CN110028539A - 同位素标记仿生糖或糖组、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本文公开了一种同位素标记仿生糖或糖组、其制备方法及应用。具体而言，本文公开的同位素标记仿生糖或糖组包括位于糖链还原端的还原醇羟基以及同位素标记，其中，每一个仿生糖链和与之对应的未修饰糖链相比，分子量增加了3道尔顿，且仿生糖(组)与未修饰糖(组)具有相同的糖链组成和相似的糖链丰度分布。本文还提供了采用同位素标记仿生糖或糖组分析样品中糖组的方法，其包括对同位素标记的内标仿生糖链与未经同位素标记的样品糖链混合物进行质量分析以对样品中的糖组进行定性和/或定量分析。本方法兼具非同位素标记糖组学方法操作简单和同位素标记糖组学方法准确的优点，且可用于高通量检测，具有广泛的应用前景。

Description

同位素标记仿生糖或糖组、其制备方法及应用
技术领域
本申请属于生物技术、分析化学技术和医学领域。具体而言，本文涉及同位素标记仿生糖或糖组、其制备方法及应用，尤其涉及一种简便、高通量、精准的稳定同位素内标糖组分析法。
背景技术
糖基化是一种普遍存在的翻译后修饰，其不仅影响蛋白质的结构、溶解度和稳定性，还涉及多个生物过程，如蛋白折叠、细胞识别、受体与配体的结合等。研究报道，大约50％的哺乳动物蛋白发生糖基化修饰。糖蛋白的异常糖基化与许多疾病包括关节炎、先天性疾病、以及肿瘤的发生发展和转移等都密不可分。
近年来，考虑到体液样本的优势，人们开始致力于血清、血浆以及尿液等体液中基于糖组学的生物标志物研究。许多糖蛋白已被广泛应用于疾病的临床诊断和治疗，例如癌抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异抗原(PSA)等。因此，对疾病相关的糖蛋白的糖基化进行分析与研究，将有助于全面地了解各种生理病理的发生发展过程，并且能实现其在疾病诊断和治疗中的实际应用价值。
并且，糖链定性和定量分析不仅仅可以用于疾病检测，同时可以运用到其他很多方面，比如抗体药物研究。不同糖基化修饰的抗体药物具有不同的生物学功能，在疾病治疗方面的效果也不尽相同。
近年来，随着各种分析技术灵敏度的提高，尤其是生物质谱的发展，定量糖组学也得到了快速的发展。基于生物质谱的定量方法通常可分为两类：非同位素标记定量和同位素标记定量方法。
非同位素标记定量方法是一种简单的定量方法，其将糖链分别从不同的样品中游离下来，进行一系列的衍生化处理，然后分别进行质谱检测分析，通过比较质谱峰信号的强弱或峰面积，获得不同样品中糖链表达量的定量结果。
虽然非同位素标记定量糖组学方法具有操作简单、不改变样品结构、实验成本低等优点，但是基质效应、质谱响应和操作误差等会导致得糖链分析的准确度低、重现性低、定量结果误差大。
而与非同位素标记定量方法相比，同位素标记定量方法是比较精准的定量方法。通过引入化学结构相同、物理性质相似但质量数不同的稳定同位素标签，标记不同样品中的糖链，混合之后进行质谱检测分析。通过该方法，一张质谱图即可显示所有样品，通过比较成对质谱峰信号的强弱或峰面积，即可获得定量结果。目前常用的同位素标记定量方法包括：酶解导入同位素标记、代谢导入同位素标记和化学衍生化导入同位素标记。
然而，目前的同位素标记定量方法各自都存在缺点：酶解导入同位素标记只能导入2Da的分子量差异，需要额外的去卷积计算；代谢导入同位素标记只适用于细胞样本，而且实验成本较高；而目前大多数化学衍生化导入同位素标记的方法操作繁琐，所有样本都需要进行相同的衍生化处理，并且同组样本通常需要混合到一起，然后与另一组混合样本进行比较，无法对每一个样品单独定量分析。
为了简化这些方法，研究者们开发了一些将外源性的糖链标准品比如同位素标记的N-糖链、麦芽糖系列寡糖等等，添加到样品中作为内标来进行定量分析的方法，并且这些方法被证明对于N-糖链的定量分析是有效的。然而，由于天然聚糖结构的异质性、广泛的分子量范围和丰度的丰富性，比较理想的是提供一种内标，使其拥有与待分析的糖组相似的糖链组成和丰度特征，但目前这仍然是一个挑战。
因此，本领域迫切需要开发出一种简便、高通量、精准的稳定同位素内标糖组分析法，能完全覆盖待测样品里的所有糖链，与待测样品有相同的糖链组成和相似的糖链丰度分布，从而可将其用于需要对蛋白质糖基化修饰进行定性以及定量分析的研究和开发中，例如筛选潜在的疾病相关糖链标志物、进行糖基化抗体药物开发等。
发明内容
本文中提供了一种同位素标记仿生糖或糖组、其制备方法及应用。本文的另一侧重点还提供了通过本文方法鉴定出的肺癌糖链标记物、以及检测所述肺癌糖链标志物的物质在制备用于肺癌诊断和/或肺癌治疗方案筛选的产品中的应用。
一个方面，在本文中，提供了一种修饰的同位素标记仿生糖或包含修饰的同位素标记仿生糖的糖组，其中，与其对应的未修饰聚糖相比，所述仿生糖包括位于糖链还原端的醇羟基以及同位素标记，且所述仿生糖的分子量增加了3道尔顿或以上。
在一些实施方式中，除了还原端修饰以外，所述仿生糖具有与其对应的未修饰糖相同的糖链组成和丰度。
在一些实施方式中，所述未修饰聚糖的还原端为半缩醛基。
在一些实施方式中，所述醇羟基以及同位素标记为未修饰聚糖的还原端经还原反应开环产生。
在一些实施方式中，所述未修饰聚糖和所述仿生糖的还原端分别如式(I)和式(I') 所示，其中代表与糖链其他部分连接的键，D代表氘代：
另一方面，在本文中，提供了一种制备同位素标记仿生糖或糖组的方法，所述方法包括：
(A)提供待修饰糖链或糖组；
(B)通过针对待修饰糖链或糖组的还原反应，使得所述待修饰糖链或糖组的还原端半缩醛结构转变为醇羟基并包含同位素标记，
其中，与其对应的天然聚糖相比，所述仿生糖包括位于糖链还原端的醇羟基以及同位素标记，且所述仿生糖的分子量增加了3道尔顿或以上。
在一些实施方式中，所述还原反应采用硼氘化钠(NaBD4)进行。
在一些实施方式中，所述糖链为N-糖链或O-糖链。
在一些实施方式中，所述待修饰糖链包含一种或多种糖链。
在一些实施方式中，所述待修饰糖链获自天然样品。
在一些实施方式中，所述待修饰糖链获自待检测样品。
在一些实施方式中，所述样品选自：体液样品，如血液、血清、血浆、尿液、唾液、淋巴液、脊髓液、腹水、羊水；细胞样品，如分离自组织的细胞样品、体外培养的细胞样品；组织样品，如癌组织、癌旁组织、正常组织，其形式可为新鲜组织样品、固定化组织样品；生产或开发样品，如带糖链药物(如抗体药物)的质检样品、抗体药物开发样品。
在一些实施方式中，所述待修饰糖链为从糖复合物中释放出的糖链。
在一些实施方式中，所述糖链采用PNGase F、内切糖苷酶(Endoglycosidase)H、F2、F3、神经酰胺糖内切酶II)、化学法(例如β消除反应)和/或其组合释放。
在一些实施方式中，所述方法还包括对糖链上的唾液酸进行保护，例如酯化保护。
另一方面，在本文中，提供了采用如上所述方法制备的同位素标记仿生糖或糖组。
另一方面，在本文中，提供了一种分析样品中糖链或糖组的方法，所述方法包括如下步骤：
(i)提供还原端为半缩醛的样品糖链；
(ii)提供与样品糖链对应的仿生糖链，所述仿生糖链包括位于糖链还原端的醇羟基以及同位素标记，且与样品糖链相比，所述仿生糖的分子量增加了3道尔顿或以上；
(iii)将所述样品糖链和所述仿生糖链混合，形成混合物；
(iv)对所述混合物进行质量分析；
(v)根据样品糖链与仿生糖链的质量分析数据的比较和/或比值，对样品糖链进行定性和/或定量。
在一些实施方式中，所述样品选自：体液样品，如血液、血清、血浆、尿液、唾液、淋巴液、脊髓液、腹水、羊水；细胞样品，如分离自组织的细胞样品、体外培养的细胞样品；组织样品，如癌组织、癌旁组织、正常组织，其形式可为新鲜组织样品、固定化组织样品；生产或开发样品，如带糖链药物(如抗体药物)的质检样品、抗体药物开发样品。
在一些实施方式中，所述仿生糖采用本文所述的方法制备。
在一些实施方式中，所述方法包括：
在步骤(i)和/或步骤(ii)中，通过从糖复合物中释放糖链来提供还原端为半缩醛的样品糖链或经还原标记获得仿生糖链；和/或
在步骤(ii)中通过还原反应，使得所述样品糖链或糖组的还原端半缩醛结构转变为醇羟基并包含同位素标记；优选通过采用硼氘化钠(NaBD4)的还原反应，使得样品糖链的还原端半缩醛结构转变为醇羟基并被氘代；和/或
步骤(iv)的质量分析采用选自下组的一种或多种方式进行：质谱(MS)分析，例如基质辅助激光解吸附电离质谱(MALDI-MS，如基质辅助激光解吸附电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、基质辅助激光解吸附电离-四级离子阱-飞行时间质谱 (MALDI-QIT-TOFMS))、电喷雾质谱(ESI-MS)、快原子轰击质谱(FAB-MS)、串级质谱、多级质谱、电喷雾-碰撞诱导解离质谱(ESI-CID-MS)；高效液相色谱HPLC；液质联用(LC-MS)；毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)；和/或
步骤(v)中的所述比较和/或比值包括：出峰位置比较、峰高比较、峰面积比较和/或比值、及其任何组合，例如比较成对峰信号的峰面积、样品糖链峰面积/内标糖链峰面积(轻/重)的比值；和/或
对内标糖链和样品糖链进行处理(优选同样的处理)，以适应后续的质量分析，例如对糖链进行纯化、富集、稀释等，或通过对糖链进行酯化反应来保护糖链末端的唾液酸。
在一些实施方式中，所述糖复合物选自：糖蛋白、蛋白聚糖、糖肽、糖脂、或其任何组合，例如含糖链抗体等。
在一些实施方式中，采用酶法(例如采用PNGase F、内切糖苷酶(Endoglycosidase)H、F2、F3、神经酰胺糖内切酶II)、化学法(例如β消除反应)和/ 或其组合来释放糖链。
在一些实施方式中，所述纯化和/或富集通过离心、沉淀分离、过滤、色谱分离等方式进行。
在一些实施方式中，所述比较和/或比值通过计算软件和/或算法获得。
在一些实施方式中，样品中每一个未经同位素标记的糖链都有一个与之相对应的同位素标记的糖链。
在一些实施方式中，所述方法包括：
(a)用PNGase F酶解样品糖蛋白上糖链，可任选地对所得糖链进行纯化和/或富集；
(b)用NaBD4还原并同位素标记(i)中所得糖链的一部分，获得同位素标记的糖链；
(c)可任选地，分别对同位素标记的糖链和未经同位素标记的糖链进行末端唾液酸保护，以及可任选地对所得唾液酸保护糖链进行纯化和/或富集；
(d)混合前步所得的同位素标记的糖链和未经同位素标记的糖链，并对所得混合物进行质量分析，例如采用质谱分析，如基质辅助激光解吸附电离-四级离子阱- 飞行时间质谱(MALDI-QIT-TOF MS)进行分析；
(e)通过比较质谱中成对峰信号的峰面积，比较未经同位素标记的糖链的峰面积(如质谱峰面积)和经同位素标记的糖链的峰面积(如质谱峰面积)，进行相对定量。
在一些实施方式中，所述方法进一步用于：
糖组定量和/或定性分析，例如用于基于糖链标志物(例如癌抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异抗原(PSA))的疾病诊断和/或预后判断；筛选潜在的疾病相关糖链标志物；糖复合物(如带糖链药物，例如含糖基化修饰的抗体)的开发和 /或质控；蛋白质糖基化修饰分析。
另一方面，在本文中，提供了一种产品，其包含如本文所述的糖链或糖组和/ 或用于如本文所述方法中的试剂和/或设备。
在一些实施方式中，本文的糖链或糖组和/或用于本文所述方法中的试剂和/或设备在制备用于基于糖链标志物的疾病诊断和/或预后判断、筛选潜在的疾病相关糖链标志物、糖复合物(如带糖链药物，例如含糖基化修饰的抗体)的开发和/或质控、蛋白质糖基化修饰分析的产品中的应用。
另一方面，在本文中，提供了选自下组的肺癌糖链标志物：
H4N3、H3N3E1、H4N3E1、H5N4E1、H5N4E2、H5N5F1E1、H5N5E2、H6N5E2、 H6N5E3，或其中一种或多种的组合；
其中，H代表己糖，N代表N-乙酰葡萄糖胺，F代表岩藻糖，E代表α2,6-连接唾液酸。
另一方面，在本文中，提供了检测如上所述肺癌糖链标志物的物质在制备用于诊断肺癌和/或肺癌治疗方案筛选的产品中的应用的产品中的应用。
另一方面，在本文中，提供了诊断肺癌和/或肺癌治疗方案筛选的方法，所述方法包括检测样品中如上所述肺癌糖链标志物的水平。
另一方面，在本文中，提供了一种用于肺癌诊断和/或肺癌治疗方案筛选的试剂盒，其包括检测样品中如上所述糖链标志物中一种或多种的物质。
在一些实施方式中，所述检测采用如本文所述的同位素标记仿生糖或包含同位素标记仿生糖的糖组、分析方法或产品进行。
本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。
图1：本申请一个实施方式的流程示意图。
图2：NA2G1F糖链质谱图：
图2(A)：上图为未进行还原标记的NA2G1F糖链质谱图，下图为还原标记后的仿生NA2G1F糖链质谱图；
图2(B)：还原标记前后NA2G1F糖链混合物的质谱图。
图3：糖蛋白标准品IgG上糖链质谱图：
图3的A部分：未进行还原标记的糖链质谱图；
图3的B部分：还原标记后的仿生糖链质谱。
图4：N-糖链标准品NA2G1F和内标的峰面积比线性分析。
图5：糖蛋白标准品IgG上的H3N4F1和H5N4F1E1糖型和内标的峰面积比线性分析。
图6：示例性人类血清N-糖组及其仿生糖组混合物质谱图。
以上各图中的糖基标识如图1中所示。
具体实施方式
本申请中提供了一种基于稳定同位素标记(如1H/2D标记)内标的糖组分析新方法。本申请中还提供了一种基于稳定同位素标记(如1H/2D标记)内标的仿生糖组。本方法中由于只对内标进行还原同位素标记，而无需对待测样品进行同位素标记，因此简化了样品处理流程，节省了时间，减少了样品损失，也更加的经济。并且，可采用包含与待测样品相似糖链混合物的物质(例如获自同一个或同一种样品来源) 作为内标，由此使得待测样品里的每一个糖型都有一个与之相对应的内标，即仿生糖(组)与未修饰糖(组)具有相同的糖链组成和相似的糖链丰度分布。因此，本方法既保留了非同位素标记定量糖组学方法操作简单的优点，同时也具有同位素标记糖组分析方法准确的优点。
发明人分别采用糖链和糖蛋白标准品考察了本方法的线性关系和变异系数，结果显示本申请的稳定同位素内标糖组分析方法，在两个数量级动态范围内有良好的线性关系，且变异系数小于现有技术方法。发明人进一步采用本申请的方法分析了血清样品中的糖组，并考察了方法的同日重现性和日间重现性，结果表明本发明的方法具有优异的同日重现性和日间重现性，变异系数显著低于现有技术方法。并且，在加入内标后，只有质谱图中成对出现的质谱峰(分子量相差3Da或以上，根据所用还原和同位素标记试剂不同而不同)才是需要研究的糖链，其他均为杂质，由此可排除样品(尤其是复杂样品，如血清等)中非糖链或非目标糖链干扰物的影响。
此外，本文所述的方法和仿生糖组具有操作简单、节省时间、降低实验成本等优点。我们已经将其成功运用于复杂生物样品(如人类血清)中的糖链定量分析。例如，发明人已通过对血清样本中的糖链进行定量分析，鉴定出肺癌特异性聚糖变化，从而也进一步证明了该定量方法的可行性。总之，我们开发了一种新颖的糖组学相对定量方法和相应的仿生糖组，该方法和糖组在寻找临床生物标志物方面具有巨大的潜力。
本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
本文的方法可用于分析各种包含糖链的样品，所述样品包括但不限于：体液样品，如血液、血清、血浆、尿液、唾液、淋巴液、脊髓液、腹水、羊水；细胞样品，如分离自组织的细胞样品、体外培养的细胞样品；组织样品，如癌组织、癌旁组织、正常组织，其形式可为新鲜组织样品、固定化组织样品；生产或开发样品，如带糖链药物(如抗体药物)的质控样品、抗体药物开发样品；等。
质量分析前的步骤
如本文所用，术语“糖组(glycome)”是指样品(如细胞、组织)中表达的全部糖链或是某一类特定糖蛋白上的全部糖链。
如本文所用，术语“样品糖链”、“待测样品糖链”、“未修饰糖链”和“未经同位素标记的糖链”可互换使用，均是指需要对其中糖链进行分析的样品中所存在的糖链，其可通过糖链释放(如酶解、化学释放)、纯化、富集、衍生化等步骤进行处理以备用于质量分析，但无需经过同位素化标记。
如本文所用，“内标糖(链)”、“仿生糖(链)”、“经修饰糖链”、“同位素标记还原糖(链)”与“同位素标记仿生糖(链)”可互换使用，是指经过本文所述同位素标记还原的糖链标准品，或者相对于“样品糖链”而言，来自同一样品或同一物种来源并经过相同处理而区别仅在于经同位素还原标记步骤的糖链物质。
通常就后者而言，内标糖链由待测样品制得，是一糖链混合物，其可以作为一个内标糖链库。在定量分析时，样品中的每一个糖链都有与之对应的内标，定量更为准确，更有利于大样本的分析。并且，仿生糖(组)与未修饰糖(组)具有相同的糖链结构和相似的糖链丰度分布，有利于对样品糖链的准确分析。
内标糖链和待测糖链可以为任何感兴趣的N-糖链或O-糖链，包括但不限于：作为疾病标志物的糖链，例如癌抗原(如CA125、CA242、CA19-9、CA15-3等)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异抗原(PSA)等；含糖链药物所带的糖链，例如抗体药物(如曲妥珠单抗)所带的糖链；影响生物过程的重要糖链，例如影响信号传递、细胞生长发育、免疫细胞调节、肿瘤发生发展的糖链。
本文所述的糖链可为N-糖链，也可为O-糖链，优选为N-糖链。本文所述的糖链可为游离糖链或从糖复合物中释放的糖链。
如本文所用，术语“糖链还原端”是指聚糖具有游离半缩醛羟基的一端。在一些实施方式中，聚糖还原末端可为半缩醛。
可采用本领域中已知的技术获得末端半缩醛的糖链。例如，可采用酶法释放糖链，可用的酶包括但不限于：PNGase F、内切糖苷酶(Endoglycosidase)H、F2、F3、神经酰胺糖内切酶II或它们的任意组合；可采用化学法释放糖链，例如采用β消除反应；也可采用酶法和化学法的组合来释放糖链。
如本文所述，在本文的方法中仅对内标糖链进行同位素标记以使其分子量高于未标记的样品糖链，该分子量差异可至少为3Da，例如3Da、4Da、5Da等。在一些实施方式中，对于N-糖链，可采用氘化合物标记内标糖链末端，以获得例如2D 标记的羟基，从而使所得同位素标记的内标糖链的分子量比未标记的样品糖链增加 3Da。在另一些实施方式中，对于O-糖链，可在β消除时利用NaBD4作为还原试剂并以H2 18O作为溶剂，从而使所得同位素标记的内标糖链的分子量比未标记的样品糖链增加3Da。
可任选地对糖链进行衍生化，以例如提高质谱检测的灵敏度或保护糖链末端基团。衍生化可包括但不限于：甲胺化、酯化、甲基化、乙酰化、还原氨化等。可根据需要对衍生化的类型和时机进行选择。例如，通常酯化衍生在同位素标记后进行。
在对糖链进行任何处理后，可采用本领域已知技术对其进行纯化和/或富集。例如可在糖链释放后、对内标糖链进行同位素标记后和/或对糖链进行衍生化后，对其进行纯化和/或富集。纯化和/或富集的方法可包括但不限于：离心、过滤、吸附、色谱法等。
质量分析和数据处理
在获得经同位素标记的内标糖链和经相同处理但未经同位素标记的样品糖链后，可将两者按所需比例混合，用于质量分析。
本文方法中对混合物的质量分析可采用适合的方式进行，这些方式包括但不限于：质谱(MS)分析，例如基质辅助激光解吸附电离质谱(MALDI MS，如基质辅助激光解吸附电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、基质辅助激光解吸附电离-四级离子阱-飞行时间质谱(MALDI-QIT-TOF MS))、电喷雾质谱(ESI-MS)、快原子轰击质谱(FAB-MS)、串级质谱、多级质谱、电喷雾-碰撞诱导解离质谱(ESI-CID-MS)；高效液相色谱HPLC；液质联用(LC-MS)；毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)。优选采用对分子量差异辨识度高的技术进行质量分析，例如基质辅助激光解吸附电离质谱 (MALDI MS)等。
可对质量分析数据进行进一步计算和处理以获得所需的糖组相关信息。例如，可对样品糖链和内标糖链在质谱图中的出峰位置、峰高、峰面积及其任何组合进行比较，例如比较成对峰信号的峰面积、样品糖链峰面积/内标糖链峰面积(轻/重)的比值，以获得糖链的定性和/或定量信息。也可将采用本文方法所得质量分析数据与其他糖链分析技术所得数据结合起来进行分析。
在质谱分析中，由于内标糖链和样品糖链之间存在分子量差异，通过质谱分析可表现出特定的荷质比差、可区分的MS峰和峰面积比值。这些数据可直接用于相对丰度比较或定性分析，推断目标糖链的分子结构；也可用于监控目标糖链丰度的变化；或用于检测带目标糖链的物质的存在、含量及其动态变化。
可采用各种糖链分析软件、应用、数据库、算法等对所得数据进行分析。可用的糖链分析软件包括但不限于：Progenesis MALDI、GlycoWorkbench、NetNGlyc、 FindMod、GlycanMass、GlycoMod、GlycoFragment和GlycoSearchMS等。可用的糖链数据库包括但不限于：GlycomeDB、EUROCarbDB、CarbBank、CCSD等。
本文的方法可用于高通量糖链检测中，例如同时检测48、96、192、384个或更多个样品等。检测大量样品时，不需要对每个样品进行还原、同位素标记，只需对内标糖链进行同位素标记，这大大简化了样品制备流程、节约了实验成本，减少了样品的损失。
应用及产品
本文的方法可用于样品中各种感兴趣糖链的定性和定量分析，从而可被广泛用于与糖链检测分析相关的各种应用中。
在一些实施方式中，本文的方法用于生理病理活动相关糖链的分析，如与信息传递、细胞生长发育、免疫细胞调节、肿瘤发生发展等过程相关的糖链。例如，本文的方法可应用的方面包括但不限于：用于基于糖链标志物(例如癌抗原125 (CA125)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异抗原(PSA))的疾病诊断和/或预后判断；用于筛选潜在的疾病相关糖链标志物；用于糖复合物(如带糖链药物，例如含糖基化修饰的抗体)的开发和/或质控；用于蛋白质糖基化修饰分析；等。
相应的，本文中还提供了一种用于本文方法和应用中的产品，其包含用于本文方法中的试剂和/或设备的组合。
用于肺癌诊断和/或肺癌治疗方案筛选的糖链标志物的鉴别及应用
如实施例中所示，本申请中还采用本发明的方法分析了在肺癌患者血清样品中和健康对照血清样品中的糖组差异，发现如表1所示的9种N-糖链(即实施例部分表3中灰色标注部分)能分别有效区分肺癌样本与健康对照样本(AUC>0.8)。由此，证明了这些N-糖链单独或组合可以作为肺癌诊断和/或肺癌治疗方案筛选的标志物：
表1.可用于肺癌诊断和/或肺癌治疗方案筛选的N-糖链标志物
其中，H＝己糖，N＝N-乙酰葡萄糖胺，F＝岩藻糖，E＝α2,6-连接唾液酸；深灰色圆＝Man；浅灰色圆＝Gal；正方形＝GlcNAc；顺时针(即连线向上)菱形＝α2,6-连接唾液酸(即E)；逆时针(即连线向下) 菱形＝α2,3-连接唾液酸(即L)；三角形＝Fuc。
由此，本公开中还提供了一种用于肺癌诊断和/或肺癌治疗方案筛选的产品(例如试剂盒)，所述产品包含：用于检测样品中如上所述9种糖链中一种或多种的水平的物质(例如试剂和/或设备)；以及可任选的用于肺癌诊断的其他物质，例如现有肺癌标志物的检测物质。
相应地，本文中还公开了一种诊断肺癌和/或肺癌治疗方案筛选的方法，所述方法包括：测定获自对象的样品中如上所述9种糖链中一种或多种的水平。本文中还公开了检测如上所述9种糖链中一种或多种的水平的物质在制备用于癌症诊断和/或肺癌治疗方案筛选的产品中的应用。
本文中还提供了一种检测试剂盒，其包含：(i)检测有效量的用于检测一种或多种如上所述9种糖链水平的一种或多种试剂；(ii)可任选地，选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂，例如用于混悬或固定细胞的溶液，可检测的标签或标记，用于裂解细胞的溶液，用于释放糖链的试剂，或用于糖链纯化的试剂等。
根据所用检测方法的需要，可选择适当的糖链检测物质，并将其制成适于所用检测方法的产品。本领域普通技术人员可根据实际条件和需要对检测方式和产品中所含物质进行调整和改变。在一些实施方式中，优选采用本文所述的仿生糖及其相关方法来检测样品中所述糖链的水平。
在一些实施方式中，所检测的样品可选自：体液样品，如血液、血清、血浆、尿液、唾液、淋巴液、脊髓液、腹水、羊水；细胞样品，如分离自组织的细胞样品、体外培养的细胞样品；组织样品，如癌组织、癌旁组织、正常组织，其形式可为新鲜组织样品、固定化组织样品等。
此外，本申请通过检测糖链标志物水平在对象肺癌诊断和/或肺癌治疗方案筛选中具有高灵敏度、高准确性的特点。并且，本申请的产品和方法也可与现有的常规肺癌诊断手段联合使用，从而更灵敏、更准确地对肺癌进行诊断。这种联合使用可产生一定的叠加甚至加合效果。现有的常规肺癌诊断手段包括但不限于：计算机断层扫描、循环肿瘤细胞(CTC)检测法(例如叶酸受体阳性CTC检测法)、肺癌自身抗体检测(例如P53、c-myc、HER2、NYESO-1、GAGE、MUG1和GBU4-5等)。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。以下实施例验证了本申请方法的可靠性、有效性和实用性。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如可参考Richard D.Cummings等编写的《糖组学手册》(科学出版社，2011年6月1 日)或按照供应商所建议的条件。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1.基于糖链标准品和糖蛋白标准品的线性关系和变异系数考察
以N-糖链标准品NA2G1F和糖蛋白标准品IgG为例进行定量分析，考察本方法定量分析的线性关系，包括以下步骤：
1.标准样品的配制
取10μg糖链标准品NA2G1F(购自Ludger公司，下同)溶解于200μL超纯水中，配制成浓度为0.05mg/mL的储存液。
取1mg糖蛋白标准品IgG(购自Sigma-Aldrich公司，货号I4506，下同)溶解于200μL生理盐水(0.85％NaCl)中，配制成浓度为5mg/mL的储存液。
2.糖蛋白的糖链酶解
取20μL糖蛋白IgG储存液，加入40μL 2％SDS溶液，置于60℃恒温混匀仪中变性10分钟。待变性后溶液温度下降到室温，加入40μL酶解缓冲溶液(4％ NP-40:5×PBS＝1:1，pH7.5)，振荡混匀。加入1μL PNGase F酶(聚糖酶F，购自 New England Biolabs公司，下同)，振荡混匀，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育过夜(16-18h)。酶解糖蛋白标准品IgG上N-糖链，并用无水乙醇沉淀蛋白质，离心后吸取上清，去除沉淀。
3.硼氘化钠NaBD4还原内标糖链
取部分糖链标准品NA2G1F和糖蛋白标准品IgG N-糖链分别作为内标，加入反应体系二分之一体积的新配制2M硼氘化钠NaBD4(购于Sigma-Aldrich公司，溶于超纯水中)，置于65℃恒温混匀仪中还原2小时，还原内标糖链。
还原完成后，利用HILIC-SPE(亲水作用色谱-固相萃取法)进行富集纯化。将棉线填充于20μL枪头，制作成纯化小柱。首先，用10μL超纯水(MQ)活化柱子3 次；随后，用10μL85％乙腈(ACN)平衡柱子3次；用移液器来回抽吸还原后体系，直接重复上样40次，以确保N-糖链完全被吸附在纯化小柱上；然后，用10μL 85％ ACN+1％三氟乙酸(TFA)洗纯化柱3次，再用10μL 85％ACN洗纯化柱3次，去除盐和杂质；最后，用10μL超纯水洗脱下还原后的N-糖链。
4.乙醇酯化反应
另分别取5μL糖链标准品NA2G1F和5μL糖蛋白标准品IgG N-糖链作为样本，与5μL还原后的内标糖链同时分别进行乙醇酯化(0.25M EDC和0.25M HOBt 溶于无水乙醇)衍生化，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育1小时，保护糖链末端唾液酸。
反应后，利用HILIC-SPE(亲水作用色谱-固相萃取法)进行富集纯化。将棉线填充于20μL枪头，制作成纯化小柱。首先，用10μL超纯水(MQ)活化柱子3次；随后，用10μL 85％乙腈(ACN)平衡柱子3次；用移液器来回抽吸还原后体系，直接重复上样40次，以确保N-糖链完全被吸附在纯化小柱上；然后，用10μL 85％ ACN+1％三氟乙酸(TFA)洗纯化柱3次，再用10μL 85％ACN洗纯化柱3次，去除盐和杂质；最后，用10μL超纯水洗脱下酯化后的N-糖链。
5.质谱分析
将未经过同位素标记而仅经过乙醇酯化反应的糖链标准品NA2G1F和步骤2 中酶解后的糖蛋白标准品IgG N-糖链样本加入超纯水按比例稀释为原浓度的2、5、 8、10、20、50、100倍。
分别将上述不同稀释倍数的糖链标准品NA2G1F和IgG N-糖链样品与其对应的内标糖链(即步骤3中还原的内标糖链)等体积混合，使用基质辅助激光解吸附电离-四级离子阱-飞行时间质谱(MALDI-QIT-TOF MS)进行分析。
在N-糖链样本分析前，先用含有八个标准肽段的混合校准液TOFMix对质谱进行质量校准。将基质super-DHB溶于含有1mM NaOH的50％ACN溶液中，终浓度为5mg/mL。取1μL混合样品滴加于质谱板上，室温下晾干；然后滴加1μL super-DHB基质，室温下晾干；再滴加0.2μL无水乙醇均一化，使样品均匀分布在靶点上，增强质谱信号。
MALDI质谱在正离子反射模式(reflection positive，RP)下采集信号离子进行信号离子检测。使用337nm的氮气激光源，激光能量设定为105-125V以最小化“源内碎裂”(in-source decay，ISD)，改善信噪比。样品处理模式为“batch mode”，自动控制激光点位置，减少人为操作误差，谱图采集设置为：2shots/profile，累计200 profiles平均化后采集一张MS谱图，采集m/z范围为1000-4000。
6.数据统计分析
采用Shimadzu Biotech MALDI MS和Progenesis MALDI软件对采集到的所有MALDI MS谱图进行处理，然后输出到Microsoft Excel进行分析。质谱数据由GlycoWorkbench糖链解析软件辅助进行人工解析，糖链结构的鉴定主要基于质荷比、串级质谱碎片归属以及之前N-糖组学的相关文献报道。
内标糖链末端被还原为羟基分子量+2Da，同位素D标记分子量+1Da，因此，最终内标糖链分子量+3Da(如图1所示)。通过比较一级质谱中成对峰信号的峰面积，待测样品糖链质谱峰面积/内标糖链质谱峰面积(轻/重)得到比值。每一个N-糖链的含量通过信号强度比(轻标/重标)来确定，通过计算最高同位素峰的峰面积比值 (样品/内标)获得。每个样品重复点样3次，按照每个靶点采集一张MS谱图进行数据分析的原则，最终每个样品数据是平均3张MS谱图信号后得到的计算结果。
7.结果及讨论
(1)经与未经同位素还原标记的NA2G1F糖链的质谱图比较如图2(A)所示，同位素还原标记前后NA2G1F糖链混合物的质谱图如图2(B)所示。如图所示，内标糖链末端被还原为羟基分子量+2Da，同位素D标记分子量+1Da，因此，最终内标糖链分子量+3Da，即由m/z1647.59迁移至m/z 1650.59。
通过糖链标准品NA2G1F(H4N4F1)还原标记前(图2(A)上图)和还原标记后 (2(A)下图)的质谱图比较可考察还原标记效率。如图所示，经还原标记后没有检测到原m/z1647.59的NA2G1F，说明本方法的还原标记效率接近100％。
(2)对包含多种复杂型N-糖链的糖蛋白标准品IgG的考察显示：如图3的A 部分和图3的B部分所示，通过本方法标记后，IgG N-糖组的每一个信号都有一个与之对应的仿生糖信号，分子量之间相差3Da。图3的A部分中检测到的24个半缩醛糖在图3的B部分中都能找到与之对应的D标记的醇糖，不论是中性糖(如 H3N4F1，m/z:1485.53/1488.54)还是酸性糖(如H5N4F1E1，m/z:2128.53/2131.54)(如图3中放大部分所示)，都能还原标记完全。
更重要的是，同时我们也发现在图3的A部分和图3的B部分中每一对N-糖链质谱峰的丰度分布是相似的。由糖蛋白标准品IgG N-糖组制备的仿生糖组覆盖的分子量范围很广，从m/z 1282.45到2653.93；峰面积覆盖范围也很广，包含4 个数量级，从338到1082307。
(3)对不同稀释倍数的N-糖链标准品NA2G1F、糖蛋白标准品IgG上的 H3N4F1和H5N4F1E1两种糖型和内标的峰面积比进行分析，结果分别如图4和图 5所示。该结果显示：本申请的稳定同位素内标N-糖组分析方法，在两个数量级动态范围内有良好的线性关系R2≥0.998且变异系数小于15％。
由此说明此N-糖链定量方法在两个数量级(100倍)的范围内(稀释倍数)展示出了良好的线性，且定量结果有良好的稳定性。
实施例2.血清样品中的糖链分析
为了进一步验证本文定量方法在复杂生物样品中的适用性，我们通过多种重复分析实验验证该定量方法在人类血清N-糖组定量分析中的应用。
1.血清样品收集和保存
血液样品收集于复旦大学附属肿瘤医院。所有实验操作及研究内容都得到了复旦大学附属肿瘤医院伦理委员会批准，样本采集前已经获得所有受试者的书面知情同意书。
血清分离方法按常规操作进行：首先抽取5mL静脉血，常温下在促凝管中静置30分钟，待凝固后以3000转离心10分钟，吸出上层血清，-80℃冻存以备后用。
2.糖链酶解
待测样品
取血清样品5μL，加入10μL的2％SDS，60℃变性10分钟。然后加入5μL 4％ NP-40、5μL 5×PBS和1μL PNGase F(聚糖酶F)，37℃酶解过夜(12～18h)。
内标
取上述血清样品20μL，加入40μL的2％SDS，60℃变性10分钟。然后加入 20μL 4％NP-40、20μL 5×PBS和1μL PNGase F，37℃酶解过夜(12～18h)。
3.硼氘化钠NaBD4还原内标糖链
取酶解后的内标酶解溶液，加入无水乙醇沉淀蛋白质，高速离心后吸取上清，去除沉淀。然后，加入反应体系二分之一体积新配制的2M硼氘化钠NaBD4，置于65℃恒温混匀仪中还原2小时。
4.同位素标记内标糖链的富集纯化
还原完成后，利用HILIC-SPE(亲水作用色谱-固相萃取法)进行富集纯化。将棉线填充于20μL枪头，制作成纯化小柱。首先，用10μL超纯水(MQ)活化柱子3 次；随后，用10μL85％乙腈(ACN)平衡柱子3次；用移液器来回抽吸还原后体系，直接重复上样40次，以确保N-糖链完全被吸附在纯化小柱上；然后，用10μL 85％ ACN+1％三氟乙酸(TFA)洗纯化柱3次，再用10μL 85％ACN洗纯化柱3次，去除盐和杂质；最后，用10μL超纯水洗脱下还原后的N-糖链。
5.乙醇酯化
待测样品
取酶解后血清样品溶液2μL，加入20μL衍生化试剂(0.25M EDC和0.25M HOBt溶于无水乙醇，37℃反应60分钟。然后利用HILIC-SPE进行富集纯化(纯化方法同4)。
内标
取还原纯化后内标N-糖链5μL，加入25μL衍生化试剂(0.25M EDC和0.25M HOBt溶于乙醇)，37℃反应60分钟。然后利用HILIC-SPE进行富集纯化(纯化方法同4)。
通过如上步骤分别获得待测样品N-糖链和内标N-糖链。
6.血清样品的N-糖链质谱分析
取酶解、乙醇酯化、纯化后的血清待测样品N-糖链2μL与酶解、还原标记、乙醇酯化、纯化后的内标N-糖链4μL混合，然后每个混合样品三点重复点样。
所有混合N-糖链样本使用基质辅助激光解吸附电离-四级离子阱-飞行时间质谱(MALDI-QIT-TOF MS)进行分析。在N-糖链样本分析前，先用含有八个标准肽段的混合校准液TOFMix对质谱进行质量校准。将基质super-DHB溶于含有1mM NaOH的50％ACN溶液中，终浓度为5mg/mL。取1μL混合样品滴加于质谱板上，室温下晾干；然后滴加1μL super-DHB基质，室温下晾干；再滴加0.2μL无水乙醇均一化，使样品均匀分布在靶点上，增强质谱信号。
MALDI质谱在正离子反射模式(reflection positive，RP)下采集信号离子进行信号离子检测。使用337nm的氮气激光源，激光能量设定为105-125V以最小化“源内碎裂”(in-source decay，ISD)，改善信噪比。样品处理模式为“batch mode”，自动控制激光点位置，减少人为操作误差，谱图采集设置为：2shots/profile，累计200 profiles平均化后采集一张MS谱图，采集m/z范围为1000-4000。
7.数据统计分析
采用Shimadzu Biotech MALDI MS和Progenesis MALDI软件对采集到的所有MALDI MS谱图进行处理，然后输出到Microsoft Excel进行分析。质谱数据由GlycoWorkbench糖链解析软件辅助进行人工解析，糖链结构的鉴定主要基于质荷比、串级质谱碎片归属以及之前N-糖组学的相关报道(例如REIDING K R,BLANK D,KUIJPER D M,etal.High-Throughput Profiling of Protein N-Glycosylation by MALDI-TOF-MSEmploying Linkage-Specific Sialic Acid Esterification[J].AnalyticalChemistry,2014,86(12):5784-93.)。
内标糖链末端被还原为羟基分子量+2Da，同位素D标记分子量+1Da，因此，最终内标糖链分子量+3Da(如图1所示)。通过比较一级质谱中成对峰信号的峰面积，待测样品糖链质谱峰面积/内标糖链质谱峰面积(轻/重)得到比值。每个样品重复点样3次，按照每个靶点采集一张MS谱图进行数据分析的原则，最终每个样品数据是平均3张MS谱图信号后得到的计算结果。
实施例3.同日重现性考察
同一日，取一血清样品按内标流程处理作为内标，同时取相同血清样品，均分为3份按样本流程处理。按内标流程处理的内标血清样品与3份样品分别混合后，进行如前所述的质谱分析。
经数据分析处理可知，丰度最高的20种糖链平均变异系数CV仅为4.6％，显著低于目前已有的N-糖组学定量方法(CV：14.2％)(Vreeker,G.C.M.；Nicolardi,S.；Bladergroen,M.R.；van der Plas,C.J.；Mesker,W.E.；Tollenaar,R.；van der Burgt,Y.E. M.；Wuhrer,M.,Automated Plasma Glycomics with Linkage-Specific SialicAcid Esterification and Ultrahigh Resolution MS.Anal Chem 2018,90(20),11955-11961)。
该结果表明：该定量方法在复杂生物样品中有极佳的定量重现性。
实施例4.日间重现性考察
取一血清样品按内标流程处理后置于冰箱储存，另一血清样品均分为3份，每日取其中一份，连续3日分别按样品流程处理。内标与连续3日处理的样品分别混合后，进行如前所述的质谱分析。
经数据分析处理可知，丰度最高的20种糖链的平均变异系数CV仅为8.7％，同样显著低于目前已有的N-糖组学定量方法(CV：16.5％)(Vreeker,G.C.M.； Nicolardi,S.；Bladergroen,M.R.；van der Plas,C.J.；Mesker,W.E.；Tollenaar,R.；van der Burgt,Y.E.M.；Wuhrer,M.,Automated Plasma Glycomics with Linkage-Specific Sialic AcidEsterification and Ultrahigh Resolution MS.Anal Chem 2018,90(20), 11955-11961)。
该结果表明：该定量方法在复杂生物样品中有极佳的定量重现性。
实施例5.肺癌定量糖组学研究
肺癌是世界上最常见的癌症之一，其5年生存率很低非常差，仅有为8-16％，因此迫切需要找到对早期肺癌诊断具有敏感性和特异性的生物标志物。蛋白质糖基化的改变已被报道与肺癌的发生发展密切相关，而且对糖链的鉴定以及定量分析有发现相关生物标志物的巨大潜力。
为了进一步评估我们的方法在多个复杂生物样本中的定量分析能力，我们用本文所述的定量方法对32例人类血清样本(其中包括16例肺癌样本(癌症组)和16例年龄性别匹配的健康对照样本(健康对照组))进行了定量分析。
表2.肺癌患者与健康对照基本资料
在进行N-糖组定量分析之前，我们使用BCA试剂盒测定了所有血清样本中蛋白质的含量，发现癌症组和健康对照组之间的血清蛋白含量没有统计学差异。
首先，由于不同血清样本的生物多样性，所以我们利用混合血清样本(即所有肺癌患者血清和健康对照样本血清的混合物)制备仿生糖作为内标。然后，按照上述实验方法将内标N-糖组与32个样本的N-糖组分别混合，进行上述的MALDI-MS 检测分析。检测到的N-糖链，每对都具有3Da的分子量差异，所有质谱峰均为加钠峰。代表性质谱图如图6所示。
根据定量分析结果，我们在肺癌与健康对照之间比较了60对CV小于25％的 N-糖链。在肺癌病例和健康对照之间具有显著统计学差异的N-糖链列于表3中，包括N-糖链结构、分子量、聚糖/内标峰面积比，p值和AUC。
表3.在肺癌样本与健康对照样本中表达有统计学差异的N-糖链列表
H＝己糖，N＝N-乙酰葡萄糖胺，F＝岩藻糖，L＝α2,3-连接唾液酸(内酯化)，E＝α2,6-连接唾液酸(乙酯化)；组成中的数字表示数量；
深灰色圆＝Man；浅灰色圆＝Gal；正方形＝GlcNAc；顺时针(即连线向上)菱形＝α2,6-连接唾液酸(即 E)；逆时针(即连线向下)菱形＝α2,3-连接唾液酸(即L)；三角形＝Fuc
试验结果显示：与健康对照相比，在肺癌血清样本中有34种N-糖链表达量升高。去半乳糖基化N-糖链、岩藻糖化N-糖链、高甘露糖化N-糖链和多分支唾液酸化N-糖链含量在肺癌样本中都明显升高。在之前的研究中，研究者使用不同的定量分析方法也发现了在肺癌血清样本中去半乳糖基化聚糖含量升高。
根据受试者工作特征曲线(ROC)测试结果，我们发现了9种N-糖链(即表3中灰色标注部分)能分别有效区分肺癌样本与健康对照样本(AUC>0.8)，包括H4N3、 H3N3E1、H4N3E1、H5N4E1、H5N4E2、H5N5F1E1、H5N5E2、H6N5E2和H6N5E3 (H＝己糖，N＝N-乙酰葡萄糖胺，F＝岩藻糖，E＝α2,6-连接唾液酸)，这些N-糖链可能可以作为肺癌诊断的潜在标志物。
有趣的是，我们同时也发现在肺癌样本中α2,6-连接和α2,3-连接的唾液酸的改变不尽相同。例如，H5N4L2和H5N4E2(L＝α2,3-连接唾液酸，E＝α2,6-连接唾液酸) 具有相同的聚糖组成但具有不同的唾液酸连接方式，在区分肺癌和健康对照时具有明显不同的能力，AUC分别为0.72和0.91。
以上结果表明，本文所述的方法可用于有效鉴别肺癌与健康对象，并可用于识别具有高AUC值的N-糖链作为肺癌肿瘤标志物。并且，根据鉴定结果，H4N3、 H3N3E1、H4N3E1、H5N4E1、H5N4E2、H5N5F1E1、H5N5E2、H6N5E2和H6N5E3 等9种糖链可用于肺癌的有效准确诊断。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种修饰的同位素标记仿生糖或包含修饰的同位素标记仿生糖的糖组，其中，与其对应的未修饰聚糖相比，所述仿生糖包括位于糖链还原端的醇羟基以及同位素标记，且所述仿生糖的分子量增加了3道尔顿或以上；
例如，所述未修饰聚糖的还原端为半缩醛基；
例如，所述醇羟基以及同位素标记为未修饰聚糖的还原端经还原反应开环产生。
2.一种制备同位素标记仿生糖或糖组的方法，所述方法包括：
(A)提供待修饰糖链或糖组；
(B)通过针对待修饰糖链或糖组的还原反应(例如采用硼氘化钠或硼氢化钠进行还原)，使得所述待修饰糖链或糖组的还原端半缩醛结构转变为醇羟基并包含同位素标记，
其中，与其对应的天然聚糖相比，所述仿生糖包括位于糖链还原端的醇羟基以及同位素标记，且所述仿生糖的分子量增加了3道尔顿或以上。
3.采用如权利要求2所述的方法制备的同位素标记仿生糖或糖组。
4.一种分析样品中糖链或糖组的方法，所述方法包括如下步骤：
(i)提供还原端为半缩醛的样品糖链；
(ii)提供与样品糖链对应的仿生糖链，所述仿生糖链包括位于糖链还原端的醇羟基以及同位素标记，且与样品糖链相比，所述仿生糖的分子量增加了3道尔顿或以上；
(iii)将所述样品糖链和所述仿生糖链混合，形成混合物；
(iv)对所述混合物进行质量分析；
(v)根据样品糖链与仿生糖链的质量分析数据的比较和/或比值，对样品糖链进行定性和/或定量；。
优选，所述样品选自：体液样品，如血液、血清、血浆、尿液、唾液、淋巴液、脊髓液、腹水、羊水；细胞样品，如分离自组织的细胞样品、体外培养的细胞样品；组织样品，如癌组织、癌旁组织、正常组织，其形式可为新鲜组织样品、固定化组织样品；生产或开发样品，如带糖链药物(如抗体药物)的质检样品、抗体药物开发样品；
优选，所述糖复合物选自：糖蛋白、蛋白聚糖、糖肽、糖脂、或其任何组合，例如含糖链抗体等；
优选，采用酶法(例如采用PNGase F、内切糖苷酶(Endoglycosidase)H、F2、F3、神经酰胺糖内切酶II)、化学法(例如β消除反应)和/或其组合来释放糖链；
优选，所述纯化和/或富集通过离心、沉淀分离、过滤、色谱分离等方式进行；
优选，所述比较和/或比值通过计算软件和/或算法获得；和/或
优选，样品中每一个未同位素标记的糖链都有一个与之相对应的同位素标记的糖链。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述方法包括：
在步骤(i)和/或步骤(ii)中，通过从糖复合物中释放糖链来提供还原端为半缩醛的样品糖链或经还原标记获得仿生糖链；和/或
在步骤(ii)中通过还原反应，使得所述样品糖链或糖组的还原端半缩醛结构转变为醇羟基并包含同位素标记；优选通过采用硼氘化钠(NaBD4)的还原反应，使得样品糖链的还原端半缩醛结构转变为醇羟基并被氘代；和/或
步骤(iv)的质量分析采用选自下组的一种或多种方式进行：质谱(MS)分析，例如基质辅助激光解吸附电离质谱(MALDI-MS，如基质辅助激光解吸附电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、基质辅助激光解吸附电离-四级离子阱-飞行时间质谱(MALDI-QIT-TOF MS))、电喷雾质谱(ESI-MS)、快原子轰击质谱(FAB-MS)、串级质谱、多级质谱、电喷雾-碰撞诱导解离质谱(ESI-CID-MS)；高效液相色谱HPLC；液质联用(LC-MS)；毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)；和/或
步骤(v)中的所述比较和/或比值包括：出峰位置比较、峰高比较、峰面积比较和/或比值、及其任何组合，例如比较成对峰信号的峰面积、样品糖链峰面积/内标糖链峰面积(轻/重)的比值；和/或
对内标糖链和样品糖链进行处理(优选同样的处理)，以适应后续的质量分析，例如对糖链进行纯化、富集、稀释等，或通过对糖链进行酯化反应来保护糖链末端的唾液酸。
6.如权利要求4所述的方法，其中，所述方法包括：
(a)用PNGase F酶解样品糖蛋白上糖链，可任选地对所得糖链进行纯化和/或富集；
(b)用NaBD4还原并同位素标记(i)中所得糖链的一部分，获得同位素标记的糖链；
(c)可任选地，分别对同位素标记的糖链和未经同位素标记的糖链进行末端唾液酸保护，以及可任选地对所得唾液酸保护糖链进行纯化和/或富集；
(d)混合前步所得的同位素标记的糖链和未经同位素标记的糖链，并对所得混合物进行质量分析，例如采用质谱分析，如基质辅助激光解吸附电离-四级离子阱-飞行时间质谱(MALDI-QIT-TOF MS)进行分析；
(e)通过比较质谱中成对峰信号的峰面积，比较未经同位素标记的糖链的峰面积(如质谱峰面积)和经同位素标记的糖链的峰面积(如质谱峰面积)，进行相对定量。
7.如权利要求4所述的方法，其中，所述方法进一步用于：
糖组定量和/或定性分析，例如用于基于糖链标志物(例如癌抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异抗原(PSA))的疾病诊断和/或预后判断；筛选潜在的疾病相关糖链标志物；糖复合物(如带糖链药物，例如含糖基化修饰的抗体)的开发和/或质控；蛋白质糖基化修饰分析。
8.一种产品，其包含如权利要求1或3所述的糖链或糖组和/或用于如权利要求4-7中任一项所述方法中的试剂和/或设备。
9.如权利要求1或3所述的糖链或糖组和/或用于如权利要求4-7中任一项所述方法中的试剂和/或设备或如权利要求8所述的产品在制备用于基于糖链标志物的疾病诊断和/或预后判断、筛选潜在的疾病相关糖链标志物、糖复合物(如带糖链药物，例如含糖基化修饰的抗体)的开发和/或质控、蛋白质糖基化修饰分析的产品中的应用。
10.选自下组的肺癌糖链标志物、以及检测所述肺癌糖链标志物的物质在制备用于肺癌诊断和/或肺癌治疗方案筛选的产品中的应用：
H4N3、H3N3E1、H4N3E1、H5N4E1、H5N4E2、H5N5F1E1、H5N5E2、H6N5E2、H6N5E3，或其任意组合；
其中，H代表己糖，N代表N-乙酰葡萄糖胺，F代表岩藻糖，E代表α2,6-连接唾液酸。
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