WO2015053338A1 - カチオン性ペプチドおよびそれを含む医薬組成物 - Google Patents

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peptide
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猛 和田
雄介 前田
隆徳 横田
一隆 仁科
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学校法人東京理科大学
国立大学法人東京医科歯科大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention relates to a cationic peptide and a pharmaceutical composition containing the same.
  • the cationic peptide is in particular a nucleic acid duplex-binding ⁇ -turn- ⁇ cationic peptide.
  • a nucleic acid binding molecule is a molecule useful for improving the stability of a nucleic acid drug in vivo. In order to express the activity of a nucleic acid drug in vivo, ON of the binding of the nucleic acid drug molecule to the nucleic acid drug, It is necessary to control OFF.
  • nucleic acid binding molecules is a cationic peptide, and when a cationic peptide binds to dsRNA, it is known to induce ⁇ -structure and bind.
  • ⁇ -structured peptides that bind to nucleic acid duplexes, see R. Iwata, M. Sudo, K. Nagafuji, T. Wada, J. Org. Chem., 2011, 76, 5895-5906, and Y. Maeda, R. Iwata, T. Wada, Bioorg. Med. Chem., 2013, 21, 1717-1723.
  • a cationic peptide having a higher order structure suitable for binding of nucleic acid duplexes, stably binding to nucleic acid duplexes, and having good thermal stability of binding has not yet been provided.
  • an object of the present invention is to provide a cationic peptide having a higher order structure suitable for binding of nucleic acid duplexes, stably binding to nucleic acid duplexes, and having good thermal stability of binding. It is to provide. It is another object of the present invention to provide a nucleic acid medicine using the peptide of the present invention.
  • a cationic peptide comprising an amino acid sequence represented by the following formula (1).
  • Z is an amino acid residue selected from the group consisting of 2,3-diaminopropionic acid (Dap), 2,4-diaminobutyric acid (Dab), ornithine (Orn), and lysine (Lys).
  • a is 1 or more and 10 or less
  • c is 2 or more and 8 or less
  • e is 1 or more and 10 or less.
  • the amino acid sequence represented by the formula (1) is Tyr-Gly-Gly-Cys- (Z / Val) 3 -Pro-Pro- (Z / Val) 3 -Cys, [1] or The cationic peptide according to [4].
  • [Z represents an amino acid residue selected from the group consisting of 2,3-diaminopropionic acid (Dap), 2,4-diaminobutyric acid (Dab), ornithine (Orn) and lysine (Lys).
  • Z / Val on both sides of Pro each independently represents Z-Val or Val-Z.
  • Z is an amino acid residue selected from the group consisting of 2,3-diaminopropionic acid (Dap), 2,4-diaminobutyric acid (Dab), ornithine (Orn), and lysine (Lys).
  • a is 1 or more and 10 or less
  • c is 2 or more and 8 or less
  • e is 1 or more and 10 or less
  • [6] or [7] The cationic peptide according to 1.
  • [9] In the amino acid sequence represented by the formula (1), [X 2 ] c is Pro-Pro, one of the two Pros is D-form, and the other is L-form, [6 ] The cationic peptide according to any one of [8] to [8].
  • the amino acid sequence represented by the formula (2) is Tyr-Gly-Gly- (Z / Val) 3 -Pro-Pro- (Z / Val) 3
  • [Z represents an amino acid residue selected from the group consisting of 2,3-diaminopropionic acid (Dap), 2,4-diaminobutyric acid (Dab), ornithine (Orn) and lysine (Lys).
  • Z / Val on both sides of Pro each independently represents Z-Val or Val-Z.
  • a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid having therapeutic activity and the cationic peptide according to any one of [1] to [10].
  • a nucleic acid medicine using the peptide of the present invention is also provided.
  • FIG. 3 is a diagram showing a CD spectrum of a cationic peptide in Example 1.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of fluorescence anisotropy measurement of a cationic peptide-nucleic acid complex in Example 2.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of measurement of fluorescence anisotropy of DapV-nucleic acid complex in Example 2.
  • FIG. 4 is a view showing a UV melting profile at 260 nm of the cationic peptide-nucleic acid complex in Example 3.
  • the term “process” is not limited to an independent process, and is included in this term if the intended purpose of the process is achieved even when it cannot be clearly distinguished from other processes. .
  • a numerical range indicated by using “to” indicates a range including the numerical values described before and after “to” as the minimum value and the maximum value, respectively.
  • the amount of each component in the composition is the total amount of the plurality of substances present in the composition unless there is a specific indication when there are a plurality of substances corresponding to each component in the composition. Means.
  • an amino acid residue in an amino acid sequence is represented by a one-letter code (for example, “G” for a glycine residue) or a three-letter code (for example, “Gly” for a glycine residue) well known in the art.
  • D and L when added to the amino acid residues in the amino acid sequence, they represent D-amino acid and L-amino acid, respectively.
  • “%” relating to amino acid sequences of peptides and polypeptides is based on the number of amino acid residues unless otherwise specified.
  • RNA interference drugs have attracted attention as new therapeutic drugs.
  • RNA interference drugs have low membrane permeability and are not fully effective due to intracellular instability. Therefore, in order to put RNA interference drugs into practical use, it is necessary to construct a new drug delivery system (DDS) for small interfering RNA (siRNA) drugs.
  • DDS drug delivery system
  • the inventors of the present application synthesized oligodiaminosaccharides and oligocationic peptides having the ability to bind to nucleic acid duplexes with the aim of developing DDS. From the results of these studies, we have discovered that regular arrangement of positive charges can be an important element of complex formation. Specifically, a peptide having an amino group as a positively charged functional group was designed. A 12-mer dsRNA r (CGCGGAAUUCCGG) 2 duplex was targeted, and 4 phosphate groups located in the major groove were targeted, and as shown in Reference Example 1, a + 8-valent peptide was designed.
  • a peptide (Ac-Tyr-Gly-Gly-Dab 8 -NH 2 ) having 8 consecutive (S) -2,4-diaminobutyric acids (hereinafter referred to as “Dab8 peptide”) is dsRNA.
  • Dab8 peptide a peptide having 8 consecutive (S) -2,4-diaminobutyric acids
  • the inventors of the present application focused on a ⁇ hairpin secondary structure in which cationic functional groups are regularly arranged.
  • a series of peptides were designed and synthesized, and their ability to bind to nucleic acid duplexes was examined.
  • the inventors focused on ⁇ -hairpin peptides in the synthesis of peptides that bind to nucleic acid duplexes.
  • One embodiment is an artificial peptide consisting of an alternating sequence of valine (Val) and an amino acid having an amino group, linked by a proline dimer ( -D Pro- L Pro-) as a bending member.
  • a proline dimer -D Pro- L Pro-
  • the present inventors aimed to obtain peptides that control the binding to nucleic acid duplexes by changing the secondary structure due to environmental differences inside and outside the cells. It is known that when a cationic peptide binds to dsRNA, it binds by inducing a ⁇ structure. Thus, the present inventors aimed to design a peptide that efficiently binds to an RNA duplex by pre-establishing a secondary structure.
  • the following cationic peptides having a cyclic ⁇ -turn- ⁇ structure were designed using alternating sequences of hydrophilic and hydrophobic amino acids and disulfide bonds. Since the disulfide bond is cleaved in the reducing environment in the cell, the ring structure opens and the degree of freedom of the structure increases, so the secondary structure is considered to change inside and outside the cell.
  • Dap (S) -2,3-diaminopropionic acid
  • Dab (S) -2,4-diaminobutyric acid
  • Orn L-ornithine Lys: L-lysine
  • Dap / Val on both sides of two Pros independently represent Dap-Val or Val-Dap. That is, in the case of Dap-Val, a repeating structure of (Dap-Val) 3 is obtained, and in the case of Val-Dap, a repeating structure of (Val-Dap) 3 is obtained.
  • -Pro-Pro- may be -D Pro- L Pro-, which represents D-form proline and L-form proline, respectively.
  • the terminal of the amino acid sequence is modified and neutralized.
  • the N-terminal is preferably acetylated and the C-terminal is aminated.
  • Preferred specific examples A1 to D1 of peptides A to D are shown below.
  • peptides E to H (DapV, DabV, OrnV, LysV) shown below having no cysteine and no disulfide bond, corresponding to the state of ring opening in cells, were designed.
  • DapV (E1) showed a spectrum peculiar to the ⁇ structure, whereas other peptides, DabV (F1), OrnV (G1), and LysV (H1) showed a random coil-dominated spectrum. From this, it is clear that DapV (E1) maintains a ⁇ structure even when it does not have a disulfide bond, whereas other peptides have a structure for a random coil when they do not have a disulfide bond. It became.
  • extracellular cDabV (peptide B), cOrnV (peptide C), and cLysV (peptide D) have a cyclic ⁇ -turn- ⁇ structure and are bound to nucleic acid duplexes, but each cell has DabV ( Peptides F), OrnV (peptide G), and LysV (peptide H) were found to be immediately dissociated from the nucleic acid.
  • DabV Peptides F
  • OrnV peptide G
  • LysV peptide H
  • cDabV (peptide B), cOrnV (peptide C), and cLysV (peptide D) were able to control the binding of nucleic acid drug molecules to nucleic acid drugs, and control of OFF, and were found to be advantageous for DDS. .
  • cDapV (peptide A) can be used as DDS because it does not dissociate from the nucleic acid even when it becomes DapV (peptide E) in the cell, and can dissociate the nucleic acid according to further environmental changes.
  • the cationic peptide of the present invention can be used for the stabilization and delivery of a medical field (particularly therapeutic use), in particular, a nucleic acid drug (for example, siRNA).
  • a nucleic acid drug for example, siRNA
  • a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid having therapeutic activity (for example, siRNA) and the cationic peptide of the present invention can be provided, and the pharmaceutical composition can be provided to a subject in need of treatment.
  • a method of treatment can be provided comprising administering.
  • a nucleic acid having therapeutic activity eg, siRNA
  • the cationic peptide of the present invention in the manufacture of a nucleic acid medicament.
  • the cationic peptide of the present invention having a disulfide bond is rapidly cleaved after being taken into the cell to become a chain peptide, and the bound nucleic acid drug is released into the cell in response to changes in the environment. I can play.
  • the cationic peptide of the present invention has a higher-order structure suitable for binding of nucleic acid duplexes, and thus stably binds to nucleic acid duplexes and has good thermal stability of binding. For this reason, the nucleic acid medicine using the cationic peptide of the present invention has stable pharmacokinetics and high thermal stability.
  • the cationic peptide of the present invention having a disulfide bond takes a cyclic structure and a ⁇ -hairpin structure outside the cell, but in the cell, the disulfide bond is cleaved to change to a chain peptide, and the structure changes to a random coil. .
  • the entropy is disadvantageous, so that the binding force to the nucleic acid duplex is reduced and the peptide is dissociated. It is done.
  • 1st aspect of this invention is a cationic peptide which consists of an amino acid sequence represented by following formula (1).
  • Z represents an amino acid residue selected from the group consisting of 2,3-diaminopropionic acid (Dap), 2,4-diaminobutyric acid (Dab), ornithine (Orn), and lysine (Lys).
  • Z / Val on both sides of [X 2 ] c each independently represents Z-Val or Val-Z
  • a X 1 each independently represents any amino acid residue
  • c X 2 is Each independently represents any amino acid residue
  • e X 3 each independently represents any amino acid residue
  • a represents 0 or an integer of 1 or more
  • c represents 0 or an integer of 1 or more
  • b represents an integer of 1 or more
  • d represents an integer of 1 or more.
  • X 1 may be any amino acid residue as long as the hairpin structure of the peptide is not hindered.
  • Tyr or Gly is preferable.
  • [X 1 ] a is preferably, for example, Tyr-Gly-Gly.
  • X 2 is preferably an amino acid capable of forming a hairpin structure, for example, Pro.
  • [X 2 ] c is preferably, for example, Pro-Pro.
  • X 3 may be any amino acid as long as the hairpin structure of the peptide is not hindered, and is preferably Tyr or Gly, for example.
  • [X 3 ] e is preferably, for example, Gly-Gly-Tyr.
  • X 1 , X 2 and X 3 are preferably amino acids that are not cysteine.
  • b is preferably 2 or more, and d is preferably 2 or more.
  • b and d can be appropriately selected depending on the base length of dsRNA used in medicine, but b is preferably 11 or less, and d is 11 or less.
  • b and d are preferably the same, and b and d are preferably 3.
  • a is preferably 1 to 10, and more preferably 1 to 6.
  • e is preferably from 1 to 10, and more preferably from 1 to 6.
  • c is not particularly limited as long as [X 2 ] c can form a hairpin structure, but is preferably 2 to 8, and more preferably 2 to 4.
  • Examples of the cationic peptide of the present invention represented by the formula (1) include Tyr-Gly-Gly-Cys- (Dap / Val) 3 -Pro-Pro- (Dap / Val) 3 -Cys (SEQ ID NO: 1).
  • -Pro-Pro- in peptides A to D is preferably such that one of the two Pros is D-form and the other is L-form.
  • the cationic peptide of the present invention has an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4, and Peptides that retain the ability to bind heavy chains are included.
  • the number of amino acid residues that are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 is preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and still more preferably. One or two.
  • the cationic peptide of the present invention has, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, more than the entire amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • Peptides having a sequence identity of preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more, and having the ability to bind to a nucleic acid duplex are included.
  • the second aspect of the present invention is a cationic peptide consisting of an amino acid sequence represented by the following formula (2).
  • Z represents an amino acid residue selected from the group consisting of 2,3-diaminopropionic acid (Dap), 2,4-diaminobutyric acid (Dab), ornithine (Orn), and lysine (Lys).
  • Z / Val on both sides of [X 2 ] c each independently represents Z-Val or Val-Z
  • a X 1 each independently represents any amino acid residue
  • c X 2 is Each independently represents any amino acid residue
  • e X 3 each independently represents any amino acid residue
  • a represents 0 or an integer of 1 or more
  • c represents 0 or an integer of 1 or more
  • b represents an integer of 1 or more
  • d represents an integer of 1 or more.
  • Preferred ranges of a, b, c, d, and e in the formula (2) are the same as those in the formula (1).
  • the preferable aspect of X ⁇ 1 >, X ⁇ 2 >, X ⁇ 3 > in Formula (2) is the same as that in the case of Formula (1).
  • the cationic peptide of the present invention represented by the formula (2) includes a cation represented by Tyr-Gly-Gly- (Dap / Val) 3 -Pro-Pro- (Dap / Val) 3 (SEQ ID NO: 5) Peptide (peptide E), cationic peptide (peptide F) represented by Tyr-Gly-Gly- (Dab / Val) 3 -Pro-Pro- (Dab / Val) 3 (SEQ ID NO: 6), Tyr-Gly -Gly- (Orn / Val) 3 -Pro-Pro- (Orn / Val) 3 (SEQ ID NO: 7) and a cationic peptide (peptide G) and Tyr-Gly-Gly- (Lys / Val) 3-
  • the cationic peptide (peptide H) represented by Pro-Pro- (Lys / Val) 3 (SEQ ID NO: 8) is preferred.
  • -Pro-Pro- in peptides E to H is preferably such that one of the two Pros is D-form and the other is L-form.
  • the cationic peptide of the present invention has an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 5 to 8, and Peptides that retain the ability to bind heavy chains are included.
  • the number of amino acid residues that are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 5 to 8 is preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and still more preferably. One or two.
  • the cationic peptide of the present invention has, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, more than the entire amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 5 to 8.
  • Peptides having a sequence identity of preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more, and having the ability to bind to a nucleic acid duplex are included.
  • RNA labeled with fluorescein by reacting FITC at the 5 ′ end was used as a fluorescent group label.
  • An aqueous solution of fluorescent group-labeled RNA (10 mM phosphate buffer, 100 mM NaCl (pH 7.0)) was annealed, and final concentration was 0.1 ⁇ m 3 ml (10 mM phosphate buffer, 100 mM NaCl (pH 7.0)).
  • Example 1 Design of secondary structure of cationic peptide
  • peptides E1 to H1 shown below were designed and synthesized by the method described above. These are peptides composed of an alternating sequence of amino acids having a valine (Val) and an amino group, linked by a proline dimer ( -D Pro- L Pro-) as a bending member.
  • L-lysine (Lys), L-ornithine (Orn), (S) -2,4-diaminobutyric acid (Dab) and (S) -2,3-diaminopropionic acid (Dap) Selected.
  • the octamer cationic oligopeptide consisting of Dab can bind to the major groove of the A-type RNA / RNA double helix dodecamer.
  • all protonated amino groups of the peptide form hydrogen bonds with the double-chain phosphate anion. It is expected that the ⁇ hairpin peptide interacts with the RNA / RNA duplex.
  • Dap (S) -2,3-diaminopropionic acid
  • Dab (S) -2,4-diaminobutyric acid
  • Orn L-ornithine Lys: L-lysine
  • the secondary structures of peptides having different side chain lengths of the peptides E1 to H1 were analyzed.
  • the secondary structures of peptides E1 to H1 in the phosphate buffer were confirmed by CD spectra (results are shown in FIG. 2).
  • the measurement conditions for the CD spectrum are 50 ⁇ M peptide, 20 ° C., 10 mM phosphate buffer, 100 mM NaCl, as described above.
  • DapV (peptide E1) showed a spectrum peculiar to the ⁇ sheet structure, whereas other peptides showed a spectrum predominating in random coils.
  • Example 2 Evaluation of binding ability between cationic peptide and dsRNA Subsequently, the binding between the cationic peptides E1 to H1 and dsRNA (Fluorescein-r (CGGCGAAUUCCG)) 2 was evaluated by fluorescence anisotropy measurement. When the peptide was added dropwise to dsRNA and the change in fluorescence anisotropy was plotted, only DapV (peptide E1) showed a significant change in fluorescence anisotropy (results shown in FIGS. 3 and 4). Other peptides showed no change.
  • the measurement conditions are 0.1 ⁇ M RNA / RNA aqueous solution (10 mM phosphate buffer, 100 mM NaCl (pH 7.0)). From this result, it was confirmed that only DapV having a ⁇ -turn- ⁇ structure was bound to dsRNA.
  • RNA duplex A series of peptides were designed and evaluated for the effects of secondary structure, including ⁇ -hairpin structure, on peptide-nucleic acid duplex interactions. Only DapV (peptide E1) was confirmed to form a ⁇ hairpin structure and bind to the RNA duplex. From this result, it was found that the binding ability to the RNA duplex can be controlled by the specific secondary structure of the oligopeptide.

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Abstract

　下記式（１）で表されるアミノ酸配列からなるカチオン性ペプチド、及び、下記式（２）で表されるアミノ酸配列からなるカチオン性ペプチド。　［Ｘ１］ａ－Ｃｙｓ－（Ｚ／Ｖａｌ）ｂ－［Ｘ２］ｃ－（Ｚ／Ｖａｌ）ｄ－Ｃｙｓ－［Ｘ３］e　・・・式（１）　［Ｘ１］ａ－（Ｚ／Ｖａｌ）ｂ－［Ｘ２］ｃ－（Ｚ／Ｖａｌ）ｄ－［Ｘ３］e　・・・式（２）　［式（１）及び（２）において、Ｚは、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、オルニチン（Ｏｒｎ）及びリシン（Ｌｙｓ）からなる群から選択されるアミノ酸残基を表し、［Ｘ２］ｃの両隣のＺ／Ｖａｌは各々独立にＺ－ＶａｌまたはＶａｌ－Ｚを表し、ａ個のＸ１はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ｃ個のＸ２はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ｅ個のＸ３はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ａは０又は１以上の整数を表し、ｃは０又は１以上の整数を表し、ｂは１以上の整数を表し、ｄは１以上の整数を表す。］

Description

カチオン性ペプチドおよびそれを含む医薬組成物
　本発明は、カチオン性ペプチドおよびそれを含む医薬組成物に関する。カチオン性ペプチドは、特に核酸二重鎖結合性β－ｔｕｒｎ－βカチオン性ペプチドである。
　核酸結合分子は核酸医薬の生体内での安定性を向上させるうえで有用な分子であるが、生体内で核酸医薬の活性を発現させるためには、核酸医薬に対する核酸医薬分子の結合のＯＮ、 ＯＦＦ を制御することが必要となる。
　核酸結合分子の一つに、カチオン性ペプチドがあり、ｄｓＲＮＡ にカチオン性ペプチドが結合する際、β-構造を誘起して結合することが知られている。核酸二重鎖に結合するβ-構造ペプチドの合成及び特性について、R. Iwata, M. Sudo, K. Nagafuji, T. Wada, J. Org. Chem., 2011, 76, 5895-5906、及び、 Y. Maeda, R. Iwata, T. Wada, Bioorg. Med. Chem., 2013, 21, 1717-1723、が報告している。
　しかしながら、核酸二重鎖が結合するのに適した高次構造を有し、核酸二重鎖と安定して結合し、結合の熱安定性も良好であるカチオン性ペプチドは未だ提供されていない。
　したがって、本発明の目的は、核酸二重鎖が結合するのに適した高次構造を有し、核酸二重鎖と安定して結合し、結合の熱安定性も良好であるカチオン性ペプチドを提供することにある。
　本発明の目的はさらに、本発明のペプチドを用いた核酸医薬を提供することにある。
　本発明は以下のとおりである。
　［１］　下記式（１）で表されるアミノ酸配列からなるカチオン性ペプチド。
　［Ｘ１］ａ－Ｃｙｓ－（Ｚ／Ｖａｌ）ｂ－［Ｘ２］ｃ－（Ｚ／Ｖａｌ）ｄ－Ｃｙｓ－［Ｘ３］e　・・・式（１）
　［式（１）において、Ｚは、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、オルニチン（Ｏｒｎ）及びリシン（Ｌｙｓ）からなる群から選択されるアミノ酸残基を表し、［Ｘ２］ｃの両隣のＺ／Ｖａｌは各々独立にＺ－ＶａｌまたはＶａｌ－Ｚを表し、ａ個のＸ１はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ｃ個のＸ２はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ｅ個のＸ３はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ａは０又は１以上の整数を表し、ｃは０又は１以上の整数を表し、ｂは１以上の整数を表し、ｄは１以上の整数を表す。］
　［２］　前記式（１）で表されるアミノ酸配列において、ｂが２以上１１以下であり、ｄが２以上１１以下である、［１］に記載のカチオン性ペプチド。
　［３］　前記式（１）で表されるアミノ酸配列において、ａが１以上１０以下であり、ｃが２以上８以下であり、ｅが１以上１０以下である、［１］または［２］に記載のカチオン性ペプチド。
　［４］　前記式（１）で表されるアミノ酸配列において、［Ｘ２］ｃが、Ｐｒｏ－Ｐｒｏであり、２個のＰｒｏの一方がＤ体であり、他方がＬ体である、［１］～［３］のいずれか一つに記載のカチオン性ペプチド。
　［５］　前記式（１）で表されるアミノ酸配列が、Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－（Ｚ／Ｖａｌ）３－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－（Ｚ／Ｖａｌ）３－Ｃｙｓである、［１］または［４］に記載のカチオン性ペプチド。
［Ｚは、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、オルニチン（Ｏｒｎ）及びリシン（Ｌｙｓ）からなる群から選択されるアミノ酸残基を表し、２個のＰｒｏの両隣のＺ／Ｖａｌは各々独立にＺ－ＶａｌまたはＶａｌ－Ｚを表す。］
　［６］　下記式（２）で表されるアミノ酸配列からなるカチオン性ペプチド。
　［Ｘ１］ａ－（Ｚ／Ｖａｌ）ｂ－［Ｘ２］ｃ－（Ｚ／Ｖａｌ）ｄ－［Ｘ３］e　　・・・式（２）
　［式（２）において、Ｚは、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、オルニチン（Ｏｒｎ）及びリシン（Ｌｙｓ）からなる群から選択されるアミノ酸残基を表し、［Ｘ２］ｃの両隣のＺ／Ｖａｌは各々独立にＺ－ＶａｌまたはＶａｌ－Ｚを表し、ａ個のＸ１はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ｃ個のＸ２はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ｅ個のＸ３はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ａは０又は１以上の整数を表し、ｃは０又は１以上の整数を表し、ｂは１以上の整数を表し、ｄは１以上の整数を表す。］
　［７］　前記式（２）で表されるアミノ酸配列において、ｂが２以上１１以下であり、ｄが２以上１１以下である、［６］に記載のカチオン性ペプチド。
　［８］　前記式（２）で表されるアミノ酸配列において、ａが１以上１０以下であり、ｃが２以上８以下であり、ｅが１以上１０以下である、［６］または［７］に記載のカチオン性ペプチド。
　［９］　前記式（１）で表されるアミノ酸配列において、［Ｘ２］ｃが、Ｐｒｏ－Ｐｒｏであり、２個のＰｒｏの一方がＤ体であり、他方がＬ体である、［６］～［８］のいずれか一つに記載のカチオン性ペプチド。
　［１０］　前記式（２）で表されるアミノ酸配列が、Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－（Ｚ／Ｖａｌ）３－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－（Ｚ／Ｖａｌ）３である、［６］または［９］に記載のカチオン性ペプチド。
［Ｚは、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、オルニチン（Ｏｒｎ）及びリシン（Ｌｙｓ）からなる群から選択されるアミノ酸残基を表し、２個のＰｒｏの両隣のＺ／Ｖａｌは各々独立にＺ－ＶａｌまたはＶａｌ－Ｚを表す。］
　［１１］　治療活性を有する核酸と、［１］～［１０］のいずれかに記載のカチオン性ペプチドとを含む医薬組成物。
　本発明によれば、核酸二重鎖が結合するのに適した高次構造を有し、核酸二重鎖と安定して結合し、結合の熱安定性も良好であるペプチドが提供される。また本発明のペプチドを用いた核酸医薬も提供される。
参考例１における、カチオン性ペプチドと核酸二重鎖との結合性を示す図である。 実施例１における、カチオン性ペプチドのＣＤスペクトルを示す図である。 実施例２における、カチオン性ペプチド－核酸複合体の蛍光異方性測定結果を示す図である。 実施例２における、ＤａｐＶ－核酸複合体の蛍光異方性測定結果を示す図である。 実施例３における、カチオン性ペプチド－核酸複合体の２６０ｎｍにおけるＵＶ融解プロファイルを示す図である。
　本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
　本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
　本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計量を意味する。
　本発明において、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基を、当技術分野で周知の一文字表記（例えば、グリシン残基を「Ｇ」）又は三文字表記（例えば、グリシン残基を「Ｇｌｙ」）で表現する場合がある。
　本発明において、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基に、Ｄ、Ｌを付した場合には、それぞれＤ－アミノ酸、Ｌ－アミノ酸を表す。
　本発明において、ペプチド及びポリペプチドのアミノ酸配列に関する「％」は、特に断らない限り、アミノ酸残基の個数を基準とする。
　以下に、本発明の実施の形態について説明する。これらの説明及び実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
　近年、核酸医薬、特にＲＮＡ干渉薬（ＲＮＡ interference drug）が新たな治療薬として注目を集めている。しかしながら、ＲＮＡ干渉薬は膜透過性が低く、また細胞内での不安定性により、十分な効力を発揮していない。従って、ＲＮＡ干渉薬を実用に供するためには、低分子干渉ＲＮＡ（siＲＮＡ）薬のための新たな薬物送達システム（ＤＤＳ）を構築する必要がある。
　本願発明者等は、ＤＤＳの開発を目指して、核酸二重鎖に結合能を有する、オリゴジアミノ糖及びオリゴカチオン性ペプチドを合成した。これらに基づく研究の結果から、正電荷の規則的配列が複合体形成の一つの重要な要素となり得ることを発見した。具体的には、正電荷の官能基としてアミノ基を有するペプチドを設計した。１２ｍｅｒのｄｓＲＮＡである ｒ（ＣＧＣＧＡＡＵＵＣＧＣＧ）２ 二重鎖をターゲットとし、そのメジャーグルーブに位置する４ 組のリン酸基をターゲットとし、参考例１として示すとおり、+８価のペプチドを設計した。このカチオン性ペプチドのうち、８個の連続する（S）－２，４－ジアミノ酪酸を有するペプチド（Ａｃ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｄａｂ８－ＮＨ２）（以下「Ｄａｂ８ペプチド」という）がｄｓＲＮＡ に最も効率的に結合することを確認した。
　そこで本願発明者等は、さらにカチオン性官能基が規則的に配列するβヘアピン二次構造に着目した。一連のペプチドを設計及び合成し、これらの核酸二重鎖への結合能を調べた。
　本願発明者等は核酸二重鎖に結合するペプチドの合成にあたり、βヘアピンペプチドに焦点を当てた。一つの態様としては、曲げ部材としてのプロリン二量体（－ＤＰｒｏ－ＬＰｒｏ－）で連結された、バリン（Ｖａｌ）とアミノ基を有するアミノ酸との交互配列からなる人工ペプチドである。このペプチドとｄｓＲＮＡとの相互作用を、オリゴペプチドの異なる二次構造間で比較すると、唯一βヘアピンペプチドのみが熱安定性を増加させることなく、核酸二重鎖に結合した。これらの結果は、特定の二次構造に制御することで核酸二重鎖への結合能を調節できる可能性を示すものである。
　具体的に本発明者等は、細胞内外の環境差により、二次構造を変化させることで核酸二重鎖との結合を制御するペプチドの獲得を目指した。
　ｄｓＲＮＡ にカチオン性ペプチドが結合する際、β構造を誘起して結合することが知られている。そこで、本発明者等は、二次構造を予めとることでＲＮＡ 二重鎖に効率的に結合するペプチドの設計を目指した。まず、親水、疎水アミノ酸の交互配列及びジスルフィド結合を用いて、環状β－ｔｕｒｎ－β構造をとる下記に示すカチオン性ペプチドを設計した。ジスルフィド結合は細胞内の還元的環境にて切断されるため、環構造が開き構造の自由度が増大することから、細胞内外で二次構造が変化すると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　Ｄａｐ：（Ｓ）－２，３－ジアミノプロピオン酸
　Ｄａｂ：（Ｓ）－２，４－ジアミノ酪酸
　Ｏｒｎ：Ｌ－オルニチン
　Ｌｙｓ：Ｌ－リシン
　上記ペプチドＡにおけるアミノ酸配列において、２個のＰｒｏの両隣のＤａｐ/Ｖａｌは各々独立にＤａｐ－ＶａｌまたはＶａｌ－Ｄａｐを表す。すなわち、Ｄａｐ－Ｖａｌである場合には、（Ｄａｐ－Ｖａｌ）３の繰り返し構造となり、Ｖａｌ－Ｄａｐである場合には、（Ｖａｌ－Ｄａｐ）３の繰り返し構造となる。ペプチドＢにおけるＤａｂ/Ｖａｌ、ペプチドＣにおけるＯｒｎ/Ｖａｌ及びペプチドＤにおけるＬｙｓ/Ｖａｌも同様である。
　上記ペプチドＡ～Ｄにおいて、－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－は、－ＤＰｒｏ－ＬＰｒｏ－であってもよく、それぞれＤ体プロリン、Ｌ体プロリンであることを表す。また、アミノ酸配列の末端は修飾されて中和されていることが好ましい。具体的には、Ｎ末端がアセチル化修飾され、Ｃ末端がアミノ化修飾されていることが好ましい。ペプチドＡ～Ｄの好ましい具体例Ａ１～Ｄ１を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ペプチドＡ～Ｄに関し、細胞内で開環した状態に相当する、システインがなく、ジスルフィド結合をもたない下記に示すペプチドＥ～Ｈ（ＤａｐＶ、 ＤａｂＶ、ＯｒｎＶ、 ＬｙｓＶ）を設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　好ましい具体例として以下のペプチドＥ１～Ｈ１を合成し、その二次構造をＣＤスペクトルにより確認した。ＤａｐＶ（Ｅ１） においてはβ構造特有のスペクトルを示したのに対し、他のペプチド、ＤａｂＶ（Ｆ１）、ＯｒｎＶ（Ｇ１）、 ＬｙｓＶ（Ｈ１）はランダムコイル優位なスペクトルを示した。これより、ＤａｐＶ（Ｅ１）はジスルフィド結合をもたない場合でも、β構造を維持するのに対し、他のペプチドはジスルフィド結合をもたない場合には、ランダムコイル用の構造をとることが明らかとなった。すなわち、細胞外におけるｃＤａｂＶ（ペプチドＢ）、ｃＯｒｎＶ（ペプチドＣ）及びｃＬｙｓＶ（ペプチドＤ）は環状β－ｔｕｒｎ－ β構造をとり、核酸二重鎖と結合しているが、細胞内でそれぞれＤａｂＶ（ペプチドＦ）、ＯｒｎＶ（ペプチドＧ）、ＬｙｓＶ（ペプチドＨ）に変化し、すぐに核酸から解離することがわかった。これによりｃＤａｂＶ（ペプチドＢ）、ｃＯｒｎＶ（ペプチドＣ）及びｃＬｙｓＶ（ペプチドＤ）は、核酸医薬に対する核酸医薬分子の結合のＯＮ、 ＯＦＦ の制御を可能とし、ＤＤＳに有利であることが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ペプチドＥ１～Ｈ１に関し、ｄｓＲＮＡ （Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｒ（ＣＧＣＧＡＡＵＵＣＧＣＧ））２ との結合を蛍光異方性測定により確認した。ｄｓＲＮＡ に対して各ペプチドを滴下し、蛍光異方性の変化をプロットしたところ、ＤａｐＶ （ペプチドＥ１）のみ有意な蛍光異方性の変化がみられた。この結果より、β－ｔｕｒｎ－ β構造をとるＤａｐＶ （ペプチドＥ１）のみがｄｓＲＮＡ に結合していることが確認された。ｄｓＲＮＡ に結合したβ－ｔｕｒｎ－ β構造をとるＤａｐＶを、更にランダムコイル構造に変化させた場合には、結合力が変化することが期待される。すなわち、ｃＤａｐＶ（ペプチドＡ）は、細胞内でＤａｐＶ（ペプチドＥ）となっても核酸から解離せず、さらなる環境の変化に応じて核酸を解離することができるため、ＤＤＳとして利用可能である。
　ペプチドＥ１～Ｈ１に関し、ｄｓＲＮＡ としてｒ（ＣＧＣＧＡＡＵＵＣＧＣＧ）２ の熱安定性に及ぼす影響を評価した。ｄｓＲＮＡ に対して各ペプチドを滴定し、その融解温度 （Ｔｍ） を測定したところ、いずれのペプチドにおいても有効な熱安定化が見られなかった。この結果より、ＤａｐＶ （ペプチドＥ１）はｄｓＲＮＡ の熱安定性を向上させずに結合することが明らかとなった。
　本発明のカチオン性ペプチドは、医療分野（特に治療用途）、特に核酸医薬（例えばｓｉＲＮＡ）の安定化とデリバリーのために使用することが出来る。例えば、本発明によれば、治療活性を有する核酸（例えばｓｉＲＮＡ）と、本発明のカチオン性ペプチドとを含む医薬組成物を提供でき、また、当該医薬組成物を、治療を必要とする対象に投与することを含む、治療方法が提供できる。また、核酸医薬の製造における、治療活性を有する核酸（例えばｓｉＲＮＡ）と、本発明のカチオン性ペプチドの使用も提供される。ジスルフィド結合を有する本発明のカチオン性ペプチドは細胞内に取り込まれた後は速やかに開裂し、鎖状ペプチドとなり、さらに環境の変化に応じて、結合した核酸医薬品が細胞内に放出され、効果を奏することが出来る。
　本発明のカチオン性ペプチドは、核酸二重鎖が結合するのに適した高次構造を有することにより、核酸二重鎖と安定して結合し、結合の熱安定性も良好である。このため、本発明のカチオン性ペプチドを用いた核酸医薬は、体内動態が安定であり、熱安定性も高い。
　ジスルフィド結合を有する本発明のカチオン性ペプチドは細胞外では、環状構造かつβヘアピン構造をとるが、細胞内ではジスルフィド結合が開裂して鎖状ペプチドに変化し、ランダムコイルへと構造変化すると考えられる。この様に、自由度の小さい環状ペプチドから自由度の大きい鎖状ペプチドに変化することで、エントロピー的に不利になることで核酸二重鎖に対する結合力が減少し、ペプチドの解離が起こると考えられる。
　本発明の第１の態様は、下記式（１）で表されるアミノ酸配列からなるカチオン性ペプチドである。
　［Ｘ１］ａ－Ｃｙｓ－（Ｚ／Ｖａｌ）ｂ－［Ｘ２］ｃ－（Ｚ／Ｖａｌ）ｄ－Ｃｙｓ－［Ｘ３］e　・・・式（１）
　式（１）において、Ｚは、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、オルニチン（Ｏｒｎ）及びリシン（Ｌｙｓ）からなる群から選択されるアミノ酸残基を表し、［Ｘ２］ｃの両隣のＺ／Ｖａｌは各々独立にＺ－ＶａｌまたはＶａｌ－Ｚを表し、ａ個のＸ１はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ｃ個のＸ２はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ｅ個のＸ３はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ａは０又は１以上の整数を表し、ｃは０又は１以上の整数を表し、ｂは１以上の整数を表し、ｄは１以上の整数を表す。
　式（１）において、Ｘ１としては、ペプチドのヘアピン構造に支障がない限り任意のアミノ酸残基でよく、例えば、ＴｙｒやＧｌｙが好ましい。［Ｘ１］ａとしては、例えば、Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙが好ましい。Ｘ２としては、ヘアピン構造を形成できるアミノ酸が好ましく、例えば、Ｐｒｏが好ましい。［Ｘ２］ｃとしては、例えば、Ｐｒｏ－Ｐｒｏが好ましい。Ｘ３としては、ペプチドのヘアピン構造に支障がない限り任意のアミノ酸でよく、例えば、ＴｙｒやＧｌｙが好ましい。［Ｘ３］eとしては、例えば、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒが好ましい。尚、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３としては、システインではないアミノ酸であることが好ましい。
　式（１）において、βシート構造を安定してとる観点から、ｂとしては２以上が好ましく、ｄとしては２以上が好ましい。また、ｂおよびｄは、医薬に用いるｄｓＲＮＡの塩基長によって適宜選択できるが、好ましくはｂとしては１１以下であり、ｄとしては１１以下である。ｂとｄは同じであることが好ましく、ｂとｄは３であることが好ましい。
　式（１）において、ａは１～１０が好ましく、１～６がより好ましい。ｅは１～１０が好ましく、１～６がより好ましい。また、式（１）において、ｃとしては［Ｘ２］ｃが、ヘアピン構造を形成することができれば特に限定されないが、２～８が好ましく、２～４がより好ましい。
　式（１）で表される本発明のカチオン性ペプチドとしては、Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－（Ｄａｐ／Ｖａｌ）３－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－（Ｄａｐ／Ｖａｌ）３－Ｃｙｓ（配列番号１）で表されるカチオン性ペプチド（ペプチドＡ）、Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－（Ｄａｂ／Ｖａｌ）３－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－（Ｄａｂ／Ｖａｌ）３－Ｃｙｓ（配列番号２）で表されるカチオン性ペプチド（ペプチドＢ）、Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－（Ｏｒｎ／Ｖａｌ）３－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－（Ｏｒｎ／Ｖａｌ）３－Ｃｙｓ（配列番号３）で表されるカチオン性ペプチド（ペプチドＣ）及びＴｙｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－（Ｌｙｓ／Ｖａｌ）３－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－（Ｌｙｓ／Ｖａｌ）３－Ｃｙｓ（配列番号４）で表されるカチオン性ペプチド（ペプチドＤ）が好ましい。
　また、ペプチドＡ～Ｄにおける－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－は、２個のＰｒｏの一方がＤ体で、他方がＬ体であることが好ましい。
　本発明のカチオン性ペプチドには、配列番号１～４で示されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、核酸二重鎖への結合能が保持されたペプチドが包含される。配列番号１～４で示されるアミノ酸配列において置換、欠失、挿入又は付加されるアミノ酸残基の数は、具体的には好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、更に好ましくは１～２個である。
　本発明のカチオン性ペプチドには、配列番号１～４で示されるアミノ酸配列全体に対して、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、かつ、核酸二重鎖への結合能が保持されたペプチドが包含される。
　本発明の第２の態様は、下記式（２）で表されるアミノ酸配列からなるカチオン性ペプチドである。
　［Ｘ１］ａ－（Ｚ／Ｖａｌ）ｂ－［Ｘ２］ｃ－（Ｚ／Ｖａｌ）ｄ－［Ｘ３］e　　・・・式（２）
　式（２）において、Ｚは、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、オルニチン（Ｏｒｎ）及びリシン（Ｌｙｓ）からなる群から選択されるアミノ酸残基を表し、［Ｘ２］ｃの両隣のＺ／Ｖａｌは各々独立にＺ－ＶａｌまたはＶａｌ－Ｚを表し、ａ個のＸ１はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ｃ個のＸ２はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ｅ個のＸ３はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ａは０又は１以上の整数を表し、ｃは０又は１以上の整数を表し、ｂは１以上の整数を表し、ｄは１以上の整数を表す。
　式（２）におけるａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅの好ましい範囲は、式（１）における場合と同様である。また、式（２）におけるＸ１、Ｘ２、Ｘ３の好ましい態様も、式（１）における場合と同様である。
　式（２）で表される本発明のカチオン性ペプチドとしては、Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－（Ｄａｐ／Ｖａｌ）３－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－（Ｄａｐ／Ｖａｌ）３（配列番号５）で表されるカチオン性ペプチド（ペプチドＥ）、Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－（Ｄａｂ／Ｖａｌ）３－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－（Ｄａｂ／Ｖａｌ）３（配列番号６）で表されるカチオン性ペプチド（ペプチドＦ）、Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－（Ｏｒｎ／Ｖａｌ）３－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－（Ｏｒｎ／Ｖａｌ）３（配列番号７）で表されるカチオン性ペプチド（ペプチドＧ）及びＴｙｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－（Ｌｙｓ／Ｖａｌ）３－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－（Ｌｙｓ／Ｖａｌ）３（配列番号８）で表されるカチオン性ペプチド（ペプチドＨ）が好ましい。
　また、ペプチドＥ～Ｈにおける－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－は、２個のＰｒｏの一方がＤ体で、他方がＬ体であることが好ましい。
　本発明のカチオン性ペプチドには、配列番号５～８で示されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、核酸二重鎖への結合能が保持されたペプチドが包含される。配列番号５～８で示されるアミノ酸配列において置換、欠失、挿入又は付加されるアミノ酸残基の数は、具体的には好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、更に好ましくは１～２個である。
　本発明のカチオン性ペプチドには、配列番号５～８で示されるアミノ酸配列全体に対して、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、かつ、核酸二重鎖への結合能が保持されたペプチドが包含される。
　以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。
　実験において、特に断りのない限り、以下の実験手法を用いた。
１．ペプチド合成
　既存のＦｍｏｃ固相合成法により各ペプチドを合成した。
２．ＣＤスペクトルの測定方法
合成した各ペプチドを１０ ｍＭ リン酸バッファー、 １００ ｍＭ ＮａＣｌ （ｐＨ ７．０） で５０ μＭとなるように調製し、光路長１ ｍｍの石英セル中、２０ ℃で円二色性 （ＣＤ） スペクトルを測定した。
３．融解温度 （Ｔｍ） 測定方法
　アニーリングした核酸二重鎖 （１０ ｍＭ リン酸バッファー、１００ ｍＭ ＮａＣｌ （ｐＨ ７．０）） に１当量のペプチド溶液を加え、終濃度４ μｍペプチド－核酸複合体の水溶液を調製した。このサンプル溶液を１０℃から９５ ℃まで、昇温速度 +０．５ ℃／ｍｉｎで加熱し、その過程を２６０ ｎｍの吸光度で追跡することで融解温度を測定した。
４．蛍光異方性測定
　蛍光基標識として５’末端にＦＩＴＣを反応させてフルオレセイン標識したＲＮＡを用いた。蛍光基標識ＲＮＡの水溶液 (１０ ｍＭ リン酸バッファー、 １００ ｍＭ ＮａＣｌ （ｐＨ ７．０）） をアニーリングし、終濃度０．１ μｍ ３ｍｌ (１０ ｍＭ リン酸バッファー、 １００ ｍＭ ＮａＣｌ （ｐＨ ７．０）) に希釈して蛍光標識ＲＮＡ水溶液のサンプルを調製した。このサンプル溶液に、２０ ℃で１０μｍのペプチドを添加し、０、 ０．１、 ０．２、 ０．３、 ０．５、 ０．７、 １．０、 １．５、 ２．０、 ３．０、 ５．０、 ７．０当量における蛍光異方性を測定した。各等量での蛍光異方性を１対１結合曲線で近似することで、ペプチド-核酸間の解離定数を算出した。
［参考例１］　カチオン性ペプチドのＲＮＡ結合能
　正電荷の官能基としてアミノ基を有するペプチドを設計した。１２ｍｅｒの ｄｓＲＮＡであるｒ（ＣＧＣＧＡＡＵＵＣＧＣＧ）２ 二重鎖をターゲットとし、そのメジャーグルーブに位置する４ 組のリン酸をターゲットとし、以下に示す+８ 価のペプチドを設計した。このカチオン性ペプチドのうち、Ｄａｂ８ペプチドがｄｓＲＮＡ に最も効率的に結合することを確認した。結果を図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
［実施例１］カチオン性ペプチドの二次構造の設計
　ペプチド－核酸二重鎖間の相互作用に及ぼす、βヘアピン構造を含めた二次構造の効果を評価するため、下記に示すペプチドＥ１～Ｈ１を設計し、上記の方法により合成した。
　これらは、曲げ部材としてのプロリン二量体（－ＤＰｒｏ－ＬＰｒｏ－）で連結された、バリン（Ｖａｌ）及びアミノ基を有するアミノ酸の交互配列からなるペプチドである。アミノ基を有するアミノ酸としては、Ｌ－リシン（Ｌｙｓ）、Ｌ－オルニチン（Ｏｒｎ）、（Ｓ）－２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）及び（Ｓ）－２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）を選択した。ＧＢ／ＳＡ水溶液モデルでの分子力学計算に基づき、Ｄａｂからなる８量体のカチオン性オリゴペプチドが、Ａ型のＲＮＡ/ＲＮＡ二重らせん１２量体のメジャーグルーブと結合することができ、結合においては、ペプチドのプロトン化したアミノ基がすべて二重鎖のリン酸アニオンと水素結合を形成している。βヘアピンペプチドがＲＮＡ/ＲＮＡ二重鎖と相互作用することが予想される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　Ｄａｐ：（Ｓ）－２，３－ジアミノプロピオン酸
　Ｄａｂ：（Ｓ）－２，４－ジアミノ酪酸
　Ｏｒｎ：Ｌ－オルニチン
　Ｌｙｓ：Ｌ－リシン
　まず、上記ペプチドＥ１～Ｈ１の異なる側鎖長を有するペプチドの二次構造を分析した。リン酸バッファーにおけるペプチドＥ１～Ｈ１の二次構造をＣＤ スペクトルにより確認した（結果を図２に示す）。ＣＤスペクトルの測定条件は上記のとおり、５０μＭ ペプチド、 ２０ ℃、１０ｍＭ リン酸バッファー、 １００ｍＭ ＮａＣｌである。ＤａｐＶ （ペプチドＥ１）においてはβシート構造特有のスペクトルを示したのに対し、他のペプチドではランダムコイル優位なスペクトルを示した。
［実施例２］カチオン性ペプチドとｄｓＲＮＡ との結合能評価
　続いて上記カチオン性ペプチドＥ１～Ｈ１とｄｓＲＮＡ （Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ-ｒ（ＣＧＣＧＡＡＵＵＣＧＣＧ））2 との結合を蛍光異方性測定により評価した。ｄｓＲＮＡ に対してペプチドを滴下し、蛍光異方性の変化をプロットしたところ、ＤａｐＶ（ペプチドＥ１） のみ有意な蛍光異方性の変化がみられた（結果を図３、図４に示す）。その他のペプチドは変化を示さなかった。測定条件は上記のとおり、０．１μＭ ＲＮＡ/ＲＮＡ水溶液 (１０ ｍＭ リン酸バッファー、 １００ ｍＭ ＮａＣｌ （ｐＨ ７．０））である。この結果より、β-ｔｕｒｎ- β構造をとるＤａｐＶ のみがｄｓＲＮＡ に結合していることが確認された。
［実施例３］カチオン性ペプチドとｄｓＲＮＡ との熱安定性評価
　次にカチオン性ペプチドＥ１～Ｈ１がｄｓＲＮＡである ｒ（ＣＧＣＧＡＡＵＵＣＧＣＧ）２ の熱安定性に及ぼす影響を評価した。ｄｓＲＮＡ に対して各ペプチドを滴定し、各ペプチド－ｄｓＲＮＡ複合体の融解温度 （Ｔｍ） を測定したところ、ＤａｐＶを含めたいずれのペプチドにおいても有効な熱安定化が見られなかった（結果を下記表６及び図５に示す）。この結果より、ＤａｐＶ はｄｓＲＮＡ の熱安定性を向上させずに結合することが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　
　ペプチド－核酸二重鎖間の相互作用に及ぼす、βヘアピン構造を含めた二次構造の効果について一連のペプチドを設計し評価した。ＤａｐＶ（ペプチドＥ１）のみがβヘアピン構造を形成し、ＲＮＡ二重鎖に結合していることを確認した。
　この結果から、オリゴペプチドの特定の二次構造により、ＲＮＡ二重鎖への結合能を制御可能であることがわかった。
　２０１３年１０月８日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６１/８８８，２００の内容は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (11)

  1. 　下記式（１）で表されるアミノ酸配列からなるカチオン性ペプチド。
    　［Ｘ１］ａ－Ｃｙｓ－（Ｚ／Ｖａｌ）ｂ－［Ｘ２］ｃ－（Ｚ／Ｖａｌ）ｄ－Ｃｙｓ－［Ｘ３］e　・・・式（１）
    　［式（１）において、Ｚは、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、オルニチン（Ｏｒｎ）及びリシン（Ｌｙｓ）からなる群から選択されるアミノ酸残基を表し、［Ｘ２］ｃの両隣のＺ／Ｖａｌは各々独立にＺ－ＶａｌまたはＶａｌ－Ｚを表し、ａ個のＸ１はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ｃ個のＸ２はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ｅ個のＸ３はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ａは０又は１以上の整数を表し、ｃは０又は１以上の整数を表し、ｂは１以上の整数を表し、ｄは１以上の整数を表す。］
  2. 　前記式（１）で表されるアミノ酸配列において、ｂが２以上１１以下であり、ｄが２以上１１以下である、請求項１に記載のカチオン性ペプチド。
  3. 　前記式（１）で表されるアミノ酸配列において、ａが１以上１０以下であり、ｃが２以上８以下であり、ｅが１以上１０以下である、請求項１または請求項２に記載のカチオン性ペプチド。
  4. 　前記式（１）で表されるアミノ酸配列において、［Ｘ２］ｃが、Ｐｒｏ－Ｐｒｏであり、２個のＰｒｏの一方がＤ体であり、他方がＬ体である、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のカチオン性ペプチド。
  5. 　前記式（１）で表されるアミノ酸配列が、Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－（Ｚ／Ｖａｌ）３－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－（Ｚ／Ｖａｌ）３－Ｃｙｓである、請求項１または請求項４に記載のカチオン性ペプチド。
    ［Ｚは、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、オルニチン（Ｏｒｎ）及びリシン（Ｌｙｓ）からなる群から選択されるアミノ酸残基を表し、２個のＰｒｏの両隣のＺ／Ｖａｌは各々独立にＺ－ＶａｌまたはＶａｌ－Ｚを表す。］
  6. 　下記式（２）で表されるアミノ酸配列からなるカチオン性ペプチド。
    　［Ｘ１］ａ－（Ｚ／Ｖａｌ）ｂ－［Ｘ２］ｃ－（Ｚ／Ｖａｌ）ｄ－［Ｘ３］e　　・・・式（２）
    　［式（２）において、Ｚは、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、オルニチン（Ｏｒｎ）及びリシン（Ｌｙｓ）からなる群から選択されるアミノ酸残基を表し、［Ｘ２］ｃの両隣のＺ／Ｖａｌは各々独立にＺ－ＶａｌまたはＶａｌ－Ｚを表し、ａ個のＸ１はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ｃ個のＸ２はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ｅ個のＸ３はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、ａは０又は１以上の整数を表し、ｃは０又は１以上の整数を表し、ｂは１以上の整数を表し、ｄは１以上の整数を表す。］
  7. 　前記式（２）で表されるアミノ酸配列において、ｂが２以上１１以下であり、ｄが２以上１１以下である、請求項６に記載のカチオン性ペプチド。
  8. 　前記式（２）で表されるアミノ酸配列において、ａが１以上１０以下であり、ｃが２以上８以下であり、ｅが１以上１０以下である、請求項６または請求項７に記載のカチオン性ペプチド。
  9. 　前記式（２）で表されるアミノ酸配列において、［Ｘ２］ｃが、Ｐｒｏ－Ｐｒｏであり、２個のＰｒｏの一方がＤ体であり、他方がＬ体である、請求項６から請求項８のいずれか１項に記載のカチオン性ペプチド。
  10. 　前記式（２）で表されるアミノ酸配列が、Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－（Ｚ／Ｖａｌ）３－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－（Ｚ／Ｖａｌ）３である、請求項６又は請求項９に記載のカチオン性ペプチド。
    ［Ｚは、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、オルニチン（Ｏｒｎ）及びリシン（Ｌｙｓ）からなる群から選択されるアミノ酸残基を表し、２個のＰｒｏの両隣のＺ／Ｖａｌは各々独立にＺ－ＶａｌまたはＶａｌ－Ｚを表す。］
  11. 　治療活性を有する核酸と、請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載のカチオン性ペプチドとを含む医薬組成物。
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