JP7275320B2 - ヒアルロナンコンジュゲートおよびその使用 - Google Patents

ヒアルロナンコンジュゲートおよびその使用 Download PDF

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Description

本開示は、一般に、ヒアルロン酸（ＨＡ）－性ホルモンコンジュゲート、および神経変性疾患の治療におけるそれらの使用に関する。
中枢神経系（ＣＮＳ）の神経変性疾患は、ニューロンの死を含む、ニューロンの構造および機能の進行性の喪失を特徴とし、主に認知症または困難を伴う動作（安静時の振戦、硬直、腰痛など）によって症状が現れる。神経変性疾患の中でも、アルツハイマー病(ＡＤ)、パーキンソン病(ＰＤ)、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、多発性硬化症(ＭＳ)、およびハンチントン病(ＨＤ)は、神経科のクリニックで非常に一般的である。神経変性疾患は、中高年層に多い疾患であり、患者やその家族にとって非常に深刻なものである。このような疾患は、患者の生活の質に悪影響を及ぼすと同時に、医療システムにとっても大きな負担となる。しかし、高齢化社会の到来に伴い、神経変性疾患の罹患率は増加の一途をたどっている。
現在のところ、神経変性疾患の治療法は、症状を緩和させるため、または疾患の進行の遅らせるだけのものである。例えば、ドネペジル、ガランタミンなどの薬物は、神経伝導活動を改善するために、シナプス間隙に放出されるアセチルコリンの異化作用を遅らせることによって、認知、機能、行動などの症状を緩和するために使用される。また、レボドパ、エルドパ（ｅｌｌｄｏｐａ）、アマンタジンなどの薬物は、病気の進行を遅らせ、患者の生存率を高めるために使用される。しかし、これらの薬物にはそれぞれ限界があり、中には重篤な副作用を伴うものもあるため、患者の生活の質は依然として思わしくない。
上記の観点から、関連技術において、神経変性疾患のための効果的な治療の必要性が存在する。
（概要）
以下では、読み手に基本的な理解を提供するために、本開示の簡略化した概要が示される。この概要は、本開示の広範な概要ではなく、本発明の肝要な／重要な要素を特定するものでも、本発明の範囲を明確にするものでもない。その唯一の目的は、後述するより詳細な説明の前段階として、本明細書に開示されているいくつかの概念を簡略化して提示することである。
一つの態様では、本開示は、ヒアルロナンコンジュゲート（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に関する。
本開示の様々な実施形態によれば、前記ヒアルロナンコンジュゲートは、ヒアルロン酸（ＨＡ）またはその誘導体もしくはその塩と、性ホルモンと、前記性ホルモンを前記ＨＡまたはＨＡ誘導体もしくはＨＡ塩の二糖単位の１つに共有結合させるリンカーとを含む。
いくつかの実施形態では、前記性ホルモンは、エストロン、エストラジオール、エストリオール、テストステロン、または１１－デオキシコルチコステロンであり得る。
本開示の任意の実施形態によれば、本発明のヒアルロナンコンジュゲートのリンカーは、１つ以上のアミノ酸、脂質、ジヒドラジド－Ｃ２～Ｃ２０ジカルボン酸、およびＣ２～Ｃ２０ジカルボン酸のうちのいずれかである。
１つの実施形態では、前記リンカーは、β－アラニン（β－ＡＬＡ）などのアミノ酸である。別の実施形態では、前記リンカーは、ジヒドラジド－Ｃ２～Ｃ２０ジカルボン酸であり、例えば、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）－スクシナートである。さらに別の実施形態では、前記リンカーは、Ｃ２～Ｃ２０ジカルボン酸、例えば、コハク酸である。
本開示の他の実施形態によれば、本発明のヒアルロナンコンジュゲートのＨＡは、０．１％～６０％の置換度を有する。
本開示のある実施形態によれば、本発明のヒアルロナンコンジュゲートのＨＡは、約５～５００キロダルトン（ｋＤａ）の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する。本開示の様々な実施形態によれば、前記リンカーは、性ホルモンのヒドロキシル基（－ＯＨ）に結合される。
本開示の別の態様は、それを必要とする対象における神経変性疾患を治療する方法に関する。
本開示のいくつかの実施形態によれば、前記方法は、有効量の本発明のヒアルロナンコンジュゲートを対象に投与するステップを含む。
本開示のいくつかの実施形態によれば、本発明のヒアルロナンコンジュゲートは、経口、経鼻、頭蓋内、脊髄内、包膜内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、髄内（ｉｎｔｒａｍｅｄｕｌｌａｒｙ）、脳内、脳室内、静脈内、動脈内、心臓内、皮内、皮下、経皮、腹腔内、または筋肉内投与によって対象に投与される。
本開示のいくつかの実施形態によれば、本発明のヒアルロナンコンジュゲートを用いて治療することができる神経変性疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、前頭側頭型認知症、てんかん、神経因性疼痛、または運動失調である。
本開示のいくつかの実施形態によれば、本発明のヒアルロナンコンジュゲートによって治療可能な対象は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
本開示の他の態様にも含まれる主題は、神経変性疾患の治療に治療するための医薬品の製造におけるヒアルロン酸のコンジュゲート（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の使用、ならびに神経変性疾患の治療に使用するためのヒアルロン酸のコンジュゲートまたはこれを含有する医薬組成物を含む。
本開示の特徴および利点の多くは、添付の図面に関連して考慮される以下の詳細な説明を参照することにより、よりよく理解されるであろう。
本発明のこれらおよびその他の特徴、態様および利点は、以下の説明、添付の特許請求の範囲および添付の図面を参照することにより、よりよく理解されるであろう。
本開示の１つの実施例による、ＨＡ－βＡＬＡ－Ｃ３／Ｃ１７エストラジオール（ＨＡ－Ｅ２）ヒアルロナンコンジュゲートを合成するためのスキームを示す。 図２Ａおよび図２Ｂは、本開示の１つの実施例による、エストラジオール（Ｅ２）およびＨＡ－Ｅ２のそれぞれのＵＰＬＣ分析結果を示す。 図２Ａおよび図２Ｂは、本開示の１つの実施例による、エストラジオール（Ｅ２）およびＨＡ－Ｅ２のそれぞれのＵＰＬＣ分析結果を示す。 本開示の１つの実施例による、ｉｎ ｖｉｔｒｏのミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）レベルに対するＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２ヒアルロナンコンジュゲートの効果を示す。 本開示の１つの実施例による、ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスのｉｎ ｖｉｖｏ血清および海馬のＡβ４２レベル変化に対するＨＡ－Ｅ２ヒアルロナンコンジュゲートの効果をそれぞれ示す。 本開示の１つの実施例による、ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスのｉｎ ｖｉｖｏ血清および海馬のＡβ４２レベル変化に対するＨＡ－Ｅ２ヒアルロナンコンジュゲートの効果をそれぞれ示す。 本開示の１つの実施例による、ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２ヒアルロナンコンジュゲートを合成するためのスキームである。 本開示の１つの実施例による、ＯＨＥラットにおける遊泳距離および遊泳時間に対するＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２ヒアルロナンコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効果をそれぞれ示す。 本開示の１つの実施例による、ＯＨＥラットにおける遊泳距離および遊泳時間に対するＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２ヒアルロナンコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効果をそれぞれ示す。 本開示の１つの実施例による、標的象限におけるＯＨＥラットの遊泳距離および遊泳時間に対するＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２ヒアルロナンコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効果をそれぞれ示す。 本開示の１つの実施例による、標的象限におけるＯＨＥラットの遊泳距離および遊泳時間に対するＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２ヒアルロナンコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効果をそれぞれ示す。 本開示の１つの実施例による、ＯＨＥラットの遊泳距離および遊泳時間に対するＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２ヒアルロナンコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効果をそれぞれ示す。 本開示の１つの実施例による、ＯＨＥラットの遊泳距離および遊泳時間に対するＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２ヒアルロナンコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効果をそれぞれ示す。 本開示の１つの実施例による、標的象限におけるＯＨＥラットの遊泳距離および遊泳時間に対するＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２ヒアルロナンコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効果をそれぞれ示す。 本開示の１つの実施例による、標的象限におけるＯＨＥラットの遊泳距離および遊泳時間に対するＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２ヒアルロナンコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効果をそれぞれ示す。 本開示の１つの実施例による、海馬ＣＡ１の錐体ニューロンの遠位尖端樹状突起および遠位基底樹状突起に対するＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２ヒアルロナンコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効果をそれぞれ示す代表的な顕微鏡写真である。 本開示の１つの実施例による、海馬ＣＡ１の錐体ニューロンの遠位尖端樹状突起および遠位基底樹状突起に対するＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２ヒアルロナンコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効果をそれぞれ示す代表的な顕微鏡写真である。 本開示の１つの実施例による、ＯＨＥラットにおける海馬ＣＡ１錐体ニューロンの尖端および基底樹状突起のスパイン密度に対するＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２ヒアルロナンコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効果をそれぞれ示す。 本開示の１つの実施例による、ＯＨＥラットにおける海馬ＣＡ１錐体ニューロンの尖端および基底樹状突起のスパイン密度に対するＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２ヒアルロナンコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効果をそれぞれ示す。 本開示の１つの実施例による、ＭＰＴＰ治療マウスの学習能力に対するＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２ヒアルロナンコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す。
（説明）
添付の図面に関連して以下に提供される詳細な説明は、本実施例の説明を意図したものであり、本実施例が構築または利用され得る唯一の形態を表すことを意図したものではない。本説明では、本実施例の役割と、本実施例を構築して実行させるためのステップの順序とを示している。しかし、同じまたは同等の役割および順序が、異なる実施例によって達成され得る。
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で採用されている特定の用語がここに集められている。本明細書で特に定義されていない限り、本開示で採用されている科学的および技術的な用語は、当業者が一般的に理解し、使用する意味を有するものとする。
文脈上特に要求されない限り、単数形には同じものの複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれることが理解される。また、本明細書および特許請求の範囲で使用されている「少なくとも１つ」および「１つ以上」という用語は、同じ意味を有し、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上を含む。さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲を通して使用される、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの少なくとも１つ」、および「Ａ、Ｂおよび／またはＣのうちの少なくとも１つ」という表現は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢを一緒に、ＢとＣを一緒に、ＡとＣを一緒に、ならびにＡ、Ｂ、およびＣを一緒にカバーすることを意図している。
本発明の広範な範囲を示す数値範囲やパラメータは近似値であるにもかかわらず、具体的な実施例に記載された数値は、可能な限り正確に報告される。しかし、いずれかの数値にも、それぞれの試験測定で見出される標準偏差に起因する一定の誤差が含まれている。また、本明細書では、「約」という用語は、一般に、所定の値または範囲の１０％、５％、１％、または０．５％以内を意味する。また、「約」という用語は、当業者が考える場合の平均値の許容可能な標準誤差の範囲内を意味する。実行／実施例以外では、または別途明示して示されない限り、本明細書で開示されている材料の量、時間の長さ、温度、作動条件、量の割合などのためのすべての数値範囲、量、値、およびパーセントは、すべての例で「約」という用語によって変更されていると理解されるものとする。したがって、特にそれとは反対の指示がない限り、本開示および添付の特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは、所望に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、各数値パラメータは、少なくとも、報告される有効桁数の数を踏まえて、および通常の丸め技法を適用することによって、少なくとも解釈されるものとする。範囲は、１つの終点からもう１つの終点までまたは２つの終点間として本明細書で示され得る。本明細書で開示される全ての範囲は、別途指定しない限り終点を含む。
本明細書で使用される「治療」および「治療する」という用語は、予防に寄与する（例えば、予防的）、治癒的または緩和的な措置を指してもよい。特に、本明細書で使用される「治療する」という用語は、本発明のヒアルロナンコンジュゲートまたはこれを含む医薬組成物を、医学的状態（例えば、神経変性疾患）、医学的状態に関連する症状、医学的状態に続発する疾患または障害、または医学的状態に対する素因、を有する対象に適用または投与することを指し、その目的は、前記特定の疾患、障害および／または状態の１つ以上の症状または特徴を部分的にまたは完全に緩和する、改善する、軽減する、発症を遅延させる、進行を阻害する、重症度を低減する、および／または発生率を減らすことである。治療を、疾患、障害および／または状態の兆候を示さない対象、および／または、疾患、障害および／または状態の早期の兆候のみを示す対象に施してもよく、その目的は、疾患、障害および／または状態に関連する病変を発症するリスクを減らすことである。
用語「対象」および「患者」は、本明細書では互いに互換可能に使用され、本明細書に記載されたヒアルロナンコンジュゲート、これを含有する医薬組成物、および／または本発明の方法により治療可能なヒト種を含む動物を意味することを意図する。用語「対象」または「患者」は、本開示から恩恵を受ける可能性のある任意の哺乳類を含む。本明細書で使用される「哺乳類」は、ヒト、霊長類、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシなどの家畜および農場動物、ならびに動物園動物、スポーツ動物、またはペット動物、ならびにマウス、およびラットなどのげっ歯類を含む哺乳綱の全てのメンバーを指す。用語「非ヒト動物」は、ヒトを除く哺乳綱の全てのメンバーを指す。１つの例示的な実施形態において、患者はヒトである。用語「対象」または「患者」は、１つの性別を具体的に示さない限り、男性および女性の両方を指すことを意図する。
本明細書で使用される用語「有効量」は、所望の治療効果を生じるのに十分な本発明のヒアルロナンコンジュゲートの量を指す。治療目的のために、有効量の薬物は、疾患または状態を治癒する（ｃｕｒｅ）のには要求されないが、疾患もしくは状態の発症を遅延する、妨げる、もしくは予防する、または疾患もしくは状態の症状を改善するなど、疾患または状態のための治療を提供する。有効量を、指定された期間を通して１回、２回、またはそれ以上の回数で、投与するのに適した形態で１回量、２回量またはそれ以上の用量に分割してもよい。具体的な有効量または十分量は、治療する特定の状態、患者の身体状態（例えば、患者の体重、年齢もしくは性別）、治療する哺乳類または動物の種類、治療の期間、併用療法（もしあれば）の特性、ならびに、使用する特定の剤形および化合物またはその誘導体の構造などの要因によって異なる。有効量は、例えば、ヒアルロナンコンジュゲートの総質量またはヒアルロナンコンジュゲートにおける性ホルモンの等価質量（例えば、グラム、ミリグラムもしくはマイクログラム単位）、またはヒアルロナンコンジュゲートの質量またはヒアルロナンコンジュゲートにおける性ホルモンの等価質量の、体重に対する比、例えば、ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）として表示してもよい。
用語「適用」および「投与」は、本明細書では互いに互換可能に使用され、本発明のヒアルロナンコンジュゲートまたは医薬組成物を、治療を必要とする対象に適用することを意味する。
本開示のいくつかの例によれば、試験期間中、前記ヒアルロナンコンジュゲートは、週２回投与される。理解できるように、有効量は、投与の間隔および期間に応じて適宜調整することができる。ある実施形態では、複数回の投与が対象に行われる場合、対象への複数回の投与の頻度は、１日３回、１日２回、１日１回、２日ごとに１回、３日ごとに１回、４日ごとに１回、５日ごとに１回、６日ごとに１回、毎週１回、隔週１回、毎月１回、または隔月に１回である。ある実施形態では、対象に複数回の投与を行う頻度は、１日１回である。ある実施形態では、複数の用量を対象に投与する頻度は、１日あたり２回である。ある実施形態では、複数の用量が対象に投与される場合、複数回の投与の最初の投与と最後の投与との間の期間は、１日、２日、４日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、７年、１０年、１５年、２０年、または対象の生涯である。ある実施形態では、複数回の投与のうち最初の投与から最後の投与までの期間は、３ヶ月、６ヶ月、または１年である。ある実施形態では、複数回の投与のうち最初の投与と最後の投与との間の期間は、対象の生涯である。特定の実施形態では、複数回の投与を対象に行う頻度は、１週間に３回である。
また、以下に提供される実施例によれば、ヒアルロナンコンジュゲートは静脈内注射によって投与されるが、これは本発明がどのように実施され得るかについての例示に過ぎず、本開示はこれに限定されない。
例えば、前記ヒアルロナンコンジュゲートは、薬学的に許容される賦形剤と共に、所望の投与様式に適した医薬組成物に処方され得る。ここに開示され、特許請求されている発明の概念に従って調製された特定の医薬組成物は、患者への経口、非経口（皮下、静脈内、ボーラス注射、筋肉内、動脈内）、硝子体内、または経皮投与に適した単一単位剤形である。剤形の例としては、錠剤；カプレット；軟ゼラチンカプセルのようなカプセル；カシェ剤；トローチ；ロゼンジ；分散剤；坐剤；軟膏；パップ剤（湿布）；ペースト；粉末；ドレッシング；クリーム；プラスター；溶液；パッチ；エアロゾル（例：鼻腔スプレーまたは吸入器）；ゲル；懸濁液（例：水性または非水性液体懸濁液、水中油型エマルジョン、または油中水型液体エマルジョン）、溶液、エリキシル剤などの患者への経口投与に適した液体剤形；および患者への非経口投与に適した液体剤形を提供するために再構成することができる無菌固体（例えば、結晶性または非晶質固体）が挙げられるが、これらに限定されない。理解され得るように、これらの医薬組成物も本開示の範囲内である。
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な賦形剤」という用語は、１つの臓器または体の一部から別の臓器または体の一部へなどの、対象薬剤の運搬または輸送に関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、担体、溶媒、カプセル化材料などの薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。各賦形剤は、製剤の他の成分と適合性があるという意味で「許容可能」でなければならない。医薬製剤は、本発明の化合物を、１つ以上の薬学的に許容される成分と組み合わせて含む。前記賦形剤は、固体、半固体または液体の希釈剤、クリームまたはカプセルの形態であり得る。これらの医薬製剤は、本発明のさらなる目的である。通常、活性化合物の量は、調製物の０．１～９５重量％、非経口用調製物ではこのましくは０．２～２０重量％、経口投与用調製物では好ましくは１～５０重量％である。本発明の方法の臨床使用のために、本発明の医薬組成物は、意図された投与経路に適した製剤に処方される。
本明細書で使用されるＨＡコンジュゲートの「置換度（ＤＳ）」という用語は、前記ＨＡの二糖単位あたりに結合した置換基（すなわち、性ホルモン）の平均比率である。
本明細書で使用する「ヒアルロン酸」（ＨＡ）（ヒアルロネートまたはヒアルロナンとも呼ばれる）という用語は、二糖単位の繰り返し配列、具体的にはＤ－グルクロン酸とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（－４ＧｌｃＵＡβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－）、からなるアニオン性の非硫酸化グリコサミノグリカンであり、ある。その分子量は３７９ダルトン(Ｄａ)（単一の二糖単位）から数百万ダルトンを超える範囲に及ぶ可能性がある。ＨＡは、細胞表面のヒアルロナン媒介運動性のための受容体（ＲＨＡＭＭ）およびＣＤ４４との相互作用により、細胞の運動性や免疫細胞の接着に関与している。「ＨＡ誘導体」という用語は、ＨＡの１つ以上の二糖単位のヒドロキシル基、カルボキシル基、アミド基、またはアセチルアミノ基に任意の修飾を有するＨＡを指す。
本明細書では、「塩」という用語は、あらゆる塩を意味し、薬学的に許容される塩を包含する。「薬学的に許容される塩」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを伴わずに、ヒトおよび下等動物の組織と接触して使用するのに適しており、合理的な利益／リスク比に見合った塩を意味する。薬学的に許容される塩は、当技術分野で周知である。
本明細書で使用される場合、用語「リンカー」は、コンジュゲートの２つの部分を接続する化学的部分（例えば、２つの官能基間の化学結合形態）を意味する。本開示では、前記リンカーは、前記性ホルモンと前記ＨＡとの間に存在する任意の化学的部分であってよい。本開示のいくつかの実施形態では、前記リンカーは、化学的または酵素的に消化されてもよく、あるいは、自然に分解されてもよい。
本開示の好ましい実施形態によれば、本発明のヒアルロナンコンジュゲートは、徐放性（ＥＲ）、制御放出（ＣＲ）、持続放出（ＳＲ）、長期放出（ＰＲ）、長時間作用型放出（ＬＡＲ）および遅延放出（ＤＲ）医薬品などの「改変放出（ＭＲ）」製剤に処方される。従来の剤形では、製剤原料が速やかに放出されるため、体内の薬物濃度が変動し、製剤原料の治療レベルを維持するために複数回の投与が必要になるのと対照的に、改変放出型剤形では、製剤原料の放出時間および／または放出位置などの放出特性を選択することで、従来の剤形では得られなかった望ましい治療目的を達成することができる。剤形に関する用語は、当業者が認識して使用する通常の意味を有するものとする。例えば、「徐放性」という用語は、即時放出型（従来型）の投与形態として提示された薬物と比較して、投与頻度の少なくとも２分の１の減少を可能にする投与形態である。「制御放出」とは、注射剤の場合、日単位から月単位までの長期間にわたって製剤原料を放出することができる剤形のことである。「持続放出」という用語は、製剤原料が所定の速度で放出され、一定の期間、血漿中の濃度が一定になることをいう。
本開示は、少なくとも部分的には、ＨＡ－性ホルモンコンジュゲートが様々な神経変性疾患の治療に望ましい治療効果を示すと同時に、胸や心臓などの他の器官に作用する性ホルモンに起因する望ましくない副作用を軽減するという予想外の発見に基づくものである。
したがって、本開示の第１の態様は、ヒアルロン酸（ＨＡ）またはその誘導体もしくはその塩と、性ホルモンと、性ホルモンをＨＡまたはＨＡ誘導体もしくはＨＡ塩の二糖単位の１つに結合させるためのリンカーとを含むヒアルロナンコンジュゲートを対象とする。
例えば、前記性ホルモンは、エストロン（Ｅｌ）、エストラジオール（Ｅ２）、エストリオール（Ｅ３）、テストステロン（Ｔ）、および１１－デオキシコルチコステロン（１１－ＤＯＣ）のいずれかであり得る。
様々な実施形態によれば、前記リンカーは、１つ以上のアミノ酸残基、脂質、ジヒドラジド－Ｃ２～Ｃ２０ジカルボン酸、またはＣ２～Ｃ２０ジカルボン酸であってもよい。本開示では、前記リンカーは、ＨＡと性ホルモンとを接続するためのアームまたはスペーサーとして機能する。前記リンカーは、一方ではヒドロキシル基、カルボキシル基、アミド基、またはアセチルアミノ基の結合を介してＨＡと結合し、他方では、任意の、あり得る共有結合を介して性ホルモンと結合する。
いくつかの実施形態では、前記リンカーは、単一のアミノ酸残基であり、例えば、アラニン（Ａｌａ；好ましくは、β－アラニン）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（ｌｕ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、バリン（Ｖａｌ）、γ－ａｂｕ（４－アミノブタン酸）、δ－アミノ吉草酸（５－アミノペンタン酸）、ε－アミノカプロン酸（６－アミノヘキサン酸）、７－アミノヘプタン酸、８－アミノオクタン酸、および１１－アミノウンデカン酸などが挙げられる。いくつかの実施形態では、前記リンカーは、２～１００個のアミノ酸残基を有する短いペプチドであってもよい。例えば、前記リンカーは、（ＧｎＳ）ｍの配列を有する柔軟なペプチドであってもよく、ここで、ｎおよびｍは、独立して、１～４の数である。
いくつかの実施形態では、脂質リンカーが好ましい。このような脂質リンカーは、親水性の極性頭部基と疎水性の鎖を有する。
いくつかの実施形態では、前記リンカーは、直鎖状または分枝状の、脂肪族、芳香族または芳香脂肪族（ａｒａｌｉｐｈａｔｉｃ）のＣ２～Ｃ２０ジカルボン酸であり、これは、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ドデカン二酸、ブラシル酸、タプシン酸（ｔｈａｐｓｉｃ ａｃｉｄ）、ジアボリック酸（ｄｉａｂｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、クロセチン、マレイン酸、フマル酸、グルタコン酸、２－デセン二酸、トラウマチン酸、ムコン酸、グルチン酸（ｇｌｕｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、シトラコン酸、メサコン酸、イタコン酸、タルトロン酸、メソシュウ酸（ｍｅｓｏｘａｌｉｃ ａｃｉｄ）、リンゴ酸、酒石酸、オキサロ酢酸、アスパラギン酸、α－ヒドロキシグルタル酸、アラビナル酸（ａｒａｂｉｎａｒｉｃ ａｃｉｄ）、アセトンジカルボン酸、α－ケトグルタル酸、グルタミン酸、ジアミノピメリン酸、サッカリン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ジフェン酸、２，６－ナフタレンジカルボン酸の誘導体であってもよい。
ジヒドラジド－Ｃ２～Ｃ２０ジカルボン酸ベースのリンカーは、一般的に２つの部分、すなわちジヒドラジドおよびＣ２～Ｃ２０ジカルボン酸を有し、Ｃ２～Ｃ２０ジカルボン酸の１つのカルボキシレート基がジヒドラジドの１つのヒドラジド基と共有結合しているものである。ジヒドラジド部分の例としては、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、セバシン酸ジヒドラジド（ＳＤＨ）、バリンジヒドラジド（ＶＤＨ）、イソフタル酸ジヒドラジド（ＩＤＨ）、カルボジヒドラジド（ＣＤＨ）、イコサン二酸（ｉｃｏｓａｎｅｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）ジヒドラジド（ＬＤＨ）、コハク酸ジヒドラジド、アジピン酸ジヒドラジド、ジヒドラジドスルホキシド、シュウ酸ジヒドラジド、およびピメリン酸ジヒドラジドなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。Ｃ２～Ｃ２０ジカルボン酸リンカーに関連して上記した例示的な例は、ジヒドラジド－Ｃ２～Ｃ２０ジカルボン酸ベースのリンカーに対するジカルボン酸部分としての使用にも適している。
本発明のリンカーは、２つの部分、すなわち、１つ以上のアミノ酸とＣ２～Ｃ２０ジカルボン酸とを有する、アミノ－Ｃ２～Ｃ２０ジカルボン酸ベースのリンカーも包含する。アミノ酸残基およびＣ２～Ｃ２０ジカルボン酸リンカーに関連して上記した例示的な例は、そのようなｔアミノ－Ｃ２～Ｃ２０ジカルボン酸ベースのリンカーを形成するための使用にも適している。限定ではなく一例として、アミノ－Ｃ２～Ｃ２０ジカルボン酸ベースのリンカーは、ＡＬＡ－スクシナートリンカーであり得る。
本開示のいくつかの実施形態によれば、本発明のヒアルロナンコンジュゲートのＨＡは、約５ｋＤａ～約５００ｋＤａ、例えば、約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、または５００ｋＤａの範囲の重量平均分子量（Ｍｗ）を有している。
本開示のいくつかの実施形態によれば、本発明のヒアルロナンコンジュゲートのＨＡは、未置換（すなわち、ＨＡそのもの）もしくは置換されている（すなわち、ＨＡ誘導体）形態であってもよく、またはその塩であってもよい。上記したように、ＨＡは、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミド基、アセチルアミノ基などの官能基で修飾され得る。ＨＡは、一連の化学剤との反応により、上記のようにその官能基（すなわち、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミド基またはアセチルアミノ基）上で、エステル化、グラフト化および／または疎水化により修飾され得る。例示的なＨＡ誘導体は、エチルスルホン化されたＨＡ、脱アセチル化されたＨＡ、またはヒドラジド修飾されたＨＡである。本開示の１つの例では、本発明のヒアルロナンコンジュゲートのＨＡは、非置換の形態である。本開示の別の例では、本発明のヒアルロナンコンジュゲートのＨＡは、置換された形態である。
本開示の様々な実施形態によれば、本発明のヒアルロナンコンジュゲートは、０．１～６０％の性ホルモンとの置換度を有する。例えば、前記ＤＳは、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０％であってもよい。
本発明のいくつかの代表的なヒアルロン酸のコンジュゲートの共役二糖単位は、表１および以下の段落に要約されているが、本発明はこれに限定されるものではない。理解できるように、表１に示した例示的な性ホルモンの立体異性体も本発明者らは想定している。
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本開示の様々な実施形態によれば、前記リンカーは、前記性ホルモンのヒドロキシル基と反応可能な１つの官能基と、前記ＨＡの１つの二糖単位のカルボキシレート基またはヒドロキシル基と反応可能な別の官能基とを有し、それによって性ホルモンとＨＡとをコンジュゲートする。しかし、本発明はこれに限定されるものではない。他の実施形態では、前記性ホルモンは、前記リンカーと反応可能な化学的部分で最初に修飾され得る。
また、本開示には、上記の本発明のヒアルロナンコンジュゲートと、薬学的に許容される賦形剤とを含有する組成物が、含まれる。
許容される担体は、使用される用量および濃度において、レシピエントに対して非毒性である。本開示のいくつかの実施形態によれば、薬学的に許容可能な賦形剤は、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；安息香酸塩、ソルビン酸塩、ｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、セリン、アラニン、またはリジンなどのアミノ酸類；グルコース、マンノース、デキストランなどの単糖類、二糖類、およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；および／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）、プルロニック（登録商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ．Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．（２０００） Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒを参照）を含んでもよい。
本明細書に記載の医薬組成物は、経口または非経口投与のために、錠剤、ピル、カプセル、粉末、顆粒、ゲル、または溶液もしくは懸濁液などの単位投与形態であり得る。
本発明のヒアルロナンコンジュゲートは、前記医薬組成物の総重量に基づいて、約０．１～９９重量％のレベルで医薬組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、本発明のヒアルロナンコンジュゲートは、前記医薬組成物の総重量を基準にして、少なくとも１重量％のレベルで存在する。ある実施形態では、本発明のヒアルロナンコンジュゲートは、前記医薬組成物の総重量を基準にして、少なくとも５重量％のレベルで存在する。他の実施形態では、本発明のヒアルロナンコンジュゲートは、前記医薬組成物の総重量を基準にして、少なくとも１０重量％のレベルで存在する。さらに他の実施形態では、本発明のヒアルロナンコンジュゲートは、前記医薬組成物の総重量を基準にして、少なくとも２５重量％のレベルで存在する。
本明細書に記載の医薬組成物は、薬理学の分野で公知の任意の方法で調製され得る。一般的に、そのような調製方法は、本明細書に記載の本発明のヒアルロナンコンジュゲート（すなわち、「活性成分」）を、担体または賦形剤、および／または１つ以上の他の付属成分と組み合わせ、次いで、必要および／または望ましい場合には、製品を所望の単回投与または複数回投与単位に成形、および／または包装することを含む。「単位用量」とは、所定の量の活性成分を含有する医薬組成物の個別の量である。前記活性成分の量は、一般的に、対象に投与される活性成分の量、および／またはそのような量の都合の良い端数（ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ｆｒａｃｔｉｏｎ）、例えば、そのような量の２分の１または３分の１に等しい。
本明細書で提供される本発明のヒアルロナンコンジュゲートは、典型的には、投与を容易にし、投与量を均一にするために、投与単位の形態で処方される。しかし、本明細書に記載された組成物の１日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で医師によって決定されることが理解されるであろう。特定の対象または生物に対する特定の治療上有効な用量レベルは、治療対象の疾患および障害の重症度；使用される特定の活性成分の活性；使用される特定の組成物；対象の種、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食生活;副作用または障害の重症度；使用した特定の有効成分の投与時間、投与経路、排泄率、治療期間、使用した特定の活性成分と組み合わせてまたは同時に使用した特定の本発明のヒアルロナンコンジュゲートの薬物の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、および医療技術で周知の同様の要因など、さまざまな要因に依存する。
このように、本開示の範囲内に包含されるのは、医薬組成物の製造における本アルロナンコンジュゲートの使用であり、前記医薬組成物は、必要とする対象における神経変性疾患の治療に使用される。
本開示の別の態様は、有効量の上記のヒアルロナンコンジュゲートまたはこれを含む医薬組成物を、対象に投与するステップを含む、対象における神経変性疾患の治療またはリスクの低減のための方法を提供することである。
本明細書に記載の本発明のヒアルロナンコンジュゲートは、対象（例えば、神経変性疾患を有する、有する疑いがある、または神経変性疾患のリスクがあるヒト患者）における神経変性疾患の治療またはリスクの低減に有用である。いくつかの実施形態では、神経変性疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、てんかん、神経因性疼痛、または運動失調が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で提供される本発明のヒアルロナンコンジュゲート、またはこれを含む組成物は、当業者に公知の適切な経路で投与され得、経口、経鼻、頭蓋内、脊髄内、包膜内、髄内、脳内、脳室内、静脈内、動脈内、心臓内、皮内、皮下、経皮、腹腔内、または筋肉内投与が含まれる。具体的には、経口投与、静脈内投与（例：全身への静脈内注射）、血液および／またはリンパ液を介した局所投与、および／または患部への直接投与などが含まれる。一般に、最も適切な投与経路は、薬物の性質（例えば、消化管の環境における安定性）、および対象の状態（例えば、対象が経口投与に耐えられるかどうか）を含む様々な要因に依存する。
有効量を得るために必要な本発明のヒアルロナンコンジュゲートまたはこれを含む医薬組成物の正確な量は、例えば、上記のような要因に応じて、対象によって異なる。有効量は、単回用量（例えば、単回経口用量）または複数回用量（例えば、複数回経口用量）で含まれてもよい。ある実施形態では、複数回用量を対象に投与する場合、複数回用量を対象に投与する頻度は、１日３回、１日２回、１日１回、２日ごとに１回、３日ごとに１回、毎週１回、隔週１回、毎月１回または隔月に１回である。ある実施形態では、複数回用量を対象に投与する頻度は、１日に１回である。ある実施形態では、複数回用量を対象に投与する頻度は、１日あたり２回である。ある実施形態では、複数回用量が対象に投与される場合、複数回の投与の最初の投与と最後の投与との間の期間は、１日、２日、４日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、７年、１０年、１５年、２０年、または対象の生涯である。ある実施形態では、複数回の投与のうち最初の投与から最後の投与までの期間は、３ヶ月、６ヶ月、または１年である。ある実施形態では、複数回の投与のうち最初の投与と最後の投与との間の期間は、対象の生涯である。特定の実施形態では、複数回の投与を対象に行う頻度は、１週間に３回である。
例えば、本開示のいくつかの実施例によれば、ラット（約１５０グラム）における様々な神経変性疾患を治療するための、ヒアルロナンコンジュゲート中の性ホルモンの等価質量で表される有効量は、約１００ｎｇ／ｋｇ体重～１０μｇ／ｋｇ体重である。したがって、前記ヒアルロナンコンジュゲートにおける性ホルモンの観点からラットを治療するための有効量は、約１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、もしくは９９０ｎｇ／ｋｇ体重／用量、または１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、もしくは１０μｇ／ｋｇ体重／用量である。
また、マウス（約２０ｇ）を治療するための、ヒアルロナンコンジュゲート中の性ホルモンの等価質量で表される有効量は、約１５０ｎｇ／ｋｇ体重～１５μｇ／ｋｇであり、例えば、約１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、もしくは９９０ｎｇ／ｋｇ体重／用量、または１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０.５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、もしくは１５μｇ／ｋｇ体重／用量である。
体重約６０ｋｇの成人ヒトの場合、上記のラットの投与量（換算係数：０．１６）から得られるヒト等価投与量（ＨＥＤ）は、前記ヒアルロナンコンジュゲートにおける性ホルモンの等価質量に換算して、約１６ｎｇ／ｋｇ体重～１．６μｇ／ｋｇ体重／用量となる。一方、マウスの投与量（換算係数０．０８）に基づくＨＥＤは、約１２ｎｇ／ｋｇ体重～１．２μｇ／ｋｇ体重／用量である。つまり、ＨＥＤは、前記ヒアルロナンコンジュゲートに含まれる性ホルモンの等価質量で、約１２ｎｇ／ｋｇ体重～１．６μｇ／ｋｇ体重／用量である。
理解できるように、上記の投与量の範囲は、提供された医薬組成物を成人に投与するための指針として提供される。例えば、子供または青年に投与する量は、医師または当業者によって決定され得、成人に投与する量よりも低いまたは同じであり得る。患者の年齢、体重、健康状態などを考慮すると、ヒト対象に対する有効量は、前記ヒアルロナンコンジュゲート中の性ホルモンの等価質量に換算して、約６ｎｇ／ｋｇ体重／用量～３μｇ／ｋｇ体重／用量であってもよい。具体的には、本発明のヒアルロナンコンジュゲートにおける性ホルモンの等価質量の有効量は、ヒト対象に対して、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９.５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、もしくは９９０ｎｇ／ｋｇの体重／用量、または１、１.５、２、２．５、または３μｇ／ｋｇ体重／用量であってもよい。
当業者であれば理解できるように、様々な神経変性を治療するための本発明のヒアルロナンコンジュゲートの有効量は、ヒアルロナンコンジュゲートの薬物負荷（または置換度）と関連して、ヒアルロナンコンジュゲートにおける性ホルモンの上記の等価質量から決定することができる。そして、このようにして決定された本発明のヒアルロナンコンジュゲートの有効量のそれぞれは、本開示の一部とみなされる。
例えば、本開示のいくつかの実施例によれば、様々な神経変性疾患を治療するためのヒアルロナンコンジュゲートの有効量は、ラット（約１５０グラム）では約２５～２，５００μｇ／ｋｇ体重、マウス（約２０グラム）では約１～１００μｇ／ｋｇである。したがって、ラットの神経変性疾患を治療するための本発明のヒアルロナンコンジュゲートの有効量は、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、 ６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、または２５００μｇ／ｋｇ体重／用量である。また、マウスを治療するための本発明のヒアルロナンコンジュゲートの有効量は、約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００μｇ／ｋｇ体重／用量である。
同様に、体重約６０ｋｇの成人ヒトの場合、上記のマウスの用量（換算係数：０．０８）から得られる本発明のヒアルロナンコンジュゲートのＨＥＤは、約８０ｎｇ／ｋｇ体重／用量～８μｇ／ｋｇ体重／用量であり、ラットの用量（換算係数：０．１６）は、４～４００μｇ／ｋｇ体重／用量である。以上のことから、本発明のヒアルロナンコンジュゲートのＨＥＤは、約８０ｎｇ／ｋｇ体重～４００μｇ／ｋｇ体重／用量となる。患者の年齢、体重、健康状態を考慮すると、ヒト対象に対する有効量は、約４０ｎｇ／ｋｇ体重／用量～７００μｇ／ｋｇ体重／用量であり得る。
具体的には、ヒト対象の有効量は、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、もしくは９９０ｎｇ／ｋｇ体重／用量、または１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、または７００μｇ／ｋｇ体重／用量である。
本明細書に記載されている用量範囲は、提供される医薬組成物を成人に投与する際の指針となるものである。例えば、子供または青年に投与される量は、医療従事者または当業者によって決定され得、成人に投与する量よりも少ないかまたは同じであり得る。
本明細書に記載の本発明のヒアルロナンコンジュゲートは、神経変性疾患の治療および／またはリスクの低減に有用な１つ以上の追加の医薬品（例えば、治療的に活性な薬剤）と組み合わせて投与され得る。ある実施形態では、本明細書に記載された本発明のヒアルロナンコンジュゲートおよび追加の医薬品は、神経変性疾患の治療に相乗効果を示す。本発明のヒアルロナンコンジュゲートは、対象における神経変性疾患の治療および／またはリスクの低減において、例えば併用療法として有用であり得る１つ以上の追加の医薬品と、併用して、先立って、同時に、または後に投与され得る。
医薬品には、治療的に活性な薬剤が含まれる。各追加の医薬品は、その医薬品について決められた用量および／またはタイムスケジュールで投与され得る。また、前記追加の医薬品は、互いに一緒に、および／または本明細書に記載の本発明のヒアルロナンコンジュゲートを含む組成物と一緒に、単回投与で投与してもよいし、異なる用量で別々に投与してもよい。ある実施形態では、前記追加の医薬品は、神経変性疾患の治療および／またはリスクの低減のための薬剤であり、アルツハイマー病（ＡＤ）を治療するための薬剤であってもよく、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、メマンチン、セルフォテル（ｓｅｌｆｏｔｅｌ）、ミダフォテル（ｍｉｄａｆｏｔｅｌ）、タクリン、セレギリン、およびビタミンＥが含まれるが、これらに限定されない。
本開示のいくつかの実施形態によれば、本発明のヒアルロナンコンジュゲートによって治療可能な対象は、哺乳類である。いくつかの例では、前記対象は、マウスまたはラットである。他の例では、前記対象は、ヒトである。
また、本開示には、本明細書に記載された対象となる神経変性疾患のいずれかの治療に使用するためのキットも含まれる。本明細書で提供されるキットは、本明細書に記載された本発明のヒアルロナンコンジュゲート、またはこれを含む医薬組成物を含んでもよい。任意に、前記キットは、本明細書に記載の１つ以上の追加の医薬品をさらに含んでもよい。
以下の実施例は、本発明の特定の態様を説明するため、および本発明を実施する当業者に役立つように提供される。これらの実施例は、いかなる方法であっても本発明の範囲を限定するとは決して見なされない。更なる詳細無しで、当業者は、本明細書の記載に基づき最大限に本発明を利用できるとされる。本明細書で引用されるあらゆる公開物は、これらの内容全体を参照することによって本願に組み込まれる。
実施例１
ＨＡ－βＡＬＡ－エストラジオールの合成および特性評価
本実施例では、ＨＡ－βＡＬＡ－Ｃ１７エストラジオール（Ａ形態）およびＨＡ－βＡＬＡ－Ｃ３エストラジオール（Ｂ形態）の両方を含む混合物を、スキームＩに記載されているステップに従って合成した（図１）。
簡単に説明すると、Ｂｏｃ－β－アラニン（２．９２ミリモル、５５２ｍｇ）、ＤＣＣ（３．４０ミリモル、７０２ｍｇ）、および４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（３．０４ミリモル、３７２ｍｇ）を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）（２５０ｍＬ）中のエストラジオール（２．７５ミリモル、７５０ｍｇ）の溶液に加え、混合物を室温（ＲＴ）で一晩撹拌した。溶媒を真空下で除去し、次に沈殿物をメタノールで溶解した。得られた混合物に１０％Ｋ２ＣＯ３溶液（メタノール：１０％Ｋ２ＣＯ３＝１：１）を加え、室温で一晩攪拌した。その後、混合物を濃縮し、ＤＣＭおよび水で抽出した。混合物中のほとんどのＤＣＭを真空下で除去し、混合物中の沈殿物を濾過した。濾液をＤＣＭで洗浄し、真空下で濃縮した。残留物をアセトンで洗浄し、沈殿物を濾過した。その後、濾液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：アセトン：ヘキサン＝１：１）で精製して、生成物であるＢｏｃ－β－アラニン－エストラジオールを得た。
ＨＡ－βＡＬＡ－エストラジオールの合成のための段階的な手順は、以下の通りである。ボトル：Ｂｏｃ－β－アラニン－エストラジオール（０．１９ミリモル、８３ｍg）をＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解し、溶液を室温で撹拌した。この溶液にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（０．２ｍＬ、２ミリモル）を加え、４時間反応を続けた後、氷浴中の溶液にＮａ２ＣＯ３溶液（５５ｍｇ／ｍＬ）を、溶液から泡が出なくなるまで滴下して加えた。その後、真空下で溶液からＤＣＭを除去した。続いて、残渣にシアノヒドロキシイミノ酢酸エチル（オキシマ）（１．３９ミリモル、２５０ｍｇ）とジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（２０ｍＬ）を加え、溶液を室温で撹拌した。Ｂボトル：ＨＡ溶液（５００ｍｇ／２５ｍＬ）をＤＭＳＯ（２０ｍＬ）と混合し、温度が室温に戻るまで混合物を撹拌した。Ｂボトルの溶液をＡボトルに注ぎ、混合物を十分に混合した。Ｎ,Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（２．５８ミリモル、３２６ｍｇ）を水平下で（ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ）混合物に加え、２４時間反応を続けた。その後、反応混合物を透析（分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）が３５００の透析バッグ、１０Ｌの水で１２時間、１Ｌの０．３Ｍ ＮａＣｌで１２時間、２回、１０Ｌの水で１２時間、５回）により精製し、透析バッグ内の画分を回収し、凍結乾燥した。
このように合成されたＨＡ－βＡＬＡ－Ｃ３／Ｃ１７エストラジオール（ＨＡ－Ｅ２）を、ＵＰＬＣ（Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣおよびＰＤＡ検出器（Ｗａｔｅｒｓ））、カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ２００ ＳＥＣカラム（１．７μｍ、ＩＤ ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）；流速：０．３ｍＬ／分；注入量：５０μｌ;検出器：ＵＶ２８０ｎｍ;温度：カラムに対して２５℃、オートサンプラーに対して２０℃；実行時間：１８分；相対保持時間：ＨＡ－Ｅ２（ＨＡ－βＡＬＡ－Ｃ３／Ｃ１７エストラジオール）に対して２．７、Ｅ２（エストラジオール）に対して１０．１、によって確認した。計算のために、線形回帰を適用して標準曲線ｙ＝ｍｘ＋ｂを生成した。式中、ｘはμｇ／ｍｌ単位のＥ２濃度である。ｙはすべてのスタンダードのピーク面積である。ｍは標準曲線の傾きである。ｂは標準曲線の切片である。また、標準曲線の許容相関係数（ｒ２）は、０．９９５０以上である。
図２Ａおよび図２Ｂはそれぞれ、エストラジオール（Ｅ２）とＨＡ－βＡＬＡ－Ｃ３／Ｃ１７エストラジオール（ＨＡ－Ｅ２）のＵＰＬＣプロファイルを示している。
実施例２
神経細胞の取り込みに対するヒアルロナンコンジュゲートの効果
本実施例では、神経細胞（ヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞）が本発明のヒアルロナンコンジュゲートを取り込むかどうかを調べるために、一対の実験を行った。その結果（データは示していない）、神経細胞はエストロン単独よりもＨＡ－Ｅ１コンジュゲートをより多く取り込むことが示された。同様のことが、ＨＡ－Ｅ２コンジュゲート対エストラジオール単独、ＨＡ－Ｅ３コンジュゲート対エストリオール単独、ＨＡ－テストステロンコンジュゲート対テストステロン単独、およびＨＡ－デオキシコルチコステロン対１１－デオキシコルチコステロン単独を含む他のペアセットにも当てはまる。
上記のペアセット実験の予備結果に基づいて、ＨＡ－Ｅ２とＥ２をさらに分析した。
エストロゲンが神経細胞の生存率を維持する働きがあることが知られているが、この現象の一つの兆候が細胞におけるＡＴＰレベルのアップレギュレーションである。ミトコンドリア膜電位は、ミトコンドリアのＡＴＰ合成の原動力であるため、神経細胞をＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２とＥ２でそれぞれ処理し、その後、細胞のミトコンドリア膜電位レベルを測定した。
簡潔に説明すると、ヒト神経芽細胞腫のＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）を用いて、５％ＣＯ２加湿インキュベーターで、３７℃で培養した。ミトコンドリア膜電位の測定には、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を、Ｅ２（０．１４、０．３４、０．６８、および１．３６μｇ／ｍＬ）、ＨＡ（６．４８、１６．１９、３２．３８、６４．７６μｇ/ｍＬ）、またはＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２（６．４８、１６．１９、３２．３８、および６４．７６μｇ/ｍＬ、それぞれＥ２濃度と同等）と共に１８時間インキュベートした。
テトラメチルローダミン・メチルエステル（ＴＭＲＭ）は、細胞透過性のあるカチオン性の赤橙色の蛍光色素で、活動性のミトコンドリアに容易に蓄積する。細胞をトリプシン処理し、１００ｎＭのＴＭＲＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ, Ｅｕｇｅｎｅ, ＯＲ）を含む０．５ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。３７℃の暗所で３０分間インキュベートした後、細胞を直ちに氷上のチューブに移し、ＦＬ２検出器を用いてフローサイトメトリーにより蛍光強度を測定した。
フローサイトメトリー解析には、４８８ｎｍのアルゴンレーザーを備えたＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いた。前方散乱および側方散乱を用いてサイズゲートを設定し、分析から細胞残屑を除外した。励起波長を４８８ｎｍに設定した。各測定では、最低２０，０００個の細胞を分析した。データを、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて取得および解析した。平均蛍光強度の相対的変化は、処理細胞のチャネルにおける平均蛍光強度と対照細胞のチャネルにおける平均蛍光強度との比として算出した。
図３に示すように、ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２（３２．３８μｇ／ｍＬ、０．６８μｇ／ｍＬのＥ２に相当）またはＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２（６４．７６μｇ／ｍＬ、１．３６μｇ／ｍＬのＥ２に相当）の処理は、対照群およびＨＡのみまたはＥ２のみの処理と比較して、細胞におけるミトコンドリア膜電位レベルを上昇させることが可能である。
実施例３
アミロイドベータ発現に対するヒアルロナンコンジュゲートの効果
本実施例では、ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスにおけるアルツハイマー病のいくつかの指標（アミロイドプラーク形成、Ａβ４２の分布と発現レベルなど）に対する本発明のヒアルロナンコンジュゲートの効果を調べた。ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスは、アミロイドベータ（Ａβ）を過剰に産生することから、アルツハイマー病の動物モデルとして広く用いられている。
ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳｌｄＥ９（ＡＰＰ／ＰＳ１）トランスジェニックマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂ.より入手した。すべての手順は、Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅの仕様（ＩＡＣＵＣ Ｎｏ.１０６－４１７－４）に従って行われた。
８週齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスに、０．２０６ｍｇ／ｋｇのＥ２もしくは１２．５ｍｇ／ｋｇのＨＡ－Ｅ２（０．２０６ｍｇ／ｋｇのＥ２に相当）、または対照のビヒクルを週３回、合計８週間静脈内投与した。７週目に５０ｍｇ／Ｋｇ／日の５－ブロモ－２'－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を毎日腹腔内に７日間投与した。その後、Ｚｏｌｅｔｉｌ／Ｘｙｌａｚｉｎｅ（２０ｍｇ／Ｋｇ：５ｍｇ／Ｋｇ）を腹腔内投与して麻酔をかけ、動物を屠殺した。深い麻酔の後、心臓から血液を採取し、１３，０００ｒｐｍで遠心分離して血清を分離した。ｐＨ７．４の生理食塩水で灌流した後、脳の半球の皮質と海馬を外科的に摘出し、ホモジナイズして－３０℃で保存した。残りの半分の脳を、４％ホルムアルデヒドに３～７日間浸漬して固定し、その後、２０％および３０％スクロースで３～７日間脱水した。さらなる切片化のために脳組織を凍結した。
２％ＳＤＳおよび７０％ギ酸（ＦＡ）（Ｓｉｇｍａ）を用いた脳のＡβの２段階連続抽出を行った。簡単に説明すると、皮質ホモジネートを、プロテアーゼ阻害剤を含むＨバッファー中の同量の４％ＳＤＳと混合した。その後、サンプルを超音波処理し、１００，０００×ｇ、４℃で６０分間遠心分離した。サンプルの上澄み液は、ＳＤＳ可溶性画分であった。ＳＤＳ不溶性画分については、サンプルのペレットをさらに７０％ＦＡに再懸濁し、１００，０００×ｇ、４℃で６０分間遠心分離した。その後、上清を回収し、１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ１１）で中和した。ＳＤＳ可溶性画分とＳＤＳ不溶性画分の両方を、サンドイッチＥＬＩＳＡ分析まで－８０℃で保存した。Ａβレベルは、製造者のプロトコルに従って、ヒトＡβ４０およびＡβ４２ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により測定した。
このようにして決定された血清および海馬におけるＡβ４２の発現レベルを、それぞれ図４Ａおよび図４Ｂにまとめた。ＨＡ－Ｅ２で治療したマウスの血清と海馬の両方におけるＡβ４２の発現レベルは、Ｅ２単独またはビヒクル単独で治療したマウスの発現レベルよりも低い。
実施例４
ＨＡ－βＡＬＡ－Ｃ１７エストラジオール（ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２）の合成
本実施例では、スキームＩＩＩに従って、ＨＡ－βＡＬＡ－Ｃ１７エストラジオール（ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２）を合成した（図５）。
まず、エストラジオール（１．８４ミリモル、５００ｍｇ）をＤＣＭ（４０ｍＬ）に溶解し、１５分間撹拌した。次に、２５５μＬの２．０２ミリモルの塩化ベンゾイルおよび５滴のトリエチルアミンを反応混合物に加え、窒素下、２０℃で２４時間撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出：ＥＡ／ＤＣＭ＝３／９７）を用いて精製し、安息香酸エストラジオール（Ｂｚ－エストラジオール）を得た。
次に、Ｂｚ－エストラジオール（０．２３ミリモル、８５ｍｇ）を乾燥ＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、１０分間撹拌した。Ｎ,Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（０．４５ミリモル、９４ｍｇ）および４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．２３ミリモル、２７ｍｇ）を反応混合物に加え、３０分間撹拌した。その後、Ｂｏｃ－β－アラニン（０．４５ミリモル、８７ｍｇ）を加え、窒素下、２５℃で２４時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を、ＤＤＷを用いて抽出した。有機層を回収し、真空下で溶媒を除去して粗生成物を得た後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出：ＥＡ／ＤＣＭ＝３／９７）を用いて精製し、エストラジオール－安息香酸－Ａｌａ－Ｂｏｃ（Ｂｚ－エストラジオール－β－ＡＬＡ－ｂｏｃ）を得た。
次に、Ｂｚ－エストラジオール－β－ＡＬＡ－ｂｏｃ（０．１８ミリモル、１００ｍｇ）をＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶解し、５Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨを９～１０に調整した。この反応混合物を室温下で撹拌した。２４時間後、５０％ＡｃＯＨを用いて反応混合物のｐＨを６に調整し、これを濃縮して油状の液体を得た。この油性液体を、ＥＡとブラインを用いて３回抽出した。有機層中の水を、ＭｇＳＯ４を用いて除去し、その後、溶媒を真空下で除去して粗生成物を得、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出：ＥＡ／ＤＣＭ＝５／９５）を用いて精製し、Ｅ２－Ａｌａ－Ｂｏｃを得た。
ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２を合成するための段階的な手順は以下の通りである。ボトルＡ：ＨＡ（０．４９ミリモル、２００ｍｇ）をＤＤＷ（２０ｍＬ）に２時間撹拌しながら溶解し、温度が室温に戻るまでＤＭＳＯ（２５ｍＬ）を撹拌下で反応混合物に注ぎ込んだ。ボトルＢ：Ｅ２－Ａｌａ－Ｂｏｃ（０．１０ミリモル、４４．１ｍｇ）をＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１．３１ミリモル、０．１ｍＬ）を加えた。この溶液を室温で２時間撹拌した。その後、ＤＣＭとＴＦＡの大部分を濃縮除去した後、ＤＤＷ（２ｍＬ）を反応混合物に注ぎ、０．５Ｍ ＮａＨＣ０３を用いてｐＨを７に調整した。沈殿物が溶解するまで反応混合物にＤＭＳＯを加えた。Ｏｘｙｍａ（０．５５ミリモル、７７ｍｇ）をＤＭＳＯ（４ｍＬ）に溶解し、その溶液をボトルＡに注ぎ、その後１０分間撹拌した。ボトルＢの溶液をピペットでボトルＡにゆっくりと加え、１５分かけて十分に混合した。ＤＩＣ（２．５８ミリモル、３２６ｍｇ）をピペットで水平下の混合物に加え、反応を２４時間持続させた。その後、反応混合物を透析（ＭＷＣＯが３，５００の透析バッグ、５Ｌの０．３Ｍ ＮａＣＩを１２時間、６回；５Ｌの水を１２時間、６回）して精製し、透析バッグ内の画分を回収して凍結乾燥した。
このようにして合成したＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２をＵＰＬＣで確認し（データは示していない）、２８０ｎｍのＵＶ－Ｖｉｓ分光器を用いて薬物負荷を測定した。ある実施例では、ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２のＤＳは約０．５４％であり、別の実施例では、ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２のＤＳは約１３．５５％である。
実施例５
認知機能に対するヒアルロナンコンジュゲートの効果
先行研究では、卵巣摘出術(ＯＶＸ)または子宮卵巣摘出術(ＯＨＥ)を受けた雌ラットでは、感覚運動皮質および海馬ＣＡ１領域における錐体ニューロンの樹状突起スパインが有意に減少し、認知障害が見られたことから、エストロゲンがラットの学習および記憶機能に何らかの役割を果たしていることが示唆されている。
本実施例では、子宮卵巣摘出術（ＯＨＥ）を受けた雌ラットに本発明のヒアルロナンコンジュゲートを投与した後、ラットの認知機能（学習や記憶など）を評価するために修正Ｍｏｒｒｉｓｏｎ水迷路課題を行った。
この実施例では、８週齢の雌のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを用いた。すべての動物を個別にケージに入れ、温度（２４±１℃）、湿度（６０％～６５％）、光を制御した部屋（１２／１２時間の明暗サイクル）で、自由に餌と水を与えた。すべての実験手順は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｔａｉｗａｎのガイドラインに基づき、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｕｎｇ－Ｈｓｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物管理使用委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。
ＯＨＥ手術では、ラットを７％抱水クロラールと２％キシラジン（０．４５ｍＬ／１００ｇ体重）で深く麻酔し、ＯＨＥ手術を行った。手術の２週間後に、ラットに試験薬を週２回、２週間投与し、手術の４週間後にラットを屠殺した。
屠殺する５日前に、修正Ｍｏｒｒｉｓｏｎ水迷路課題を開始した。迷路は、直径１４５ｃｍ、深さ２２ｃｍの黒い円形のプールで構成されていた。プールの縁には視覚的手がかり（星のカードボード）を１つ設置した。水面下３ｃｍのところに丸い透明な台を置いた。動物の行動を、ビデオカメラで記録し、ＳＭＡＲＴビデオ追跡システム（ＳＭＡＲＴ ３．０Ｖ，Ｐａｎｌａｂ，Ｈａｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）で分析した。
逃避潜時（ｅｓｃａｐｅ ｌａｔｅｎｃｙ）を評価するために、ラットは１日２回の試行を３日連続で行った。ラットを、プールの壁に面した異なる象限にランダムに配置した。ラットは、１８０秒以内に脱出した場合は６０秒間プラットフォーム上にそのまま留まらせ、１８０秒以内に水中プラットフォームを見つけられなかった場合は６０秒間プラットフォーム上に置いた。１日２回の実験の間には、１０分間の回復時間を設けた。その後の分析のために、1日２回の実験の逃避潜時を平均化した。
空間プローブテストを実行するために、プール内のプラットフォームを取り除き、以前のプラットフォームの位置に応じて、仮想ターゲット象限と仮想プラットフォームを用いて、プールを設計した。最終的な逃避潜時課題および１日の休息の後、ラットをプールの壁に面した標的象限の対角線上の領域に入れた。ラットを３０秒間泳がせ、遊泳経路を分析した。
すべての実験データを、平均±ＳＥＭで表した。統計的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とＳｔｕｄｅｎｔ－Ｎｅｗｍａｎ－Ｋｅｕｌｓ（ＳＮＫ）の事後検定で検証した。差は、p値＜０．０５で統計的に有意であるとみなされた。
１ラウンドのテストでは、ＯＨＥラットは、２×Ｅ２（２８０ｎｇ／ｋｇ体重；ｎ＝６）、１×ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２（３５μｇ／ｋｇ体重；ＤＳ：０．５４％；１４０ｎｇ／ｋｇ Ｅ２に相当；ｎ＝５）、または１．５×ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２（５．２５μｇ／１００ｇ体重；ＤＳ：０．５４％；２１０ｎｇ／ｋｇ Ｅ２に相当；ｎ＝５）で治療された。陽性および陰性対照として、ＯＨＥラット（ｎ＝６）、およびＯＨＥ手術を受けていない正常ラット（ｎ＝４）を用いた。
図６Ａ（遊泳距離）と図６Ｂ（遊泳時間）に要約された潜時テストの結果は、ＯＨＥ手術がラットの学習機能に悪影響を及ぼすが、１×ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２、１．５×ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２、および２×Ｅ２の投与は、ＯＨＥ群に関して統計的に有意にＯＨＥラットの学習能力を改善する可能性があることを示している。
空間プローブテストについて、図７Ａ（標的象限での距離）および図７Ｂ（標的象限での時間）に提供されたデータは、１．５×ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２の投与が、ＯＨＥ治療群（＃，ｐ＜０．０５）、１×ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２群（＠，ｐ＜０．０５）および２×Ｅ２群（＄，ｐ＜０．０５）と比較してラットの記憶機能を有意に改善したことを示している。本実施例の予備データでは、２×Ｅ２は、２×Ｅ２に対して同等のＥ２が７５％しかない１．５×ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２と比較して、ＯＨＥラットの学習・記憶機能を促進する効果が低いことが示されているため、その後のテストでは、ＯＨＥラットに投与するＥ２の量をさらに増加させた。
別のテストでは、ＯＨＥラットを２．５×Ｅ２（３５０ｎｇ／ｋｇ体重；ｎ＝１６）または１．５×ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２（５２．５μｇ／ｋｇ体重；２１０ｎｇ／ｋｇ体重相当；ｎ＝１６）で治療した。ＯＨＥラット（ｎ＝８）、およびＯＨＥ手術を受けていない正常ラット（ｎ＝８）を、陽性および陰性対照として使用した。
図８Ａ（遊泳距離）および図８Ｂ（遊泳時間）に要約された潜時テストは、ＯＨＥ手術がラットの学習機能に悪影響を及ぼすが、１．５×ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２および２．５×Ｅ２の投与は、３日目にＯＨＥ群に対して統計的に有意にＯＨＥラットの学習能力を改善する可能性があることを示している（♯、ｐ＜０．０５）。
空間プローブテストについては、図９Ａ（標的象限における距離）および図９Ｂ（標的象限における時間）に提供されたデータは、１．５×ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２および２．５×Ｅ２の投与が、ＯＨＥ治療群に対してラットの記憶機能を有意に改善したことを示している（♯，ｐ＜０．０５）。
２回目の実験では、１．５×ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２または２．５×Ｅ２で治療したラットは、いずれも認知機能の有意な改善を示しているが、１．５×ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２治療時の等価Ｅ２の量は、２．５×Ｅ２治療における６０％に過ぎないことに留意すべきである。
実施例６
樹状突起の数とスパイン密度に対するヒアルロナンコンジュゲートの影響
ラットを、７％の抱水クロラールと２％のキシラジン（５ｍＬ／ｋｇ体重）で深い麻酔をかけ、解剖台に固定した。細胞内色素注入および免疫組織化学的染色のための組織調製を、以下のように行った。簡単に説明すると、ラットを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）中の２％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．３）で３０分間、経心的に灌流した。脳を注意深く摘出し、ビブラトーム（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｔ.Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、以下の２つの部分に切片化した：（１）細胞内色素注入用に海馬を含む３５０μｍ厚の冠状切片２枚；（２）免疫組織化学染色用に内側中隔（ＭＳ）核を含む１００００μｍ厚の冠状切片と海馬を含む２０００μｍ厚の冠状切片。免疫組織化学的染色のための厚い切片は、０．１ＭのＰＢ中の４％パラホルムアルデヒドで１日間後固定した。細胞内色素注入用の切片を、０．１ＭＰＢ中の１０－７Ｍ４´，６－ジアミノ－２－フェニル－インドール（ＤＡＰＩ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に浸し、その後の処理に用いた。前脳基底核、大脳皮質、および海馬を含む新鮮な脳組織を、断頭により採取した。脳組織を、その後のタンパク質の定量のために、－７０℃の冷蔵庫に保存した。
図１０Ａおよび図１０Ｂは、それぞれ、ラットにおける遠位尖端樹状突起および基底尖端樹状突起の写真を示す。図面に見られるように、ＯＨＥ手術を受けていない対照ラットと比較して、ＯＨＥラットは樹状突起が少ない。一方、Ｅ２を２．５×ＨＡ－Ｃ１７－Ｅおよび１．５×ＨＡ－Ｃ１７－Ｅで治療したラットは、ＯＨＥ治療ラットに比べて、樹状突起が多い。
図１１Ａ(尖端部分)および図１１Ｂ(基底部分)の定量的な結果は、ＯＨＥ手術が対照ラットと比較してスパイン密度の低下に関連していることを示している（＊，ｐ＜０．０５）。一方、１．５×ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２と２．５×Ｅ２を投与すると、ＯＨＥラットと比較して、スパイン密度が有意に改善するが（♯，ｐ＜０．０５）、１．５×ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２で治療したラットは、２．５×Ｅ２で治療したラットに対して、スパイン密度がわずかに高いことがわかった。１．５×ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２治療群に与えられたエストラジオールの量が、２．５×Ｅ２治療群に与えられた量のわずか６０％であるという事実を考えると、このような結果が得られたことは予想外である。
背側海馬を、各ラットの３つのセクションでランダムに選択した。海馬における樹状突起のスパイン密度を決定するために、ＣＡ１錐体細胞の遠位尖端および遠位基底樹状突起を分析した。海馬ＣＡ１領域の独立した５つの細胞と、各樹状突起からの３つのセグメントを１０μｍごとにランダムにカウントした。すべてのデータは、平均±ＳＥＭで表した。統計的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続き、スパイン密度についてはＳｔｕｄｅｎｔ－Ｎｅｗｍａｎ－Ｋｅｕｌｓ（ＳＮＫ）事後（ｐｏｓｔ－ｈｏｃ）検定を用いて検定した。ｐ＜０．０５で統計的に有意な差とした。
実施例７
感覚運動機能に対するヒアルロナンコンジュゲートの影響
この実施例では、マウスの感覚運動機能に対する本発明のヒアルロナンコンジュゲートの効果を評価するために、ポールおよびビームトラバーサルテスト（ポールテスト）を実施した。
ＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ.Ｌｔｄから購入した８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（１群あたりｎ＝４～５）を、本テストに使用した。すべての動物を個別にケージに入れ、温度（２４±１℃）、湿度（６０％～６５％）、光を制御した部屋（１２／１２時間の明暗サイクル）で、自由に餌と水を与えた。すべての実験手順は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｔａｉｗａｎのガイドラインに基づき、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｕｎｇ－Ｈｓｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物管理使用委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。
ＭＰＴＰ導入群において、メチル－４－フェニル－ｌ，２，３，６－テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ；２０ｍｇ／ｋｇ）を１日目および５日目に１日４回、２時間間隔でマウスの腹腔内（ｉ.ｐ.）に投与した。５×Ｅ２（３４２ｎｇ／ｋｇ）および２．５×または５×ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２コンジュゲート（１．９６または３．９２μｇ／ｋｇ体重；ＤＳ：１３．５５％；１７１または３４２ｎｇ/ｋｇ Ｅ２に相当）を、２日目および６日目に実験動物に静脈内投与した。偽群（Ｓｈａｍ ｇｒｏｕｐ）には、生理食塩水の腹腔内注射またはＰＢＳ緩衝液の静脈内注射を同様に行った。
マウスは、ＭＰＴＰ導入の２日前に予備テストを行い、２日目と６日目に、薬物投与の４時間後にポールテストを行った。簡単に説明すると、長さ５０ｃｍ、直径１ｃｍのチューブを用い、チューブの上部にポールを取り付けた。動物は多くの場合、自然に下向きになり、ホームケージに戻るためにポールの長さを下ってくる。登って元のケージに戻ったマウスには「０」のスコアを付けた。一方、向きを変えずにポールと水平な姿勢を保ち、コークスクリューのようにはい降りた（Ｃｌｉｍｂｅｄ ｄｏｗｎ）マウスには「１」のスコアを付けた。結果は、ＩＢＭ ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ２０．０ソフトウェアの独立性のカイ二乗検定を用いて分析し、有意性はｐ＜０．０５に設定した。
図１２に要約した結果から、ＭＰＴＰ誘導はマウスの運動協調機能に悪影響を及ぼし（＊、ｐ＜０．０５）、５×Ｅ２の投与はＭＰＴＰ治療マウスの運動協調機能を効果的に改善しないことがわかった。一方、２．５×または５×ＨＡ－Ｃ１７－Ｅ２の投与は、ＭＰＴＰ治療マウスの運動協調機能を有意に改善した（＊，ｐ＜０．０５）。
上記の実施例は、本発明のヒアルロナンコンジュゲートが樹状突起のスパイン密度を促進し、認知機能（学習や記憶など）を改善し、感覚運動機能を高めることができることを立証するいくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの試験結果を提供する。これらの実験データは、本発明のヒアルロナンコンジュゲートが、マウスおよびラットにおける神経変性の発現を実際に防ぐことができることを示しており、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、てんかん、神経因性疼痛、または運動失調などの神経変性疾患を治療するための医薬品を開発するための有力な候補となり得る。
上記した実施形態の記載は例示としてのみ行われ、様々な改変が当業者により行われ得ることが理解されるであろう。上記した明細書、実施例およびデータは、本発明の例示的実施形態の構造および使用の完全な説明を提供する。本発明の様々な実施形態を、ある程度の特殊性によりまたは１つ以上の個別の実施形態に関して記載したが、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、当業者は、開示された実施形態に対して多数の変更を行うことができる。

Claims (7)

  1. ヒアルロン酸（ＨＡ）またはその塩；
    エストロン、エストラジオール、および、エストリオールからなる群から選択される性ホルモン；および
    前記性ホルモンを、前記ＨＡまたはその塩の二糖単位の１つに共有結合させるリンカー、を含有し、ここで、前記リンカーが、β－アラニン（β－ＡＬＡ）、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）－スクシナート、または、コハク酸である、神経変性疾患の治療または予防において使用するためのヒアルロナンコンジュゲート。
  2. 前記ヒアルロナンコンジュゲートが、０．１％～６０％の性ホルモンでの置換度を有する、請求項１に記載のヒアルロナンコンジュゲート。
  3. 前記ＨＡまたはその塩が、約５～５００キロダルトン（ｋＤａ）の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、請求項１に記載のヒアルロナンコンジュゲート。
  4. 前記リンカーが、前記性ホルモンのヒドロキシル基（－ＯＨ）に共有結合される、請求項１に記載のヒアルロナンコンジュゲート。
  5. 神経変性疾患の治療または予防において使用するための医薬組成物であって、有効量の、請求項１～４のいずれか一項に記載のヒアルロナンコンジュゲート、および薬学的に許容される賦形剤を含有する、医薬組成物。
  6. 前記医薬組成物が、経口、経鼻、頭蓋内、脊髄内、包膜内、髄内、脳内、脳室内、静脈内、動脈内、心臓内、皮内、皮下、経皮、腹腔内、または筋肉内投与によって対象に投与される、神経変性疾患の治療または予防において使用するための請求項５に記載の医薬組成物。
  7. 前記神経変性疾患が、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、前頭側頭型認知症、てんかん、神経因性疼痛、または運動失調である、神経変性疾患の治療または予防において使用するための請求項５に記載の医薬組成物。
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