CN109923407A - 糖链解析方法 - Google Patents

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Abstract

使用具有一个容易带负电的部位的2‑氨基苯甲酸等标记试剂来对具有分支结构的糖链进行标记。此时，不进行在基于还原氨基化的标记中通常实施的还原。制备包含如此得到的糖链标记体的质谱分析用样品，针对该样品以负离子模式执行MS/MS分析。由此得到的MS/MS谱中，明显地出现反映出分支结构的E离子、D离子等的峰。由此，能够容易地进行包含分支结构的糖链整体的结构解析。

Description

糖链解析方法
技术领域
本发明涉及利用质谱分析来解析糖链的结构的方法，尤其涉及在具有分支结构(也称为树状结构)的糖链的结构解析中有用的方法。
背景技术
认为构成生物体的蛋白质的一半以上受到了糖链修饰，糖链修饰在蛋白质的结构、功能的调节中发挥重要的作用。另外，通过近年来的研究，已知在细胞表面上表达的糖链参与细胞间相互作用、信号传递、发育/分化、进而受精、癌症转移等各种各样的生物体内现象。
修饰蛋白质的糖链很少是单糖以直链状连接而成的结构，在大多的情况下具有分支结构。这种具有分支结构的糖链的结构非常富有多样性，其结构对蛋白质的功能产生重大影响。因此，糖链的结构解析在生理学、生命科学、医学等各种领域中是重要的。
近年来，糖链的结构解析中，广泛利用了质谱分析、特别是被称为串联质谱分析、多级质谱分析(MSn)等的伴有针对离子的解离操作的质谱分析。使用质谱分析的糖链结构解析通常基于在正离子模式下获取的质谱(本说明书中，有时通过MS/MS分析得到的MS/MS谱等也称为质谱)来进行。但是，若使正离子化的糖链通过碰撞诱导解离(CID)法解离，则往往在单糖间的糖基键处发生解离，难以得到分支结构的信息。因此，这种方法在推定构成糖链的单糖时是有用的，但不太适于具有分支结构的糖链的结构解析。
与此相对，虽然不太常规，但也尝试了基于在负离子模式下获取的质谱的糖链结构解析。
已知，若使负离子化的糖链通过CID解离，则反映分支结构的解离容易特异性地发生。例如N型糖链中，分别容易生成反映二条分支中的1-6臂的结构信息的D离子、反映1-3臂的结构信息的E离子，通过检测这些离子而能够推定分支结构。而且，这些产物离子被认为是通过单纯的一次断裂而生成的，具有如下特性：与通过复杂的二次断裂或三次断裂而生成的离子相比，原分子的结构信息容易直接反映于产物离子。因此，例如在质谱上观测到某个特定的产物离子的情况下，具有能够进行唯一确定原分子的部分结构的诊断性解析的优点。由此，可以说负离子模式下的质谱分析在具有分支结构的糖链的结构解析中是有利的。
然而，原本糖链就有难以负离子化的问题。作为单糖之一的唾液酸具有羧基，因此容易带负电荷。因此，包含唾液酸的酸性糖链比较容易成为负离子，但是，在实际测定中也往往为了防止唾液酸的损失而通过前处理进行衍生物化，使得唾液酸部分的负电荷被中和。因此，通常即使在糖链中包含唾液酸的情况下，也需要使实质上不具有会发生去质子化的官能团的中性糖链进行负离子化。
作为使中性糖链进行负离子化的一个方法，开发了通过在糖链分子上加成阴离子从而进行负离子化的方法。例如专利文献1、非专利文献1中公开了，为了使实质上为中性的糖链通过基质辅助激光解吸离子化(MALDI)法进行负离子化而在特殊的液体基质中添加阴离子来制备测定用样品的方法。液体基质例如为由胺的离子与对香豆酸等的含酸性基团有机物质的离子形成的离子性液体，阴离子为四氟硼酸等。然而，这种方法中，能够使用的基质的种类相当受限制，无法利用MALDI用的常规的、即能够容易廉价购入的基质。另外，这种特殊的基质根据质谱分析装置的种类而有时不适合。例如，液体基质在通常的基质辅助激光解吸离子化飞行时间型质谱分析装置(MALDI-TOFMS)中有时因基质自身的厚度、其他的影响而导致分辨率降低。因此，优选在TOFMS的前级设置的质谱分析装置中使用后述离子阱。另外，根据糖链的种类，即使添加的阴离子的种类相同，也有时完全得不到产物离子，因此阴离子的选择也是困难的。另外，也有如下的问题：在糖链上加成的阴离子与该糖链之间形成共价键，因此有时得不到对结构解析有用的诊断性的产物离子。
然而，糖链的结构解析虽然也有时在从糖蛋白、糖肽等切出糖链的状态下直接进行，但也常常在对糖链的还原末端进行了标记(labeling)的状态下进行。众所周知的是用于荧光标记的标记。在标记试剂中也有具有容易带负电荷的部分的标记试剂，若利用这种标记试剂对糖链进行标记，则糖链的负离子化变得容易。该标记试剂可以不依赖于中性糖链、唾液酸糖链、修饰唾液酸糖链等糖链种类地应用，能够效率良好地使糖链进行负离子化。
然而，根据非专利文献2的报道，通过对以容易带负电的标记试剂进行了标记的糖链在负离子模式下进行MS/MS分析而得到的MS/MS谱并不具有期待那样的特异性，仅观测到单糖间的糖基键被切断的被称为所谓y系列的多个产物离子。该文献中得到的结论是，即使以容易带负电的标记试剂对糖链的还原末端进行标记并在负离子模式下进行MS/MS分析，也得不到反映出对糖链结构解析而言重要的分支结构的产物离子。
由此，在基于负离子模式的质谱分析来进行糖链结构解析时，无论是否对糖链进行标记，都不得不采用如上所述使用加成有阴离子的特殊基质来制备MALDI用样品，通过特殊的质谱分析装置进行测定的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2013-205221号公报
非专利文献
非专利文献1：西风(T.Nishikaze)、其他3人、“通过负离子基质辅助激光解吸/电离质谱法，使用阴离子掺杂液体基质G3CA对中性N-聚糖的灵敏分析(Sensitive Analysisof Neutral N-Glycans using Anion-Doped Liquid Matrix G3CA by Negative-IonMatrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry)”、分析化学(Anal.Chem.)、2012年、Vol.84、No.12、pp.6097-6103
非专利文献2：D.J.Harvey、“源自用2-氨基苯甲酸衍生化的N-连接的聚糖的负离子的碰撞诱导的碎片化(Collision-induced fragmentation of negative ions from N-linked glycans derivatized with 2-aminobenzoic acid)”、质谱杂质(Journal ofMass Spectrometry)、2005年、Vol.40、pp.642-653
非专利文献3：西风(T.Nishikaze)、其他3人、“在负离子MALDI-MS中使用采用基于3-氨基喹啉的液体基质的聚糖标记方法的N-聚糖的结构分析(Structural analysis ofN-glycans by the glycan-labeling method using3-aminoquinoline-based liquidmatrix in negative-ion MALDI-MS)”、分析化学(Anal.Chem.)、2012年、Vol.84、No.12、pp.6097-6103
非专利文献4：Chen ST.、其他1人、“使用8-氨基芘-1,3,6-三磺酸盐和对氨基苯甲酸乙酯的闭环标记和负离子阱质谱的高甘露寡糖的连接和分支分析(Linkage and BranchAnalysis of High-Mannose Oligosaccharides Using Closed-Ring Labeling of 8-Aminopyrene-1,3,6-Trisulfonate and P-Aminobenzoic Ethyl Ester and NegativeIon Trap Mass Spectrometry)”、美国质谱学会杂志(Journal of The American Societyfor Mass Spectrometry)、2012年8月、Vol.23、Issue 8、pp.1408-1418
发明内容
发明要解决的问题
如上所述在现有的糖链解析方法中，存在如下问题：为了使作为解析对象的糖链可靠地负离子化来获取反映出其分支结构信息的MS/MS谱，使用昂贵的特殊基质而非容易购入的常规基质等、用于样品制备的前处理耗费成本且复杂。进而，能使用的质谱分析装置的种类有时受到限定，并非通用的方法。
本发明是鉴于这种问题而做出的，其目的在于，提供在使用质谱分析进行糖链结构解析时，能够通过低成本的简便的前处理而使糖链可靠地负离子化，获取反映出糖链的分支结构信息的MS/MS谱的糖链解析方法。
用于解决问题的方案
通常，在对糖链进行标记时，常常使用被称为还原氨基化(或还原性氨基化)的方法。其为在使糖链的还原末端与具有氨基的标记试剂反应后利用还原剂使其发生还原反应，由此使标记体稳定化的方法。例如上述非专利文献2中使用的标记法也是还原氨基化法。
迄今，本发明人针对使用碱性或中性的标记试剂进行了标记的糖链，通过专利文献1、非专利文献1中记载的方法尝试了基于负离子模式的糖链结构解析，在非专利文献3等中报道了其结果。本发明人在该实验中确认了，有无用于获得稳定的标记产物的还原过程会影响是否能得到对糖链结构解析有用的MS/MS谱。此外，得出如下结论：与标记的有无、标记的种类几乎无关地，在获得诊断性的产物离子信息的方面优选不进行还原。推测这种现象是因为，通过在标记后进行还原，糖链的根部(还原末端侧)的N-乙酰基葡糖胺残基完全开环，其结果，在CID时的环内的电子移动变得困难，二次断裂、三次断裂受到促进。
另外，非专利文献4中报道了对糖链应用不伴有还原的标记法的实验例。该文献中声称，以中性的4-氨基苯甲酸乙酯(ABEE)为标记试剂来进行不伴有还原的标记(该文献中称为“闭环标记(closed-ring labeling)”)，以负离子模式进行MS/MS分析，从而得到与非衍生化糖链等同的质谱。另一方面声称，也完成了以酸性的8-氨基芘-1,3,6-三磺酸(APTS)为标记试剂来进行不伴有还原的标记的实验，但与使用中性的标记试剂的情况不同，未能观测到特异性的产物离子。即，在该报道中推导出如下结论：从获取在解析分支结构方面有用的信息的观点出发，在使用中性的标记试剂的情况下有不进行还原的效果，但在使用酸性的标记试剂的情况下没有不进行还原的效果。
然而，本发明人鉴于使用碱性或中性的标记试剂时的结果，基于在利用容易带负电的标记试剂、即酸性的标记试剂进行了标记的情况下有无还原可能也会影响断裂方式的推测，通过实验等进行了深入研究。其结果，发现通过在使用容易带负电的酸性的标记试剂对糖链进行了标记后不进行还原地、进行负离子模式的质谱分析，从而能够效率良好地得到去质子化体。另外，发现通过进一步以该去质子化体为目标进行包含CID的MS/MS分析，能够观测到分支结构特异性的产物离子，从而完成了本发明。
即，为了解决上述问题而做出的本发明为利用质谱分析来解析糖链的结构的方法，其特征在于，具备如下的步骤：
a)样品制备步骤，使用在分子内具有至少一个能使负电荷稳定存在的部位的标记试剂，以不伴有还原的方式对解析对象的糖链进行标记，制备样品；以及，
b)分析执行步骤，对前述样品以负离子模式进行MS/MS分析，
所述方法从MS/MS分析结果获取糖链的分支结构信息。
本发明的糖链解析方法中，作为进行不伴有还原的标记的方法，代表性地，可以采用如下的两个方法中的任一个。
(1)如上所述在对糖链进行标记时利用的通常的方法为还原氨基化，此时，组合使用标记试剂与还原剂。通常，当在糖链的游离还原末端上键合源自标记试剂的物质时，其后通过还原剂的作用使键合部分附近的一部分结构被还原，形成稳定的标记体。该情况下，通过不使用还原剂，能够进行不伴有还原的标记。
(2)作为常用于蛋白质标记的标记试剂，有与氨基键合的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)酯类，近年来，也有销售使用其的糖链的标记试剂。这种标记试剂与基于还原氨基化的标记试剂不同，原本就不需要在标记时进行还原。这种NHS酯类的标记试剂也只要具有至少一个能使负电荷稳定存在的部位，就能够用于本发明的糖链解析方法。该情况下，如上所述标记本身为不伴有还原的标记。
本发明的糖链解析方法中，在样品制备步骤中，制备包含未被还原的糖链的标记体作为试样的样品。例如使用MALDI质谱分析装置进行质谱分析的情况下，作为基质，使用液体基质，作为构成该液体基质的含酸性基团有机物质，使用也成为标记试剂的物质。由此，作为制备MALDI质谱分析用样品的作业的一环，可以进行不伴有还原的糖链的标记，作业工序能够简化。在分析执行步骤中，对于所制备的上述样品，使用适宜的质谱分析装置进行MS/MS分析。由此得到的MS/MS谱中，反映出糖链的分支结构的例如D离子、E离子等作为产物离子而被观测。通过利用这种产物离子的信息，能够推定具有分支结构的糖链的结构。
本发明的糖链解析方法中，标记试剂中能使负电荷稳定存在的部位通常是指羧基、磷酸基、硫酸基等具有容易带负电的性质的官能团。例如作为具有1个羧基的代表性的标记试剂，有2-氨基苯甲酸(2AA)、5-氨基水杨酸(5ASA)等。另外，作为具有硫酸基的化合物中的能用作标记试剂的物质，有2-氨基苯磺酸(2-Aminobenzenesulfonic Acid)、2-氨基-1-萘磺酸(2-Amino-1-naphthalenesulfonic Acid)等，作为具有磷酸基的化合物中的能用作标记试剂的物质，有4-氨基苄基膦酸(4-Aminobenzylphosphonic acid)等。
另一方面，作为上述NHS酯类中的具有1个羧基的标记试剂，有均为美国SIGMA-ARDRICH公司制造的“79636Sigma Atto 590NHS ESTER”(分子式：C41H42ClN3O11)、“72464Sigma Atto 565NHS ESTER”(分子式：C35H34ClN3O11)、“F9551Sigma-Aldrich”(荧光素5-羧甲基硫代丙酸NHS酯)等。另外，作为同属NHS酯类中的具有1个硫酸基的标记试剂，有“73494Sigma Dy-560NHS ESTER”(分子式：C37N44N4O10S2)、“55536Sigma Fluorescent RedMega 480NHS ESTER”(分子式：C30H33N3O9S)等。
通常已知的糖链的标记试剂中，有时在分子内具有一个使负电荷稳定存在的部位，也有时具有多个上述部位。例如在上述非专利文献4中报道的实验中利用的APTS具有三个硫酸基，为强酸性。根据这种以往的知识，在分子内存在多个使负电荷稳定存在的部位的情况下，有可能观测不到反映分支结构的产物离子。于是，本发明的糖链解析方法中优选的是，作为前述标记试剂，可以使用在分子内仅具有一个使负电荷稳定存在的部位的标记试剂。
另外，作为标记试剂，可以采用具有氨基、酰肼基、氨基氧基、或与其相当的碱性官能团，并与糖链的还原末端键合的标记试剂。另外，作为其它种类的标记试剂，可以采用与糖链中的葡基胺结构的氨基反应的标记试剂。上述2AA、5ASA等为满足这种条件的化合物。
另外，本发明的糖链解析方法中，在前述分析执行步骤中，可以执行以糖链的去质子化体为前体离子的MS/MS分析。
需要说明的是，本发明的糖链解析方法中作为解析对象的糖链为例如在糖蛋白、糖肽中所含的糖链、即修饰蛋白质或肽等的糖链。对这种糖链的结构进行解析的情况下，通常需要从糖蛋白、糖肽等切出(分离)糖链的前处理步骤，对如此得到的糖链进行标记。
另外，本发明的糖链解析方法中，质谱分析代表性地为进行基于MALDI法的离子化的MALDI质谱分析，但只要是能生成作为去质子化体的离子的离子化法，离子化法就不限定于MALDI法。作为其它有用的离子化法，具体可列举出例如电喷雾离子化(ESI)法等。ESI法的情况下也会生成1价去质子化体以外的多价离子，因此也可以将它们(多价去质子化体)作为前体离子来进行MS/MS分析。另外，当然，也可以使用将高效液相色谱仪(HPLC)与这种质谱分析装置联用的LC-MS系统，一边用色谱柱进行成分分离一边进行质谱分析。
发明的效果
根据本发明的糖链解析方法，无需复杂且耗费成本的前处理，能够通过常规的前处理进行样品制备，并且使具有分支结构的糖链可靠地进行负离子化，获取反映出其分支结构信息的MS/MS谱。具体而言，例如在进行MALDI质谱分析时，使用常规的即容易廉价购入的MALDI质谱分析用基质来制备样品即可。由此，能够较简便地以低成本推定具有分支结构的糖链的结构。
附图说明
图1为本发明的一个实施例的糖链解析方法中的解析过程的概要流程图。
图2为示出通过对作为2AA的标记体(有还原)的2分支型糖链以负离子模式进行MS/MS分析而得到的MS/MS谱的一例的图。
图3为示出通过对作为2AA的标记体(无还原)的2分支型糖链以负离子模式进行MS/MS分析而得到的MS/MS谱的一例的图。
图4为示出通过对使用添加有阴离子的特殊液体基质来制备的样品以负离子模式进行MS/MS分析而得到的MS/MS谱的一例的图。
图5为示出通过对作为5ASA的标记体(无还原)的2分支型糖链以负离子模式进行MS/MS分析而得到的MS/MS谱的一例的图。
具体实施方式
首先，对于本发明的一个实施例的糖链解析方法中的解析过程，参照图1进行说明。图1为该解析过程的概要流程图。此处，举出使用MALDI质谱分析装置作为质谱分析装置来对修饰蛋白质的糖链的结构进行解析的情况作为例子。
首先，通过已知的方法，从包含作为解析对象的糖链的糖蛋白中切出糖链，进而将切出的糖链纯化，制备试样(步骤S1)。
接着，使用包含容易带负电的部分的适宜的化合物作为标记试剂，对作为解析对象的糖链进行标记。容易带负电的部分代表性地是指例如羧基、磷酸基、硫酸基等容易带负电的、即质子容易脱离的官能团。此处重要的是，进行不伴有还原的标记(步骤S2)。
通常已知的糖链的标记试剂常常基于还原氨基化来进行标记，但这种标记试剂与还原剂成套使用。即，通过使糖链与标记试剂反应，在糖链的游离还原末端键合源自标记试剂的化合物。接着，通过还原剂的作用而使键合于糖链的化合物的一部分被还原，形成稳定的标记糖链。与此相对，在本实施例的糖链解析方法中，作为标记试剂而使用基于还原氨基化进行标记的标记试剂的情况下，不使用还原剂且不引起还原反应即可。
上述2AA、5ASA是包含一个羧基和氨基并与糖链的开环状的还原末端键合的标记试剂，适合于如上所述的不使用还原剂的标记。
另一方面，作为蛋白质的标记试剂而已知的NHS酯为与氨基键合的化合物，因此也能与糖链中的葡基胺的氨基键合。即，作为刚利用PNGase F等酶从糖蛋白上游离后的糖链(具有葡基胺结构的糖链)的标记试剂，可以利用NHS酯类。NHS酯类的标记试剂有各种物质，其中也有包含上述容易带负电的官能团的物质，它们也可以作为用于使糖链负离子化的标记试剂而利用。使用NHS酯类的标记与上述基于还原氨基化的标记相比，反应的机理不同，不需要进行还原。因此，使用NHS酯类对糖链进行标记的情况下，其本身为不伴有还原的标记。
上述“79636Sigma Atto 590NHS ESTER”、“72464Sigma Atto 565NHS ESTER”、“F9551Sigma-Aldrich”等具有1个羧基，“73494Sigma Dy-560NHS ESTER”、“55536SigmaFluorescent Red Mega 480NHS ESTER”等具有1个硫酸基，适合于如上所述的不伴有还原的标记。
接着，将如上所述不伴有还原的标记而形成的糖链的标记体作为试样，使用适宜的基质来制备MALDI质谱分析用的样品(步骤S3)。需要说明的是，如后述那样，样品制备中使用液体基质，作为构成该液体基质的含酸性基团有机物质而能利用步骤S2中列举的标记试剂的情况下，可以将不伴有还原的标记与MALDI质谱分析用样品的制备实质上同时地或连续地进行。
然后，对于由步骤S3制备的样品，使用安装有MALDI离子源且能进行MS/MS分析的质谱分析装置，以负离子模式执行MS/MS分析(步骤S4)。MS/MS分析中，将标记糖链的去质子离子作为前体离子即可。
针对如上所述进行了标记的糖链所得到的MS/MS谱中，清晰地出现源自反映出糖链的分支结构的产物离子、例如D离子、E离子的峰。另外，在糖链的还原末端侧存在N-乙酰基葡糖胺的情况下，还出现源自因该N-乙酰基葡糖胺残基发生环断裂而产生的离子的峰。因此，检测这种反映出分支结构的产物离子，基于该产物离子的质荷比等来推定糖链的结构(步骤S5)。
如以上所述，通过本实施例的糖链解析方法，能够准确地推定具有分支结构的糖链的结构。
实施例
以下，关于遵循上述实施例的糖链解析方法的过程的实验例、以及为了与其对比而进行的遵循以往的糖链解析方法的过程的比较例，具体进行说明。
[比较例1]
作为试样，使用英国Ludger公司制造的NA2型的2AA化标准糖链(2-AA labeledNA2glycan)。其具有在下述化学式中记载的二分支结构的NA2型的标准糖链的还原末端键合有2AA的结构，在标记后进行了还原处理。
将上述2AA化标准糖链以浓度成为1pmol/uL的方式溶解于超纯水，将该溶液采集1uL并滴加在MALDI用样品板(美国Hudson Surface Technology公司制造的μFocus MALDIplate)上。然后，将在浓度50％的乙腈(ACN＝Acetonitrile)中溶解有作为基质的浓度5mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸(DHB)的物质采集0.5uL，叠加于样品板上的上述试样，使其风干，从而制备测定用样品。对于该测定用样品，使用质谱分析装置，以负离子模式进行MS/MS分析。作为质谱分析装置，使用具备MALDI离子源、三维离子阱、及飞行时间型质谱分析仪的MALDI-QIT-TOFMS、具体而言Shimadzu Corporation/Kratos公司制造的AXIMA-Resonance(注册商标)。
将通过上述分析所获取的MS/MS谱示于图2。其为以在m/z1760.7检测到的1价的去质子([M-H]-)离子为前体离子来实施MS/MS分析而得到的结果。由图2可知，检测到的峰大多是因单糖间的糖基键的切断而产生的，是单糖残基依次从糖链的非还原末端(图2中记载的糖链结构的左端)脱离而成的y系列的离子峰。此处，几乎或完全未检测到源自D离子、E离子等分支结构特异性的产物离子的峰、源自GlcNAc的环断裂的峰。这是因为，根据该MS/MS谱，虽然能够推定构成糖链的单糖，但是极难进行糖链的分支结构的解析。
[遵照本实施例的糖链解析方法的实验例1]
作为试样，使用美国SIGMA-ARDRICH公司制造的未标记的NA2型的标准糖链。该糖链的化学式与比较例1所示者相同。将该标准糖链溶解于包含也属于标记试剂的2AA作为含酸性基团有机物质的液体基质中，通过加温而促进糖链与2AA的反应，形成糖链的标记体。更具体地说明的话，在1M浓度的2AA溶液45μL中添加四甲基胍(TMG＝1,1,3,3,-Tetramethylguanidine)原液5μL并使其溶解，将其采集5μL并用50％ACN 45μL稀释，将所得物质用作基质溶液(液体基质)。将该基质溶液0.5uL与样品溶液1uL在MALDI用样品板(上述Hudson Surface Technology公司制造的μFocus MALDI plate)上混合，直接连同板一起在加热块上以75℃的温度加温90分钟。通过以2AA为标记试剂的标记而在糖链的还原末端键合2AA，但由于未使用还原剂，因此未进行还原。
将如此制备的测定用样品与上述比较例1同样地使用MALDI-QIT-TOFMS以负离子模式进行MS/MS分析。将通过该分析得到的MS/MS谱示于图3。其为以在m/z1758.7检测到的去质子([M-H]-)离子为前体离子来实施MS/MS分析而得到的结果。需要说明的是，此处如上所述在标记后未进行还原，因此前体离子的质荷比与比较例1相比低2Da，但实质上前体离子与比较例1相同。
由图3可知，与图2所示的比较例1的MS/MS谱不同，清晰地观测到包含分支结构的信息的源自D离子、E离子的峰。另外，在m/z＝1200以上的高质荷比区域中观测的峰为通过位于糖链的还原末端侧的GlcNAc残基的环断裂(A系列)而产生的A离子，根据前体离子与这些峰的质量差可以推定海藻糖(fucose)的位置。基于这些各离子的质荷比，能够容易地进行包含分支结构的糖链整体的结构推定。
如此，即使在如基于2AA的标记那样在糖链结构中局部存在负电荷的情况下也能得到D离子、E离子、A离子等包含非还原末端侧的部分结构的产物离子，这可以说是根据以往的知识完全预想不到的。
需要说明的是，用于得到非还原2AA标记体的化学反应也可以在管等容器内而不是在样品板上进行。另外，如常规的标记中也常常进行的那样，也可以在质谱分析的执行前设置去除过量试剂(标记试剂)等的纯化工序。
[比较例2]
按照专利文献1中记载的现有技术的方法，对未标记的NA2型糖链的硝酸加成体离子([M+NO3]-)进行MS/MS分析。具体而言，为了制备测定用样品，作为基质使用G3CA(1,1,3,3-四甲基胍对香豆酸盐)，作为基质添加剂使用硝酸铵。将由此得到的MS/MS谱示于图4。其为以在m/z1702.6检测到的硝酸加成([M+NO3]-)离子为前体离子来实施MS/MS分析而得到的结果。此时得到的MS/MS谱与图3所示的由实验例1得到的MS/MS谱相当接近，可知观测到了分支结构特异性的产物离子。换言之，可以说在上述实施例的糖链解析方法中，能够得到包含糖链的分支结构信息的MS/MS谱，而无需使用该比较例2那样的特殊基质。
[实验例2]
为了对糖链进行标记，使用5-氨基水杨酸(5ASA)来代替2AA，除此之外按照与上述实验例1完全相同的过程来制备测定用样品，以负离子模式进行MS/MS分析。将由此得到的MS/MS谱示于图5。其为以在m/z1774.7检测到的去质子([M-H]-)离子为前体离子来实施MS/MS分析而得到的结果。
观测到与实验例1大致相同的图案的峰，即在与由实验例1得到的MS/MS谱相同的质荷比观测到源自通过D离子、E离子、GlcNAc残基的环断裂而产生的A离子的峰。由此可知，本发明的糖链解析方法中，只要糖链相同，则不依赖于标记试剂的化学结构，能得到反映出相同的分支结构信息的MS/MS谱。
上述实验例2中得到的知识在糖链的结构解析中是便利的。即，只要针对利用不同的标记试剂进行了标记的样品的MS/MS谱的图案大致相同，就能够做出它们为相同糖链的结论。因此，只要将例如使用某个标记试剂针对各种各样的糖链所获取的MS/MS谱制成数据库，就可以通过将针对使用其它标记试剂制备的未知糖链所得到的MS/MS谱与上述数据库对照，来鉴定该未知的糖链。如此，若在进行糖链的鉴定时能使用的标记试剂的限制放宽，则分析员使用手头的适宜的标记试剂来制备样品即可。
需要说明的是，上述实施例只不过是本发明的一例，当然即使在本发明的主旨的范围内适当进行变形、修正、追加等也包含在本申请权利要求书的范围内。
例如，不限于上述实验例中使用的标记试剂，也可以在不还原的条件下使用其它的具有羧基、磷酸基、硫酸基等的标记试剂、例如2-氨基苯磺酸、2-氨基-1-萘磺酸、4-氨基苄基膦酸等。另外，可以使用上述例示的“79636Sigma Atto 590NHS ESTER”、“72464SigmaAtto 565NHS ESTER”、“F9551Sigma-Aldrich”、“73494Sigma Dy-560NHS ESTER”、“55536Sigma Fluorescent Red Mega 480NHS酯”等NHS酯类。
另外，上述实施例以使用MALDI质谱分析装置进行质谱分析为前提，但本发明的糖链解析方法可以应用于使用基于以去质子化体(多价的去质子化体)为前体离子进行MS/MS分析以外的离子化法的质谱分析装置的质谱分析。即，能够应用于使用了可利用所谓软离子化法来进行负离子化的离子化法、例如ESI法等的质谱分析。

Claims (6)

1.一种糖链解析方法，其特征在于，利用质谱分析来解析糖链的结构，所述方法具备如下的步骤：
a)样品制备步骤，使用在分子内具有至少一个能使负电荷稳定存在的部位的标记试剂，以不伴有还原的方式对解析对象的糖链进行标记，制备样品；以及，
b)分析执行步骤，对所述样品以负离子模式进行MS/MS分析，
所述方法从MS/MS分析结果获取糖链的分支结构信息。
2.根据权利要求1所述的糖链解析方法，其特征在于，所述标记试剂在分子内具有一个使负电荷稳定存在的部位。
3.根据权利要求1所述的糖链解析方法，其特征在于，所述标记试剂中的使负电荷稳定存在的部位为羧基。
4.根据权利要求1所述的糖链解析方法，其特征在于，所述标记试剂具有氨基、酰肼基、氨基氧基、或与其相当的碱性官能团，并与糖链的还原末端键合。
5.根据权利要求1所述的糖链解析方法，其特征在于，所述标记试剂与糖链中的葡基胺结构的氨基反应。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的糖链解析方法，其特征在于，所述分析执行步骤中，执行以糖链的去质子化体为前体离子的MS/MS分析。
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