CN102144164A - 标记糖链的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于标记包含在生物样品中的糖链的糖链标记方法,其目的在于简化从生物样品分离糖链并对其进行标记的工序,所述方法包括:(a)将糖链捕获到糖链捕获物质中,该糖链捕获物质是特异捕获生物样品中的糖链的物质;(b)清洗该捕获了糖链的糖链捕获物质;(c)从所述糖链捕获物质释放糖链;和(d)标记该释放的糖链,其中,步骤(a)、(b)、(c)和(d)在同一反应容器中连续进行。
Description
技术领域
本发明涉及有效分离并标记包含在生物样品中的糖链的方法。
背景技术
生物聚合物,例如糖链、糖蛋白、糖肽、肽、寡肽、蛋白质、核酸和脂质等在包括医药科学、细胞工程和组织工程等的生物技术领域发挥重要的作用,因此可以理解,阐明这些物质控制生物反应的机理将有助于生物技术领域的发展。
其中,糖链是高度通用的一类物质,并与自然生物所具有的多种功能相关。已知糖链是生物体的重要组分之一,其在体内通常以复合糖(glycoconjugate)的形式存在,并与蛋白质和脂质结合。现已逐渐阐明,糖链与细胞间通讯的体内调控,以及蛋白质的功能和相互作用密切相关。
注意,本文所述的糖链是指单糖,例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、木糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺和唾液酸,或这些单糖的衍生物通过糖苷键相互结合而形成的链状分子的统称。
具有糖链的生物聚合物的实例有:构成植物细胞,有助于稳定细胞的蛋白多糖;影响细胞分化、增殖、粘附和迁移等的糖脂;以及与细胞间相互作用和细胞识别相关的糖蛋白。基于对生物聚合物的功能取代、辅助、扩增、调控或抑制,对包含在这些生物聚合物中的糖链所进行的复杂而精确控制的机制已逐渐清晰明确。如果进一步揭示糖链与分化、增殖、细胞粘附、免疫性以及致瘤性转化的关系,预期能够通过将此糖链工程与医药科学、细胞工程或组织工程结合来进行新的研发。
在糖蛋白药物中,糖链通常在生物活性的表达中发挥重要作用。因此,作为糖蛋白药物质量控制的参数,对糖链的评估特别重要。特别是在抗体药物领域中,由于曾报道糖链的结构决定抗体依赖性细胞毒性(ADCC活性),因而进一步提高了糖链结构分析的重要性。
因此,目前需要以快速、简单且精确的方式分析糖链结构的技术,并且通过各种方法进行糖链分析,包括高效液相色谱(HPLC)、核磁共振、毛细管电泳(CE法)、质谱分析和凝集素芯片检测方法(lectin array method)等。
为了使用这些技术进行糖链分析,必须首先从包含在生物样品中的蛋白质、肽、脂质和核酸等分离纯化糖链。尽管HPLC和CE由于其高分辨率、良好的重复性和定量性以及其高敏感度而被广泛使用,但为了实现高敏感度的目标,通常必须首先通过还原胺化反应标记糖链的还原性末端。然而,对糖链进行纯化和标记需要时间和多个步骤,因此,难以一次制备大量的样品。
用于解决上述问题的技术的实例,如在专利文献1中描述的通过使用特异性糖链捕获物质实现的样品制备方法。
[专利文献1]WO 2008/018170
发明内容
如上所述,糖链的分离、纯化和标记需要时间和多个步骤。尽管已经使用了利用离子交换树脂、反相层析、活性碳和凝胶过滤色谱等技术来分离纯化糖链,但是这些用于分离的技术并非设计用于特异性地识别糖。因此,杂质(肽或蛋白质等)的并入不可避免。此外,糖链的结构导致回收率经常存在差异。此外,为了标记糖链,还必须将纯化步骤后获得的糖链彻底干燥,因此,完成从纯化到标记的一系列操作需要数天的时间。
本发明的目的是提供一种以简便的方式从生物样品纯化糖链,并对其进行标记的方法。
本发明如下所述:
(1)一种用于标记包含在生物样品中的糖链的糖链标记方法,其包括:
(a)将糖链捕获到糖链捕获物质中,所述糖链捕获物质是特异捕获生物样品中的糖链的物质;
(c)从所述糖链捕获物质释放糖链;和
(d)标记该释放的糖链,
其中,步骤(a)、(c)和(d)在同一反应容器中连续进行。
(2)一种用于标记包含在生物样品中的糖链的糖链标记方法,其包括:
(a)将糖链捕获到糖链捕获物质中,所述糖链捕获物质是特异捕获生物样品中的糖链的物质;
(b)清洗该捕获了糖链的糖链捕获物质;
(c)从所述糖链捕获物质释放糖链;和
(d)标记该释放的糖链,
其中,步骤(a)、(b)、(c)和(d)在同一反应容器中连续进行。
(3)如(1)或(2)所述的糖链标记方法,其中在步骤(a)中,所述糖链捕获物质是具有能够特异性地与所述糖链的醛基基团进行反应的官能团的载体。
(4)如(3)所述的糖链标记方法,其中所述官能团是酰肼基团或氨氧基基团(aminoxy group)。
(5)如(4)所述的糖链标记方法,其中所述糖链捕获物质具有下式1所示的交联聚合物结构:
R1和R2分别代表具有1-20个碳原子的烃链,该烃链可插入-O-、-S-、-NH-、-CO-或-CONH-;R3、R4和R5分别代表H、CH3或具有2-5个碳原子的烃链。m和n分别代表单体单元数目。
(6)如(5)所述的糖链标记方法,其中所述糖链捕获物质具有下式2所示的交联聚合物结构:
m和n分别代表单体单元数目。
(7)如(1)至(6)中任一项所述的糖链标记方法,其中所述步骤(c)具有对所述糖链捕获物质进行酸处理的工序。
(8)如(1)至(7)中任一项所述的糖链标记方法,其中所述步骤(a)和(c)包括蒸发反应溶剂的工序。
(9)如(1)至(8)中任一项所述的糖链标记方法,其中在所述步骤(d)中,使用具有氨基基团的化合物标记所述糖链。
(10)如(9)所述的糖链标记方法,其中该使用具有氨基基团的化合物标记所述糖链的工序是通过还原胺化反应进行的。
(11)如(9)或(10)所述的糖链标记方法,其中所述具有氨基基团的化合物具有UV-可见光吸收特征或荧光特征。
(12)如(9)至(11)中任一项所述的糖链标记方法,其中所述具有氨基基团的化合物选自8-氨基芘-1,3,6-三磺酸盐、8-氨基萘-1,3,6-三磺酸盐、7-氨基-1,3-萘二磺酸、2-氨基-9(10H)-吖啶酮、5-氨基荧光素、丹磺酰乙二胺、2-氨基吡啶、7-氨基-4-甲基香豆素、2-氨基苯甲酰胺、2-氨基苯甲酸、3-氨基苯甲酸、7-氨基-1-萘酚、3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶、2-氨基-6-氰基乙基吡啶、p-氨基苯甲酸乙酯、p-氨基苄腈和7-氨基萘-1,3-二磺酸中的至少一个。
(13)一种检测糖链的方法,其包括:
检测通过(1)至(12)中任一项所述的糖链标记方法标记的糖链。
(14)一种分离(fractionating)糖链的方法,其包括:
分离通过(1)至(12)中任一项所述的糖链标记方法标记的糖链。
根据本发明的糖链标记方法,可在同一反应容器中对靶化合物(例如包含在生物样品中的糖链)进行纯化和标记,从而能够以简便的方式标记靶化合物。还可简化HPLC和CE等分析中通常使用的利用氨基化合物进行标记的过程。
附图说明
通过下面参照附图对优选实施方式的描述,本发明的上述和其他目的、特征和优点将更清晰明确。
图1:显示在示例性实施例1中,通过高效液相色谱测量获得的以2-AB标记的牛胎球蛋白糖链的结果的图表;
图2:显示在示例性实施例2中,通过高效液相色谱测量获得的以2-AB标记的牛血清IgG糖链的结果的图表;和
图3:显示在示例性实施例3中,通过高效液相色谱测量获得的以2-AB标记的牛胎球蛋白糖链的结果的图表。
最佳实施方式
本发明提供了一种用于标记包含在生物样品中的糖链的糖链标记方法,其包括:
(a)将糖链捕获到糖链捕获物质中,所述糖链捕获物质是特异捕获生物样品中的糖链的物质;
(b)清洗该捕获了糖链的糖链捕获物质;
(c)从所述糖链捕获物质释放糖链;和
(d)标记该释放的糖链,
其中,步骤(a)、(b)、(c)和(d)在同一反应容器中连续进行。
在步骤(a)中,用于特异性地捕获糖链的物质优选具有与所述糖链的醛基基团反应的官能团。所述官能团更优选为酰肼基团或氧氨基(oxylamino)基团。
对于此类糖链捕获物质,优选以载体的形式使用具有下式1或式2所示结构的交联聚合物。
R1和R2分别代表具有1-20个碳原子的烃链,该烃链可插入-O-、-S-、-NH-、-CO-或-CONH-;R3、R4和R5分别代表H、CH3或具有2-5个碳原子的烃链。m和n分别代表单体单元数目。
R1代表具有1-20个碳原子的烃链,该烃链可插入-O-、-S-、-NH-、-CO-或-CONH-,并且其实例如下所示。注意,下式中a、b和d分别代表1-5的整数,c代表1-10的整数。
R2代表具有1-20个碳原子的烃链,该烃链可插入-O-、-S-、-NH-、-CO-或-CONH-,并且其实例如下所示。注意,下式中e和f分别代表1-5的整数,g代表1-10的整数。
R3、R4和R5可相同或彼此不同,分别代表如下所示的H、CH3或具有2-5个碳原子的烃链。在下式中,h代表1-4的整数。
-H
-CH3
在式1中,特别优选的物质A的实例为具有下式2所示的交联聚合物结构的那些。
m和n分别代表单体单元数目。
也可使用可商购的包含酰肼基团的交联颗粒,例如Affigel Hz(BIO-RAD,153-6047)、CarboLink(TM)Coupling Gel(PIERCE,20391)和UltraLink(R)Hydrazide Gel(PIERCE,53149)。
对于糖链捕获物质,也可使用下式5或式6所示的交联聚合物作为载体。
R1和R2分别代表具有1-20个碳原子的烃链,该烃链可插入-O-、-S-、-NH-、-CO-或-CONH-;且R3、R4和R5分别代表H、CH3或具有2-5个碳原子的烃链。m和n分别代表单体单元数目。R1至R5的具体实例可列举为类似于与对式1所列举的那些实例。
此外,作为式5所示的聚合物颗粒,也可以优选使用具有式6所示结构的聚合物颗粒。
m和n分别代表单体单元数目。
在这些糖链捕获物质中,优选使用具有酰肼基团的物质。
在反应系统中,允许其中的糖链和糖链捕获物质相互反应,pH优选为酸性条件,优选2-9,更优选2-7,且再更优选2-6。反应温度优选为4-90℃,更优选25-90℃,且再更优选40-90℃。反应时间为10分钟至24小时,优选10分钟至8小时,且更优选10分钟至2小时。从允许糖链捕获反应有效进行的观点来看,优选在开放系统中进行反应以彻底蒸发溶剂。
随后,在步骤(b)中,清洗该捕获了糖链的糖链捕获物质,从而除去部分未被所述糖链捕获物质捕获的糖链和其他生物样品。用于清洗该糖链捕获物质的溶剂包括蛋白质变性剂溶液,例如胍或表面活性剂的水溶液;醇,例如甲醇、乙醇,水和水基缓冲液。在使用水溶液进行清洗的情况中,所述水溶液的pH优选接近中性,优选4-10,更优选6-8。
可不进行清洗步骤(b),这取决于所述生物样品的初始状态,例如除糖链外共存物质的量。
在步骤(c)中,从该捕获了糖链的糖链捕获物质释放糖链。也就是进行从所述糖链捕获物质切除所述糖链的反应。在此步骤中,优选使用酸和有机溶剂的混合溶剂,或酸、水和有机溶剂的混合溶剂对所述糖链捕获物质进行酸处理。在酸、水和有机溶剂的混合溶剂中,水含量优选为0.1%至90%,更优选0.1%至80%,且再更优选0.1%至50%。可包含水基缓冲液以代替水。所述缓冲液的浓度优选为0.1mM至1M,更优选0.1mM至500mM,再更优选1mM至100mM。反应溶液的pH优选为2-9,更优选2-7,再更优选2-6。本发明中优选使用的酸的实例为乙酸、甲酸、三氟乙酸、盐酸、柠檬酸、磷酸和硫酸;更优选的实例为乙酸、甲酸、三氟乙酸和磷酸;且再更优选的实例为乙酸和三氟乙酸。反应温度优选为4-90℃,更优选25-90℃,再更优选40-90℃。反应时间为10分钟至24小时,优选10分钟至8小时,再更优选10分钟至3小时。从有效进行糖链释放反应的观点来看,优选在开放系统中进行反应以彻底蒸发溶剂。
与常规的强酸处理(例如使用在强酸如10%三氟乙酸存在下的切割反应)相比,由于糖链的切割反应可以在弱酸性或接近中性的条件下进行,所以能够抑制糖链等的诱导水解,例如唾液酸残基等的消除。
在步骤(d)中,标记在步骤(c)中获得的游离糖链。标记方法优选为使用具有氨基基团的化合物标记所述糖链的反应,例如使用任意的氨基化合物进行还原胺化反应。在反应系统中,pH优选为酸性至中性条件,优选2-9,更优选2-8,且再更优选2-7。反应温度优选为4-90℃,更优选25-90℃,且再更优选40-90℃。氨基化合物的浓度优选为1mM至10M。还原剂的浓度优选为1mM至10M。反应时间为10分钟至24小时,优选10分钟至8小时,且更优选10分钟至3小时。
具有氨基基团的化合物优选具有UV-可见光吸收特征或荧光特征,并且优选选自以下组中的至少一种:
8-氨基芘-1,3,6-三磺酸盐、8-氨基萘-1,3,6-三磺酸盐、7-氨基-1,3-萘二磺酸、2-氨基-9(10H)-吖啶酮、5-氨基荧光素、丹磺酰乙二胺、2-氨基吡啶、7-氨基-4-甲基香豆素、2-氨基苯甲酰胺、2-氨基苯甲酸、3-氨基苯甲酸、7-氨基-1-萘酚、3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶、2-氨基-6-氰基乙基吡啶、p-氨基苯甲酸乙酯、p-氨基苄腈和7-氨基萘-1,3-二磺酸。
特别地,对于所述氨基化合物为2-氨基苯甲酰胺的情况,pH为酸性至中性条件,优选2-9,更优选2-8,且再更优选2-7。反应温度为4-90℃,优选30-90℃,且更优选40-80℃。氨基化合物的浓度为1mM至10M,优选为10mM至10M,且更优选为100mM至1M。还原剂的浓度为1mM至10M,优选为10mM至10M,且更优选为100mM至2M。反应时间为10分钟至24小时,优选10分钟至8小时,且更优选1小时至3小时。
可用于本发明的还原剂包括:氰基硼氢化钠、甲胺硼烷、二甲胺硼烷、三甲胺硼烷、甲基吡啶硼烷和吡啶硼烷,从反应性的观点来看优选使用氰基硼氢化钠。
由于步骤(d)后获得的溶液包含标记的糖链、过量添加的氨基化合物的未反应部分和还原剂,所以优选进行除去过量试剂的步骤。使用硅胶柱的去除法、通过凝胶过滤的去除法以及使用离子交换树脂的去除法均可使用,其中从防止唾液酸消除的观点来看,使用的溶剂优选为中性的。
尽管上文已经阐述了所述糖链标记方法,根据本发明的另一个方面,本文提供了检测糖链的方法,所述方法包括检测通过所述糖链标记方法标记的糖链的步骤。根据本发明的另一个方面,本文还提供了分离糖链的方法,所述方法包括分离通过所述糖链标记方法标记的糖链的步骤。
尽管专利文献1描述的糖链捕获技术在标记捕获糖链的步骤中采用了在添加过量试剂的条件下基于交换反应进行标记的技术,但本发明采用的是基于还原胺化反应进行标记的技术。还原胺化反应是常用的方法,但通常需要很长时间进行糖链的分离、脱盐和干燥。本发明通过将其与载体上的捕获和分离组合,从而能够方便地使用还原胺化反应。相对于专利文献1所述的标记技术,基于还原胺化反应的标记法的优点在于:(1)由于此反应可应用于通常使用的标记化合物,例如2-氨基苯甲酰胺和2-氨基吡啶,所以可以参考此前使用这些标记获得的发现;和(2)糖链和标记化合物之间的结合更稳定,并且因此能够长期贮存。
实施例
以下将参照包含示例性试验的实施例来解释本发明。然而,本发明并不限于这些典型试验。
在此示例性实施方式中,将用于制备作为分析样品的牛血清胎球蛋白和牛血清IgG(二者均为糖蛋白)的糖链的方法及其分析方法作为典型案例阐述。
(实施例1)
(生物样品的预处理)
将1毫克牛血清胎球蛋白溶于50μL 100mM碳酸氢铵中,添加5μL 120mM DTT(二硫苏糖醇),在60℃反应30分钟。反应完成后,向混合物中添加10μL 123mM IAA(碘乙酰胺),在室温下避光反应1小时。随后,使用400U胰蛋白酶对混合物进行蛋白酶处理,从而将蛋白质部分片段化成肽。将反应溶液在90℃处理5分钟,随后使用5U糖苷酶F处理,从而从肽释放糖链,由此获得预处理的生物样品。
(糖链捕获步骤(a)和清洗步骤(b))
向含有5mg具有酰肼基团的珠子(其为捕获糖链的载体)(BlotGlyco(R),来自Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.,BS-45601S,具有式2所示的结构的聚合物,所用单体的比例m∶n为20∶1)的一次性柱中添加20μL预处理生物样品的悬浮液和180μL2%乙酸/乙腈溶液,并在80℃反应1小时。此反应在开放系统中进行。通过目测确定溶剂完全蒸发,从而使珠子处于干燥状态。随后使用胍溶液、水、甲醇和三乙胺溶液清洗珠子,随后添加10%乙酸酐/甲醇,并在室温下反应30分钟,从而对未反应的酰基基团加帽(cap)。在加帽后,使用甲醇、盐酸水溶液和水清洗珠子。
(糖链释放步骤(c))
向含有所述珠子的一次性柱中添加20μL超纯水和180μL 2%乙酸/乙腈溶液,并在60℃反应2小时。此反应在开放系统中进行。通过目测确定溶剂完全蒸发,从而将珠子置于干燥状态。
(标记步骤(d))
向含有所述珠子的一次性柱中添加通过将2-氨基苯甲酰胺(2-AB)和氰基硼氢化钠溶于30%乙酸/DMSO混合溶剂中使其最终浓度分别调至0.35M和1M而制备的50μL溶液,并在60℃反应2小时。
上述糖链捕获步骤(a)、清洗步骤(b)、糖链释放步骤(c)和标记步骤(d)都在作为同一反应容器的一次性柱中进行。
(除去过量试剂的步骤)
回收50μL反应溶液,使用乙腈稀释十倍,并将其放入填充了硅胶的柱(Iatrobeads,6RS-8060,来自Mitsubishi Kagaku Iatron,Inc.)中,从而使硅胶吸附标记的糖链。在使用乙腈和乙腈/水混合溶液(95∶5)清洗柱子后,使用50μL超纯水回收标记的糖链。
(检测标记的糖链)
使用氨基柱(Shodex Asahipak NH2P-50),在330nm的激发波长和420nm的磷光波长下,通过HPLC测量所得的糖链。测量结果显示在图1中。检测到以2AB标记的糖链。
在图1中,峰1代表由含有一个唾液酸的糖链衍生的峰;峰1代表由含有一个唾液酸的糖链衍生的峰;峰2代表由含有两个唾液酸的糖链衍生的峰;峰3代表由含有三个唾液酸的糖链衍生的峰;峰4代表由含有四个唾液酸的糖链衍生的峰。
(实施例2)
实施例2以类似实施例1的方式进行,不同的是使用牛血清IgG代替牛血清胎球蛋白。测量结果显示在图2中。检测到以2AB标记的糖链。
在图2中,峰5代表由中性糖衍生的峰,峰6代表由酸性糖链衍生的峰。
(实施例3)
实施例3以类似实施例1的方式进行,不同的是使用Affigel Hz(BIO-RAD,153-6047)作为具有酰肼基团的珠子,以充当捕获糖链的载体。Affigel的使用量为50μL。测量结果显示在图3中。在此图表中,实线对应于Affigel,虚线对应于实施例1中使用的BlotGlyco(R)。发现使用Affigel Hz也检测到以2AB标记的糖链,但其特征在于强度低于使用BlotGlyco(R)的情况。
Claims (14)
1.一种用于标记包含在生物样品中的糖链的糖链标记方法,其包括:
(a)将糖链捕获到糖链捕获物质中,所述糖链捕获物质是特异捕获生物样品中的糖链的物质;
(c)从所述糖链捕获物质释放糖链;和
(d)标记该释放的糖链,
其中,步骤(a)、(c)和(d)在同一反应容器中连续进行。
2.一种用于标记包含在生物样品中的糖链的糖链标记方法,其包括:
(a)将糖链捕获到糖链捕获物质中,所述糖链捕获物质是特异捕获生物样品中的糖链的物质;
(b)清洗该捕获了糖链的糖链捕获物质;
(c)从所述糖链捕获物质释放糖链;和
(d)标记该释放的糖链,
其中,步骤(a)、(b)、(c)和(d)在同一反应容器中连续进行。
3.如权利要求1或2所述的糖链标记方法,
其中在步骤(a)中,所述糖链捕获物质是具有特异性地与所述糖链的醛基基团进行反应的官能团的载体。
4.如权利要求3所述的糖链标记方法,其中所述官能团是酰肼基团或氨氧基基团。
7.如权利要求1-6中任一项所述的糖链标记方法,其中所述步骤(c)具有对所述糖链捕获物质进行酸处理的工序。
8.如权利要求1-7中任一项所述的糖链标记方法,其中所述步骤(a)和(c)包括蒸发反应溶剂的工序。
9.如权利要求1-8中任一项所述的糖链标记方法,其中在所述步骤(d)中,使用具有氨基基团的化合物标记所述糖链。
10.如权利要求9所述的糖链标记方法,其中该使用具有氨基基团的化合物标记所述糖链的工序是通过还原胺化反应进行的。
11.如权利要求9或10所述的糖链标记方法,其中所述具有氨基基团的化合物具有UV-可见光吸收特征或荧光特征。
12.如权利要求9-11中任一项所述的糖链标记方法,其中所述具有氨基基团的化合物选自8-氨基芘-1,3,6-三磺酸盐、8-氨基萘-1,3,6-三磺酸盐、7-氨基-1,3-萘二磺酸、2-氨基-9(10H)-吖啶酮、5-氨基荧光素、丹磺酰乙二胺、2-氨基吡啶、7-氨基-4-甲基香豆素、2-氨基苯甲酰胺、2-氨基苯甲酸、3-氨基苯甲酸、7-氨基-1-萘酚、3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶、2-氨基-6-氰基乙基吡啶、p-氨基苯甲酸乙酯、p-氨基苄腈和7-氨基萘-1,3-二磺酸中的至少一个。
13.一种检测糖链的方法,其包括检测通过权利要求1-12中任一项所述的糖链标记方法标记的糖链。
14.一种分离糖链的方法,其包括分离通过权利要求1-12中任一项所述的糖链标记方法标记的糖链。
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