CN109142506A - 一种基于质谱的n-糖链相对定量的方法 - Google Patents

一种基于质谱的n-糖链相对定量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属生化分析技术领域，涉及一种基于质谱的N‑糖链相对定量的方法，本方法利用苯胺功能化的大环化合物标记N‑糖链再螯合稀土金属离子相对定量，其中采用苯胺功能化的DOTA对N‑糖链衍生，在螯合稀土金属离子Ho3+/Lu3+，两步反应均具有较高的衍生效率；测试结果显示，通过衍生上螯合了稀土金属离子的DOTA后，能提高糖链在MALDI‑MS负离子反射模式下的离子化效率，并改善糖链在质谱中的碎裂，有助于糖链结构解析。本发明用于大肠癌病人与正常人血清中N‑糖链表达水平的差异分析结果显示，本方法通过螯合不同的稀土金属离子，能实现多标标记定量，并具有很好的定量准确性及重复性。

Description

一种基于质谱的N-糖链相对定量的方法
技术领域
本发明属生化分析技术领域，涉及N-糖组学分析，具体涉及一种基于质谱的N-糖链相对定量的方法，尤其涉及一种利用苯胺功能化的大环化合物标记N-糖链再螯合稀土金属离子的相对定量新方法。本方法通过衍生上螯合了稀土金属离子的DOTA后，能提高糖链在MALDI-MS负离子反射模式下的离子化效率，并改善糖链在质谱中的碎裂，有助于糖链结构解析；通过螯合不同的稀土金属离子，能实现多标标记定量，并具有很好的定量准确性及重复性。
背景技术
现有技术公开了N-糖基化是生物体内最普遍存在的一种翻译后修饰，在诸多生命过程中起着重要的作用，如蛋白质的折叠，细胞-细胞相互作用，细胞识别以及炎症反应等。研究表明，异常的糖基化与许多重大疾病，如免疫缺陷，老年痴呆症及癌症等息息相关。研究报道，N-糖链有可能成为癌症的血清标志物，因此，解析N-糖链结构并进一步定量分析是深入了解N-糖链在生物过程所扮演角色的必要前提，然而，实践显示，所述的研究面临着巨大的困难，首先，含糖基化修饰的蛋白种类虽然很多，但是其丰度很低，第二，由于N-糖链是非模板合成，具有微观不均一性，且离子化效率低，在质谱解析上仍存在着诸多瓶颈，第三，尽管已经有较多的方法实现了N-糖链的定量，如代谢标记，18O标记，化学标记等，但该些定量方法仍存在下述缺陷，均为基于同位素2D,13C,15N和18O的标记实现质量差标签的引入，等。基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种基于稀土金属离子螯合标记的伪同位素标记方法，尤其涉及一种利用苯胺功能化的大环化合物标记N-糖链再螯合稀土金属离子的相对定量新方法；通过苯胺功能化的DOTA(S-2-(4-氨基苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸)标记N-糖链的还原端，再螯合不同的稀土金属离子，使能够同时实现N-糖链的结构解析及相对定量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种基于质谱的N-糖链相对定量的方法，具体涉及一种利用苯胺功能化的大环化合物标记N-糖链再螯合稀土金属离子的相对定量新方法。尤其是一种利用苯胺功能化的DOTA标记N-糖链还原端再螯合稀土金属离子Ho3+/Lu3+实现相对定量的方法。本方法有助于N-糖链结构解析并实现N-糖链相对定量。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
1.以麦芽七糖DP7为标准样品，考察苯胺功能化的DOTA与糖链的衍生效率；
2.考察苯胺功能化的DOTA螯合稀土金属离子Ho3+/Lu3+的衍生效率；
3.以麦芽七糖DP7为标准样品，考察DOTA螯合稀土金属离子Ho3+/Lu3+标记糖链用于糖链相对定量的可行性；
4.以核糖核酸酶B(RNB)、去唾液酸胎球蛋白(ASF)、鸡卵清白蛋白(OVA)、牛血清胎球蛋白(Fetuin)为标准糖蛋白，测试DOTA螯合稀土金属离子Ho3+/Lu3+标记N-糖链用于N-糖链相对定量的可行性；
5.以大肠癌血清为实际样，测试DOTA螯合稀土金属离子Ho3+/Lu3+标记N-糖链用于实际样N-糖链相对定量的可行性。
具体的，本发明的基于质谱的N-糖链相对定量的方法，为一种苯胺功能化的DOTA(S-2-(4-氨基苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸)标记N-糖链再螯合稀土金属离子的相对定量的方法，其中包括，选用苯胺功能化的DOTA对糖链进行衍生，然后在利用DOTA与不同的稀土金属离子Ho3+/Lu3+螯合实现质量差标签的引入，实现相对定量。
本发明的基于质谱的N-糖链相对定量的方法，其包括步骤：
(1)在糖链的冻干样品中，按顺序加入苯胺功能化的DOTA，还原剂氰基硼氢化钠混合，反应结束后冻干样品；
(2)分别向标记上DOTA的糖链中加入LuCl3或者HoCl3，反应完后混合除盐，
(3)进行MALDI质谱分析。
本发明方法中，苯胺功能化的DOTA与糖链的反应中，所述苯胺功能化的DOTA与糖链先在37℃孵育1小时后，再加入还原剂氰基硼氢化钠进行还原胺化反应，反应温度为37℃，反应时间为2小时，还原剂氰基硼氢化钠的终浓度是5mg/ml，反应体系为甲醇溶液(乙酸/甲醇：v/v 15:85)，总体系为50μL。
本发明方法中，DOTA标记的糖链与稀土金属盐LuCl3或者HoCl3的螯合反应中，利用DOTA与稀土金属离子Ho3+/Lu3+强的螯合作用，反应温度是37℃，反应时间是1小时，DOTA与金属盐的摩尔比是1:10，反应体系是10mM NH4AC,pH 5.6。
本发明方法中，将标记上DOTA-Lu和DOTA-Ho的糖链混合，其中，糖链衍生DOTA分别衍生，衍生DOTA后，其中一份螯合金属离子Ho3+，其中一份螯合金属离子Lu3+，衍生金属离子后再混合除盐。
本发明方法中，将不同金属离子标记的糖链混合后进行PGC tip除盐，其中包括，预洗：将PGC tip头在乙腈中反复吹20次左右进行活化；平衡：将PGC tip头在超纯水中反复吹打20次左右；上样：用PGC tip头反复吹打样品20次左右；清洗：将PGC tip头在超纯水中反复吹打20次左右；洗脱：PGC tip头在洗脱液(乙腈/水：v/v 3:7，含0.05％TFA)中反复吹打40次左右。
本发明中，进行了还原胺化及金属螯合反应衍生效率的实验，苯胺功能化的DOTA标记糖链再螯合稀土金属离子对提高糖链信号的能力实验，DOTA标记糖链再螯合稀土金属离子相对定量方法准确性及重复性实验和稀土金属离子螯合的DOTA对糖链质谱二级碎裂行为的影响实验，并进行了DOTA标记糖链再螯合稀土金属离子相对定量方法在复杂样品中的应用实验，实验结果显示，本方法中通过衍生上螯合了稀土金属离子的DOTA后，能提高糖链在MALDI-MS负离子反射模式下的离子化效率，并改善糖链在质谱中的碎裂，有助于糖链结构解析；通过螯合不同的稀土金属离子，能实现多标标记定量，并具有很好的定量准确性及重复性。
本发明的基于质谱的N-糖链相对定量的方法的优点有：
1)苯胺功能化的DOTA与稀土金属离子的盐酸盐(LuCl3或者HoCl3)均为商品化，可以推广使用；
2)苯胺功能化的DOTA与糖链还原端的醛基发生还原胺化反应，衍生效率高，接近100％；且DOTA与稀土金属盐酸盐螯合反应的效率高，接近100％；
3)若干稀土金属元素是同位素或者准同位数，便于实现多标标记定量；
4)糖链衍生上带稀土金属离子的DOTA，可以在MALDI的反射负离子模式下实现高灵敏检测，改善糖链分析的信噪比与信号强度；
5)螯合金属离子的DOTA能改善糖链在质谱中的碎裂模式，不仅能够提供系列的Y离子，还能提供跨环碎裂离子，如A离子。
附图说明
图1，(a)苯胺功能化的DOTA与N-糖链反应的示意图，(b)苯胺功能化的DOTA标记N-糖链再螯合稀土金属离子Ho3+/Lu3+相对定量方法的流程图。
图2，(a)DP7与苯胺功能化的DOTA还原胺化反应效率的优化,(b)苯胺功能化的DOTA与HoCl3反应条件的优化，和(c)苯胺功能化的DOTA与LuCl3反应条件的优化。
图3，(a)衍生前DP7的MALDI质谱图，(b)苯胺功能化的DOTA标记DP7的MALDI质谱图；(c)DOTA-Ho标记的DP7的MALDI质谱图，和(d)DOTA-Lu标记的DP7的MALDI质谱图；其中(a)和(b)在MALDI的反射正离子模式下获得；(c)和(d)在MALDI的反射负离子模式下获得。
图4为等摩尔比的DP7与DOTA-Lu标记的DP7混合后的MALDI质谱图，其中，(a)在MALDI的反射正离子模式下获得，(b)在MALDI的反射负离子模式下获得。
图5，(a)等摩尔比的DOTA-Ho标记的DP7和DOTA-Lu标记的DP7混合后的MALDI质谱图，(b)DOTA标记DP7再螯合稀土金属离子Ho3+/Lu3+相对定量方法的线性与重复性图。
图6，(a)未标记DP7的二级碎裂质谱图，(b)DOTA-Ho标记的DP7的二级碎裂质谱图，和(c)DOTA-Lu标记的DP7的的二级碎裂质谱图；其中，(a)在MALDI的正离子模式下获得，(b)和(c)在MALDI的负离子模式下获得。
具体实施方式
实施例1还原胺化及金属螯合反应衍生效率的考察实验
100μg的DP7(10μg/μL)与232μg苯胺功能化的DOTA(5.8μg/μL)混合后冻干，溶在40μL甲醇溶液中(乙酸/甲醇：v/v 15:85)，在37℃条件下反应1小时后加入还原剂氰基硼氢化钠(乙酸/甲醇：v/v 15:85)，使其终浓度为5mg/mL，总体系为50μL，37℃继续反应2小时。将反应前的DP7与反应后的DP7进行MALDI质谱分析，DP7几乎完全转化成DOTA-Lu标记的DP7，未衍生前的几乎看不到，结果如图3(a)和3(b)所示；
取上述衍生完DOTA的DP75μL冻干后，加入20μL的HoCl3(4.82μg/μL,10mM NH4AC,pH5.6)或LuCl3(5.00μg/μL,10mM NH4AC,pH 5.6)，在37℃条件下反应1小时。反应后进行MALDI质谱分析，结果如图3(c)和3(d)所示。
实施例2考察苯胺功能化的DOTA标记糖链再螯合稀土金属离子对提高糖链信号的能力实验
100μg的DP7(10μg/μL)与232μg苯胺功能化的DOTA(5.8μg/μL)混合后冻干，溶在40μL甲醇溶液中(乙酸/甲醇：v/v 15:85)，在37℃条件下反应1小时后加入还原剂氰基硼氢化钠(乙酸/甲醇：v/v 15:85)，使其终浓度为5mg/mL，总体系为50μL，37℃继续反应2小时后，取出5μL冻干后，加入20μL的LuCl3(5.00μg/μL,10mM NH4AC,pH 5.6),在37℃条件下反应1小时后加入10μg的DP7混匀，取出1μL用超纯水稀释10倍后进行MALDI质谱分析，结果如图4(a)和4(b)所示。
实施例3考察DOTA标记糖链再螯合稀土金属离子相对定量方法准确性及重复性实验
按照实施例1的方法分别对DP7进行DOTA-Lu及DOTA-Ho的衍生后，取等摩尔DOTA-Lu标记的DP7及DOTA-Ho标记的DP7混合后进行MALDI质谱分析，结果如图5(a)所示；DOTA-Lu标记的DP7信号强度与DOTA-Ho标记的DP7信号强度接近理论比，将不同摩尔比(1:10,1:5,1:2,1:1,2:1,5:1,10:1)DOTA-Lu标记的DP7及DOTA-Ho标记的DP7混合，进行MALDI质谱分析，将实验得到的强度比对理论比作图，得图5(b)，结果显示，本发明方法具有很好的定量准确性(R＝0.9995)，该实验重复三次，其变异系数CV<5％,证实本方法具有好的重复性。实施例4考察稀土金属离子螯合的DOTA对糖链质谱二级碎裂行为的影响实验
按照实施例1的方法对DP7进行DOTA-Lu及DOTA-Ho的衍生后，分别取等量的DP7，DOTA-Lu标记的DP7及DOTA-Ho标记的DP7点靶并进行MALDI质谱分析，结果如图6所示，DP7正离子模式条件下的碎裂只能得到系列的B/Y离子，而衍生上金属离子标记的DOTA后，在负离子模式条件下的碎裂不仅能得到系列的Y离子用于糖链序列的推断，以及能得到一系列的跨环碎裂碎片，有助于糖链链接方式的分析及鉴定。
实施例5 DOTA标记糖链再螯合稀土金属离子相对定量方法在复杂样品中的应用
取10μL正常人血清(600μg)，向样品中加入190μL 25mM碳酸氢铵溶液混匀，再中加入二硫苏糖醇(DTT)，使终浓度为10mM，置于37℃振荡反应1小时后再向溶液中加入碘乙酰胺(IAA)，使其终浓度为10mM，室温、避光条件下反应30分钟，实现巯基的还原烷基化，DTT与IAA通过超滤(3kD)除去，随后向样品中加入PNGase F酶，37℃孵育16小时后用PGC SPE富集除盐，中性糖链用2mL溶液30％乙腈(乙腈/水：v/v 3:7)洗脱，酸性糖链用2mL 30％乙腈(乙腈/水：v/v 3:7，含0.05％TFA)洗脱，之后冻干；10μL大肠癌病人血清(600μg)也是按照同样的方法进行处理；之后按照实例1对正常人的血清中性N-糖链进行DOTA-Ho衍生，对大肠癌病人的血清中性N-糖链进行DOTA-Lu衍生，衍生后混合，PGC除盐富集后进行MALDI质谱分析，酸性N-糖链除了在还原胺化前对唾液酸进行甲胺化保护外，其他均如前述同样的处理方法；结果显示，利用苯胺功能化的DOTA标记糖链再螯合稀土金属离子的相对定量N-糖链方法，能成功的对比分析大肠癌病人血清中N-糖链相对正常人血清N-糖链表达水平的差异，本实施例中共鉴定到30条N-糖链，其中12条N-糖链表达水平明显上升。

Claims (6)

1.一种基于质谱的N-糖链相对定量的方法，其特征在于，该方法为苯胺功能化的DOTA(S-2-(4-氨基苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸)标记N-糖链再螯合稀土金属离子的相对定量的方法，其中，选用苯胺功能化的DOTA对糖链进行衍生，然后在利用DOTA与不同的稀土金属离子Ho3+/Lu3+螯合实现质量差标签的引入，从而实现相对定量。
2.按权利要求1所述的基于质谱的N-糖链相对定量的方法，其特征在于，其包括步骤：
(1)在糖链的冻干样品中，按顺序加入苯胺功能化的DOTA，还原剂氰基硼氢化钠混合，反应结束后冻干样品；
(2)分别向标记上DOTA的糖链中加入LuCl3或者HoCl3，反应完后混合除盐；
(3)进行MALDI质谱分析。
3.按权利要求1或2所述的基于质谱的N-糖链相对定量的方法，其特征在于，
所述的苯胺功能化的DOTA与糖链的反应中，苯胺功能化的DOTA与糖链先在37℃孵育1小时后，再加入还原剂氰基硼氢化钠进行还原胺化反应，反应温度为37℃，反应时间为2小时，还原剂氰基硼氢化钠的终浓度是5mg/ml，反应体系为甲醇溶液(乙酸/甲醇：v/v 15:85)，总体系为50μL。
4.按权利要求1或2所述的基于质谱的N-糖链相对定量的方法，其特征在于，
所述的DOTA标记的糖链与稀土金属盐LuCl3或者HoCl3的螯合反应中，利用DOTA与稀土金属离子Ho3+/Lu3+强的螯合作用，反应温度是37℃，反应时间是1小时，DOTA与金属盐的摩尔比是1:10，反应体系是10mM NH4AC,pH 5.6。
5.按权利要求1或2所述的基于质谱的N-糖链相对定量的方法，其特征在于，
所述的将标记上DOTA-Lu和DOTA-Ho的糖链混合中，开始的糖链衍生DOTA分别进行衍生，衍生DOTA后，其中一份螯合金属离子Ho3+，其中一份螯合金属离子Lu3+，衍生金属离子后再混合除盐。
6.按权利要求1或2所述的基于质谱的N-糖链相对定量的方法，其特征在于，所述的将不同金属离子标记的糖链混合后进行PGC tip除盐中，其中包括：预洗：将PGC tip头在乙腈中反复吹20次左右进行活化；平衡：将PGC tip头在超纯水中反复吹打20次；上样：用PGCtip头反复吹打样品20次；清洗：将PGC tip头在超纯水中反复吹打20次；洗脱：PGC tip头在洗脱液(乙腈/水：v/v 3:7，含0.05％TFA)中反复吹打40次。
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CN109828107A (zh) * 2019-01-16 2019-05-31 清华大学 一种多原子元素标记探针及其制备方法与应用

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