CN101906452A - 一种糖苷内切酶催化同位素标记n-糖链的方法 - Google Patents

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张伟
汪泓
杨芃原
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Abstract

本发明属分析化学技术领域，具体为一种糖苷内切酶催化同位素标记N-糖链的方法。本发明采用在18O水中进行糖苷内切酶酶解糖蛋白的反应，在N-糖链被酶切下的同时，在其还原末端标记上一个同位素18O分子；质谱检测结果证明，同位素18O标记的糖链分子量和不标记的糖链分子量之间相差2道尔顿，同位素18O分子被稳定地标记于糖链还原末端。本发明简单、高效，弥补了糖链同位素18O标记技术的空白，可以有效地用于糖链相对定量。

Description

一种糖苷内切酶催化同位素标记N-糖链的方法
技术领域
本发明属分析化学技术领域，具体涉及一种同位素标记N-糖链的方法，尤其涉及一种糖苷内切酶催化的同位素18O标记N-糖链的方法。
背景技术
蛋白质糖基化是生物体内最普遍、最重要、也是最复杂的蛋白质翻译后修饰（PTMs）之一。蛋白质糖基化修饰始于内质网和高尔基体，成熟后或定位于质膜、胞质中发挥功能；或分泌到细胞外，形成分泌蛋白。糖链在生物功能方面发挥着重要作用，糖链会影响蛋白的结构、定位和功能，影响分子和细胞的识别、信号传导和相互作用等等。此外，许多疾病也与糖基化的异常有着密切关系，在临床研究上，糖蛋白与糖链是潜在的疾病分子标志物和药物靶标。
因此，研究不同生理或疾病状态下糖链相对量的变化具有重要意义，定量糖组学也应运而生。定量糖组学的分析方法主要是利用同位素标记技术，即将同位素标记的糖链与不标记的糖链等量混合，并由质谱检测。在质谱中，同位素标记的糖链与不标记的糖链离子化效率相当，并形成有一定道尔顿差异的两个独立峰，根据峰强或峰面积比即可实现糖链的相对定量。目前，糖链的同位素标记方法主要有三种：基于同位素碘甲烷的全甲基化同位素标记，基于同位素苯胺的糖链还原末端同位素标记，和基于代谢方法的同位素标记。但是，这些方法都存在一定的弊端，前两种方法涉及化学反应，需要额外的反应试剂和步骤，这不仅影响标记效率，而且会产生副反应，对后续分析十分不利；而后一种方法不仅操作复杂，而且只能用于细胞样品，应用范围有限。
本发明提出的酶催化同位素标记糖链的方法，采用了生物酶催化反应，避免了化学反应对样品产生的不利影响；且同位素18O不影响糖链的质谱离子化效率，18O标记的糖链与不标记的糖链离子化效率完全相同，可以高效地用于糖链相对定量。本发明提出的酶催化同位素标记糖链的方法，弥补了糖链同位素18O标记技术的空白，在糖组学、糖生物学、生物医学等领域有着良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提出一种简单、高效、无副反应的酶催化同位素标记糖链的方法。
本发明提出的酶催化同位素标记糖链的方法，即糖苷内切酶催化同位素标记N-糖链的方法，是在糖苷内切酶的作用下，在N-糖链的还原末端标记上一个同位素18O分子，它包括以下步骤：将糖蛋白样品和糖苷内切酶溶于18O水（H2 18O）配置的缓冲溶液中，糖蛋白在缓冲溶液中的浓度为0.1-10微克/微升；将溶液放置于37℃进行酶解，酶解时间12-20小时；将溶液用超滤管进行超滤，去除酶解后的蛋白和糖苷内切酶；将缓冲溶液用石墨化碳柱进行处理，去除缓冲溶液中的盐；将溶液冷冻干燥，并质谱检测标记，标记的糖链在质谱中表现为比不标记的糖链分子量高2道尔顿的独立峰。
糖苷内切酶主要包括以下几种亚型：Endo H、Endo F1、Endo F2或Endo F3，或者广义上的糖苷内切酶PNGase F、PNGase A。所有糖苷内切酶亚型均适用于本发明，仅缓冲溶液需做相应改变。
本发明的积极效果如下：
1、简单、高效，不需要额外的试剂和步骤，不产生副反应，避免了化学反应的不利因素；
2、只要酶解反应发生，标记反应就发生，标记效率高；
3、标记的糖链，其物理、化学性质稳定；
4、标记无样品类型限制，应用范围广；
5、同位素18O不影响糖链的质谱离子化效率，标记与不标记的糖链离子化效率完全相同。
附图说明
图1为MALDI质谱检测糖苷内切酶Endo H催化的同位素18O标记和不标记的糖链的质谱谱图。上图是不标记的糖链谱图，下图是同位素18O标记的糖链谱图。谱图清晰地显示了同位素18O标记和不标记的糖链峰之间2道尔顿分子量的差异。该图所用的糖蛋白样品为蔗糖酶（Invertase）。G及其数字表示糖链中乙酰葡糖胺的数量；M及其数字表示糖链中甘露糖的数量。所有离子均为单电荷的钠离子加合物。
图2为图1中G1M10糖链峰的放大图。上图为不标记的G1M10谱图，下图为同位素18O标记的G1M10谱图。
图3为图2中同位素18O标记和不标记的糖链等量混合后的G1M10糖链峰的质谱谱图放大图。谱图中两个峰的强度差异是由于同位素峰的重叠而非离子化效率造成的。
图4为MALDI质谱检测糖苷内切酶Endo F2催化的同位素18O标记和不标记的糖链的质谱谱图。上图是不标记的糖链谱图，下图是同位素18O标记的糖链谱图。谱图清晰地显示了同位素18O标记和不标记的糖链峰之间2道尔顿分子量的差异。该图所用的糖蛋白样品为胎球蛋白（Fetuin）。HexNAc及其数字表示糖链中乙酰己糖胺的数量；Hex及其数字表示糖链中己糖的数量。所有离子均为单电荷的钠离子加合物。
图5为MALDI质谱检测糖苷内切酶Endo F3催化的同位素18O标记和不标记的糖链的质谱谱图。上图是不标记的糖链谱图，下图是同位素18O标记的糖链谱图。谱图清晰地显示了同位素18O标记和不标记的糖链峰之间2道尔顿分子量的差异。该图所用的糖蛋白样品为胎球蛋白（Fetuin）。HexNAc及其数字表示糖链中乙酰己糖胺的数量；Hex及其数字表示糖链中己糖的数量。所有离子均为单电荷的钠离子加合物。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体步骤作进一步描述。
糖苷内切酶包括多种亚型，以下以糖苷内切酶亚型之一Endo H为例说明。
将变性了的糖蛋白样品和糖苷内切酶Endo H溶于18O水配置的50毫摩尔柠檬酸钠缓冲溶液（pH值为5.5）中，糖蛋白在缓冲液中的浓度在0.1-10微克/微升，糖苷内切酶Endo H在缓冲液中的浓度视具体酶活力而定。
将溶液放置于酶解仪中进行酶解，酶解仪温度为37℃，转速在800-1200转/分钟，酶解时间在12-20小时。
酶解完成后，将溶液移至3k-6k的超滤管中，将超滤管放置于离心机中进行超滤，离心机温度为4℃，转速在7000-7500个相对离心力，时间在1-3小时。
超滤完成后，将滤过的溶液移至用80%乙腈0.1%三氟乙酸溶液活化了的石墨化碳柱上，以0.5-1毫升/分钟的速度使溶液流过柱子，反复流过三遍后，用3毫升0.1%三氟乙酸溶液，以0.5-1毫升/分钟的速度清洗柱子，最后用1毫升25%乙腈0.1%三氟乙酸溶液，以0.5-1毫升/分钟的速度洗脱柱子，并收集洗脱液。
将洗脱液置于冷冻干燥机中干燥，干燥后的样品用10-50微升50%乙腈0.1%三氟乙酸溶液重溶，并取1-5微升溶液用生物质谱进行检测，MALDI源和ESI源均可，质谱分辨率需大于5000。
糖苷内切酶的其它亚型：Endo F1、Endo F2、Endo F3，以及广义上的糖苷内切酶PNGase F、PNGase A，均可以本方式实施，仅缓冲溶液需做相应改变。
虽本发明已以较佳之实施方式详述如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技术者，在不脱离本发明之精神和范围内，可作些许更动和润饰，本发明之保护范围当视所附之权利要求范围所界定。

Claims (2)

1.一种糖苷内切酶催化同位素标记N-糖链的方法，其特征在于，将糖蛋白和糖苷内切酶溶于18O水配置的缓冲溶液中，于37℃进行酶解，酶解时间为12到20小时；其中，糖蛋白在缓冲液中的浓度为0.1-10微克/微升。
2.根据权利要求1所述的糖苷内切酶催化同位素标记N-糖链的方法，其特征在于所述糖苷内切酶为以下几种亚型：Endo H、Endo F1、Endo F2或Endo F3，或者广义上的糖苷内切酶PNGase F、PNGase A。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102788720A (zh) * 2012-06-05 2012-11-21 西北大学 一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全n-连接糖链及其鉴别方法
CN104458989A (zh) * 2014-09-12 2015-03-25 江西师范大学 基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方法
CN110028539A (zh) * 2019-04-24 2019-07-19 复旦大学 同位素标记仿生糖或糖组、其制备方法及应用
CN117969642A (zh) * 2024-04-02 2024-05-03 浙江大学 一种植物n-糖链的精准相对定量分析方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050074794A1 (en) * 2003-10-07 2005-04-07 Tran Nathaniel Tue Methods and reagents for differential proteomic analysis
US20060084065A1 (en) * 2003-01-28 2006-04-20 Nathaniel Tue Tran Radioactive multiplexing analytical methods for biomarkers discovery

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060084065A1 (en) * 2003-01-28 2006-04-20 Nathaniel Tue Tran Radioactive multiplexing analytical methods for biomarkers discovery
US20050074794A1 (en) * 2003-10-07 2005-04-07 Tran Nathaniel Tue Methods and reagents for differential proteomic analysis

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《Journal of Proteome Research》 20091119 Ze Liu et al. Tandem 18O Stable Isotope Labeling for Quantification of N-Glycoproteome 227-236 1-2 第9卷, 2 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102788720A (zh) * 2012-06-05 2012-11-21 西北大学 一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全n-连接糖链及其鉴别方法
CN104458989A (zh) * 2014-09-12 2015-03-25 江西师范大学 基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方法
CN110028539A (zh) * 2019-04-24 2019-07-19 复旦大学 同位素标记仿生糖或糖组、其制备方法及应用
CN110028539B (zh) * 2019-04-24 2023-01-31 复旦大学 同位素标记仿生糖或糖组、其制备方法及应用
CN117969642A (zh) * 2024-04-02 2024-05-03 浙江大学 一种植物n-糖链的精准相对定量分析方法及应用

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