CN102788720A - 一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全n-连接糖链及其鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全N-连接糖链及其鉴别方法，以解决现有技术反应效率较低、可鉴定的糖链种类较少的问题。本发明利用8～12KD滤膜的分子筛效应，将从糖蛋白上释放的糖链与蛋白分离，在10KD分子筛上糖蛋白的N-连接糖链被PNGase F酶释放，通过反复离心的方法使N-连接糖链流出，蛋白仍保留于滤膜上，从而实现了糖链的分离。该方法分离糖链效果明显，并避免了因非特异性吸附和化学反应带入副产物；反应效率高、反应步骤简明。

Description

一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全N-连接糖链及其鉴别方法

技术领域

本发明涉及一种分离生物样本中糖蛋白全N-连接糖链及其鉴别方法。

背景技术

糖类物质是一种广泛存在于机体中的生物分子，在生物体内起着多种重要的作用。糖类物质主要是以糖类复合物的形式存在，如糖脂，糖蛋白，蛋白聚糖，肽葡聚糖，脂多糖等。其中蛋白质糖基化广泛分布于细胞表面和细胞外基质中，其上的糖链结构与很多的重要的生物功能相互关联，主要涉及调节蛋白的构象和稳定性，控制蛋白质甚至细胞的半衰期。另外，这些糖链结构作为配体的特异性结合介导蛋白的靶向识别，细胞与细胞以及细胞与胞外基质相互作用。生物体中的糖蛋白一般包括多个糖基化位点，而其每个糖基化位点的糖链结构具有其特异的糖型。因此鉴定糖蛋白上所有的糖链结构是非常具有挑战性，其中包括鉴定糖蛋白上的糖基化位点，分析每个糖型结构中的糖链组成，糖链序列，分支类型以及糖链残基中的羟基基团与其他残基的连接方式。现在没有一种技术可以完全得到糖蛋白糖基化修饰所有信息，只有将多种方法联合起来，如多种质谱技术联合，再加上糖链生物合成通路特点才能得到糖链的信息。

糖链分离和分析的方法在最近几年也得到长足的发展。通常，糖蛋白或者糖脂上的糖链通过酶解或者化学反应的方法释放，例如用PNGase F可以释放几乎所有的N-连接糖链，而通过β-消除反应可以释放所有的O-连接糖链。从糖蛋白或者糖脂上释放的糖链需要进行除盐处理，并且要将其从酶，化学反应物以及多肽或者脂类物质等非糖类物质中分离出来，现有的方法主要有特异亲和方法，反相高效液相色谱法，亲水色谱或者是多维联合分离等。这些方法的主要缺点是不能完全将糖链和其他物质分离，特别是亲水色谱法无法将亲水性多肽和盐类等物质与糖链分离。另外最近由Hui Zhang等发明了一种利用肼化修饰的磁性微粒分离N-连接糖链的方法，该方法通过化学反应将糖链共价结合至磁性微粒上，充分清洗后通过水解的方法可以再次释放糖链，达到分离糖链的目的。该方法的优势就是通过共价结合的方法分离糖链可以避免非特异性吸附，能较好地分离糖链。但是也可以看到该方法同样存在反应步骤复杂，反应效率较低，导致最后鉴定的糖链种类较少等缺点。

发明内容

本发明提供了一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全N-连接糖链的方法，以解决现有技术反应效率较低、可鉴定的糖链种类较少的问题。

为实现以上发明目的，本发明给出以下基本技术方案：

一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全N-连接糖链的方法，包括以下步骤：

（1）蛋白样品的预处理

取蛋白样品加入超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，再加入弱碱性清洗液，再次离心从而尽可能去除杂质；另取一离心管，将8～12KD的超滤管倒置于该离心管中，然后离心，收集离出的蛋白，用Bradford方法定量，最后定容至1～5mg/ml，即得到定容的蛋白溶液；

（2）定容的蛋白溶液中糖蛋白全N-连接糖链分离

将定容的蛋白溶液加入另一8～12KD的超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，然后加入等体积的16M尿素溶液，在恒温振荡孵育器中振荡混合，然后离心；再加入8M尿素溶液至超滤管中（用以使蛋白充分变性）并进行离心，弃去离心管中的流出液；然后加入10～100mM NH₄HCO₃，振荡混合，离心；将超滤管转移至新的离心管中，向超滤管中加入反应缓冲液，振荡混合，再向超滤管中加入PNGase F酶液，振荡混合，37℃湿盒中静置孵育过夜，然后离心；再加超纯水至超滤管中后离心，收集流出液，并冷冻干燥，得到已分离的糖蛋白全N-连接糖链；

或者，将定容的蛋白溶液加入另一8～12KD的超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，加入等体积的16M尿素溶液，振荡混合，离心；再加入8M尿素溶液至超滤管中，离心，弃去收集管中的流出液；然后加入10～100mM的DTT（二硫苏糖醇）溶液并振荡混合，56℃静置孵育，离心；再加入10～100mM的IAM(碘乙酰胺)或IAA（碘乙酸）溶液并振荡混合，暗处静置孵育，离心；再加8M尿素溶液至超滤管中，离心，至少重复1次；然后加反应缓冲液至超滤管中，离心，至少重复1次；将超滤管转移至新的离心管中，加入用40mM NH₄HCO₃溶解的PNGase F酶液，振荡混合，37℃的湿盒中静置孵育过夜，然后离心；再加超纯水至超滤管中后离心，收集流出液，并冷冻干燥，得到已分离的糖蛋白全N-连接糖链。（PNGase F酶液来自New EnglandBioLabs的PNGase F酶解试剂盒。）

基于以上基本技术方案，为取得更佳的技术效果，还可以对方案进一步改进、限定，如：

上述所有的超滤管均采用10KD滤膜，效果最佳。

上述步骤（1）所述的弱碱性清洗液采用40mM NH₄HCO₃或者NH₄AC（醋酸铵）溶液。

上述步骤（2）中的反应缓冲液具体可以采用10～100mM NH₄HCO₃或NH₄AC溶液，或者还可以直接采用PNGase F酶解试剂盒中的10×反应缓冲液。

在上述步骤（2）中，加入反应缓冲液的同时还加入NP-40，其终浓度为10%（V/V）；可以提高活性，使得反应效率更高。

对于上述步骤（2）中列出的第一种方案，步骤（2）中，为进一步充分变性，可以在加入10～100mM NH₄HCO₃，振荡混合，14,000g离心后，向超滤管中加入PNGase F酶解试剂盒中的10×变性缓冲液5μl，封口后沸水浴中变性5min；取出后待其回至室温后，再进行所述向超滤管中加入反应缓冲液的操作。

对于上述步骤（2）中列出的两种方案，步骤（2）中所述向超滤管中加入PNGase F酶液，其加入量均按照质量比计为，滤膜上的蛋白：酶液=50:1～100:1。

上述步骤（2）中所述加入超纯水至超滤管中后离心并收集流出液的操作，重复一次；可以使释放的糖链进一步充分分离。

上述步骤（2）的所有离心操作均是在离心机中14,000g离心；所述振荡混合均是在550rpm的恒温振荡孵育器中进行，效果最佳。

对按照上述分离方法分离得到糖蛋白的N-连接糖链进行鉴别的方法，包括以下步骤：

（3）糖链除盐处理

准备Sepharose 4B：加Sepharose 4B至离心管中，再向该离心管中加入体积比为1:1的甲醇：水溶液，摇匀，离心，弃上清，重复清洗至少1次；再向离心管中加入体积比为5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液，摇匀，离心，弃上清，重复清洗至少1次；

向上述步骤（2）得到的糖蛋白全N-连接糖链样品中加入体积比为5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液，上样至Sepharose 4B的离心管中摇匀，25℃振荡反应；14,000g离心15min弃上清；再加入5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液摇匀，12,000g离心5min，弃上清，重复清洗至少1次；再加入1:1的甲醇：水溶液摇匀，25℃振荡，12,000g离心15min，收集上清，并冷冻干燥；（经此步骤，对糖链样品进一步纯化，从而使得到的糖蛋白全N-连接糖链样品可直接用于质谱鉴定。）

（4）分析样品中的全N-连接糖链结构

取50%甲醇溶液完全溶解经步骤（3）处理后的糖蛋白全N-连接糖链样品，然后点样于MTPAnchorchip 384点的靶板上，真空抽干；再加20mg/ml的基质DHB至样品板上，真空抽干；用多肽校正混合物作为外标校正质谱仪；以反射阳性离子模式鉴定多糖，一级质谱方法参数如下：离子源1，7.50KV；离子源2，6.75KV，反射电压1，29.5KV；反射电压2，13.95KV；LIFT1，19KV；LIFT2，3.7KV；激发光源为N₂激光，分子量检测范围为700-6800；检测时每个样品在多点采集图谱，每个图谱扫描1500次，最后将所有谱图叠加得到最后的多糖一级图谱；从一级图谱中选择质谱峰进行二级质谱分析，其分析方法参数如下：离子源1，25KV；离子源2，22.40KV；反射电压1，26.45KV；反射电压2，13.35KV；LIFT1，19KV；LIFT2，3.7KV；

（5）复杂糖链样品的MALDI结果分析

采用SimGlycan 4软件，选择目标前体离子分析其二级图谱，分析参数为：选择前体离子分子量，电荷状态，阳性离子化模式，加和Na⁺，前体离子容忍度为1，碎片离子容忍度为0.5，无化学衍生化，无还原端修饰；分析后得到可能的糖链结构，选择其中得分最高即最可能的糖链结构，软件中同时提供糖链及其碎片的具体结构，结果用Glycanworkbench绘制二级碎片和一级质谱结果，并标注于图中。

本发明具有以下优点：

滤膜辅助分离蛋白样品中糖蛋白全N-连接糖链的方法利用蛋白质与糖链分子量之间的明显差异分离糖蛋白上的糖链结构。该方法分离糖链效果明显，并避免了因非特异性吸附和化学反应带入副产物；反应效率高、反应步骤简明。

附图说明

图1为滤膜辅助分离血清中糖蛋白全N-连接糖链的方法示意图。

图2为血清糖蛋白全N-连接糖链连接指纹图谱：糖链结构中蓝色方框为GlcNAc，绿色圆圈为Man，黄色圆圈为Gal，黄色方框为GalNAc，白色菱形方框为NeuAc。

图3为m/z 1810.004的MALDI-TOF/TOF二级图谱。

图4为m/z 1851.035的MALDI-TOF/TOF二级图谱。

具体实施方式

本发明利用8～12KD滤膜的分子筛效应，将从糖蛋白上释放的糖链与蛋白分离，如图1。蛋白质的分子量大于10KD，经鉴定，N-连接糖链最多含有28个糖基，其分子量不会超过6000Da。在10KD分子筛上糖蛋白的N-连接糖链被PNGase F酶释放，通过反复离心的方法使N-连接糖链流出，蛋白仍保留于滤膜上，从而实现了糖链的分离。

下面以血清样品为例，依照本发明实现分离糖蛋白全N-连接糖链及其鉴别的方法。其他蛋白样品（如唾液、尿液等）的主要步骤与此例完全相同。

（1）血清蛋白的预处理

取血清样品，用离心机离心，取中间液体部分，加入超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，再加入40mM NH₄HCO₃，再次离心从而尽可能去除杂质；另取一离心管，将10KD的超滤管倒置于该离心管中，然后离心，收集离出的蛋白，用Bradford方法定量，最后定容至2mg/ml，即得到定容的蛋白溶液；

（2）血清中糖蛋白全N-连接糖链分离

将定容的蛋白溶液加入另一10KD的超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，然后加入等体积的16M尿素溶液，在恒温振荡孵育器中振荡混合，然后离心；再加入8M尿素溶液至超滤管中并进行离心，弃去离心管中的流出液；然后加入10～100mM NH₄HCO₃，振荡混合，离心；将超滤管转移至新的离心管中，向超滤管中加入反应缓冲液，振荡混合，再向超滤管中加入PNGase F酶液，振荡混合，37℃湿盒中静置孵育过夜，然后离心；再加超纯水至超滤管中后离心，收集流出液，并冷冻干燥，得到已分离的糖蛋白全N-连接糖链；

该步骤（2）还可以采用另一种方案：

将定容的蛋白溶液加入另一10KD的超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，加入等体积的16M尿素溶液，振荡混合，离心；再加入8M尿素溶液至超滤管中，离心，弃去收集管中的流出液；然后加入90mM的DTT（二硫苏糖醇）溶液并振荡混合，56℃静置孵育，离心；再加入20mM的IAM(碘乙酰胺)或IAA（碘乙酸）溶液并振荡混合，暗处静置孵育，离心；再加8M尿素溶液至超滤管中，离心，至少重复1次；然后加反应缓冲液至超滤管中，离心，至少重复1次；将超滤管转移至新的离心管中，加入用40mM NH₄HCO₃溶解的PNGase F酶液，振荡混合，37℃的湿盒中静置孵育过夜，然后离心；再加超纯水至超滤管中后离心，收集流出液，并冷冻干燥，得到已分离的糖蛋白全N-连接糖链。

以上的PNGase F酶液均来自New England BioLabs的PNGase F酶解试剂盒（P0704L）。

经实验，当其他条件（如酶液加入量、离心过程等参数）按照常规操作方式进行时，分离效果基本符合预期。

以下实施例对本发明方案以具体实验操作过程示例详述，其中的实验条件和设定参数仅作为最佳操作方式的参考，而不应视为对本发明基本技术方案的局限。

（1）血清蛋白的预处理

血清样品用离心机12,000g离心15min，取中间液体部分，加入10KD的超滤管中（对于唾液、尿液等蛋白样品，一般不需要经过此步骤），将超滤管置于配套的离心管中，进行离心，然后加入400μl的40mM NH₄HCO₃，再次离心，重复一次；将8～12KD滤膜倒置于新的离心管中，9000g离心3min，收集离出的蛋白（约50μl），用Bradford方法定量，最后分别定容至2mg/ml；

选取滤膜的考虑：对于“8～12KD”，若小于8，则有部分无法通过，难以达到全N-连接糖链；若大于12，则会给下一环节造成蛋白污染。

（2）血清中糖蛋白全N-连接糖链分离

取定容的蛋白溶液2mg分次（每次500μl）加入新的10KD的超滤管中并加入等体积的16M尿素溶液，在550rpm的恒温振荡孵育器中，离心机中14,000g离心15min。再加入200μl的8M尿素溶液至超滤管中并在14,000g离心15min，弃去收集管（即离心管）中的流出液。加入200μl的40mMNH₄HCO₃，振荡混合2min，14,000g离心15min，重复一次。向超滤管中加入PNGase F酶解试剂盒中的10×变性缓冲液5μl，封口后沸水浴中变性5min。取出后待其回至室温后，向超滤管中加入5μl PNGase F酶解试剂盒中的10×反应缓冲液和5μl NP-40，振荡混合2min，再向超滤管中加入3μl PNGase F酶液，振荡混合2min，37℃湿盒中静置孵育过夜，14,000g离心10min。加200μl的超纯水至超滤管中后14,000g离心8min，重复一次。收集流出液（此时，血清样品中的糖蛋白的N-连接糖链已经分离），并用冷冻干燥仪干燥。

以上步骤（2）还可以采用另一种方案（作为第二实施例），如下：

取定容的蛋白溶液2mg分次（每次500μl）加入新的10KD的超滤管中并加入等体积的16mol/L尿素溶液，在550rpm的恒温振荡孵育器中振荡混合2min，离心机中14,000g离心15min。再加入200μL的8mol/L尿素溶液至超滤管中并在14,000g离心15min，弃去收集管中的流出液。加入150μL的10mM的DTT溶液并在550rpm的恒温振荡孵育器中振荡混合2min，56℃静置孵育45min，14,000g离心10min。加入150μL的20mM的IAM溶液并在550rpm的恒温振荡孵育器中振荡混合2min，暗处静置孵育20min，14,000g离心10min。加150μL的尿素溶液至超滤管中后14,000g离心15min，重复两次；加150μL的40mM NH₄HCO₃至超滤管中后14,000g离心10min，重复两次。将超滤管转移至新的收集管中，加入用40mmol/LNH₄HCO₃溶解的PNGase F酶液3μL，并在550rpm的恒温振荡孵育器中振荡混合2min。37℃的湿盒中静置孵育过夜，14,000g离心10min。加200μL的超纯水至超滤管中后14,000g离心8min，重复一次。收集流出液，并用冷冻干燥仪干燥。

（3）糖链除盐处理

加100μl的Sepharose 4B至1.5ml的离心管中，向该离心管中加入1:1的甲醇：水溶液1ml，摇匀，12,000g离心5min，弃上清，重复清洗2次。再向离心管中加入5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液1ml，摇匀，12,000g离心5min，弃上清，重复清洗2次；

向步骤（2）得到的冻干的健康志愿者和HCC患者血清糖蛋白中的糖链样品中加入500μl的5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液，上样至Sepharose 4B的离心管中摇匀，25℃振荡反应1h。14,000g离心15min弃上清。加1ml 5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液摇匀，12,000g离心5min，弃上清，重复清洗3次。再加入1ml的1:1的甲醇：水溶液摇匀，25℃振荡20min，12,000g离心15min，收集上清。重复一次，合并收集的样品并于冷冻干燥仪中冻干。

以上的步骤（3）旨在对糖链样品进一步纯化，从而使得到的糖蛋白全N-连接糖链样品可直接用于质谱鉴定。

（4）分析血清样品中的全N-连接糖链结构

应用Bruker Daltonics公司的ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF-MS解析分离的血清中糖蛋白的N-连接糖链。取20μl的50%甲醇溶液完全溶解糖链，取2μl糖链溶液点样于MTP Anchorchip 384点的靶板上，真空抽干。再加1μl的20mg/ml的基质DHB至样品板上，真空抽干。以反射阳性离子模式鉴定多糖，一级质谱方法参数如下：离子源1，7.50KV；离子源2，6.75KV，反射电压1，29.5KV；反射电压2，13.95KV；LIFT1，19KV；LIFT2，3.7KV。激发光源为N₂激光（337nm），分子量检测范围为700-6800。用多肽校正混合物作为外标校正质谱仪。检测时每个样品在多点采集图谱，每个图谱扫描1500次，最后将所有谱图叠加得到最后的多糖一级图谱。从一级图谱中选择质谱峰进行二级质谱分析，其分析方法参数如下：离子源1，25KV；离子源2，22.40KV；反射电压1，26.45KV；反射电压2，13.35KV；LIFT1，19KV；LIFT2，3.7KV。

（5）复杂糖链样品的MALDI结果分析

糖链的二级质谱图用Primer公司的商业分析软件SimGlycan 4分析。打开MALDI结果中的.fid文件，可以看到软件的主界面看到所有的质谱结果。选择目标前体离子分析其二级图谱，分析参数为：选择前体离子分子量，电荷状态，阳性离子化模式，加和Na⁺，前体离子容忍度为1，碎片离子容忍度为0.5，无化学衍生化，无还原端修饰。分析后得到可能的糖链结构，选择其中得分最高即最可能的糖链结构，软件中同时提供糖链及其碎片的具体结构，结果用Glycanworkbench绘制二级碎片和一级质谱结果，并标注于图中。

实验结果

1滤膜辅助分离血清中糖蛋白全N-连接糖链指纹图谱

质谱作为最灵敏的检测手段之一被广泛应用在了糖链的解析中，该方法可以获得糖链的组成，序列信息，分支情况等，并且通过串联质谱可以获得糖链连键信息，甚至在有的时候可以的糖链的同分异构体的结构信息。本实验中利用布鲁克公司的新型MALDI-TOF质谱仪ultrafleXtreme系列。该质谱仪具备1kHz smartbeam-II激光技术，是最新的离子光学技术。作为唯一的获得1kHz高通量的MALDI-TOF/TOF，且具有很高的灵敏度，可用于生物标志物发现和定量。从图2中可以看出该方法从血清总共分离得到17个糖链结构，且糖链结构峰型明显，信噪比大均大于8。

2血清糖蛋白N-连接糖链结构的串联质谱解析

通过MALDI-TOF-MS一级质谱分析可以看到血清中糖链指纹图谱，但不能解析糖链组成，序列，分支，连键形式和异构体形式。而利用二级质谱对糖链进行离子碎片化，出现糖链糖苷键和穿环断裂，通过分析糖链的断裂情况可以解析糖链结构信息。传统的MALDI反射器通过源后降解断裂糖链而获得糖链的信息，这种亚稳态解离方式是离子从离子源出来后在源后降解装置中通过碰撞产生一系列糖链的碎片离子，经过加速的离子可以被分步反射器检测到。这种方式虽然被用来检测糖链序列，但穿环断裂得到糖链连键方式的碎片离子常常检测不到。近年来，为了克服传统MALDI的PSD和CID离子化方式在片段化时的限制科学家设计了串联的TOF/TOF，这种高真空的脉冲的MALDI-TOF可以快速产生离子，通过定时离子门筛选母离子，用带千伏电压的气体原子或分子碰撞，TOF反射器进行第二次加速。因此这种MALDI质谱可以获得多肽和糖链的高能CID谱。本实验采用MALDI-TOF/TOF对一级质谱中的糖链质谱峰进行二级碎片化，产生糖链质谱峰的二级图谱。二级结果用SimGlycan分析得出每种碎片离子的断裂形式，用Glycoworkbench注释图谱。其中m/z为1810.004和1851.035的二级图谱如图3，4所示，图中可以看出糖链母离子断裂时大多数为糖苷键断裂，即多为Y离子和B离子，但是也有很多糖链断裂为穿环断裂。这种现象出现的原因是母离子在断裂时，糖苷键的断裂需要较小的能量就可以断裂，而穿环断裂则需要更大的能量。其中在母离子m/z 1810.004中的碎片1444.816（Y_4α）和母离子m/z 1851.035中的碎片1483.923（B₅）分别为这两种糖链最主要的断裂方式，这是由于碎片的断裂偏好于在GlcNAc残基的相邻糖苷键断裂。除了B离子和Y离子外，二级图谱中同样存在含量较高的X离子，A离子，C离子和Z离子，如在m/z1851.035二级图谱中，^0，2X₂（635.314）可以知道C-2上的O原子是否在糖苷键中，并且可以看出GlcNAc是连接到分支处甘露糖的C2上，而其中的^1，5X离子由于是从C1位置上断裂，所以基本上不能提供连键的信息。对于^3,5A，^2,4A，^0,2A的断裂提供大量的连键信息，特别是如果这些断裂是在非还原端，并且与X断裂相结合就可以得出糖链之间的连接方式。

Claims (10)

1.一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全N-连接糖链的方法，包括以下步骤：

（1）蛋白样品的预处理

取蛋白样品加入超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，再加入弱碱性清洗液，再次离心从而尽可能去除杂质；另取一离心管，将8～12KD的超滤管倒置于该离心管中，然后离心，收集离出的蛋白，用Bradford方法定量，最后定容至1～5mg/ml，即得到定容的蛋白溶液；

（2）定容的蛋白溶液中糖蛋白全N-连接糖链分离

将定容的蛋白溶液加入另一8～12KD的超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，然后加入等体积的16M尿素溶液，在恒温振荡孵育器中振荡混合，然后离心；再加入8M尿素溶液至超滤管中并进行离心，弃去离心管中的流出液；然后加入10～100mM NH₄HCO₃，振荡混合，离心；将超滤管转移至新的离心管中，向超滤管中加入反应缓冲液，振荡混合，再向超滤管中加入PNGase F酶液，振荡混合，37℃湿盒中静置孵育过夜，然后离心；再加超纯水至超滤管中后离心，收集流出液，并冷冻干燥，得到已分离的糖蛋白全N-连接糖链；

或者，将定容的蛋白溶液加入另一8～12KD的超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，加入等体积的16M尿素溶液，振荡混合，离心；再加入8M尿素溶液至超滤管中，离心，弃去收集管中的流出液；然后加入10～100mM的DTT（二硫苏糖醇）溶液并振荡混合，56℃静置孵育，离心；再加入10～100mM的IAM(碘乙酰胺)或IAA（碘乙酸）溶液并振荡混合，暗处静置孵育，离心；再加8M尿素溶液至超滤管中，离心，至少重复1次；然后加反应缓冲液至超滤管中，离心，至少重复1次；将超滤管转移至新的离心管中，加入用40mM NH₄HCO₃溶解的PNGase F酶液，振荡混合，37℃的湿盒中静置孵育过夜，然后离心；再加超纯水至超滤管中后离心，收集流出液，并冷冻干燥，得到已分离的糖蛋白全N-连接糖链。

2.根据权利要求1所述的滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全N-连接糖链的方法，其特征在于：所有的超滤管均采用10KD滤膜。

3.根据权利要求2所述的滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全N-连接糖链的方法，其特征在于：步骤（1）所述的弱碱性清洗液采用40mM NH₄HCO₃或者NH₄AC溶液。

4.根据权利要求1至3任一所述的滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全N-连接糖链的方法，其特征在于：步骤（2）中所述反应缓冲液采用10～100mMNH₄HCO₃或NH₄AC溶液，或者采用PNGase F酶解试剂盒中的10×反应缓冲液。

5.根据权利要求4所述的滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全N-连接糖链的方法，其特征在于：步骤（2）中，在加入反应缓冲液的同时还加入NP-40，其终浓度为10%（V/V）。

6.根据权利要求5所述的滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全N-连接糖链的方法，其特征在于：对于步骤（2）限定的前一种方案，步骤（2）中，在加入10～100mM NH₄HCO₃，振荡混合，14,000g离心后，向超滤管中加入PNGase F酶解试剂盒中的10×变性缓冲液5μl，封口后沸水浴中变性5min；取出后待其回至室温后，再进行所述向超滤管中加入反应缓冲液的操作。

7.根据权利要求6所述的滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全N-连接糖链的方法，其特征在于：步骤（2）中所述向超滤管中加入PNGase F酶液，其加入量均按照质量比计为，滤膜上的蛋白：酶液=50:1～100:1。

8.根据权利要求7所述的滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全N-连接糖链的方法，其特征在于：步骤（2）中所述加入超纯水至超滤管中后离心并收集流出液的操作，重复一次。

9.根据权利要求8所述的滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全N-连接糖链的方法，其特征在于：步骤（2）的所有离心操作均是在离心机中14,000g离心；所述振荡混合均是在550rpm的恒温振荡孵育器中进行。

10.对按照权利要求1所述方法分离得到糖蛋白的N-连接糖链进行鉴别的方法，包括以下步骤：

（3）糖链除盐处理

准备Sepharose 4B：加Sepharose 4B至离心管中，再向该离心管中加入体积比为1:1的甲醇：水溶液，摇匀，离心，弃上清，重复清洗至少1次；再向离心管中加入体积比为5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液，摇匀，离心，弃上清，重复清洗至少1次；

向所述步骤（2）得到的糖蛋白全N-连接糖链样品中加入体积比为5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液，上样至Sepharose 4B的离心管中摇匀，25℃振荡反应；14,000g离心15min弃上清；再加入5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液摇匀，12,000g离心5min，弃上清，重复清洗至少1次；再加入1:1的甲醇：水溶液摇匀，25℃振荡，12,000g离心15min，收集上清，并冷冻干燥；

（4）分析样品中的全N-连接糖链结构

取50%甲醇溶液完全溶解经步骤（3）处理后的糖蛋白全N-连接糖链样品，然后点样于MTPAnchorchip 384点的靶板上，真空抽干；再加20mg/ml的基质DHB至样品板上，真空抽干；用多肽校正混合物作为外标校正质谱仪；以反射阳性离子模式鉴定多糖，一级质谱方法参数如下：离子源1，7.50KV；离子源2，6.75KV，反射电压1，29.5KV；反射电压2，13.95KV；LIFT1，19KV；LIFT2，3.7KV；激发光源为N2激光，分子量检测范围为700-6800；检测时每个样品在多点采集图谱，每个图谱扫描1500次，最后将所有谱图叠加得到最后的多糖一级图谱；从一级图谱中选择质谱峰进行二级质谱分析，其分析方法参数如下：离子源1，25KV；离子源2，22.40KV；反射电压1，26.45KV；反射电压2，13.35KV；LIFT1，19KV；LIFT2，3.7KV；

（5）复杂糖链样品的MALDI结果分析

采用SimGlycan 4软件，选择目标前体离子分析其二级图谱，分析参数为：选择前体离子分子量，电荷状态，阳性离子化模式，加和Na⁺，前体离子容忍度为1，碎片离子容忍度为0.5，无化学衍生化，无还原端修饰；分析后得到可能的糖链结构，选择其中得分最高即最可能的糖链结构，软件中同时提供糖链及其碎片的具体结构，结果用Glycanworkbench绘制二级碎片和一级质谱结果，并标注于图中。

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