringa de barril o una jeringa de perilla), una aguja, una pipeta, gasa, esponjas o algodón, hisopos, un vendaje, un tapón para sangrado nasal, un desinfectante, hilo quirúrgico, tijeras, un bisturí, un fluido estéril, un bote de aerosol, incluidos aquellos en los que se rocía una solución líquida a través de una bomba manual simple, un recipiente estéril o guantes desechables. En una realización, el kit contiene un aplicador que puede dispensar selectivamente varias composiciones que son específicas para diferentes tejidos. Por ejemplo, el dispositivo puede contener varias cámaras, cada una de las cuales contiene una composición de péptidos de autoensamblaje que es específica para un tejido. La composición se puede dispensar directamente en el sitio de administración o se puede mezclar en una cámara de mezcla dentro del dispositivo antes de la administración. En una realización, se puede usar un aplicador para administrar composiciones a los vasos sanguíneos.

II. Procedimientos de uso

A. Matriz extracelular (ECM) y unión estrecha

La matriz extracelular (ECM) es cualquier parte material de un tejido que no forma parte de ninguna célula. La matriz extracelular es la característica definitoria del tejido conectivo. Los componentes principales del ECM son varias glicoproteínas, proteoglicanos y ácido hialurónico. En la mayoría de los animales, las glicoproteínas más abundantes en la ECM son los colágenos. La ECM también contiene muchos otros componentes: proteínas como fibrina, elastina, fibronectinas, lamininas y nidogenos, y minerales como la hidroxiapatita o fluidos como el plasma sanguíneo o el suero con antígenos secretados de flujo libre. Además, secuestra una amplio intervalo de factores de crecimiento celular y actúa como un depósito local para ellos. Los cambios en las condiciones fisiológicas pueden desencadenar actividades de proteasa que provocan la liberación local de dichos depósitos. Esto permite la activación rápida y local de las funciones celulares, sin síntesis de novo. Dada esta diversidad, la ECM puede cumplir muchas funciones, como proporcionar soporte y anclaje para las células, proporcionar una forma de separar los tejidos y regular la comunicación intercelular. El ECM regula el comportamiento dinámico de una celda.

Las uniones estrechas, o zonula occludens, son las áreas estrechamente asociadas de dos células cuyas membranas se unen formando una barrera prácticamente impermeable al líquido. Es un tipo de complejo de unión. Están formados por proteínas claudina y ocludina, uniéndose a los citoesqueletos de la célula adyacente. Las uniones estrechas realizan tres funciones vitales: (1) mantener unidas las células; (2) bloquear el movimiento de las proteínas integrales de la membrana entre las superficies apical y basolateral de la célula, permitir que se conserven las funciones especializadas de cada superficie (por ejemplo, endocitosis mediada por receptores en la superficie apical y exocitosis en la superficie basolateral) y, por tanto, preservar el transporte transcelular; y (3) prevenir el paso de moléculas e iones a través del espacio entre las células, por lo que los materiales deben entrar realmente en las células (por difusión o transporte activo) para pasar a través del tejido. Esta vía proporciona control sobre qué sustancias pueden pasar. (por ejemplo, las uniones estrechas juegan el papel de control en el mantenimiento de la barrera hematoencefálica).

Los trastornos asociados con la fuga de uniones estrechas incluyen sepsis y neurodegeneración. La sepsis es la respuesta sistémica a una infección grave en pacientes críticamente enfermos. La sepsis, el síndrome de sepsis y el shock séptico representan las etapas cada vez más graves de la misma enfermedad. La sepsis severa y el choque séptico ocurren en personas con una enfermedad o trauma preexistente. Si la sepsis no se diagnostica y trata a tiempo, puede volverse autoperpetuosa y las personas mayores, en particular, tienen un mayor riesgo de muerte por sepsis. La sepsis se asocia con un déficit profundo de líquido intravascular debido a vasodilatación, acumulación venosa y fuga capilar. La fluidoterapia tiene como objetivo restaurar el estado del volumen intravascular, la estabilidad hemodinámica y la perfusión de órganos.

La estabilidad circulatoria después de la reanimación con líquidos generalmente se logra en el paciente séptico a expensas de la formación de edema tisular que puede influir significativamente en la función de órganos vitales. El tipo de fluidoterapia, cristaloide o coloide, en la sepsis con fuga capilar sigue siendo un área de intensa y controvertida discusión.

Las formulaciones de péptidos de autoensamblaje se pueden administrar mediante inyección. Las formulaciones de péptidos de autoensamblaje se pueden inyectar usando una jeringa u otros medios de administración adecuados. Las formulaciones de péptidos de autoensamblaje se pueden administrar directamente al tejido usando una jeringa u otros medios de administración mecánicos, por ejemplo, un tubo o un catéter.

Los trastornos neurodegenerativos, como el Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, degradan el sistema nervioso central, lo que resulta en demencia senil y disfunción motora. Actualmente existen medidas preventivas y terapéuticas para la enfermedad de Alzheimer pero no tienen cura. La barrera hematoencefálica es esencial para la actividad neuronal normal y la pérdida de características clave, como las uniones estrechas, puede provocar deterioro neuronal. Las células endoteliales de microvasos que forman la barrera envían señales reguladoras a las células dentro del cerebro, proporcionando instrucciones vitales tanto durante el desarrollo normal del cerebro como posteriormente en la vida adulta. Las conexiones cercanas entre las células endoteliales y circundantes (incluidas la glía y las neuronas diferenciadas, así como las células precursoras neurales no comprometidas) facilitan el intercambio regulador entre las diversas células.

B. Retinopatía diabética

La retinopatía diabética es una retinopatía (daño a la retina) causada por complicaciones de la diabetes mellitus, que eventualmente puede conducir a la ceguera. La retinopatía diabética es el resultado de cambios retinianos microvasculares. La muerte por pericitos inducida por hiperglucemia y el engrosamiento de la membrana basal conducen a la incompetencia de las paredes vasculares. Estos daños cambian la formación de la barrera hematoretiniana y también hacen que los vasos sanguíneos de la retina se vuelvan más permeables.

Los vasos sanguíneos pequeños, como los del ojo, son especialmente vulnerables a un control deficiente del azúcar en sangre. Una sobreacumulación de glucosa y/o fructosa daña los diminutos vasos sanguíneos de la retina. Durante la etapa inicial, llamada retinopatía diabética no proliferativa (NPDR), la mayoría de los pacientes no notan ningún cambio en su visión.

A medida que avanza la enfermedad, la retinopatía diabética no proliferativa grave entra en una etapa avanzada o proliferativa. La falta de oxígeno en la retina hace que crezcan vasos sanguíneos nuevos y frágiles a lo largo de la retina y en el humor vítreo claro y gelatinoso que llena el interior del ojo. Sin un tratamiento oportuno, estos nuevos vasos sanguíneos pueden sangrar, nublar la visión y destruir la retina. La proliferación fibrovascular también puede causar desprendimiento de retina por tracción. Los nuevos vasos sanguíneos también pueden crecer en el ángulo de la cámara anterior del ojo y causar glaucoma neovascular. La retinopatía diabética no proliferativa se manifiesta como manchas algodonosas, anomalías microvasculares o hemorragias retinianas superficiales. Aun así, la retinopatía diabética proliferativa avanzada (PDR) puede permanecer asintomática durante mucho tiempo, por lo que debe controlarse de cerca con chequeos regulares.

En la neuropatía diabética, la ECM estructural en los bordes de los vasos sanguíneos se retira a la célula y, como resultado, los vasos sanguíneos tienen fugas. Se pueden usar materiales de autoensamblaje para reemplazar o complementar la unión estrecha de los vasos sanguíneos en la neuropatía diabética, así como los vasos en el cerebro que también tienen fugas debido a la retracción de las uniones estrechas entre las células. En una realización, el material de autoensamblaje se inyecta en el torrente sanguíneo. Se cree que las composiciones descritas en la presente memoria pueden salvar la brecha entre la ECM estructural en retroceso interactuando con los azúcares de las glicoproteínas en la ECM o integrándose en las membranas dañadas alrededor del sitio de la lesión.

La figura 2 muestra una porción ampliada de un vaso sanguíneo que está perdiendo líquido. Cuando el material de autoensamblaje se administra al sitio de la fuga, el material de autoensamblaje se ensambla alrededor de la proteína estructural rota. El material de autoensamblaje, cuando está completamente ensamblado, atrae las celdas adyacentes entre sí.

C. Refuerzo de las paredes de los recipientes

Las composiciones descritas en la presente memoria también pueden usarse para fortalecer y/o reparar las paredes de los vasos, como en pacientes que padecen venas varicosas. Los materiales también se pueden usar para reforzar las paredes de los vasos en otros órganos o tejidos, como el ojo o el intestino, así como las propias paredes de los órganos. Se pueden agregar plantillas al material de autoensamblaje que permiten el acoplamiento del material de autoensamblaje a los azúcares de la matriz extracelular (ECM) de los vasos sanguíneos para un tejido dado. El material se extiende por todo el sitio de la lesión al acoplarse al ECM y puede volver a unir las paredes de los vasos sanguíneos para detener las fugas. La composición química de las plantillas que se añaden al material de autoensamblaje depende de la composición de ECM de los vasos sanguíneos del tejido a tratar. La ECM para los vasos sanguíneos en el cerebro es diferente de la ECM en los otros órganos, como el hígado, los ojos, el corazón, etc. Un experto en la técnica podrá determinar la plantilla apropiada basándose en el tejido a tratar. Por ejemplo, se pueden agregar ADADAD en exceso a los extremos de los materiales de autoensamblaje. Los fragmentos de ADADAD deben ser complementarios con los azúcares ECM de varios tipos de células. Sin embargo, se pueden diseñar plantillas que sean específicas para un tipo de tejido. Además, pueden añadirse moldes hidrófobos, tales como segmentos de residuos de aminoácidos hidrófobos, a los extremos de los materiales de autoensamblaje, lo que permitiría que los materiales se integraran en el ECM. El andamio de nanofibras autoensamblaje es biocompatible y los productos de degradación, L-aminoácidos en el caso de los péptidos, pueden ser utilizados por las células como bloques de construcción para el crecimiento y la reparación celular.

D. Quemaduras

El manejo adecuado de los fluidos es fundamental para la supervivencia de la víctima de una lesión térmica importante. En la década de 1940, el choque hipovolémico o la insuficiencia renal inducida por choque fue la principal causa de muerte después de una lesión por quemadura. Hoy en día, con el conocimiento actual de los cambios masivos de líquidos y los cambios vasculares que ocurren durante el shock por quemaduras, la mortalidad relacionada con la pérdida de volumen inducida por quemaduras ha disminuido considerablemente. Aunque se ha aplicado un enfoque vigoroso a la fluidoterapia en los últimos 20 años y se están produciendo menos muertes en las primeras 24 a 48 horas posteriores a la quemadura, el hecho es que aproximadamente el 50 % de las muertes ocurren dentro de los primeros 10 días después de la lesión por quemadura por una multitud de causas, una de las más importantes es la terapia inadecuada de reanimación con líquidos. El conocimiento del manejo de líquidos después de la reanimación por choque por quemaduras también es importante y a menudo se pasa por alto en la educación sobre quemaduras.

El shock por quemadura es tanto un shock hipovolémico como un shock celular, y se caracteriza por cambios hemodinámicos específicos que incluyen disminución del gasto cardíaco, líquido extracelular, volumen plasmático y oliguria. Al igual que en el tratamiento de otras formas de shock, el objetivo principal es restaurar y preservar la perfusión tisular para evitar la isquemia. Sin embargo, en el shock por quemaduras, la reanimación se complica por el edema por quemaduras obligatorio, y los voluminosos cambios de líquido transvascular que resultan de una quemadura importante son exclusivos del trauma térmico. Aunque se desconoce la fisiopatología exacta de los cambios vasculares y de fluidos posteriores a la quemadura, un componente importante del choque por quemadura es el aumento de la permeabilidad capilar corporal total. La lesión térmica directa da como resultado cambios marcados en la microcirculación. La mayoría de los cambios ocurren localmente en el sitio de la quemadura, cuando la formación máxima de edema ocurre alrededor de 8-12 horas después de la lesión en quemaduras más pequeñas y 12-24 horas después de la lesión en lesiones térmicas importantes. La tasa de progresión del edema tisular depende de la idoneidad de la reanimación.

La reanimación con líquidos tiene como objetivo ayudar al paciente durante el período inicial de hipovolemia de 24 a 48 horas. El objetivo principal de la terapia es reemplazar el líquido secuestrado como resultado de una lesión térmica. El concepto crítico en el shock por quemaduras es que pueden ocurrir cambios masivos de fluidos aunque el agua corporal total permanezca sin cambios. Lo que realmente cambia es el volumen de cada compartimento de líquido, los volúmenes intracelular e intersticial aumentan a expensas del volumen de plasma y el volumen de sangre.

Está bastante claro que el procedimiento de edema se ve acentuado por el líquido de reanimación. La magnitud del edema se verá afectada por la cantidad y el tipo de líquido administrado. El sumario de consenso de los Institutos Nacionales de Salud sobre la reanimación con líquidos en 1978 no estaba de acuerdo con respecto a una fórmula específica; sin embargo, hubo consenso con respecto a dos cuestiones principales: las pautas utilizadas durante el procedimiento de reanimación y el tipo de líquido utilizado. Con respecto a las guías, el consenso fue dar la menor cantidad de líquido necesaria para mantener una adecuada perfusión de los órganos. El volumen infundido debe titularse continuamente para evitar tanto la subresucitación como la sobrerresucitación. En cuanto al tipo óptimo de líquido, no hay duda de que el reemplazo de la sal extracelular perdida en el tejido quemado y en la célula es esencial para una reanimación exitosa.

Una de las características agudas de la lesión térmica cutánea es la hinchazón del tejido afectado. Esta hinchazón es causada por un desplazamiento de líquido del plasma circulante. Junto con la evolución de la fluidoterapia intravenosa en el trauma y la cirugía, la implementación de dicha terapia para las víctimas de quemaduras ha mejorado la supervivencia. Sin embargo, la generación de edema agravada por la fluidoterapia puede representar una fuente de aumento de la morbilidad. Está bien documentado que se pierde líquido de la circulación hacia el tejido quemado debido a un aumento moderado de la permeabilidad capilar al líquido y las macromoléculas y un aumento moderado de la presión hidrostática dentro de los microvasos de perfusión. Recientemente se descubrió que se desarrolla una presión intersticial muy negativa en la piel lesionada térmicamente. Esta presión constituye una fuerte "succión" que se suma notablemente al efecto generador de edema de aumento de la permeabilidad y presión capilar.

E. Evitar el movimiento de líquidos

Como las composiciones descritas aquí se pueden usar para inhibir el movimiento de una sustancia corporal en un sujeto, incluyendo el movimiento dentro o desde la epidermis, las composiciones pueden emplearse en el contexto de realizar cirugía y pueden describirse como nuevos procedimientos para realizar cirugía o generar un campo quirúrgico. Los procedimientos, ya sea que se realicen en el contexto de una cirugía o no, pueden incluir un paso de identificación de un sujeto que necesite tratamiento y un paso de proporcionar un material estructurado a nano escala, o un precursor de este, en o en las proximidades de un sitio donde ha ocurrido o se espera que ocurra un movimiento no deseado. La cantidad de la composición administrada y la concentración de péptidos que se autoensamblan en la misma pueden ser suficientes para inhibir el movimiento no deseado de una sustancia corporal. Por ejemplo, se puede identificar a un paciente que está a punto de someterse a un procedimiento quirúrgico y proporcionar una composición biocompatible que comprenda péptidos de autoensamblaje y un vasoconstrictor, un agente colorante o un agente anestésico local en un sitio en el que se realizará o se ha realizado una incisión u otra maniobra invasiva. La sustancia corporal que se ve afectada puede ser un líquido como la sangre o un producto sanguíneo, exudado seroso (un exudado asociado a inflamación compuesto principalmente de plasma, que generalmente aparece como un líquido transparente o de color ámbar), pus, jugo gástrico, orina, bilis, líquido cefalorraquídeo (LCR), jugo pancreático y similares. La sustancia corporal puede ser viscosa, similar a un lodo o semisólida, pero generalmente exhibirá una capacidad para fluir o moverse.

Tratamiento y prevención de hemorragias.

Cualquier individuo que tenga un mayor riesgo de sufrir hemorragias indeseables, que pueden o no ser excesivas o poner en peligro la vida de forma inmediata, puede tratarse con las composiciones descritas en la presente memoria. Estos individuos incluyen aquellos con trastornos de la coagulación de la sangre como hemofilia, pacientes que están recibiendo terapia anticoagulante, pacientes que sufren hemorragias nasales recurrentes e individuos que se someten a cirugía, particularmente cirugía mayor o procedimientos que involucran el acceso a una arteria. Sin limitación, la cirugía o procedimiento puede ser una operación en el sistema nervioso, ojo, oído, nariz, boca, faringe, sistema respiratorio, sistema cardiovascular, sistema digestivo, sistema urinario, sistema musculoesquelético, sistema tegumentario (piel) o sistema reproductivo. Como se señaló, las composiciones también se pueden aplicar a tejidos exclusivos de los que definen el sistema nervioso central (es decir, el cerebro y la médula espinal). Los ejemplos específicos de cirugías y procedimientos en los que se pueden usar las composiciones incluyen arteriografía, angiocardiografía, cateterismo cardíaco, reparación de laceración obstétrica, eliminación de obstrucción de arteria coronaria, inserción de una endoprótesis, cesárea, histerectomía, reducción de fractura, injerto de derivación de arteria coronaria, colecistectomía, trasplante de órganos, reemplazo total de articulaciones (por ejemplo, rodilla, cadera, tobillo, hombro), apendicectomía, escisión o destrucción del disco intervertebral, escisión parcial del intestino grueso, mastectomía o prostatectomía. El procedimiento quirúrgico puede implicar la sección intencionada o no intencionada de un vaso sanguíneo o provocar la liberación de una sustancia corporal distinta de la sangre.

Las víctimas de accidentes, las personas que participan en combate y las mujeres que dan a luz también corren el riesgo de sufrir una pérdida significativa de sangre. La hemorragia espontánea, la ruptura de un aneurisma, las várices esofágicas, las úlceras gástricas, las úlceras de la porción superior del intestino (por ejemplo, úlceras duodenales) también son afecciones médicas en las que puede ocurrir una hemorragia considerable, y estas personas también pueden tratarse como se describe aquí.

La fuente precisa del sangrado puede variar y puede ser de cualquier vaso sanguíneo en el sistema arterial o venoso (por ejemplo, una arteria, arteriola, capilar o lecho capilar, vénula o vena). El tamaño del vaso puede variar desde grande (por ejemplo, las composiciones pueden inhibir el sangrado de la aorta, la arteria ilíaca o femoral, o una vena porta) hasta pequeño (por ejemplo, un capilar), y el vaso puede estar ubicado en cualquier parte del cuerpo (por ejemplo, en un órgano sólido como el hígado, el estómago, el intestino, la piel, los músculos, los huesos, los pulmones o el sistema reproductivo).

El tiempo que normalmente se requiere para la coagulación de la sangre puede prolongarse cuando los niveles plasmáticos de factores de coagulación y/o plaquetas son bajos o en casos en los que un individuo ha recibido un anticoagulante (por ejemplo, warfarina o heparina). El sangrado persiste con frecuencia durante mucho más tiempo que el tiempo medio de coagulación cuando hay un daño más que mínimo a la integridad de los vasos sanguíneos. En base a los estudios, se espera que las composiciones provoquen hemostasia en un período de tiempo que sea menor que, y en al menos algunos casos mucho menor, que el tiempo medio de coagulación de la sangre. Aunque las composiciones no se limitan a aquellas que logran la hemostasia en un momento dado (y usos tales como proteger un área de la contaminación o promover la curación del tejido son independientes de esta función), las composiciones pueden conferir un beneficio a un sujeto sangrante en tan solo cinco segundos después de la aplicación. Otras composiciones pueden ejercer un efecto en aproximadamente 10, 15 o 20 segundos después de la aplicación. El período efectivo se puede caracterizar de una manera diferente al tiempo absoluto. Por ejemplo, las composiciones pueden reducir el tiempo necesario para lograr la hemostasia entre un 25 % y un 50 %; entre 50 % y 75 %; o entre 75 % y 100 % en relación con el tiempo requerido cuando se aplica solución salina helada. El tiempo necesario para lograr la hemostasia se puede reducir en aproximadamente 2, 3, 4 o 5 veces en relación con el tiempo necesario cuando se aplica solución salina helada.

La concentración de péptido puede seleccionarse con referencia a variables tales como el calibre del vaso, el grado en que se ha lesionado y la fuerza con la que sale la sangre (o saldría tras la lesión). Serán deseables concentraciones de péptido más altas para promover la hemostasia de un vaso principal (por ejemplo, las arterias aorta, braquiocefálica, carótida, subclavia, celíaca, mesentérica superior, renal, ilíaca, femoral o poplítea). Las concentraciones útiles pueden variar entre aproximadamente 0,1-10 % (por ejemplo, 1-10 %; 0,5-5 %; 1-4 %; 0,1-2 %; 0,1-3 %; 0,1-4 %; 0,1-5 %; y 1-8 % (por ejemplo, aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6 o 7 %). Se puede utilizar cualquier subintervalos, o cualquier valor específico dentro de cualquiera de los intervalos antes mencionados. Las concentraciones mencionadas anteriormente también pueden usarse para las otras indicaciones descritas en la presente memoria.

Como se señaló, el sangrado puede deberse a una gran cantidad de causas diferentes y puede ser interno o externo. Las composiciones se pueden aplicar independientemente de la causa o la naturaleza de la causa (por ejemplo, si está causada por un proceso de enfermedad o un trauma intencional o accidental). Las composiciones se pueden usar para lograr la hemostasia en un espacio confinado (por ejemplo, dentro de un órgano hueco) o en o cerca de la superficie del cuerpo. En ese caso, las composiciones pueden tener múltiples funciones; pueden no solo promover la hemostasia, sino también proteger el tejido herido de los contaminantes y promover la cicatrización del tejido.

Muchos procedimientos médicos implican una punción vascular, que puede ir seguida de un sangrado importante.

Más generalmente, las composiciones que comprenden materiales nanoestructurados o precursores de estos (por ejemplo, péptidos de autoensamblaje) pueden usarse para sellar cualquier paso a través del tejido. Sellar el pasaje puede resultar en hemostasia. El pasaje también puede ser una fístula (es decir, una conexión anormal entre dos órganos o estructuras corporales o entre un órgano o estructura y el mundo externo).

Como las composiciones contienen material biocompatible y biodegradable, se pueden dejar en su lugar, evitando así la necesidad de retirarlas al final del procedimiento y evitando la necesidad de una operación posterior para este fin. Los materiales biodegradables se pueden descomponer física y/o químicamente dentro de las células o dentro del cuerpo de un sujeto (por ejemplo, por hidrólisis en condiciones fisiológicas o por procesos biológicos naturales como la acción de enzimas presentes dentro de las células o dentro del cuerpo) para formar especies químicas más pequeñas que se pueden metabolizar y, opcionalmente, reutilizar y/o excretar o eliminar de otro modo. Preferiblemente, los compuestos biodegradables son biocompatibles.

El sangrado gastrointestinal, que puede ocurrir como consecuencia de úlceras o angiodisplasia, es una condición relativamente común y grave que puede ser fatal si no se trata. Las várices esofágicas sangrantes y las úlceras gástricas o duodenales sangrantes pueden ser particularmente graves. Se han desarrollado varios enfoques terapéuticos endoscópicos para lograr la hemostasia, tales como la inyección de agentes esclerosantes, la unión de dispositivos hemostáticos mecánicos y técnicas de electrocauterización de contacto. El sangrado en la porción distal del intestino grueso, recto o ano (por ejemplo, hemorroides) también puede tratarse de esta manera.

La rotura de un aneurisma puede representar un evento catastrófico con consecuencias rápidamente fatales. Los aneurismas aórticos rotos pueden resultar rápidamente en exanguinación a pesar de la atención médica inmediata. Los aneurismas intracraneales rotos con frecuencia tienen consecuencias devastadoras. Las composiciones y procedimientos de la invención se pueden usar para tratar el sangrado de un aneurisma roto de una manera esencialmente similar a la forma en que se usan para tratar el sangrado debido a otras causas. Dadas las consecuencias a menudo graves de la rotura del aneurisma, a menudo se intenta la reparación quirúrgica. Una vez que el sangrado está mejor controlado, el aneurisma puede repararse utilizando cualquier técnica adecuada. La presencia de la estructura peptídica dentro del saco del aneurisma reduce la posibilidad de fuga o ruptura antes o durante estos otros procedimientos. El andamio se puede dejar en su lugar.

Inhibir el movimiento o la fuga de líquido cefalorraquídeo (LCR)

La duramadre es la membrana fibrosa más externa y resistente que recubre el cerebro y la médula espinal y recubre la superficie interna del cráneo. La fuga de LCR es una complicación importante después de una lesión, cirugía u otros procedimientos en los que se perfora la duramadre, incluida la penetración inadvertida durante la administración de un anestésico en el espacio epidural. Dicha fuga puede provocar secuelas graves, como dolores de cabeza intensos, infecciones y meningitis.

Inhibir la fuga de contenido del tracto gastrointestinal.

El contenido gástrico, que contiene secreciones digestivas de las glándulas del estómago, que consisten principalmente en ácido clorhídrico, mucina y enzimas como la pepsina y la lipasa, pueden causar lesiones y/o infecciones si se liberan en la cavidad peritoneal. La liberación de contenido intestinal en la cavidad peritoneal representa un evento frecuente durante la cirugía en el intestino y también puede ocurrir en casos de perforación intestinal o apéndice roto. El sitio de movimiento puede ser un sitio de daño gástrico o intestinal causado por un proceso patológico o una incisión quirúrgica.

De manera similar, se puede inhibir el movimiento del contenido de otros órganos internos (por ejemplo, órganos en los sistemas biliar o urinario). Por ejemplo, se puede inhibir el movimiento de la bilis, el jugo pancreático (es decir, las secreciones de la porción exocrina del páncreas que contiene enzimas digestivas) u orina y/o descontaminar o limpiar un área en la que se haya liberado bilis, jugo pancreático u orina mediante la aplicación y posterior eliminación de las composiciones en el sitio. Por tanto, los procedimientos tienen una amplia aplicación a las cirugías para reparar o tratar de otro modo defectos del sistema intestinal, biliar y/o urinario.

Cicatrización de la herida

Los estudios también indican que las composiciones tienen la capacidad de mejorar la cicatrización, en particular de una capa epitelial o de un músculo, y por lo tanto pueden administrarse para tratar un sitio de daño tisular. Las composiciones parecen incrementar la tasa de reparación del tejido e inhibir la formación de tejido cicatricial.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen los mismos significados que los entendidos comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la invención divulgada.

Preparación de muestras de microscopía de electrodos de transmisión.

En el cerebro y el hígado de ratas adultas anestesiadas se inyectó 1 % o 2 % de NHS-1 inmediatamente después de hacer un corte y se tomaron muestras del sitio de tratamiento. Las muestras se fijaron en una mezcla de paraformaldehído al 2 % y glutaraldehído al 2,5 % en PB 0,1 M durante 4 horas. Las muestras se lavaron en tampón PB 0,1 M durante 10 min x 3 a 4 °C y se incluyeron en agar al 2 %. Los bloques de agar se fijaron posteriormente en tetróxido de osmio al 1 % durante 2 horas a 4 °C y luego se lavaron en tampón durante 10 min x 3 a 4 °C. Los bloques de muestra se deshidrataron en etanol, se infiltraron y se incrustaron en epon puro con el procesador de tejidos Lynx EM. Se cortaron secciones ultrafinas de 70 nm (ultracorte de Reichert-Jung) y se recogieron en rejillas de malla # 200. Las secciones y rejillas se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo y se examinaron con un microscopio electrónico de transmisión Philip EM208S.

Elaboración de las soluciones de autoensamblaje.

La solución de NHS-1 se preparó utilizando polvo seco sintético RADA16-I (SEQ ID NO: 60) (obtenido del Massachusetts Institute of Technology Center for Cancer Research Biopolymers Lab, Cambridge, MA; el laboratorio Zhang y 3-DMatrix, Cambridge, MA) disuelto en un tubo Eppendorf. La solución de NHS-1 al 1 % se preparó disolviendo 10 mg de RADA16-I (SEQ ID NO: 60) en polvo en 1 ml de agua Milli-Q esterilizada en autoclave (Millipore corp. Billerica, MA), sonicada durante hasta cinco minutos y filtrada. Esto se repitió con 20 mg/ml, 30 mg/ml y 40 mg/ml para producir concentraciones del 2 %, 3 % y 4 %. Los polvos secos NHS-2 y TM-3 (fabricados por el Laboratorio de Biopolímeros de Investigación del Cáncer del Instituto Tecnológico de Massachusetts, Cambridge, MA) se prepararon usando el mismo procedimiento. El tiempo de preparación no afectó la acción de la solución. Parte del material que se preparó (obtenido del laboratorio de Zhang) y se almacenó en solución a temperatura ambiente durante tres años antes de su uso también se probó y se demostró que funciona tan bien como el material recién mezclado.

Los siguientes ejemplos ilustran la naturaleza de autoensamblaje de los péptidos y su capacidad para provocar hemostasis, pero no implican necesariamente la administración a la sangre.

Ejemplo 1: hemostasia en una lesión cerebral

Procedimientos y materiales

Se anestesiaron hámsteres sirios adultos con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg) y se anestesiaron ratas adultas con una inyección intraperitoneal de ketamina (50 mg/kg). Los procedimientos experimentales se adhirieron estrictamente al protocolo aprobado por el Departamento de Salud y avalado por el Comité sobre el Uso de Animales de Laboratorio para la Enseñanza e Investigación de la Universidad de Hong Kong y el Comité de Cuidado Animal del Instituto Tecnológico de Massachusetts.

Los animales se colocaron en un soporte para la cabeza. Se expuso la parte lateral izquierda de la corteza. Cada animal recibió una sección transversal de un vaso sanguíneo que conduce al seno sagital superior (Figura 4a). Con la ayuda de una micropipeta de vidrio estéril, se aplicaron 20 pl de solución de NHS-1 al 1 % en el sitio de la lesión o solución salina helada en los casos de control. Se permitió que los animales sobrevivieran hasta seis meses.

Resultados

Los experimentos iniciales en el cerebro incluyeron la extracción del cráneo suprayacente y la realización de una sección completa de una rama del seno sagital superior en el cerebro de ratas (n = 15) y hámsteres (n = 15) (figura 3A). Las áreas se trataron con 20 pl de solución al 1 % de solución de autoensamblaje RADA16-I (SEQ ID NO: 60) (NHS-1) o con solución salina helada.

En los grupos tratados con NHS-1, la hemostasia se logró en menos de 10 segundos tanto en hámsteres como en ratas (Figura 4a-d). Los hámsteres del grupo de control (n = 5) y las ratas (n = 5) regadas con solución salina, sangraron durante más de 3 minutos (Figura 3A). La prueba t de Student para dos muestras independientes tanto en hámsteres como en ratas mostró diferencias altamente significativas (p <0,0001).

Ejemplo 2: hemostasia en una lesión de la médula espinal

Procedimientos y materiales

Bajo un microscopio quirúrgico, se identificó el segundo segmento de la médula espinal torácica (T2) antes de realizar una laminectomía dorsal en ratas adultas anestesiadas. Después de abrir la duramadre, se realizó una hemisección derecha con un cuchillo de cerámica. Inmediatamente después de la hemisección del cordón, se aplicaron 20 pl de una solución al 1 % de RADA16-I (SEQ ID NO: 60) (NHS-1) al área del corte para el control del sangrado. Los controles recibieron un tratamiento con solución salina. Se permitió que los animales sobrevivieran hasta 8 semanas como parte de otro experimento.

Resultados

Se investigaron el entorno espinal y el entorno cerebral en busca de similitudes o diferencias. El daño secundario causado por la cirugía puede reducirse controlando rápidamente el sangrado. Después de laminectomía y extracción de la duramadre, se hemiseccionó la médula espinal en T2, desde la cara dorsal hasta la ventral y se trató (N = 5) con 20 pl de NHS-1 al 1 %. La hemostasia se logró en 7,6 segundos. En los controles con solución salina (n = 5), tomó una media de 163 segundos detener el sangrado (Figura 3a). La comparación del grupo tratado y los controles de solución salina utilizando la prueba t de Student para dos muestras independientes mostró una diferencia altamente significativa (p <0,0001).

Ejemplo 3: Hemostasia en una herida de la arteria femoral de alta presión

Procedimientos y materiales

Las ratas se colocaron boca arriba y la extremidad trasera se extendió para exponer la cara medial del muslo (Figura 4b). Se extrajo la piel y se cortaron los músculos suprayacentes para exponer la arteria femoral y el nervio ciático. Se cortó la arteria femoral para producir un purgador de alta presión. Con una aguja de calibre 27, se aplicaron 200 pl de solución de RADA16-I al 1 % (SEQ ID NO: 60) (NHS-1) sobre el sitio de la lesión. En dos casos se aplicó polvo en el lugar de la lesión que también funcionó. (Datos no mostrados y no incluidos en el análisis). Los controles se trataron con una combinación de solución salina y presión con un manómetro. Todos los animales fueron sacrificados cuatro horas después del experimento.

Resultados

La arteria femoral de 14 ratas adultas se expuso quirúrgicamente, se seccionó y luego se trató con 200 |jl de solución al 1 % de NHS-1 o solución salina helada y empaquetamiento. Los casos tratados (n = 10) tardaron unos 10 segundos en lograr la hemostasia (figura 3a). Los controles (n = 4) continuaron sangrando durante más de 6 minutos. La diferencia de tiempos para lograr la hemostasia completa fue muy significativa (prueba t de Student p <0,0001).

Ejemplo 4: hemostasia en heridas hepáticas muy vascularizadas

Procedimientos y materiales

Las ratas fueron anestesiadas y colocadas boca arriba y se abrió el abdomen exponiendo el hígado (Figura 4c). El lóbulo izquierdo del hígado se cortó utilizando un bisturí en dirección rostral a caudal separando las dos mitades del lóbulo en el corte sagital. Con una aguja de calibre 27, 100 j l de 1 % o 2 %, de RADA16-I (SEQ ID NO: 60) (NHS-1), RADA-12 (NHS-2) o EAK-16 (TM-3) se aplicó una solución en el lugar de la lesión. Los hígados de los controles se trataron con solución salina o se cauterizaron. La cauterización se realizó utilizando un dispositivo de cauterización térmica y se aplicó a toda la superficie de la lesión. En otro grupo de ratas adultas se siguió el mismo procedimiento para el hígado, que se cortó transversalmente (Figura 4d). Con una aguja de calibre 27, se aplicaron 400 ml de solución al 1 %, 2 %, 3 % o 4 % de NHS-1 o TM-3 en el sitio de la lesión.

TM-3 es un gel más rígido: 1 % de TM-3 tiene una rigidez similar al 3 % de NHS-1. Se probaron tres niveles de concentración diferentes, 1 %, 2 % y 3 % y se encontró que TM-3 no era eficaz a ninguna concentración; el material ensamblado se fracturó y los animales tratados con TM-3 continuaron sangrando independientemente de la concentración utilizada. En realidad, no hubo diferencia significativa entre TM-3 y los controles (figura 3d) para lograr la hemostasia.

En otro grupo de ratas adultas anestesiadas, se expuso el hígado y se realizó una biopsia en punción de 4 mm desde la cara ventral a través del hígado hasta la superficie dorsal del lóbulo hepático izquierdo. El núcleo resultante se extrajo del hígado y se aplicó uno de los tres tratamientos. En un tratamiento, se aplicaron 200 j l de una solución de NHS-1 al 3 % en el lugar de la lesión. En un control se aplicó solución salina al sitio de la lesión. En un segundo control, se cauterizó la superficie lesionada. A continuación, se limpió el material superficial del lugar de la lesión. Se cerró la incisión abdominal y se permitió que los animales sobrevivieran hasta ocho semanas.

En ratones desnudos adultos anestesiados usando precauciones asépticas, se usó un punzón de 4 mm para crear tres heridas en cada lado del lomo del animal. En un lado del animal, las heridas creadas se trataron con una solución de NHS-1 al 1 % y las heridas del lado opuesto se dejaron sin tratar como control. Las biopsias con sacabocados se realizaron en todo el espesor de la piel. Si la herida no sangraba durante diez segundos, el puñetazo se excluiría de los datos analizados. Todos los procedimientos se grabaron en video y el análisis se realizó mediante la revisión de las cintas. Se permitió que los animales sobrevivieran hasta dos meses. Si los animales involucrados en cualquiera de los experimentos anteriores parecían experimentar alguna incomodidad, eran sacrificados.

Resultados

Se realizaron tres cortes de hígado diferentes usando un grupo de 76 ratas 1) Un corte sagital (caudal rostral) corte para explorar NHS en una herida de laceración de forma irregular; 2) un corte transversal (lateral medial) que involucra la sección transversal de una rama principal de la vena porta hepática para intensificar el sangrado; y 3) punzones de 4 mm a través del lóbulo hepático para observar el material en heridas uniformes. En el primer experimento de hígado se realizó un corte sagital en el lóbulo izquierdo (n = 8) y tras el tratamiento de 100 j l de solución de NHS-1 al 1 % el sangrado cesó en menos de 10 segundos. En un grupo de controles (n = 3) el sangrado se detuvo a los 90 segundos (Figura 3a) después de la cauterización de la herida; en los animales de control tratados con solución salina (n = 3) el sangrado continuó durante más de 5 minutos. La comparación del grupo cauterizado y los controles tratados con solución salina muestra una diferencia significativa utilizando la prueba de Tukey con un intervalo de confianza del 99 %.

En el segundo experimento, se cortó una rama principal de la vena porta mientras se realizaba un corte transversal en el lóbulo izquierdo para probar NHS-1 en un entorno de alta tasa de flujo. Se probaron cuatro concentraciones de NHS-1 (n = 12) junto con (n = 4) animales de control. Se aplicaron 400 j l de NHS-1 en concentración al 4 % y el sangrado se detuvo en 11 segundos. La prueba se duplicó con éxito con 400 j l de solución de NHS-1 al 3 % y al 2 %; el sangrado cesó en 10 y 10,3 segundos, respectivamente (figura 3d). Cuando se aplicaron 400 j l de NHS-1 al 1 %, el sangrado continuó durante más de 60 segundos (figura 3d). Sin embargo, los controles sangraron durante más de 6 minutos. La respuesta a la dosis muestra que los resultados del tratamiento con NHS-1 al 3 % y al 4 % son casi los mismos que con la concentración al 2 %. Además, en los casos de tratamiento con concentraciones de 2 %, 3 % y 4 %, se mantuvo la hemostasia completa después de retirar el exceso de material NHS-1 ensamblado. Se encontró que el corte transversal hepático de presión sanguínea/tasa de flujo más alta requería una concentración de NHS-1 al 2 % o más para lograr una hemostasia completa en menos de 15 segundos. Se encontró una diferencia significativa entre los grupos tratados con NHS-1 y los grupos de control utilizando ANOVA. Cuando se comparó cada grupo de tratamiento con el grupo de control, esas diferencias también fueron significativas. No hubo diferencias significativas cuando se compararon las diversas concentraciones de NHS-1, excepto para el grupo de tratamiento con solución de NHS-1 al 1 %.

En el tercer experimento con ratas adultas (n = 45) se perforaron agujeros de 4 mm a través del lóbulo lateral izquierdo y luego se trató el área con NHS-1 al 3 %, solución salina o cauterización térmica para lograr la hemostasia (figura 3b). En el grupo experimental (n = 15) se aplicó una solución de NHS-1 al 3 % después de la lesión y se logró la hemostasia en aproximadamente 10 segundos, mientras que los controles de solución salina (n = 15) tardaron 3,5 minutos en detener el sangrado. En el grupo de control de cauterización térmica (n = 15), el cese de la hemorragia tomó más de 60 segundos, incluida la aplicación de calor para cauterizar la superficie interior del punzón. Se permitió que los animales tratados con NHS-1 sobrevivieran hasta 6 meses sin ningún efecto perjudicial sobre los tejidos. Usando ANOVA hubo una diferencia significativa entre el tratamiento con NHS-1 al 3 % y los controles (p <0,0001). Además, la prueba de Tukey mostró que cada grupo era significativamente diferente del otro con un intervalo de confianza del 99 %.

Ejemplo 5: Hemostasia en biopsias cutáneas con punción

Se realizaron seis biopsias con punción de 4 mm en el lomo de ratones desnudos adultos anestesiados (n = 23) para un total de 138 punciones en la piel. Se trataron tres punzones con una solución de NHS-1 al 1 % y los otros tres se dejaron sin tratar, excepto por frotar con algodón cada 15 segundos hasta que se detuvo el sangrado. Las heridas perforadas que sangraron durante menos de 10 segundos se excluyeron del experimento. Se aplicó una solución de NHS-1 al 1 % diez segundos después de la lesión (n = 23) y la hemostasia tomó menos de 10 segundos; los controles (n = 23) continuaron sangrando durante más de 60 segundos (Figura 3c). Los tiempos de sangrado se promediaron para cada lado del animal y la prueba t de Student para muestras apareadas mostró una diferencia significativa entre el lado de tratamiento y el de control del animal (p <0,0001).

Ejemplo 6: Comparación de tres materiales diferentes

Para obtener más información sobre las propiedades hemostáticas y el mecanismo de acción de NHS-1 (RADA-16) (SEQ ID NO: 60), Se repitieron los experimentos de hígado tanto sagital como transversal, comparándolos con dos materiales adicionales que se sabe que se autoensamblan y forman nanofibras espontáneamente: 1) RADA-12 (NHS-2), una variación de secuencia de NHS-1 y 2) EAK-16 (TM-3), una secuencia diferente en la misma familia de péptidos de autoensamblaje que se usa para determinar si la longitud y rigidez del material alteraron su efectividad hemostática en modelos de sangrado.

Realización de un corte de hígado sagital en ratas adultas (n = 9) Se aplicaron 100 pl de solución de NHS-2 al 2 % a la herida y el sangrado se detuvo en menos de 10 segundos. En los controles (n = 3) de cauterización el sangrado continuó durante más de 90 segundos (p <0,0001). Repitiendo el experimento en ratas adultas (n = 8) usando 100 pl de TM-3 al 2 %, el material ensamblado pero no logró la hemostasia; los animales continuaron sangrando hasta que el experimento terminó después de más de 3 minutos.

El aumento del flujo sanguíneo de la vena porta después de realizar un corte hepático transversal permitió la realización de otro experimento de respuesta a la dosis en el que se pudieron comparar varias concentraciones de NHS-1 (1 % a 4 %) y TM-3 (1 % a 3 %) con controles (figura 3d). Todas las concentraciones de NHS-1 fueron eficaces; sin embargo, la presión arterial y la tasa de flujo más altas después del corte transversal del hígado requirieron una concentración del 2 % o más de NHS-1 para detener el sangrado en menos de 15 segundos.

Ejemplo 7: Interfaz de NHS-1 y tejidos

Aun buscando pistas sobre el mecanismo, así como una mayor comprensión de la relación de la interfaz sangre/tejido NHS-1 tanto en el cerebro como en el hígado, los tejidos tratados se examinaron bajo el microscopio electrónico de transmisión (TEM), para determinar cómo interactúan los glóbulos rojos (RBC), las plaquetas, el tejido y el ECM con el material.

Se aplicó una solución de NHS-1 al 1 % a una herida del hígado y el tejido se recogió inmediatamente. En la micrografía electrónica, el hepatocito y los glóbulos rojos parecen estar intactos con el NHS-1 ensamblado en la interfaz. Cuando se aplicó poco después de la lesión, el material pareció detener el movimiento de la sangre de los vasos sin efectos perjudiciales para los glóbulos rojos del hígado; tampoco hubo evidencia de lisis. Además, no hubo evidencia de agregación plaquetaria en la interfaz sangre/NHS-1 cuando se tomaron muestras en varios momentos después del tratamiento.

Se encontró una interacción muy estrecha entre NHS-1 y el tejido neural en el cerebro. No se observaron glóbulos rojos ni evidencia de agregación plaquetaria en el NHS-1 ensamblado. Los glóbulos rojos que estaban presentes parecían intactos en los bordes del NHS-1 ensamblado sin evidencia de lisis. Además, no se observó evidencia de trombos en el cerebro, pulmón o hígado de los animales tratados con NHS-1 y NHS-2.

NHS-1 y NHS-2 son sintéticos, biodegradables y no contienen hemoderivados, colágenos o contaminantes biológicos que puedan estar presentes en agentes hemostáticos de origen humano o animal, como el pegamento de fibrina. Se pueden aplicar directamente sobre o dentro de una herida sin preocuparse de que el material se expanda, lo que reduce el problema del daño tisular secundario, así como los problemas causados por el flujo sanguíneo restringido. En nuestros estudios cerebrales se investigó la evidencia de la producción de sustancias similares a priones u ovillos de fibrillas en animales que tenían el material implantado en su cerebro durante hasta seis meses. No se encontró ninguno. Además, los productos de degradación del NHS-1 son aminoácidos que pueden usarse como bloques de construcción de tejidos para la reparación de la lesión. Las pruebas de terceros independientes del material no encontraron pirogenicidad, que se ha encontrado con algunos otros agentes hemostáticos, ni coagulación sistémica u otros problemas de seguridad en animales. Estos datos demuestran que la hemostasia se puede lograr en menos de 15 segundos en múltiples tejidos, así como en una variedad de heridas diferentes.

Las soluciones NHS-1 y NHS-2 se rellenaron fácilmente y se adaptaron a las formas irregulares de las heridas antes de ensamblarse, como se muestra en las micrografías electrónicas. Se cree que este estrecho contacto juega un papel en la acción hemostática debido al tamaño de las unidades peptídicas autoensambladas. Las micrografías también mostraron que el material no hace que los glóbulos rojos se lisen, lo que los protege de la degradación normal cuando se exponen al aire.

La hemostasia observada no se puede explicar por la cinética de gelificación. Uno pensaría que un gel más rígido sería más efectivo para personas que sangran con mayor presión; sin embargo, se encontró que lo contrario era cierto. TM-3, que pertenece a la misma familia de péptidos que NHS-1 y NHS-2, y es el más rígido de los tres péptidos de autoensamblaje probados, no detuvo el sangrado; se fracturó en la interfaz del tejido y dentro del gel resultante. TM-3 puede haberse fracturado debido a 1) las pulsaciones del hígado y 2) la incapacidad del material para flexionarse con el tejido a medida que la sangre bombea a través del órgano. Esto es similar a la fractura de una arteria cuando se cultiva en un entorno de flujo laminar y luego se trasplanta a un entorno pulsado. Las células se alinean a lo largo de la dirección del flujo, a diferencia de la espiral helicoidal natural 36-39 que se ve en un entorno pulsado, que permite la expansión y contracción, sin dividirse, a medida que la sangre se mueve a través de la arteria. Por el contrario, NHS-1 y NHS-2 pudieron flexionarse con el tejido.

Finalmente, NHS-2, el menos rígido de los tres materiales, pareció funcionar igual que NHS-1, probablemente debido a su estructura y módulo similares.

Con este descubrimiento, la velocidad de la hemostasia cambiará fundamentalmente la cantidad de sangre necesaria durante la cirugía del futuro. Se puede dedicar hasta el 50 % del tiempo quirúrgico a taponar las heridas para reducir o controlar el sangrado. Las soluciones del NHS pueden representar un cambio radical en la tecnología y podrían revolucionar el control del sangrado durante la cirugía y el trauma; sin embargo, deben ser probados clínicamente para su uso en humanos.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación que comprende una cantidad eficaz de péptidos que se autoensamblan para formar una estructura de barrera para prevenir o limitar el movimiento de fluidos corporales;

en el que los péptidos de autoensamblaje tienen una longitud de 8 a 16 residuos de aminoácidos y comprenden una secuencia que se ajusta a una o más de las Fórmula I-IV:

((Xaaneu-Xaa+)x(Xaaneu-Xaa-)y)n (I)

((Xaaneu-Xaa-)x(Xaaneu-Xaa+)y)n (II)

((Xaa+-Xaaneu)x(Xaa--Xaaneu)y)n (III)

((Xaa--Xaaneu)x(Xaa+-Xaaneu)y)n (IV)

en las que cada Xaaneu es un residuo de aminoácido seleccionado de alanina, leucina, isoleucina, fenilalanina o tirosina; Xaa+ es arginina o lisina; Xaa' es ácido aspártico o ácido glutámico; x e y son números enteros que tienen un valor de 1, 2, 3 o 4, independientemente; y n es un número entero que tiene un valor de 1-4;

para su uso en un procedimiento para el tratamiento de trastornos que implican uniones estrechas con fugas o dañadas o una matriz extracelular débil, enferma o lesionada que comprende administrar la formulación como un líquido en el torrente sanguíneo de un sujeto que lo necesite.

2. La formulación para su uso de la reivindicación 1, en la que la cantidad de péptidos de autoensamblaje eficaz para prevenir o limitar el movimiento de los fluidos corporales está entre 1 % peso a volumen y 4 % peso a volumen.

3. La formulación para su uso de la reivindicación 1 o 2, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable para la administración en el cuerpo.

4. La formulación para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que los péptidos de autoensamblaje comprenden una secuencia de residuos de aminoácidos que se ajustan a la Fórmula III o la Fórmula IV.

5. La formulación para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que Xaaneu representa alanina o leucina.

6. La formulación para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que los péptidos de autoensamblaje comprenden la secuencia de aminoácidos RADARADARADARADA (SEQ ID No. 60).

7. La formulación para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que los péptidos de autoensamblaje comprenden además un componente específico de tejido.

8. La formulación para su uso de la reivindicación 7, en la que el componente específico de tejido comprende un oligosacárido.

9. La formulación para su uso de la reivindicación 8, en la que el oligosacárido comprende moléculas de azúcar de origen natural.

10. La formulación para su uso de la reivindicación 7, en la que el componente específico de tejido comprende un péptido hidrófobo, un péptido hidrófilo o combinaciones de los mismos.

11. La formulación para su uso de la reivindicación 10, en la que el péptido hidrófobo comprende 5 residuos de aminoácidos naturales idénticos.

12. La formulación para su uso de la reivindicación 1 o 2, en la que uno o más de los péptidos de autoensamblaje comprenden uno o más sitios de escisión de proteasa o peptidasa.

13. La formulación para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en el tratamiento de la sepsis o retinopatía diabética.

14. La formulación para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en el tratamiento y soporte de paredes de vasos sanguíneos, venas o arterias.

15. La formulación para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende además un agente terapéutico, profiláctico o de diagnóstico.

16. La formulación para su uso de la reivindicación 15, en la que el agente terapéutico o profiláctico se selecciona del grupo que consiste en un vasoconstrictor, un agente anestésico, un agente antimicrobiano, colágeno, un agente antiinflamatorio, un factor de crecimiento o un nutriente.

17. La formulación para su uso de la reivindicación 15, en la que el agente de diagnóstico es un agente colorante.