CN101907603B - 一种基于18o标记的n-糖链相对定量方法 - Google Patents
一种基于18o标记的n-糖链相对定量方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101907603B CN101907603B CN2010102332323A CN201010233232A CN101907603B CN 101907603 B CN101907603 B CN 101907603B CN 2010102332323 A CN2010102332323 A CN 2010102332323A CN 201010233232 A CN201010233232 A CN 201010233232A CN 101907603 B CN101907603 B CN 101907603B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sugar chain
- mark
- isotope
- peak intensity
- peak
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明属分析化学技术领域,具体为一种基于18O标记的N-糖链相对定量方法。具体是将糖苷内切酶催化生成的同位素18O标记的N-糖链与糖苷内切酶催化生成的不标记的N-糖链按等摩尔比混合为溶液,由生物质谱检测峰强度,再经计算消除同位素峰重叠后,进行相对定量。本发明成功解决了同位素18O标记的糖链与不标记的糖链在质谱中同位素峰重叠的问题。本发明在两个数量级的动态范围内,取得了良好的线性和较低的变异系数,为糖苷内切酶催化同位素标记N-糖链的方法在定量糖组学中的应用提供了有效的修正和计算方法。
Description
技术领域
本发明属分析化学技术领域,具体涉及一种糖链相对定量方法,尤其涉及一种基于18O标记的N-糖链相对定量方法。
背景技术
蛋白质糖基化是生物体内最普遍、最重要、也是最复杂的蛋白质翻译后修饰(PTMs)之一,参与多种生物学过程,在生命活动中发挥着重要功能。在医学上,糖蛋白与糖链是潜在的疾病分子标志物和药物靶标,为多种疾病的早期诊断和治疗提供了可能。随着糖基化修饰和糖链研究的深入,仅限于对糖基化修饰和糖链的定性研究已不能满足生物、医学研究的需要,而对不同样品间的特定糖基化修饰或糖链进行相对定量研究具有更大的意义。因此,糖组学,特别是基于糖链相对定量的定量糖组学应运而生,引起了生物、医学等领域的广泛关注。
目前,定量糖组学主要有非标定量和同位素标记定量两种方法。这两种方法都是基于质谱检测的。非标定量是将需要定量的几组糖链样品分别进行质谱检测,再由谱图峰强度或峰面积,经过特定的软件计算,得到相对定量结果。非标定量操作简单,省时,但是定量结果准确度较低。同位素标记定量是将需要定量的几组糖链样品先分别进行相应的同位素标记,然后等量混合,进行质谱检测,将所有的样品都展示在一张质谱图上,每组样品峰之间相差相应同位素的分子量差,再由峰强度或峰面积得到定量结果。同位素标记定量操作较为繁琐,但是由于所有样品展示在一张谱图上,且不同同位素的离子化效率几乎相同,因此定量结果准确度高。现在发展的标记定量主要有,基于同位素碘甲烷标记的全甲基化方法,基于同位素苯衍生物标记的糖链还原末端标记方法,和基于同位素类似物标记的代谢标记方法。这些方法都存在一些问题,不仅操作繁琐,而且涉及化学反应,需要额外的试剂与步骤,并会产生副反应,影响标记效率和质谱检测。
我们最近发展的糖苷内切酶催化同位素标记N-糖链的方法,通过酶催化的方法将同位素 18O引入糖链,很好地弥补了上述同位素标记方法的不足。但要应用到糖链的相对定量中并取得良好的效果,依然需要一定的修正方法,这是由于标记与不标记的糖链分子量仅相差2道尔顿,会有较严重的同位素峰重叠;且由于技术限制,18O水中的18O元素的比例达不到100%,因此仍会有一定量的18O元素存在,造成由于标记不完全而形成的同位素峰重叠。
本发明提出的基于18O标记的N-糖链相对定量方法,通过公式计算,成功解决了同位素 18O标记的糖链与不标记的糖链在质谱中同位素峰重叠的问题,在扣除同位素峰重叠之后,在两个数量级的动态范围内,取得了良好的线性和较低的变异系数,为糖苷内切酶催化同位素标记N-糖链的方法在定量糖组学中的应用提供了修正方法。
发明内容
本发明的目的在于为18O标记的N-糖链提供一种相对定量的方法,以解决同位素18O标记的糖链与不标记的糖链在质谱中同位素峰重叠的问题。
本发明提出的基于18O标记的N-糖链相对定量方法,是通过质谱检测18O标记的糖链和不标记的糖链,得到若干对相差2道尔顿的糖链对峰。具体是将糖苷内切酶催化生成的同位素18O标记的N-糖链与糖苷内切酶催化生成的不标记的N-糖链按等摩尔比混合为溶液,由生物质谱检测峰强度,再经计算消除同位素峰重叠后,进行相对定量;其中溶液体系为50%乙腈0.1%三氟乙酸的水溶液。
上述混合溶液中,同位素18O标记的糖链与不标记的糖链在生物质谱中表现为两个分子量相差2道尔顿的独立峰。
由生物质谱检测到的峰强度,按下列公式计算消除同位素峰重叠:
上述公式中,ratio(16O/18O)表示消除同位素峰重叠后得到的定量结果,即不标记的糖链与同位素18O标记的糖链的比例,IA表示不标记的糖链峰强度,IB表示同位素18O标记的糖链峰强度,Ia+2/Ia表示不标记的糖链中分子量加2道尔顿的同位素峰强度所占比例,Ib-2/Ib表示同位素18O标记的糖链中分子量减2道尔顿的同位素峰强度所占比例。
通过几种标准糖蛋白糖链的计算,验证了本发明的有效性。如附图(详细数据见具体实施方式)所示,在两个数量级的动态范围内(1∶10-10∶1),所有糖链标准曲线的R2均达到0.99,变异系数均小于20%。
本发明的积极效果如下:
1、为18O标记的N-糖链提供了一种有效的相对定量方法;
2、提出了一种扣除同位素峰重叠的修正方法。
附图说明
图1为不标记的糖链与同位素18O标记的糖链理论峰强度比,同实际检测并修正得到的峰强度比的对偶对数曲线图。其中(1)、(2)、(3)所示糖链来自鸡卵清白蛋白(Ovalbumin);(4)、(5)、(6)所示糖链来自蔗糖酶(Invertase)。所有曲线R2均大于0.99,详细数据见具体实施方式。绿色圆圈表示甘露糖;蓝色方块表示乙酰葡糖胺。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体步骤作进一步描述。
将100微克鸡卵清白蛋白(Ovalbumin)和蔗糖酶(Invertase)分别进行糖苷内切酶酶解标记(18O水缓冲溶液中)和糖苷内切酶酶解不标记(普通超纯水缓冲溶液中),并将酶解后的样品经超滤管和石墨化碳柱依次纯化后,于冷冻干燥机中干燥。
将样品分别用10-50微升50%乙腈0.1%三氟乙酸的水溶液重溶,并分别取1-5微升用生物质谱进行检测,MALDI源和ESI源均可,质谱分辨率需大于5000。根据质谱谱图得到不标记的糖链峰强度(Ia)及其加2道尔顿的同位素峰强度(Ia+2),和标记的糖链峰强度(Ib)及其减2道尔顿的同位素峰强度(Ib-2)。
将标记的样品和不标记的样品按一定比例混合,并分别取1-5微升样品混合溶液用生物质谱进行检测,MALDI源和ESI源均可,质谱分辨率需大于5000。确定每个质谱谱图中相差2道尔顿的对峰,并分别得到对峰中分子量偏小的峰强度(IA)和分子量偏大的峰强度(IB)。
将得到的强度数据Ia、Ia+2、Ib、Ib-2、IA、IB带入下列公式计算,得到修正后的比例:
下表是选取卵清白蛋白和蔗糖酶的六种糖链按1∶10、1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1的比例进行混合后,按以上实施方式得到的结果及其线性(曲线图见附图)。
Claims (1)
1.一种基于18O标记的N-糖链相对定量方法,其特征在于,将糖苷内切酶催化生成的同位素18O标记的N-糖链与糖苷内切酶催化生成的不标记的N-糖链按等摩尔比混合为溶液,由生物质谱检测峰强度,再经计算消除同位素峰重叠后,进行相对定量;其中溶液体系为50%乙腈0.1%三氟乙酸的水溶液;
其中,由生物质谱检测到的峰强度,按下列公式计算消除同位素峰重叠:
其中ratio(16O/18O)表示消除同位素峰重叠后得到的定量结果,即不标记的糖链与同位素18O标记的糖链的比例,IA表示不标记的糖链峰强度,IB表示同位素18O标记的糖链峰强度,Ia+2/Ia表示不标记的糖链中分子量加2道尔顿的同位素峰强度所占比例,Ib-2/Ib表示同位素18O标记的糖链中分子量减2道尔顿的同位素峰强度所占比例。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2010102332323A CN101907603B (zh) | 2010-07-19 | 2010-07-19 | 一种基于18o标记的n-糖链相对定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2010102332323A CN101907603B (zh) | 2010-07-19 | 2010-07-19 | 一种基于18o标记的n-糖链相对定量方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101907603A CN101907603A (zh) | 2010-12-08 |
CN101907603B true CN101907603B (zh) | 2012-09-05 |
Family
ID=43263122
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2010102332323A Expired - Fee Related CN101907603B (zh) | 2010-07-19 | 2010-07-19 | 一种基于18o标记的n-糖链相对定量方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101907603B (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201305986D0 (en) * | 2013-04-03 | 2013-05-15 | Asociaci N Ct De Investigaci N Cooperativa En Biomateriales | Synthesis and use of isotopically-labelled glycans |
CN106053834B (zh) * | 2016-06-22 | 2018-02-16 | 复旦大学附属中山医院 | 一种基于16o/18o标记的完整糖肽相对定量方法 |
CN109142506B (zh) * | 2017-06-18 | 2022-03-18 | 复旦大学 | 一种基于质谱的n-糖链相对定量的方法 |
CN113880704B (zh) * | 2021-10-18 | 2023-07-21 | 西北师范大学 | 一种快速合成18o标记醛类化合物的方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007124750A2 (en) * | 2006-04-27 | 2007-11-08 | Syddansk Universitet | Methods for isolation and analysis of sialylated and phosphorylated peptides |
CN101173926A (zh) * | 2006-11-03 | 2008-05-07 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 稳定同位素18o标记蛋白质组双重定量方法与试剂盒 |
WO2008130924A2 (en) * | 2007-04-16 | 2008-10-30 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Isotopically-labeled glycans |
CN101344520A (zh) * | 2008-08-21 | 2009-01-14 | 上海化工研究院 | 一种稳定同位素15n标记三肽产品的检测方法 |
-
2010
- 2010-07-19 CN CN2010102332323A patent/CN101907603B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007124750A2 (en) * | 2006-04-27 | 2007-11-08 | Syddansk Universitet | Methods for isolation and analysis of sialylated and phosphorylated peptides |
CN101173926A (zh) * | 2006-11-03 | 2008-05-07 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 稳定同位素18o标记蛋白质组双重定量方法与试剂盒 |
WO2008130924A2 (en) * | 2007-04-16 | 2008-10-30 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Isotopically-labeled glycans |
CN101344520A (zh) * | 2008-08-21 | 2009-01-14 | 上海化工研究院 | 一种稳定同位素15n标记三肽产品的检测方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101907603A (zh) | 2010-12-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Harstad et al. | Capillary electrophoresis | |
Geiger et al. | Capillary electrophoresis | |
US6355416B1 (en) | Assay for the measurement of DNA synthesis rates | |
Chace | Mass spectrometry in the clinical laboratory | |
Dudley et al. | Mass spectrometry analysis of nucleosides and nucleotides | |
Becher et al. | Metaproteomics to unravel major microbial players in leaf litter and soil environments: C hallenges and perspectives | |
CN101907603B (zh) | 一种基于18o标记的n-糖链相对定量方法 | |
CN101936945B (zh) | Atp含量的检测方法及atp适配体传感器 | |
Chatgilialoglu et al. | New insights into the reaction paths of hydroxyl radicals with purine moieties in DNA and double-stranded oligodeoxynucleotides | |
CN105223248A (zh) | 基于苯硼酸印迹聚合物/碳纳米管修饰电极及其制备方法和应用 | |
WO2010035140A8 (en) | Method for analyzing d4z4 tandem repeat arrays of nucleic acid and kit therefore | |
CN102539544A (zh) | 血红蛋白A1c测定中的校正方法 | |
English et al. | Use of elemental analysis to determine comparative performance of established DNA quantification methods | |
Williamson et al. | Investigating the structure of α/β carbohydrate linkage isomers as a function of group I metal adduction and degree of polymerization as revealed by cyclic ion mobility separations | |
Trefulka et al. | Voltammetry of Os (VI)‐Modified Polysaccharides | |
Deschamps et al. | Advances in ultra-high-resolution mass spectrometry for pharmaceutical analysis | |
Fernández‐de‐Cossio et al. | Automated interpretation of mass spectra of complex mixtures by matching of isotope peak distributions | |
Xie et al. | Permethylation of ribonucleosides provides enhanced mass spectrometry quantification of post-transcriptional RNA modifications | |
Kataoka et al. | Online in-tube solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography–tandem mass spectrometry for automated analysis of four sulfated steroid metabolites in saliva samples | |
Yuan et al. | A novel hybridization LC-MS/MS methodology for quantification of siRNA in plasma, CSF and tissue samples | |
Tsuchida et al. | Metabolomics research in periodontal disease by mass spectrometry | |
Nazlawy et al. | Green voltammetric nano scaled determination of toldimfos and its residues in cattle meat and milk in presence of its toxic metabolite and Co-administered vitamin C | |
Pallecchi et al. | Simultaneous Degradation Study of Isomers in Human Plasma by HPLC-MS/MS and Application of LEDA Algorithm for Their Characterization | |
CN104928375B (zh) | 一种同时测定人环孢素作用靶点基因多态性的方法 | |
Nix et al. | Potential of single pulse and multiplexed drift-tube ion mobility spectrometry coupled to micropillar array column for proteomics studies |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120905 Termination date: 20150719 |
|
EXPY | Termination of patent right or utility model |