JP2012032203A - 抗体の糖鎖を調製する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 抗体をプロテインAやプロテインGなどの吸着材に結合させたまま抗体から糖鎖の切り出しを行った後に、切り出した糖鎖を、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応して安定な結合を形成する官能基を有する捕捉担体固相担体に捕捉し、次いで、捕捉した糖鎖を再遊離することにより、質量分析、クロマトグラフィー、あるいは電気泳動などに供するための糖鎖試料を、簡便かつ迅速に調製しうることを見出した。
【選択図】 なし
Description
(a)糖鎖が結合した抗体を含む試料を、抗体を捕捉するための担体に接触させ、当該抗体を当該担体に捕捉する工程、
(b)担体に捕捉した状態で抗体から糖鎖を遊離する工程、
(c)遊離した糖鎖を固相担体に捕捉する工程、
(d)捕捉した糖鎖を再遊離する工程、
、を含む方法。
(a)抗体を捕捉するための担体
(b)糖鎖を捕捉するための担体
(c)担体に捕捉された糖鎖を標識化および/または再遊離するための試薬
(d)反応液中に過剰に存在する(c)の試薬を除去するための担体
(e)反応用チューブ
[4] [1]に記載の方法を実施するための、下記(a)から(c)を含むマイクロ流路デバイス。
(a)抗体を捕捉するための担体
(b)糖鎖を捕捉するための担体
(c)(a)の担体および(b)の担体に連通している流路
本発明において使用する糖鎖が結合した抗体を含む試料としては、例えば、血清(血液)、リンパ液、腹腔浸出液、組織間液、脳脊髄液などの体液、またはB細胞、ハイブリドーマ、CHO細胞などの抗体産生細胞の培養上清などが挙げられるが、これらに制限されない。これら試料から、抗体を捕捉するための担体としては、抗体に親和性のある分子やイオン交換樹脂が固定化された担体が挙げられる。抗体に親和性のある分子としては、例えば、プロテインA、プロテインG、プロテインL、抗体精製用アプタマーなどを利用することができる。
本発明においては、上記の担体に抗体を捕捉した状態で、当該抗体から糖鎖を遊離する。この工程によれば、担体に捕捉した抗体を、一旦、溶出して回収し、脱塩、濃縮した上で、糖鎖を遊離させる常法(後述の比較例を参照のこと)に比して、操作が簡便である。糖鎖を遊離させる手段としては、N−グリコシダーゼあるいはO−グリコシダーゼを用いたグリコシダーゼ処理、ヒドラジン分解、アルカリ処理によるβ脱離などの方法を用いることができる。N型糖鎖の分析を行う場合は、N−グリコシダーゼを用いる方法が好ましい。グリコシダーゼ処理に先立って、トリプシンやキモトリプシンなどによるプロテアーゼ処理、および/または、SDSなどの界面活性剤による変性処理を行ってもよい。
糖鎖を含む溶液を糖鎖と特異的に結合する捕捉担体に接触させて捕捉担体上に糖鎖を捕捉する。
次いで、捕捉担体であるポリマー粒子に結合した糖鎖を再遊離し、精製された糖鎖試料を得る。
本発明は、上記本発明の方法を実施するための、キットを提供する。本発明のキットには、例えば、(1)抗体を捕捉するための担体(ビーズなど)、(2)糖鎖を捕捉(精製)するための担体(ビーズなど)、(3)担体に捕捉された糖鎖を標識化および/または再遊離するための試薬、(4)反応液中に過剰に存在する(3)の試薬を除去するための担体(カラムなど)、(5)反応用チューブ、(6)使用説明書、を含むことができる。
上記本発明の方法は、マイクロ流路デバイスを利用して行うことも可能である。従って、本発明は、上記本発明の方法を実施するための、マイクロ流路デバイスを提供する。本発明のマイクロ流路デバイスは、(1)抗体を捕捉するための担体、(2)糖鎖を捕捉するための担体、(3)(1)の担体および(2)の担体に連通している流路を含むものである。
[実施例]
(抗体捕捉)
糖鎖精製キットBlotGlyco(R)(住友ベークライト株式会社製、BS-45603)に付属の反応用チューブ(スピンカラム)に、プロテインAビーズ分散液(MabSelect Xtra, GEヘルスケア・ジャパン株式会社製、17-5269-07)100μLを分注し、遠心して溶媒を除去した後、純水200μLで3回洗浄した。抗体を含む培養上清1.6mLを加え、スピンカラムを通過させた後、純水200μLで3回洗浄した。
スピンカラム内のプロテインAビーズに純水(50μL)、1M重炭酸アンモニウム水溶液(5μL)、120mMジチオスレイトール水溶液(5μL)を加え、60℃で30分間反応させた。室温に戻した後、123mMヨードアセトアミド水溶液(10μL)を加え、室温で遮光して1時間静置した。トリプシン40ユニットを加え、37℃で1時間静置した後、90℃で5分間加熱してトリプシンを失活させた。室温に戻した後、N−グリコシダーゼF(ロシュ・アプライドサイエンス社製、11365193001)10ユニットを加え、37℃で2時間反応させた。90℃で5分間加熱してN−グリコシダーゼFを失活させた後、純水50μLを加え、スピンカラムを遠心して溶液を回収した。
上記で得られた糖鎖含有溶液にうち20μLを使用し、糖鎖精製キットBlotGlyco(R)(住友ベークライト株式会社製、BS-45603)により糖鎖の精製および蛍光標識(2-aminobenzamide:2AB)化を行った。まず、糖鎖捕捉ビーズ5mgを反応用チューブに取り、これに糖鎖含有溶液20μLを添加し、さらに2%酢酸/アセトニトリル溶液(180μL)を加え、80℃で1時間反応させることにより糖鎖をビーズに捕捉させた。反応後、ビーズを2Mグアニジン塩酸塩水溶液、純水、1%トリエチルアミン/メタノール溶液、メタノール(各200μL)で3回ずつ洗浄した。10%無水酢酸/メタノール溶液(100μL)を添加し、室温で30分間反応させることでビーズ上の余剰のヒドラジド基をキャッピングした。ビーズをメタノール、10mM塩酸、純水(各200μL)で順次洗浄したのち、純水(20μL)および2%酢酸/アセトニトリル溶液(180μL)を加え、70℃で90分間反応させることでビーズから糖鎖を再遊離させた。次に、30%酢酸/ジメチルスルホキシド溶液を調製し、これに2AB(350mM)およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム(1M)をそれぞれ記載の濃度で溶解させた。この溶液50μLを上記ビーズに添加し、60℃で2時間反応させることにより糖鎖を2ABラベル化した。反応後、溶液をサンプルチューブに回収し、アセトニトリル950μLを加えて希釈した。この溶液をBlotGlyco(R)に付属のクリーンアップカラム(底部にモノリスシリカフィルターを備えたスピンカラム)に全量加え、カラムを通過させることで2ABラベル化糖鎖をモノリスシリカに吸着させた。カラムをアセトニトリル400μLで3回、アセトニトリル/純水(95:5,v/v)で3回洗浄した後、純水50μLを加えて2ABラベル化糖鎖をモノリスシリカから溶出させた。
上記で得られたラベル化糖鎖溶液のうち10μLをHPLC測定に供した。HPLC装置は、Waters Corporation製‘Alliance’(Separation module 2695, Multi λ Fluorescent detector 2475)を使用し、蛍光励起波長330nm、検出波長420nmで測定した。カラムは、Shodex Asahipak NH2P-50 4Eを使用し、カラム温度は40℃とした。溶離液は2%酢酸/アセトニトリル(A液)と5%酢酸、3%トリエチルアミン/水(B液)を使用し、B液30%(0分)→B液30%(2分)→B液95%(80分)→B液95%(110分)のグラジエント、流速1mL/分の条件で測定した。
(抗体精製)
プロテインAビーズ分散液を容量1mLのディスポーザブルカラム(Varian社製)に充填した。抗体を含む培養上清1.6mLを加え、カラムを通過させた後、pH7の20mMリン酸バッファー1000μLで洗浄した。その後、pH2.7の100mMグリシンバッファー1000μLで抗体を溶出させた。回収した抗体溶液を透析により脱塩し、凍結乾燥することで精製抗体を得た。
上記精製抗体を50μLの純水に溶解し、これに1M重炭酸アンモニウム水溶液(5μL)、120mMジチオスレイトール水溶液(5μL)を加え、60℃で30分間反応させた。室温に戻した後、123mMヨードアセトアミド水溶液(10μL)を加え、室温で遮光して1時間静置した。N−グリコシダーゼF(ロシュ・アプライドサイエンス社製、11365193001)10ユニットを加え、37℃で2時間反応させた。90℃で5分間加熱してN−グリコシダーゼFを失活させた後、エタノール80μLを添加してタンパク質を沈殿させた。遠心して上清を回収し、これを凍結乾燥することで糖鎖を得た。
30%酢酸/ジメチルスルホキシド溶液を調製し、これに2AB(350mM)およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム(1M)をそれぞれ記載の濃度で溶解させた。この溶液50μLを上記糖鎖に添加し、60℃で2時間反応させることにより糖鎖を2ABラベル化した。反応後、溶液をサンプルチューブに回収し、アセトニトリル950μLを加えて希釈した。この溶液をクリーンアップカラム(底部にモノリスシリカフィルターを備えたスピンカラム)に全量加え、カラムを通過させることで2ABラベル化糖鎖をモノリスシリカに吸着させた。カラムをアセトニトリル400μLで3回、アセトニトリル/純水(95:5,v/v)で3回洗浄した後、純水50μLを加えて、2ABラベル化糖鎖をモノリスシリカから溶出させた。
実施例と同様の方法でHPLC測定を行った。図1に、HPLCチャートから読み取ったピークのうち、面積の上位5ピークについて実施例と比較例のデータを比較したものを示した。実施例と比較例で糖鎖解析のパターンに大差がないことが確認され、本発明の方法により、簡便な方法で従来法と同等の糖鎖分析が可能であることが示された。
Claims (4)
- 抗体の糖鎖を調製する方法であって、
(a)糖鎖が結合した抗体を含む試料を、抗体を捕捉するための担体に接触させ、当該抗体を当該担体に捕捉する工程、
(b)担体に捕捉した状態で抗体から糖鎖を遊離する工程、
(c)遊離した糖鎖を固相担体に捕捉する工程、
(d)捕捉した糖鎖を再遊離する工程、
を含む方法。 - 抗体を捕捉するための担体が、プロテインA、プロテインG、プロテインL、イオン交換樹脂、または抗体精製用アプタマーが固定化された担体である、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法を実施するための、下記(a)から(e)からなる群より選択される少なくとも1つの標品を含むキット。
(a)抗体を捕捉するための担体
(b)糖鎖を捕捉するための担体
(c)担体に捕捉された糖鎖を標識化および/または再遊離するための試薬
(d)反応液中に過剰に存在する(c)の試薬を除去するための担体
(e)反応用チューブ - 請求項1に記載の方法を実施するための、下記(a)から(c)を含むマイクロ流路デバイス。
(a)抗体を捕捉するための担体
(b)糖鎖を捕捉するための担体
(c)(a)の担体および(b)の担体に連通している流路
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