CN104020216A - 一种两端标记相对定量分析糖链的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种两端标记相对定量分析糖链的方法，属于糖类定量分析领域。本发明通过酰肼化试剂和胺基化试剂分别对糖链结构唾液酸酰胺化和对还原端氨基化修饰，同时保护了糖链结构的唾液酸基团并使糖链的还原端被同位素标记，从而使糖链完整的结构信息和定量信息同时得到分析，提高了糖链解析的全面性和定量的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及一种两端标记相对定量分析糖链的方法，属于糖类定量分析领域。
背景技术
糖类物质是一类大量存在于生物机体中的大分子物质，在生物体的各个过程中年扮演着重要的角色。糖类物质的存在形式主要是糖类复合物，如糖脂、糖蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖、脂多糖等。其中糖基化蛋白质广泛分布于细胞表面和细胞外基质中，其上的糖链结构与很多的重要的生物功能相互关联，主要包括调节蛋白的构象和稳定性，控制蛋白质甚至细胞的半衰期。另外，这些糖链结构作为配体的特异性结合介导蛋白的靶向识别，细胞与细胞以及细胞与胞外基质相互作用。生物体中的糖蛋白一般包括多个糖基化位点，而其每个糖基化位点的糖链结构具有其特异的糖型。因此鉴定糖蛋白上所有的糖链结构是非常具有挑战性，其中包括鉴定糖蛋白上的糖基化位点，分析每个糖型结构中的糖链组成，糖链序列，分支类型以及糖链残基中的羟基基团与其他残基的连接方式。现在没有一种技术可以完全得到糖蛋白糖基化修饰所有信息，只有将多种方法联合起来，如多种质谱技术联合，再加上糖链生物合成通路特点才能得到糖链的信息。
定量糖组学分析技术被认为是分析糖类复合物及其糖链结构在众多生物过程中所扮演角色的最有力的方法。最近几年，随着糖组学技术和其他新兴仪器方法的发展，很多定量糖组学的方法也得到了长足的发展。目前定量糖组学常用的方法有：液相色谱技术，毛细管电泳技术，以及质谱技术。在这些定量分析糖链的方法中，质谱技术是其中最有用最直接的方法。而利用质谱技术定量糖组学分析方法一般都需要对糖链进行修饰标记，同时促进糖链在质谱检测中的离子化效率和定量的准确度。目前用糖链定量质谱分析的糖链标记方法主要有：糖链还原端同位素标记方法(GRIL)，同位素泛甲基化标记方法，同重醛类物质标记方法(iARTs)，同位素酰肼标记方法(IGHT)，以及同位素谷氨酸盐氨基糖标记方法(IDAWG)。这些方法均是通过分析用不同的同位素试剂标记不同样本，然后利用质谱检测同位差异分子量的样品相对丰度或面积，从而将不同样品在一次质谱分析中进行检测。以上方法对糖链的定量各有其优点，但是除泛甲基化的方法以外均存在丢失唾液酸信息的缺点；而泛甲基化方法由于所有的羟基均被甲基化，所以很多糖链的结构信息会被掩盖。
发明内容
为在质谱检测和定量分析糖链的过程中同时保护糖链结构的唾液酸并使糖链的还原端被同位素标记，从而使糖链完整的结构信息和定量信息同时被分析，提高糖链解析的全面性和定量的准确性，本发明提供了一种两端标记相对定量分析糖链的方法，首先通过酰肼化试剂对样品的糖链结构的唾液酸进行酸酰胺化，酶解释放糖链后，用同位素标记的氨基化试剂分别对两种样品的糖链的还原端进行氨基化修饰，然后通过MALDI-TOF/TOF-MS解析糖链，比较分别经同位素标记的氨基化试剂修饰的两种样品中相应糖链的含量差异。
所述酰肼化试剂优选乙酰肼。
所述同位素标记的氨基化试剂优选12C-和13C-苯胺。
所述方法主要包括以下步骤：
(1)将需要进行相对定量分析的两种样品的糖蛋白用乙酰肼标记，保护糖链结构的唾液酸基团；
(2)用糖苷酶PNGase F酶解释放两种样品中的糖蛋白的糖链；
(3)分别用12C-和13C-苯胺修饰来自两种样品的糖链还原端；
(4)取以上来自两种样品的分别经12C-和13C-苯胺修饰的糖链，等量溶解于5：1：1的正丁醇：甲醇：水溶液中，然后等量混合进行糖链的除盐处理；
所述经12C-和13C-苯胺修饰的糖链优选以质量体积比1：3(g：L)溶解于5：1：1的正丁醇：甲醇：水溶液中；
(5)应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)解析糖链，从一级图谱中选择信噪比大于6的质谱峰进行二级质谱分析；通过比较分别经12C-和13C-苯胺修饰的两种样品中相应糖链的相对面积比例以确定某种糖链在不同样品中的含量差异。
(6)将糖链质谱数据在flexAnalysis软件中打开，取信噪比大于6，且被至少三次试验鉴定到的质谱峰做后续分析，结合Glycoworkbench软件同时手动分析唾液酸情况，分析参数为：选择GlycomeDB数据库，离子选择[M+Na]+，电荷最多为+1，前体离子容忍度为1Da，碎片离子容忍度为0.5Da。
所述方法进一步优选以下步骤：
(1)用Bradford或者BCA方法定量两个样品中的蛋白质，每个样品各取2mg左右蛋白质，用10-30KD超滤膜进行除盐处理；
(2)乙酰肼标记：向以上除盐的2mg的蛋白质中加入100μL1M乙酰肼、20μL1N盐酸、20μL2M EDC，于室温下反应4h，14000g离心10min，加入150μL40mM的NH4HCO3至超滤管中，14000g离心10min，重复3次。
(3)糖苷酶PNGase F酶解释放糖链：将超滤管转移至新的收集管中，加入用300μL的40mM的NH4HCO3溶解的PNGase F(300000U/mL)充分混匀37℃静置孵育12h，14000g离心10min，加200μL超纯水至超滤管中，14000g离心10min，重复一次，收集流出液，冷冻干燥得糖链干粉。
(4)12C-和13C-苯胺修饰糖链还原端：向步骤(3)所得来自两个样品的糖链中分别加入10μL的12C-苯胺溶液和10-25μL的13C-苯胺溶液，再各自加入25μL NaCNBH3(溶于v/v为7/3的DMSO/乙酸溶液)，于70℃孵育反应15min，反应获得的苯胺修饰的糖链分别冷冻干燥；将获得的分别经同位素标记的糖链分别等量溶解于300μL5：1：1的正丁醇：甲醇：水溶液中，然后等量混合进行糖链的除盐处理。
所述13C-苯胺溶液优选10μL。
(5)糖链的除盐处理：加100μL的Sepharose4B分别至1.5mL的离心管中，向各离心管中加入1：1的甲醇：水溶液1mL，混匀，12000g离心5min，弃上清，重复清洗2次。再向各离心管中加入5：1：1的正丁醇：甲醇：水溶液1mL，混合均匀，12000g离心5min，弃上清，重复清洗2次。将步骤(4)得到的糖链样品上样至上述含Sepharose4B的离心管中混匀，25℃振荡反应1h。14000g离心15min，弃上清，重复清洗3次。再加入1：1的甲醇：水溶液1mL摇匀，25℃振荡20min，14000g离心15min，收集样品并冷冻干燥。
(6)定量分析：将糖链质谱数据在flexAnalysis软件中打开，取信噪比大于6，且被至少三次试验鉴定到的质谱峰做后续分析，结合Glycoworkbench软件同时手动分析唾液酸情况，分析参数为：选择GlycomeDB数据库，离子选择[M+Na]+，电荷最多为+1，前体离子容忍度为1Da，碎片离子容忍度为0.5Da。通过比较12C-和13C-苯胺修饰的糖链的相对面积(RelativeArea)比例以确定某种糖链在不同样品含量差异。
本发明提供了一种两端标记定量分析糖链的方法，通过酰肼化试剂和胺基化试剂分别对糖链结构唾液、还原端进行酸酰胺化、氨基化修饰。在质谱检测和定量分析糖链的过程中同时保护糖链结构的唾液酸并使糖链的还原端被同位素标记，从而使糖链完整的结构信息和定量信息同时被分析，提高糖链解析的全面性和定量的准确性。而现有技术均存在丢失唾液酸糖链信息的缺点，且其中的泛甲基化方法由于所有的羟基均被甲基化，所以很多糖链的结构信息也会被掩盖。
附图说明
图1：两端同时标记N-连接糖链结构并定量分析原理图
图2：利用两端同时标记糖链法对标准糖蛋白质RNase B糖链结构的分析
图3：利用两端同时标记糖链法对等质量的NMuMG细胞的糖蛋白质糖链结构的分析
图4：利用两端同时标记糖链法对等质量的HCV29和KK47细胞的糖蛋白质糖链结构的分析，(A)：HCV29，(B)：KK47。
具体实施方式
实施例1样品蛋白质的准备
细胞蛋白质的准备：用细胞蛋白质试剂提取盒(如T-PER，RIPA)提取细胞蛋白质，尽量用较少的裂解液，以保证蛋白质浓度为2-10mg/mL，14,000g离心5min除去细胞残渣。用BCA试剂盒测定两种细胞提取的蛋白浓度(保证至少三次重复)。
血清蛋白质的准备：血清样品用离心机12,000g离心15min，取中间液体部分。加入10KD的超滤管中，将超滤管置于配套的离心管中，12,000g离心15min，加入400μl的40mMNH4HCO3，再次离心，重复一次。将滤膜倒置于新的离心管中，9000g离心3min，收集离出的蛋白(约50μl)，用Bradford方法定量，最后分别定容至2mg/ml。
实施例2糖链两端标记及分析
(1)糖链唾液酸的乙酰肼修饰及释放
取实施例1提取的蛋白2mg加入10KD超滤膜中，14000g离心浓缩至50μL左右，加入300μL的8M尿素，充分混匀，14000g离心15min。再加入200μL8M尿素溶液至超滤管，14000g离心15min。弃去收集管中的流出液，加入150μL的10mM DTT(二硫苏糖醇)充分混匀，56℃孵育45min，14000g离心10min，加入150μL的20mM的IAM(碘乙酰胺)充分混匀，暗处孵育20min，14000g离心10min。加入150μL超纯水至超滤管中，14000g离心10min，重复3次。通过以上方法可以对蛋白质进行除盐处理，同时实现了对糖链的变性和修饰，更有利于蛋白质结构的伸展和糖链的释放。
乙酰肼标记：向以上除盐的2mg的蛋白质中加入100μL1M乙酰肼、20μL1N盐酸、20μL2M1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，于室温下反应4h，14000g离心10min，加入150μL40mM的NH4HCO3至超滤管中，14000g离心10min，重复3次。
糖苷酶PNGase F酶解释放糖链：将超滤管转移至新的收集管中，加入用300μL的40mM的NH4HCO3溶解的300000U/mL的PNGase F充分混匀37℃静置孵育12h，14000g离心10min，加200μL超纯水至超滤管中，14000g离心10min，重复一次，收集流出液，冷冻干燥。
(2)12C-和13C-苯胺修饰糖链还原端
取等量的糖链(2mg蛋白质上释放的糖链)分别加入10μL的12C-苯胺溶液和13C-苯胺溶液，再各自加入25μL NaCNBH3(溶于体积比为7/3的DMSO/乙酸溶液)，于70℃孵育反应15min，反应获得的苯胺修饰的糖链分别冷冻干燥，获得的经两种同位素分别标记的糖链分别等量溶解于300μL5：1：1的正丁醇：甲醇：水溶液中，然后等量混合进行糖链的除盐处理。
(3)糖链的除盐(Clean-up)处理
加100μL的Sepharose4B分别至1.5mL的离心管中，向各离心管中加入1：1的甲醇：水溶液1mL，混匀，12000g离心5min，弃上清，重复清洗2次。再向各离心管中加入5：1：1的正丁醇：甲醇：水溶液1mL，混合均匀，12000g离心5min，弃上清，重复清洗2次。将步骤(2)得到的糖链样品上样至上述含Sepharose4B的离心管中混匀，25℃振荡反应1h。14000g离心15min，弃上清，重复清洗3次。再加入1：1的甲醇：水溶液1mL摇匀，25℃振荡20min，14000g离心15min，收集样品并冷冻干燥。
(4)N-连接糖链的MALDI-TOF/TOF质谱解析
应用Bruker Daltonics公司的ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF-MS解析三种膀胱癌上皮细胞中糖蛋白的N-连接糖链。取5μL的50％的甲醇溶液完全溶解1:1混合的苯胺同位素标记的糖链，取2μL糖链溶液点样于MTP Anchorchip384点的靶板上，真空抽干。再加1μL的20mg/mL的基质DHB至样品板上，真空抽干。分别以反射阳性离子模式和反射阴性离子模式鉴定多糖，分子量检测范围为700-5000，用校正混合物作为外标校正质谱仪。从一级图谱中选择信噪比大于6的质谱峰进行二级质谱分析。
数据分析：将糖链质谱数据在flexAnalysis软件中打开，取信噪比大于6，且被至少三次试验鉴定到的质谱峰做后续分析。将所得糖链的m/z和信号强度结果导出成.txt格式。结合Glycoworkbench软件同时手动分析唾液酸情况。分析参数为：选择GlycomeDB数据库，离子选择[M+Na]+，电荷最多为+1，前体离子容忍度为1Da，碎片离子容忍度为0.5Da。
实施例3标准糖蛋白质RNase B的N-连接糖链修饰和质谱分析
对于RNase B糖链的修饰，首先糖蛋白RNase B被用酰胺化试剂乙酰肼修饰，然后用糖苷酶PNGase F酶解释放糖链，再用胺基化试剂苯胺对N-连接糖链还原端进行修饰，获得的糖链用MALDI-TOF鉴定，得到RNase B的[M+Na]+的糖链峰谱图。同时以不作任何糖链修饰并释放的RNase B糖链作对比，结果如图2所示，从图2-A中可以看出完全鉴定到RNase B的糖链谱，从谱图中可以看出RNase B同一个糖基化位点上的糖链微不均一性，存在5种高甘露糖的糖型结构，高甘露糖个数为5-9，被表示为Man5-Man9。从图2-B中可以看出RNaseB上的5种高甘露糖型糖链与原始糖链分子量均为苯胺的差值，而没有乙酰肼的分子量差别，说明对高甘露糖型等中性糖链只是修饰其还原端，不会破坏其他糖链结构，说明该修饰方法的特异性比较强。
实施例4同一细胞糖蛋白质N-连接糖链定量分析
提取的小鼠乳腺细胞NMuMG蛋白质，取等量的两份蛋白质，同RNase B标记方法一样，同时对其末端唾液酸和还原端糖链进行标记，且其还原端分别用12C-和13C-苯胺修饰，获得的糖链等量混合后用MALDI-TOF/TOF-MS进行鉴定分析。结果如图3所示，从结果中可以看出，该方法可以同时对糖链的唾液酸(如m/z2053.947和2059.968)、还原端(如m/z1886.891和1892.905)分别进行酰胺化和氨基化修饰，并且从标注的五种糖链结构相对面积比即ratio接近于1可以看出该同位素的标记方法可以很好地定量分析糖链结构。
实施例5不同来源细胞株糖蛋白质N-连接糖链定量分析
取不同来源的膀胱上皮细胞HCV29和KK47细胞两种，其中HCV29细胞是正常膀胱上皮细胞，KK47是非浸润性膀胱癌细胞。分别提取两株细胞的蛋白质，然后取等量进行糖蛋白质糖链的唾液酸的酰胺化和还原端的氨基化标记，其中还原端氨基化标记试剂分别为12C-和13C-苯胺试剂。从图4我们可以看出不同细胞来源的糖蛋白质糖链均可以被同时标记，并能通过同位素的修饰实现准确定量法分析，并找出不同细胞糖蛋白糖链表达差异。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (7)
1.一种两端标记相对定量分析糖链的方法，其特征在于，首先通过酰肼化试剂对样品的糖链结构的唾液酸进行酸酰胺化，酶解释放糖链后，用同位素标记的氨基化试剂分别对两种样品的糖链的还原端进行氨基化修饰，然后通过MALDI-TOF/TOF-MS解析糖链，比较分别经同位素标记的氨基化试剂修饰的两种样品中相应糖链的含量差异。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酰肼化试剂是乙酰肼。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述同位素标记的氨基化试剂是12C-和13C-苯胺。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)将需要进行相对定量分析的两种样品的糖蛋白用乙酰肼标记，保护糖链结构的唾液酸基团；
(2)用糖苷酶PNGase F酶解释放两种样品中的糖蛋白的糖链；
(3)分别用12C-和13C-苯胺修饰来自两种样品的糖链的还原端；
(4)取以上来自两种样品的分别经12C-苯胺、13C-苯胺修饰的糖链，等量溶解于5：1：1的正丁醇：甲醇：水溶液中，然后等量混合进行糖链的除盐处理；
(5)应用MALDI-TOF/TOF-MS解析糖链，从一级图谱中选择信噪比大于6的质谱峰进行二级质谱分析；通过比较分别经12C-和13C-苯胺修饰的两种样品中相应糖链的相对面积比例以确定某种糖链在不同样品中的含量差异。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将糖链质谱数据在flexAnalysis软件中打开，取信噪比大于6，且被至少三次试验鉴定到的质谱峰做后续分析，结合Glycoworkbench软件同时手动分析唾液酸情况。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)每个样品各取2mg蛋白质，用10-30KD超滤膜进行除盐处理；
(2)乙酰肼标记：向以上除盐的2mg的蛋白质中加入100μL1M乙酰肼、20μL1N盐酸、20μL2M EDC，于室温下反应4h，14000g离心10min；加入150μL40mM的NH4HCO3至超滤管中，14000g离心10min，重复3次；
(3)糖苷酶PNGase F酶解释放糖链：将超滤管转移至新的收集管中，加入用300μL的40mM的NH4HCO3溶解的PNGase F充分混匀37℃静置孵育12h，14000g离心10min；加200μL超纯水至超滤管中，14000g离心10min，重复一次，收集流出液，冷冻干燥得糖链；
(4)12C-和13C-苯胺修饰糖链还原端：向步骤(3)所得来自两个样品的糖链中分别加入10μL的12C-苯胺溶液和10-25μL的13C-苯胺溶液，再各自加入25μL溶于体积比为7/3的DMSO/乙酸溶液中的NaCNBH3溶液，于70℃孵育反应15min，反应获得的苯胺修饰的糖链分别冷冻干燥；分别将经两种同位素标记的糖链等量溶解于5：1：1的正丁醇：甲醇：水溶液中，然后等量混合进行糖链的除盐处理；
(5)糖链的除盐处理；
(6)定量分析：将糖链质谱数据在flexAnalysis软件中打开，取信噪比大于6，且被至少三次试验鉴定到的质谱峰做后续分析，结合Glycoworkbench软件同时手动分析唾液酸情况，分析参数为：选择GlycomeDB数据库，离子选择[M+Na]+，电荷最多为+1，前体离子容忍度为1Da，碎片离子容忍度为0.5Da。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，糖链的除盐处理：加100μL的Sepharose4B分别至1.5mL的离心管中，向各离心管中加入1：1的甲醇：水溶液1mL，混匀，12000g离心5min，弃上清，重复清洗2次；再向各离心管中加入5：1：1的正丁醇：甲醇：水溶液1mL，混合均匀，12000g离心5min，弃上清，重复清洗2次；将步骤(4)得到的糖链样品上样至上述含Sepharose4B的离心管中混匀，25℃振荡反应1h；14000g离心15min，弃上清，重复清洗3次，再加入1：1的甲醇：水溶液1mL摇匀，25℃振荡20min，14000g离心15min，收集样品并冷冻干燥。
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