TW202110456A - 玻尿酸複合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

在此揭示一種玻尿酸複合物，其包含玻尿酸(HA)、性荷爾蒙以及連接物，其中連接物用以連接HA的一個雙醣單元與。此處亦揭示所述玻尿酸複合物於治療或預防神經退化性疾病的用途。

Description

玻尿酸複合物及其用途
本揭示內容一般是關於玻尿酸(hyaluronic acid，簡稱HA)-性荷爾蒙複合物及其於治療神經退化性疾病的用途。
中樞神經系統(central nervous system，簡稱CNS)之神經退化性疾病的特點在於神經元的結構與功能會逐漸喪失，這包括神經元死亡，其主要症狀為失智或運動困難(如，靜止性顫抖、僵硬或行動笨拙)。於神經醫學臨床診斷中，較為常見的神經退化性疾病中有：阿茲海默症(Alzheimer’s disease，簡稱AD)、巴金森氏症(Parkinson’s disease，簡稱PD)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，簡稱ALS)、多發性硬化症(multiple Sclerosis，簡稱MS)與杭丁頓氏症(Huntington’s disease，簡稱HD)。神經退化性疾病常見於中至高齡族群，且對患者和其家屬通常帶來極大困擾。此類疾病會大幅降低患者的生活品質，且同時對於醫療體系造成沉重的負擔。然而，隨著人口邁向高齡化，神經退化性疾病的盛行率勢必升高。
目前為止，神經退化性疾病的療法僅限於緩減症狀或延緩疾病進程。舉例來說，諸如多奈哌齊(donepezil)、加蘭他敏(galantamine)和重酒石酸卡巴拉汀(rivastigmine)之類的藥物可通過延遲釋放到突觸間隙中的乙酰膽鹼的分解代謝來減輕認知、功能和行為症狀，從而改善神經傳導活動。此外，左旋多巴(levodopa)、艾多巴(elldopa)和金剛烷胺(amantadine)之類的藥物也被用來延緩疾病的進程並提高患者的存活率。然而，這些藥物各有其局限性，有些甚至具有嚴重的副作用，因此，患者的生活質量仍不盡理想。
有鑒於此，本領域亟需一種能夠有效治療神經退化性疾病的解決方案。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。發明內容的主要目的在於以簡化的形式提出此處揭露的某些概念，以作為下文提出之實施方式的前序。
本揭示內容的一態樣是關於一種玻尿酸複合物。
根據本揭示內容多種實施方式，玻尿酸複合物包含玻尿酸(HA)或其衍生物或鹽類、性荷爾蒙及連接物，所述連接物將性荷爾蒙連接到HA或HA衍生物或HA鹽類的一個雙醣單元。
於某些實施方式中，性荷爾蒙可以是雌酮、雌二醇、雌三醇、睪固酮或11-去氧皮質固酮。
根據本揭示內容視需要而採用的實施方式，所述玻尿酸複合物的連接物可以是以下任一種：一或多個胺基酸、脂肪、二醯肼-C2 -C20 二酸以及C2 -C20 二酸。
於一實施方式中，所述連接物為胺基酸，譬如β-丙胺酸(β-ALA)。於另一種實施方式中，所述連接物是二醯肼-C2 -C20 二酸，譬如己二酸二醯肼(ADH)-琥珀酸酯。再又另一種實施方式中，所述連接物為C2 -C20 二酸；譬如琥珀酸。
根據本揭示內容的其他實施方式，本揭示內容之玻尿酸複合物的HA之取代度(degree of substitution)為0.1%至60%。
根據本揭示內容某些實施方式，本揭示內容之玻尿酸複合物的HA之重量平均分子量(Mw)為約5 kDa 至500 kDa。根據本揭示內容多種實施方式，所述連接物係連接至性荷爾蒙的羥基(-OH)。
本揭示內容的另一種態樣是關於一種治療方法，其可用以治療有需要之個體的神經退化性疾病。
根據本揭示內容某些實施方式，所述方法包含對該個體投予有效量的本案之玻尿酸複合物。
根據本揭示內容某些實施方式，本案之玻尿酸複合物可經由以下方法投予該個體：口服、鼻腔、顱內、脊柱內、鞘內、髓內、腦內、腦室內、靜脈內、動脈內、心內、皮內、皮下、經皮、腹膜內或肌內給藥。
根據本揭示內容某些實施方式，本案之玻尿酸複合物可用以治療的神經退化性疾病為：阿茲海默症(AD)、巴金森氏症(PD)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、多發性硬化症(MS)、杭丁頓氏症(HD)、額顳癡呆(frontotemporal dementia)、癲癇(epilepsy)、神經性疼痛(neuropathic pain)或共濟失調(ataxia)。
根據本揭示內容某些實施方式，可接受本案玻尿酸複合物治療的個體為哺乳類動物，較佳為人類。
本揭示內容的其他態樣還涵蓋了玻尿酸複合物於製備可用以治療神經退化性疾病的藥物的用途，還有玻尿酸複合物或包含其之藥學組合物於治療神經退化性疾病的用途。
在參閱下文實施方式與附隨圖式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本揭示內容之諸多特徵與優點。
下文連同附隨圖式揭示的實施方式旨在說明此處提出之例式，且不應視為用以建構或實施本揭示內容之實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的功能以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
為了便於說明，此處整理了說明書、實施例與附隨申請專利範圍中所用的某些詞彙。除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙的含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。
在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞亦涵蓋該名詞的單數型。此外，在本說明書與申請專利範圍中，「至少一」與「一或更多」等表述方式的意義相同，兩者都代表包含了一、二、三或更多。更有甚者，在本說明書與申請專利範圍中，「A、B及C其中至少一者」、「A、B或C其中至少一者」以及「A、B和/或C其中至少一者」係指涵蓋了僅有A、僅有B、僅有C、A與B兩者、B與C兩者、A與C兩者、以及A、B與C三者等情形。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10％、5％、1％或0.5％之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。當可理解，除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一端點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點
「治療(treatment或治療)」一詞係指預防性(如，預防用藥)、療癒性或緩和性的處置，藉以達到所欲的藥學和/或生理學效果；而治療的行為在此包括上述預防性、療癒性或緩和性的處置。具體來說，治療在此係指對於可能患有一醫療疾患(如，神經退化性疾病)或與此疾患相關的症狀、由此疾患所生的疾病或異常、或易於罹患此疾患的個體施用或投予本發明提出的玻尿酸複合物或包含此玻尿酸複合物的藥學組合物，以期能部分地或完全地緩和、改善、減輕特定異常和/或病症的一或多種症狀或特徵，或是延緩其發生、阻礙其進展、減輕其嚴重性和/或減低發生率。亦可對尚未表出現疾病、異常和/或病症徵兆的個體和/或出現早期徵兆的個體進行治療，以期降低發展出與該疾病、異常和/或病症相關的病理變化的風險。
「個體(subject)」或「患者(patient)」等詞在此可交互使用，且是指可接受本揭示內容之玻尿酸複合物、藥學組合物和/或方法處置的動物(包含人類)。因此，「個體」或「患者」包含任何可因本揭示內容的處置而獲益的哺乳類動物。所述「哺乳類動物」涵蓋哺乳動物綱的所有成員，包括人類、靈長類動物、家畜和農畜(如兔子、豬、綿羊和牛)、動物園動物或競賽用動物、寵物，以及齧齒類動物(如，小鼠和大鼠)。「非人類哺乳動物」一詞則涵蓋除了人類以外的所有哺乳動物綱成員。在一實例中，所述患者為人類。除非另有指明，「個體」或「患者」一般包含雄性與雌性。
在此處，「有效量(effective amount)」一詞係指本發明玻尿酸複合物的用量足以招致所欲的治療反應。藥劑的有效量不必然能夠治癒疾病或病症，但能夠延緩、阻礙或防止該疾病或病症的發生，或是可緩減與疾病或病症相關的病徵。可將治療有效量可分成一、二或更多劑，而以適當的劑型在指定期間內施用一次、二次或更多次。具體的治療有效量取決於多種因素，例如欲治療的特定狀況、個體的生理條件(如，個體體重、年齡或性別)、接受治療的哺乳類動物或動物類型、治療持續時間、併行治療(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。舉例來說，可將治療有效量表示成玻尿酸複合物的總重量或玻尿酸複合物所含性荷爾蒙的均等重量，譬如以克、毫克或微克來表示；或表示成玻尿酸複合物重量或玻尿酸複合物所含性荷爾蒙的均等重量相對於體重的比例，譬如表示為每公斤體重多少毫克(mg/kg)。
「施用(application)」與「投予(administration)」等詞在此可交替使用，其係指將本發明之玻尿酸複合物或藥學組合物提供給需要治療的個體。
根據本揭示內容某些實施例，在試驗期中，每週投予玻尿酸複合物兩次。當可理解，可隨為著頭要間隔與持續時間來調整有效量。於一些實施方式中，當對個體多次投藥時，對該個體投予多次藥物的頻率可為每日三劑、每日兩劑、每日一劑、每兩日一劑、每三日一劑、每四日一劑、每五日一劑、每六日一劑、每週一劑、每兩週一劑、每三週一劑、每月一劑或每兩月一劑。於一些實施方式中，對該個體投予多次藥物的頻率可為每日一劑。於一些實施方式中，對該個體投予多次藥物的頻率可為每日兩劑。於一些實施方式中，當對個體多次投藥時，第一劑與最後一劑間的間隔可以是一天、兩天、四天、一週、兩週、三週、一個月、兩個月、三個月、四個月、六個月、九個月、一年、兩年、三年、四年、五年、七年、十年、十五年、二十年或該個體之終生。於一些實施方式中，多次投藥之第一劑與最後一劑間的間隔可以是三個月、六個月或一年。於一些實施方式中，多次投藥之第一劑與最後一劑間的間隔可以是該個體的終生。於一特定實施方式中，對該個體投予多次藥物的頻率可為每週三劑。
此外，根據下文提出的實驗例，可透過靜脈內注射來投予玻尿酸複合物；然而，此方式僅為實施本揭示內容之例示，本揭示內容不限於此。
舉例來說，可將玻尿酸複合物和藥學上可接受的賦型劑調製為適用於所欲給藥方式的藥學組合物。根據此處揭示與請求保護之發明性概念所製備的某些藥學組合物可以是適用於以下給藥途徑的單一劑型：口服、腸胃外(如皮下、靜脈內、靜脈推注、肌肉內或動脈內)、玻璃體內或經皮膜給藥。適用之藥物劑型的實施例包括但不限於：錠劑、膠囊型錠劑(caplets)、膠囊(如：軟彈性明膠膠囊)、扁囊(cachets)、口含錠(troches)、喉頭錠劑(lozenges)、分散液、栓劑、藥膏、泥敷劑(cataplasms，如膏藥)、糊劑、粉劑、敷料、乳膏、膏藥、溶液、貼片、噴霧劑(如鼻噴霧劑或吸入劑)、凝膠、適合患者口服的液體劑型(包括懸浮液(如，水性或非水性液體懸浮液、水包油型乳劑或油包水型液體乳劑)、溶液以及酏劑(elixirs))、及劑型、適合於對一名患者進行腸胃外給藥的液體劑型、及無菌固體(如，結晶或無定形固體)、適用於對患者進行腸胃外給藥的液態劑型、及滅菌固體(如，結晶或非晶型固體)，其可經復水以製得適用於對患者進行腸胃外給藥的液態劑型。當可理解，這些藥學組合物亦屬於本揭示內容之範圍。
在此處「藥學上可接受賦型劑」(pharmaceutically acceptable excipient)指一種藥學上可接受的材料、組合物或媒劑(vehicle)，諸如液體或固體填充物、稀釋劑(diluent)、載體(carrier)、溶劑或包覆材料，其可用以攜帶或運送標的成分由身體的一器官或部分到達身體的另一器官或部份。「可接受」的賦型劑係指其可和組合物中的其他成分相容。藥學製劑(pharmaceutical formulation)包含本案所述的化合物以及一或多種藥學上可接受的賦型劑。上述賦型劑可以是譬如固態、半固態或液態稀釋劑、乳霜或膠囊。這些藥學配方亦屬於本發明之範圍。一般來說，在藥學配方中，活性成分的的重量通常佔總重的0.1-95%，在腸胃外給藥時較佳佔總重的0.2-20%，在口服給藥時較佳佔總重的1-50%。於臨床上運用本發明之方法時，可將本案所述的藥學組合物配製成適合所欲給藥途徑的配方。
在此處，HA複合物的「取代度」(degree of substitution，簡稱DS)係指HA的每一個雙醣單元上連接有取代基(即，性荷爾蒙)的平均比例。
在此處，「玻尿酸」(HA或hyaluronate或hyaluronic acid)是一種陰離子、未硫酸化的糖胺聚醣，其係由重複序列的雙醣單元所組成，所述雙醣是指D-葡萄醣醛酸與N-乙醯基-D-葡萄糖胺(-4GlcUAβ1-3GlcNAcβ1-)。其分子量為379道爾頓(Da)(單一個雙醣單元)至數百萬道爾頓不等。HA透過與細胞表面的玻尿酸介導之運動性受體(receptor for HA-mediated motility，簡稱RHAMM)與CD44受體互動，而影響細胞運動以及免疫細胞黏附。「HA衍生物」一詞係指一HA的一或多個HA雙醣單元之羥基、羧基、醯胺基或乙醯胺基中的任一個經過修飾。
如本文所用，「鹽類」一詞是指任何和所有鹽類，並且包括藥學上可接受的鹽類。「藥學上可接受的鹽類」一詞是指在合理的醫學判斷範圍內適用於與人和較低等動物的組織接觸而不會產生過度的毒性、刺激性、過敏反應等的鹽類，並且與合理的收益/風險比相稱。藥學上可接受的鹽類為本領域眾所周知的。
在此處，「連接物」一詞係指連接複合物之兩個部分的一化學部分(chemical moiety)，譬如兩個官能基間的一個化學鍵結。在本揭示內容中，連接物可以是存在於性荷爾蒙與HA間的任何化學部分。於本揭示內容某些實施方式中，可經由化學或酵素方法將連接物切斷；或者是其可自動降解。
根據本揭示內容較佳的實施方式，可將此處提出的玻尿酸複合物配製成「修飾釋放(modified release，簡稱MR)」製劑，例如延長釋放(extended-release，簡稱ER)、控制釋放(controlled-release，簡稱CR)、持續性釋放(sustained-release，簡稱SR)、緩釋(prolonged release，PR)、長效釋放(long-acting release，簡稱LAR)及延遲釋放(delayed-release，簡稱DR)之藥品。常規劑型通常是讓藥物迅速釋放，因此體內的藥物濃度會出現波動，並需要多次給藥以維持藥物的療效；而修飾釋放劑型與常規劑型不同之處在於可藉由選擇藥物的釋放特性(如，時程和/或位置)，進而實現常規劑型無法提供的所欲治療目的。關於劑型的用語應具有本發明所屬技術領域中具有通常知識者認可和使用的普通含義。舉例來說，「延長釋放」劑型是指與速釋(常規)劑型相比，前者的劑量頻率可至少降低兩倍。「控制釋放」是指可以在較長時期內遞送藥物的劑型；以注射劑型來說，上述時期能是數日至數月。「持續性釋放」一詞是指藥物以預定速率釋放，因而在一段時間內血漿濃度恆定。
本揭示內容至少部分基於出乎意料地發現到HA-性荷爾蒙複合物對於多種神經退化性疾病有治療效果，且同時可減少性荷爾蒙對其他器官(如，胸部、心臟)的副作用。
因此，本揭示內容的第一種態樣是關於一種玻尿酸複合物，其包含一玻尿酸(HA)或其衍生物或鹽類、一性荷爾蒙以及一連接物，所述連接物用以將性荷爾蒙連接至HA或HA衍生物或HA鹽類的一個雙醣單元。
舉例來說，性荷爾蒙可以是以下任一種：雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、睪固酮(T)以及11-去氧皮質固酮(11-DOC)。
根據多種實施方式，所述連接物可以是一或多個胺基酸殘基、脂肪、二醯肼-C2 -C20 二酸或C2 -C20 二酸。於本揭示內容中，所述連接物可作為用以連接HA與性荷爾蒙的連接臂或間隔物。連接物的一側可透過HA的羥基、羧基、醯胺基或乙醯胺基而與HA連接，而另一側則透過任何可能的共價鍵與性荷爾蒙連接。
於某些實施方式中，連接物可以是單一個胺基酸殘基，例如，丙胺酸(Ala；較佳為β-丙胺酸)、精胺酸(Arg)、天冬醯胺酸(Asn)、天冬胺酸(Asp)、半胱胺酸(Cys)、麩胺酸(Glu)、麩醯胺酸(Gln)、甘胺酸(Gly)、組胺酸(His)、異白胺酸(Ilu)、白胺酸(Leu)、離胺酸(Lys)、甲硫胺酸(Met)、苯丙胺酸(Phe)、脯胺酸(Pro)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)、纈胺酸(Val)、γ-胺基丁酸(4-胺基丁酸)、δ-胺基戊酸(5-氨基戊酸)、ε-氨基己酸(6-胺基己酸)、7-胺基庚酸、8-胺基辛酸和11-胺基十一酸。於某些實施方式中，連接物可以是具有2至100個胺基酸殘基的短胜肽。舉例來說，連接物可以是彈性的胜肽(Gn S)m ，其中n與m各自獨立地為1至4之間的整數。
於某些實施方式中，優選為脂肪連接物。此種脂肪連接物有一親水性極性頭部基團以及一疏水鏈。
於某些實施方式中，連接物為線性或分支的脂肪族、芳香族或芳脂族C2 -C20 二酸，其可以是譬如以下物質的衍生物：乙二酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十二烷二酸、蕓苔酸、十六烷二酸、15,16-雙甲基三十烷二酸(diabolic acids)、藏花酸(crocetin)、馬來酸、富馬酸、戊二酸、2-癸二酸、2-十二烯二酸(traumatic acid)、己二烯二酸(muconic acid)、戊二酸、甲基順丁烯二酸(citraconic acid)、甲基反丁烯二酸(mesaconic acid)、亞甲基丁二酸(itaconic acid)、羥丙二酸(tartronic acid)、中草酸(mesoxalic acid)、蘋果酸、酒石酸、草醯乙酸、天冬胺酸、α-羥基戊二酸、阿拉伯酸、丙酮二羧酸、α-酮戊二酸、麩胺酸、二胺基庚二酸、葡萄糖二酸、鄰苯二甲酸、間苯二甲酸、對苯二甲酸、二苯甲酸和2,6-萘二甲酸。
二醯肼-C2 -C20 二酸類之連接物通常帶有兩個部分，即，二醯肼部分與C2 -C20 二酸部分，其中C2 -C20 二酸的一個羧基和二醯肼的一個醯肼基共價連接。二醯肼部分的實施例包括但不限於己二酸二醯肼(adipic acid dihydrazide，ADH)、癸二酸二醯肼(sebacic acid dihydrazide，SDH)、纈胺酸二醯肼(valine dihydrazide，VDH)、間苯二甲酸二醯肼(isophthalic dihydrazide，IDH)、碳二醯肼(carbodihydrazide，CDH)、二十碳二酸二醯肼(icosanedioic acid dihydrazide，LDH)、丁二酸二醯肼、己二酸二醯肼、二醯肼亞碸、乙二酸二醯肼及庚二酸二醯肼。上文參照C2 -C20 二酸連接物所述的例示性實施例亦可作為二醯肼-C2 -C20 二酸類連接物中的二酸部分。
此處提出的連接物亦涵蓋胺基-C2 -C20 二酸類的連接物，其具有兩個部分，即，一或多個胺基酸與C2- C20 二酸部分。上文參照胺基酸殘基與C2- C20 二酸連接物所述的例示性實施例亦可用以成胺基-C2- C20 二酸類連接物。作為例示而非限制，所述胺基-C2- C20 二酸類連接物可以是ALA-琥珀酸酯連接物。
根據本揭示內容某些實施方式，本案玻尿酸複合物之HA的重量平均分子量(Mw)約為5 kDa 至500 kDa，譬如約5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500 kDa。
根據本揭示內容某些實施方式，本案玻尿酸複合物之HA可以是未經取代(即，HA本身)或經取代(即， HA衍生物)的形式，或可為其之鹽類。如上文所述，HA的官能基可經過修飾，上述官能基如羥基、羧基、醯胺基或乙醯胺基。可在上述HA的上述官能基(即羥基、羧基、醯胺基或乙醯胺基)上進行酯化、接枝及/或疏水化等修飾。HA衍生物的例示包括乙基磺酸化HA、去乙醯化HA或醯肼修飾HA。於本揭示內容一實施例中，本案玻尿酸複合物的HA為未經取代之形式。於本揭示內容另一種實施例中，本案玻尿酸複合物的HA為經取代之形式。
根據本揭示內容多種實施方式，此處提出的玻尿酸複合物之性荷爾蒙取代度(DS)為0.1至60%。舉例來說，DS可以是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60%。
下表1整理了本發明之某些代表性玻尿酸複合物中經複合的雙醣單元；然而，本發明不限於此。當可理解，表1所例示之性荷爾蒙的立體異構物亦屬本發明之範圍。 [表1]
編號 化學結構 性荷爾蒙 連接物
I                  
Figure 02_image002
 E1 琥珀酸酯
II                
Figure 02_image004
 E1 ADH-琥珀酸酯
III             
Figure 02_image006
 E1 β-Ala
IV             
Figure 02_image008
 E1 β-Ala-琥珀酸酯
V               
Figure 02_image010
 E2 ADH-琥珀酸酯
VI             
Figure 02_image012
 E2 ADH-琥珀酸酯
VII          
Figure 02_image014
 E2 琥珀酸酯
VIII        
Figure 02_image016
 E2 琥珀酸酯
IX             
Figure 02_image018
 E2 β-Ala-琥珀酸酯
X               
Figure 02_image020
 E2 β-Ala-琥珀酸酯
XI             
Figure 02_image022
 E2 β-Ala
XII          
Figure 02_image024
 E2 β-Ala
XIII        
Figure 02_image026
 E3 ADH-琥珀酸酯
XIV       
Figure 02_image028
 E3 ADH-琥珀酸酯
XV          
Figure 02_image030
 E3 ADH-琥珀酸酯
XVI       
Figure 02_image032
 E3 琥珀酸酯
XVII     
Figure 02_image034
 E3 琥珀酸酯
XVIII  
Figure 02_image036
 E3 琥珀酸酯
XIX       
Figure 02_image038
 		 E3 β-Ala-琥珀酸酯
XX          
Figure 02_image040
 E3 β-Ala-琥珀酸酯
XXI       
Figure 02_image042
 E3 β-Ala
XXII     
Figure 02_image044
 E3 β-Ala-琥珀酸酯
XXIII  
Figure 02_image046
 E3 β-Ala
XXIV  
Figure 02_image048
 E3 β-Ala
XXV    
Figure 02_image050
 11-DOC ADH-琥珀酸酯
XXVI  
Figure 02_image052
 11-DOC 琥珀酸酯
XXVII      
Figure 02_image054
 11-DOC   β-Ala
XXVIII   
Figure 02_image056
 11-DOC β-Ala-琥珀酸酯
XXIX  
Figure 02_image058
 T ADH-琥珀酸酯
XXX    
Figure 02_image060
 T 琥珀酸酯
XXXI  
Figure 02_image062
 T β-Ala
XXXII      
Figure 02_image064
`		 T β-Ala-琥珀酸酯
根據本揭示內容多種實施方式，所述連接物有一官能基能夠與性荷爾蒙的羥基反應，且有另一官能基能夠和HA之雙醣單元的羧基或羥基反應，因而能夠將性荷爾蒙與HA複合。然而，本發明不限於此。於其他實施方式中，可先以能夠和連接物反應的化學部分來修飾所述性荷爾蒙。
本揭示內容亦涵蓋一種組合物，其包含此處提出的玻尿酸複合物以及藥學上可接受的賦型劑。
在所使用的劑型與濃度下，可接受的賦型劑不會對接受者產生毒性。根據本揭示內容某些實施方式，藥學上可接受的賦型劑可包含：緩衝液，例如磷酸、檸檬酸及其他有機酸；抗氧化物，包括抗壞血酸與及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲基氯化銨；苯扎氯銨，芐索氯銨；苯酚，丁基或芐基醇；對羥基苯甲酸烷基酯例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸；間苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；苯甲酸酯、山梨酸酯和間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸、絲胺酸、丙胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或聚葡萄糖；螯合劑，例如EDTA；糖類，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；用以形成鹽類的反離子，例如鈉；金屬複合體(如， Zn-蛋白複合體)；及/或非離子介面活性劑，例如TWEEN™，PLURONICS™或聚乙二醇(polyethylene glycol，簡稱PEG)(參見，Remington所著：Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000)；Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover)。
此處所述的藥學組合物可以是單位劑型，譬如藥錠、藥丸、膠囊、粉末、顆粒、凝膠或溶液或懸浮液等可供口服或腸胃外給藥者。
此處提出的玻尿酸複合物於藥學組合物中的重量約為藥學組合物總重的0.1%至99%。於某些實施方式中，此處提出的玻尿酸複合物於藥學組合物中的重量約為藥學組合物總重的至少1%。於一些實施方式中，此處提出的玻尿酸複合物於藥學組合物中的重量約為藥學組合物總重的至少5%。在另一些實施方式中，此處提出的玻尿酸複合物於藥學組合物中的重量約為藥學組合物總重的至少10%藥學組合物。在又另一些實施方式中，此處提出的玻尿酸複合物於藥學組合物中的重量約為藥學組合物總重的至少25%。
可利用藥學領域所知的任何方法來製備所述的藥學組合物。一般來說，此種製備方法包括使此處提出的玻尿酸複合物(即，「活性成分」)與載體或賦型劑及/或一或多個其他附屬成分結合，接著，若有必要及/或想要，可將其塑型及/或將產品包裝為所欲的單一或多單位劑量。一「單位劑量」是一種離散數量的藥學組合物，其包含預定量的活性成分。活性成分的量通常等於欲施用至一個體之活性成分的劑量及/或此種劑量的簡單分量，例如此種劑量的二分之一或三分之一。
通常可將此處提出的玻尿酸複合物調配成易於施用且劑量均勻的劑量單位形式。然而，當可理解，此處所述之組合物的總每日用量係由醫師依據合理醫學判斷所決定。對特定個體或生物體之具體的治療有效量取決於多種因素，包括：欲治療的疾病與疾患的嚴重性；所用活性成分的活性；所用的具體組合物；個體之物種、年齡、體重、一般健康狀況、性別與飲食；副作用或疾患的嚴重性；給藥時間、給藥路徑與所用特定活性成分排放之速率；治療期間；與所用特定活性成分共同或並行給予的特定藥品成分；及醫學領域所知的類似因素。
因此，本揭示內容的範圍亦涵蓋將此處提出的玻尿酸複合物用以製備一藥學組合物，其中該藥學組合物係用以治療有需要個體之神經退化性疾病。
本揭示內容的另一種態樣是提供一種治療一個體之神經退化性疾病或降低其風險的方法，包含對該特體投予有效量的上述玻尿酸複合物或包含其之藥學組合物。
此處提出的玻尿酸複合物可用以治療一個體(如，患有、疑似患有、或可能患有神經退化性疾病之人類病患)的神經退化性疾病或降低其風險。於某些實施方式中，上述神經退化性疾病包括但不限於阿茲海默症、巴金森氏症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、多發性硬化症、杭丁頓氏症、額顳癡呆、癲癇、神經性疼痛或共濟失調。
可利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者所知的適當途徑來投予此處提出的玻尿酸複合物或包含其之組合物，包括：口服、鼻腔、顱內、脊柱內、鞘內、髓內、腦內、腦室內、靜脈內、動脈內、心內、皮內、皮下、經皮、腹膜內或肌內給藥。此處具體提出的給藥途徑包括口服給藥、靜脈內給藥(如，全身性靜脈內注射)、透過血液及/或淋巴供應的區域給藥及/或直接給藥至受影響區域。一般來說，最適當的給藥途徑取決於多種因素，包括藥劑的本質(如，其在腸胃道環境的安定性)及/或個體的狀況(如，該個體是否能承受口服給藥)。
本案玻尿酸複合物或包含其之藥學組合物的精確有效量視個體而不同，通常會取決於如上文所述的各種因素。可將有效量包含在單一劑中(如，單一口服劑)或多劑中(如，多個口服劑)。於一些實施方式中，當對個體投予多劑時，對該個體投予多劑的頻率為每日三劑、每日兩劑、每日一劑、每兩日一劑、每三日一劑、每週一劑、每兩週一劑、每月一劑或每兩月一劑。於一些實施方式中，對該個體投予多次藥物的頻率可為每日一劑。於一些實施方式中，對該個體投予多次藥物的頻率可為每日兩劑。於一些實施方式中，當對個體多次投藥時，第一劑與最後一劑間的間隔可以是一天、兩天、四天、一週、兩週、三週、一個月、兩個月、三個月、四個月、六個月、九個月、一年、兩年、三年、四年、五年、七年、十年、十五年、二十年或該個體之終生。於一些實施方式中，多次投藥之第一劑與最後一劑間的間隔可以是三個月、六個月或一年。於一些實施方式中，多次投藥之第一劑與最後一劑間的間隔可以是該個體的終生。於一特定實施方式中，對該個體投予多次藥物的頻率可為每週三劑。
舉例來說，根據本揭示內容某些實驗例，用以治療大鼠(約150克)神經退化性疾病之有效量可表示為玻尿酸複合物中性荷爾蒙的均等量，其有效量為約100 ng/公斤體重至10 μg/公斤體重。因此，治療大鼠之有效量可表示為玻尿酸複合物中的性荷爾蒙量為約100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980或990 ng/公斤體重/劑、或1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10 μg/公斤體重/劑。
此外，用以治療小鼠(約20克)之有效量可表示為玻尿酸複合物中性荷爾蒙的均等量，其有效量為約150 ng/公斤體重至15 μg/kg；舉例來說，約150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980或990 ng/公斤體重/劑、或1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5或15 μg/公斤體重/劑。
以體重約60公斤的成年人類而言，從上述大鼠劑量(換算因子：0.16)換算所得之玻尿酸複合物中性荷爾蒙均等量之人類均等劑量(human equivalent dose，簡稱HED)為約16 ng/公斤體重至1.6 μg/公斤體重/劑。另一方面，基於小鼠劑量(換算因子：0.08)所得之HED為約12 ng/公斤體重至1.2 μg/公斤體重/劑。總結來說，玻尿酸複合物中性荷爾蒙均等量之HED為約12 ng/公斤體重至1.6 μg/公斤體重/劑。
當可理解，上文所述的劑量範圍是對成人投予本案藥學組合物之指引。舉例來說，醫師或本領域具有通常知識者可決定對兒童或青少年投予之劑量，且此劑量可以低於或等同於給予成人之劑量。考量患者的年齡、體重與健康狀況後，對人類個體而言，玻尿酸複合物中性荷爾蒙之均等量的有效量可以是約6 ng/公斤體重/劑至3 μg/公斤體重/劑。具體來說，對人類個體而言，本案玻尿酸複合物中性荷爾蒙之均等量的有效量可以是6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980或990 ng/公斤體重/劑、或1、1.5、2、2.5或3 μg/公斤體重/劑。
所屬技術領域中具有通常知識者當可理解，可基於上文所述的玻尿酸複合物中性荷爾蒙的均等量以及玻尿酸複合物的藥物負載量(或取代度)來決定此處提出的用以治療各種神經退化疾病之玻尿酸複合物的有效量。故，利用此種方式決定之本案玻尿酸複合物的各種有效量亦屬於本揭示內容的一部份。
舉例來說，根據本揭示內容某些實驗例，用以對大鼠(約150克)治療各種神經退化性疾病之玻尿酸複合物的有效量為約25至2,500 μg/公斤體重，而對小鼠(約20克)則為約1至100 μg/公斤體重。因此，本案玻尿酸複合物於治療大鼠神經退化性疾病的有效量為約25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或2500 μg/公斤體重/劑。此外，本案玻尿酸複合物於治療小鼠的有效量為約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 μg/公斤體重/劑。
相似地，對於體重約60公斤的成年人類而言，從上述小鼠劑量(換算因子：0.08)換算所得之玻尿酸複合物之HED為約80 ng/公斤體重/劑至8 μg/公斤體重/劑，而基於大鼠劑量(換算因子：0.16)所得之HED為約4至400 μg/公斤體重/劑。總結來說，玻尿酸複合物之HED為約80 ng/公斤體重至400 μg/公斤體重/劑。考量患者的年齡、體重與健康狀況後，對人類個體而言，所述人類個體的有效量可以是約40 ng/公斤體重/劑至700 μg/公斤體重/劑。
具體來說，對人類個體之上述有效量可以是40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980或990 ng/公斤體重/劑、或1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690或700 μg/公斤體重/劑。
當可理解，上文所述的劑量範圍是對成人投予本案藥學組合物之指引。舉例來說，醫師或本領域具有通常知識者可決定對兒童或青少年投予之劑量，且此劑量可以低於或等同於給予成人之劑量。
可將本案的玻尿酸複合物和能夠治療神經退化性疾病(如，治療活性藥物)及/或減低其風險的一或多種額外的治療藥劑合併給藥。於一些實施方式中，此處提出的玻尿酸複合物與額外的藥劑對治療神經退化性疾病有加乘效果。此處提出的玻尿酸複合物可在一或多種額外的藥劑之前、同時、或之後給藥，此類藥劑可作為譬如合併療法，以治療個體的神經退化性疾病及/或降低其罹病風險。
上述藥劑包含治療活性藥物。可根據依各該藥劑所定的給藥劑量與時間方案來投予各額外的藥劑。亦可將所述額外藥劑彼此或包含本案玻尿酸複合物之組合物一起給藥，譬如以單一劑的方式或分成多劑分別給藥。於一些實施方式中，所述額外藥劑為用以治療及/或降低神經退化性疾病風險的藥物，其可用以治療阿茲海默症(AD)，所述藥物包括但不限於：多奈哌齊、重酒石酸卡巴拉汀、加蘭他敏、美金剛、賽福太(selfotel)、，米達福太(midafotel)、他克林(tacrine)、司來吉蘭(selegiline)和維生素E。
根據本揭示內容某些實施方式，本案玻尿酸複合物可治療之個體為哺乳類動物。於某些實施例中，所述個體為小鼠或大鼠。於其他實施例中，所述個體為人類。
本揭示內容亦涵蓋用以治療此處所述之任何目標神經退化性疾病之套組。所素套組可包含此處提出的玻尿酸複合物或包含其之藥學組合物。所述套組亦可視需要地包含一或多個額外的藥劑，如上文所述。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。
實驗例
實驗例 1
HA-βALA- 雌二醇的合成與定性
於本實驗例中，根據圖1所是的路徑I合成含有HA-βALA-C17 雌二醇(A式)及HA-βALA-C3 雌二醇(B式)的混合物。
簡言之，將Boc-β-丙胺酸(2.92 mmole，552 mg)、DCC (3.40 mmole，702 mg)與4-二甲基胺基吡啶(4-dimethylaminopyridine，簡稱DMAP)(3.04 mmole，372 mg)加入雌二醇(2.75 mmole，750 mg)的二氯甲烷(dichloromethane，簡稱DCM)(250 mL)溶液中，並將混合物在室溫(RT)下攪拌一夜。在真空下移除溶劑，並將沉澱物溶解於甲醇中。之後將所得到的混合物加入10% K2 CO3 溶液(甲醇：10% K2 CO3 =1：1)並在室溫下攪拌一夜。接著，以DCM與水濃縮並萃出混合物。在真空下移除混合物中大多數的DCM，並濾出混合物內的沉澱物。沉澱物以DCM沖洗後，取濾液在真空下濃縮。以丙酮沖洗殘留物，並濾出沉澱物。此後，將濾液濃縮並以矽膠管柱層析(沖提液：丙酮：己烷=1：1)純化，以得到產物Boc-βALA-雌二醇。
HA-βALA-雌二醇的逐步(stepwise)合成程序如下：A瓶：將Boc-β-ALA-雌二醇(0.19 mmole，83 mg)溶解於DCM (1 mL)中，並將溶液在室溫下攪拌。在溶液中加入三氟乙酸(trifluoroacetic acid，簡稱TFA)(0.2 mL，2 mmole)並使反應持續4小時；之後將Na2 CO3 溶液(55 mg/mL)逐滴加入冰浴上的反應溶液中，直到溶液不再釋出泡泡為止。接著，在真空下移除溶液中的DCM。接著將氰基羥基亞胺基乙酸乙酯(ethyl cyanohydroxyiminoacetate，簡稱oxyma)(1.39 mmole，250 mg)與二甲亞碸(dimethyl sulfoxide，簡稱DMSO)(20 mL)加入殘餘物，並在室溫下攪拌溶液。B瓶：將HA溶液(500 mg/25 mL)和DMSO (20 mL)混合，並攪拌混合物直到溫度回到室溫為止。將B瓶溶液倒入A瓶中，並使混合物均勻混合。將N ,N’ -二異丙基碳二亞胺(N ,N’ -diisopropylcarbodiimide，簡稱DIC)(2.58 mmole，326 mg)加入混合物的液面以下，並使反應持續24小時。其後，利用透析法(透析袋截留分子量(molecular weight cut off，簡稱MWCO)為3500，10 L的水進行12小時；1 L的0.3M NaCl進行12小時、兩次；以及10 L的水進行12小時、5次)來純化反應混合物，且之後收集透析袋中的部分並將其凍乾。
以UPLC設備(Acquity UPLC與PDA偵測器，購自Waters)來確認所合成的HA-βALA-C3 /C17 雌二醇(HA-E2)；所用管柱為：ACQUITY UPLC BEH200 SEC管柱(1.7μm，ID 4.6mm × 150mm)；流速：0.3 mL/分；注入體積：50 μl；偵測器：UV 280 nm；溫度：管柱25 °C、自動進樣器20 °C；運作時間：18分鐘；相對滯留時間： HA-E2 (即HA-βALA-C3 /C17 雌二醇)為2.7、E2 (雌二醇)為10.1。進行計算時，使用線性回歸以產生標準曲線y=mx+b，其中：x為E2濃度(µg/ml)；y為所有標準品的峰值面積；m為標準曲線的斜率；b為標準曲線的截距；以及，標準曲線之可接受的相關係數(r2)為≥0.9950。
圖2A及圖2B分別顯示雌二醇(E2)及HA-βALA-C3 /C17 雌二醇(HA-E2)的UPLC圖譜。
實驗例 2
玻尿酸複合物對神經細胞攝取的影響
於本實驗例中，進行成對實驗以探討神經細胞(人類神經胚細胞瘤SH-SY5Y細胞株)對本案玻尿酸複合物之攝取。試驗結果(資料未示出)顯示，神經細胞所捨取的HA-E1複合物多於雌酮本身，在其他成對的試驗中亦可見到相同的結果，包括HA-E2複合物對雌二醇本身、HA-E3複合物對雌三醇本身、HA-睪固酮複合物對睪固酮本身以及HA-去氧皮質固酮對11-去氧皮質固酮本身。
基於以上成對試驗的結果，對HA-E2及E2進行後續分析。
已知雌激素有助於保持神經細胞存活，且此現象的表徵之一為細胞中ATP量上調。由於粒腺體膜電位是粒腺體ATP合成的驅動力，以HA-C17 -E2及E2分別處理神經細胞，之後再測量細胞粒腺體膜電位水平。
簡言之，將人類神經胚細胞瘤SH-SY5Y細胞培養於Eagle's最低必要培養基(Eagle's minimum essential medium，簡稱EMEM)中，培養基中添加了10%熱不活化胎牛血清(fetal bovine serum，簡稱FBS)、100 單位/mL盤尼西林以及100 μg/mL鏈黴素，細胞培養於37 °C、加濕之5% CO2 培育箱中。於測量粒腺體膜電位時，將SH-SY5Y細胞和E2 (0.14、0.34、0.68與1.36 μg/mL)、HA (6.48、16.19、32.38與64.76 μg/mL)或HA-C17 -E2 (6.48、16.19、32.38與64.76 μg/mL，分別對應於E2濃度)一起培養18個小時。
四甲基若丹明甲酯(tetramethylrhodamine methyl ester，簡稱TMRM)是一種具細胞滲透性的陽離子紅橙色螢光染料，易於被活化粒腺體螯合。細胞經胰蛋白酶處理後，重新懸浮於0.5 mL的PBS中，其中含100 nM的TMRM (購自Molecular Probes, Eugene, OR)。於黑暗中37 °C下培育30分鐘後，立刻將細胞轉移到冰上的試管中，並利用流式細胞儀以FL2偵測器來測定螢光強度。
流式細胞分析使用配備有488-nm氬雷射之FACS Calibur流式細胞儀(購自Becton Dickinson, Bedford, MA)。利用前向與側向散射來建立尺寸門(size gates)並將細胞碎屑排除於分析外。激發波長設定為488 nm。每次測量時，至少分析20,000個細胞。獲取資訊並利用Cell Quest軟體(Becton Dickinson)分析。計算平均螢光強度的相對改變，其係指經處理細胞與對照細胞之通道中的平均螢光強度間的比例。
如圖3所示，相較於對照組與以及僅使用HA或E2處理之組別，HA-C17 -E2 (32.38 μg/mL，相當於0.68 μg/mL E2)或HA-C17 -E2 (64.76 μg/mL，相當於1.36 μg/mL E2)處理能夠增加細胞中的粒腺體膜電位水平。
實驗例 3
玻尿酸複合物對 β 類澱粉蛋白表現的影響
於本實驗例中，探究此處提出的玻尿酸複合物對APP/PS1轉基因小鼠之數種阿茲海默症指數的影響，包括類澱粉蛋白斑塊形成以及Aβ42的分布與表現量。APP/PS1轉基因小鼠會產生過量的類澱粉蛋白β (amyloid β，簡稱Aβ)，故是常用的阿茲海默症動物模型。
APPswe/PS1dE9(APP/PS1)轉基因小鼠係購自Jackson Lab。所有實驗程序根據中醫藥研究所的規格書(IACUC No. 106-417-4)進行。
對8週大APP/PS1小鼠以靜脈內注射0.206 mg/kg的E2或12.5 mg/kg的HA-E2 (相當於0.206 mg/kg的E2)或對照媒劑，每週注射三次，共計8週。在第7週，連續七天每日以腹腔內注射5-溴-2’-脱氧尿苷(5-bromo-2’-deoxyuridine，簡稱BrdU)，注射劑量為每劑50 mg/Kg/天。之後對小鼠靜脈內注射舒泰/甲苯噻嗪(Zoletil/Xylazine；20 mg/Kg:5 mg/Kg)使其麻最後犧牲。在深度麻醉後，由心臟收集血液，以13,000 rpm離心以分離血清。在以pH 7.4生理食鹽水灌注後，利用手術移除腦部半球的皮質與海馬迴並將其均質化後儲存於-30 °C。腦部的另一半以4%甲醛浸泡3至7天，之後以浸泡於其他20%及30%蔗糖脫水3至7天，以固定組織。將腦部組織冷凍以供後續切片。
採用2%SDS和70%甲酸(formic acid，簡稱FA，購自Sigma)進行腦部Aβ的兩步連續提取。簡而言之，將皮質勻漿與含有蛋白酶抑製劑的H-緩衝液中的4%SDS以等體積混合。然後以超音波處理樣本，並在4 °C下以100,000 x g離心60分鐘。樣本的上清液是SDS可溶餾分。對於不溶於SDS的餾分，將樣本沉澱物重新懸浮在70%的FA中，並在4 °C下以100,000 x g離心60分鐘。接著，收集上清液，並用pH 11的1M Tris中和。將SDS可溶餾分和SDS不溶餾分都保存在-80°C下，直到進行夾心ELISA分析為止。根據製造商的操作手冊，以人Aβ40和Aβ42 ELISA試劑盒(購自Invitrogen)來測量Aβ量。
圖4A及圖4B分別摘要整理了利用上述方法測定之血清與海馬迴中的Aβ42表現量。經HA-E2處理之小鼠在血清與海馬迴中的Aβ42表現量皆低於僅經E2媒劑處理之小鼠。
實驗例 4
HA-βALA-C17 雌二醇 (HA-C17 -E2) 之合成
於本實驗例中，根據圖5所示的路徑III來合成HA-βALA-C17 雌二醇(HA-C17 -E2)。
首先，將雌二醇(1.84 mmole，500 mg)溶解於DCM (40 mL)中並攪拌15分鐘。接著，將255 μL、2.02 mmole的苯甲醯氯以及5滴的三乙胺加入反應混合物中，之後將其在20 °C下於氮氣下攪拌24小時。在真空下濃縮反應混合物，之後以矽膠管柱層析(沖提液：EA/DCM = 3/97)純化，以得到雌二醇苯甲酸酯(Bz-雌二醇)。
接著，將Bz-雌二醇(0.23 mmole，85 mg)溶解於乾的DCM (20 mL)中並攪拌10分鐘。將N,N’-二環己基碳二亞胺(N,N’-Dicyclohexylcarbodiimide，簡稱DCC)(0.45 mmole，94 mg)與DMAP (0.23 mmole，27 mg)加入反應混合物中，再攪拌30分鐘。其後，加入Boc-β-丙胺酸(0.45 mmole，87 mg)並在25 °C於氮氣下攪拌24小時。過濾反應混合物並以DDW萃取。收集有機層並於真空下移除溶劑，以得到粗產物，之後利用矽膠管柱層析(沖提液：EA/DCM = 3/97)純化以得到雌二醇-苯甲酸酯-Ala-Boc (Bz-雌二醇-β-ALA-boc)。
接著，將Bz-雌二醇-β-ALA-boc (0.18 mmole，100 mg)溶解於MeOH (5 mL)中，並利用5 M NaOH將pH值調整為9-10。接著，在室溫下攪拌反應混合物。24小時之後，利用50%的AcOH將反應混合物的pH值調整為6，接著將反應混合物濃縮以得到油狀液體。利用EA與滷水萃取上述油狀液體三次。利用MgSO4 移除有機層中的水，之後在真空下移除溶劑，以得到粗產物，接著以矽膠管柱層析(沖提液：EA/DCM = 5/95)純化粗產物以得到E2-Ala-Boc。
HA-C17 -E2的逐步合成程序如下。A瓶：將HA (0.49 mmole，200 mg)在DDW(20 mL)中攪拌2小時使其溶解，之後在攪拌下將DMSO (25 mL)倒入反應混合物中直到溫度回到室溫為止。B瓶：將E2-Ala-Boc (0.10 mmole，44.1 mg)溶解於DCM (2 mL)中，之後加入TFA (1.31 mmole，0.1 mL)。在室溫下攪拌溶液2小時。之後，透過濃縮移除大部分的DCM與TFA，且之後將DDW (2 mL)倒入反應混合物中，並利用0.5 M的NaHCO3 將pH值調整至7。將DMSO加入反應混合物中直到沉澱物溶解為止。將Oxyma (0.55 mmole，77 mg)溶解於DMSO (4 mL)中，接著將溶液倒入A瓶中，再攪拌10分鐘。利用吸量管將B瓶溶液緩緩加入A瓶中，並使混合物均勻混合15分鐘。利用吸量管將DIC (2.58 mmole，326 mg)加入混合物的液面下，並使反應持續24小時。其後，利用透析法(MWCO為3500，5 L的0.3M NaCl進行12小時、6次；以及5 L的水進行12小時、6次)來純化反應混合物，且之後收集透析袋中的部分並將其凍乾。
以UPLC設備來確認所合成的HA-C17 -E2 (資料未示出)，並利用UV-Vis光譜儀在280 nm下決定載藥率。於一實驗例中，HA-C17 -E2的DS為約0.54%；於另一實驗例中，HA-C17 -E2的DS為約13.55%。
實驗例 5
玻尿酸複合物對認知功能的影響
先前的研究顯示經卵巢切除(ovariectomy，簡稱OVX)或子宮切除(hysteroovariotomy，簡稱OHE)的雌性大鼠在感覺運動皮質及海馬迴CA1區域中之錐體神經元的樹突棘明顯減少，且會出現認知障礙，這意味著雌激素和大鼠的學習與記憶功能有相當程度的關係。
於本實驗例中，以本案玻尿酸複合物處理經OHE手術的雌性大鼠，之後使其進行經修改的莫里森水迷宮測試(modified Morrison water maze task)，以評估大鼠的認知功能(如，學習與記憶)。
本試驗採用8週大的雌性Sprague-Dawley (SD)大鼠。所有動物分別飼養於經溫度(24±1 °C)、濕度(60%至65%)與光線(12/12小時之光暗循環)控制的飼養室中，食物與水任食。所有實驗步驟依循台灣科技部的指引並經中興大學實驗動物照護及使用委員會之核准。
進行OHE手術時，以7%水合氯醛與2%甲苯噻嗪(0.45 mL /100克體重)將大鼠深度麻醉以進行OHE手術。數後兩週，每週兩次給予大鼠藥物，持續兩週，並於手術後四週犧牲大鼠。
大鼠犧牲前五天，開始進行經修改的莫里森水迷宮測試。迷宮是由黑色圓形泳池所組成，其直徑為145公分，且深度為22公分。在泳池的邊緣設立一視覺線索(星形紙板)。在水面下3公分處設置透明平台。利用相機紀錄動物表現並以SMART影像追蹤系統(SMART 3.0V, Panlab, Havard Apparatus, Cambridge，UK)分析。
於評估逃離潛伏期時，連續三天每天對大鼠進行兩次測試。將大鼠隨機放置於泳池的不同象限且面向泳池壁。若大鼠在180秒內逃離，則允許其在平台上停留60秒，或者是，若大鼠未能在180秒內找到水下平台，則將其放置於平台上使其停留60秒。每天進行的兩次測試間，有10分鐘的回復期間。將每天兩次測試的逃離潛伏期平均以供後續分析。
空間探索試驗的進行方式如下，移除泳池內的平台，並根據平台前一次的位置設置虛擬的目標象限與虛擬平台。在最後一次逃避潛伏期試驗之後，使大鼠休息一天，再將大鼠放置於目標象限的對角區域使其面向泳池壁。允許大鼠游動30秒並記錄其游動路徑。
所有實驗數據表現為平均值±SEM。統計顯著性採用方差單因子變異數分析(analysis of variance，簡稱ANOVA)進行檢驗，然後進行用學生氏-紐曼-庫爾(Student-Newman-Keuls，簡稱SNK)事後檢驗(post hoc test)。當p值＜ 0.05，差異具統計上顯著性。
在一輪測試中，OHE大鼠接受以下處置：2X的E2 (280 ng/公斤體重；n=6)、1X的HA-C17 -E2 (35 μg/公斤體重；DS：0.54%；相當於140 ng/kg E2；n=5)或1.5X的HA-C17 -E2 (5.25 μg/100 g體重；DS：0.54%；相當於210 ng/kg E2；n=5)。OHE大鼠(n=6)與未經OHE手術的一般大鼠(n=4)分別作為正對照組與負對照組。
圖6A (游泳距離)與圖6B (游泳時間)所示的潛伏期測試結果指出OHE手術對大鼠學習功能有負面影響，而投予1X的HA-C17 -E2、1.5X的HA-C17 -E2以及2X的E2可改善OHE大鼠之學習能力，且相較於OHE組有統計上的顯著差異。
在空間探索試驗中，圖7A (目標象限中的距離)與圖7B (目標象限中的時間)顯示相較於OHE處理組(#，p＜ 0.05)、1X HA-C17 -E2組(@，p＜ 0.05)以及2X E2組($，p＜ 0.05)，投予1.5X的HA-C17 -E2可顯著提升大鼠的記憶功能。由於本實驗例的初步結果顯示2X的E2在提升OHE大鼠學習與記憶功能方面的效果不及於1.5X的HA-C17 -E2，且後者的E2均等含量只有2X E2的75%，在後續的測試中，進一步提高了投予OHE大鼠之E2的用量。
在另一回合的測試中，對OHE大鼠進行以下處置：2.5X的E2 (350 ng/公斤體重；n=16)或1.5X的HA-C17 -E2 (52.5 μg/公斤體重；相當於210 ng/公斤體重的E2；n=16)。OHE大鼠(n=8)與未經OHE手術的一般大鼠(n=8)分別作為正對照組與負對照組。
圖8A (游泳距離)與圖8B (游泳時間)所示的潛伏期測試結果指出OHE手術對大鼠學習功能有負面影響，而投予1.5X的HA-C17 -E2以及2.5X的E2在第三天可改善OHE大鼠之學習能力，且相較於OHE組有統計上的顯著差異(#，p＜ 0.05)。
在空間探索試驗中，圖9A (目標象限中的距離)與圖9B (目標象限中的時間)顯示相較於OHE處理組(#，p＜ 0.05)，投予1.5X的HA-C17 -E2與2.5X的E2可顯著提升大鼠的記憶功能。
應注意到，在第二回合的實驗中，經1.5X之HA-C17 -E2或2.5X之E2處理的大鼠之認知功能都有明顯的改善；然而，在1.5X之HA-C17 -E2中，其E2均等量僅有2.5X E2的60%。
實驗例 6
玻尿酸複合物對樹突數目與樹突密度之影響
以7%水合氯醛與2%甲苯噻嗪(5 mL/公斤體重)將大鼠深度麻醉後固定於解剖桌上。利用以下方式處理組織，以在細胞內注入色素並進行免疫組織染色。簡言之，以2%多聚甲醛的0.1 M磷酸緩衝液(phosphate buffer，簡稱PB)溶液(pH 7.3)對大鼠進行經心灌注30分鐘。小心地取出大腦，並以玻璃纖維刀(Technical Products International, St. Louis, MO)切成兩部分：(1)兩片350 μm厚的冠狀切片，其含有海馬迴以用於細胞內染料注射；(2) 1000微米厚的冠狀切片，其包含內側中隔(medial septal，MS)核、以及2000微米厚的冠狀切片，其包含海馬迴，均用於免疫組織化學染色。將用於免疫組織化學染色的厚切片在4％多聚甲醛的0.1 M PB溶液中固定1天。將用於細胞內染料注射的切片浸入10-7 M之4',6-二甲脒基-2-苯基-吲哚(4',6-diamidino-2-phenyl-indole ，簡稱DAPI；購自Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)的0.1M PB溶液中，以供後續處理。進行斷頭以取得含有前腦基底核、大腦皮層和海馬迴的新鮮腦組織。將腦組織儲存在-70°C的冰箱中，以供後續蛋白質定量。
圖10A及圖10B分別為大鼠遠端根尖樹突與基底根尖樹突的照片。由圖式中可以看出，相較於未經過OHE手術的對照組大鼠，OHE大鼠的樹突數目較少。另一方面，經過2.5X E2與1.5X HA-C17 -E2處理的大鼠則比OHE處理之大鼠有更多的樹突。
圖11A (根尖區段)與圖11B (基底區段)的定量結果顯示相較於對照組大鼠，OHE手術與樹突棘密度的降低有關(*，p＜ 0.05)。另一方面，雖然投予1.5X的HA-C17 -E2以及2.5X的E2都會導致樹突棘密度相對於OHE大鼠有顯著的提升(#，p＜ 0.05)，經1.5X HA-C17 -E2處理之大鼠的樹突棘密度略高於經2.5X E2處理的大鼠。有鑑於在以1.5X HA-C17 -E2處理的組別中，給予受試動物的雌二醇量只有經2.5X E2處理組的60%，這樣的結果相當出乎意料。
在每隻大鼠的三個區段隨機選擇背側海馬迴。分析CA1錐體細胞的遠端根尖及遠端基底樹突，以決定海馬迴中的樹突棘密度。每10 μm隨機計數海馬迴CA1區的五個獨立細胞和每個樹突的3個片段。所有實驗數據表現為平均值±SEM。樹突棘密度的統計顯著性採用單因子ANOVA進行檢驗，然後進行SNK事後檢驗(post hoc test)。當p值＜ 0.05，差異具統計上顯著性。
實驗例 7
玻尿酸複合物對感覺運動功能的影響
於本實驗例中，進行桿與平衡木穿越測驗(爬桿測驗)，以評估本案玻尿酸複合物對小鼠感覺運動功能的影響。
本實驗採用8週大雄性C57BL/6小鼠(每組n = 4-5)，小鼠購自BioLASCO Taiwan公司。所有動物分別飼養於經溫度(24±1 °C)、濕度(60%至65%)與光線(12/12小時之光暗循環)控制的飼養室中，食物與水任食。所有實驗步驟依循台灣科技部的指引並經中興大學實驗動物照護及使用委員會之核准。
在MPTP誘發組中，於第一及第五天，對小鼠以腹膜內(i.p.)投予甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，簡稱MPTP；20 mg/kg)，每天四次，每次間隔兩小時。在第2天與第6天對試驗動物以靜脈內(i.v.)投予5X的E2 (342 ng/kg)及2.5X或5X的HA-C17 -E2複合物(1.96或3.92 μg/公斤體重；DS：13.55%；相當於171或342 ng/kg E2)。假性處理組則是以相同的方式經腹膜內注射生理食鹽水或靜脈內注射PBS緩衝液。
在MPTP誘發前兩天，對小鼠進行預測試，並在第2與第6天在給藥後4小時進行爬桿測試。簡言之，使用高50公分、直徑1公分的管子並在管子頂部接上一爬桿。動物通常會自然地面向下方並爬下爬桿以回到其飼育籠。小鼠爬下並回到飼育籠者給予0分。另一方面，無法轉向而將身體保持水平方向並以類似開瓶器之方式爬下的小鼠則給予1分。利用IBM SPSS Statistics 20.0軟體對結果進行卡方獨立性檢驗；設定p＜ 0.05為具有統計顯著性。
圖12摘要整理的結果顯示MPTP誘發會負面地影響小鼠的運動協調功能(*，p＜ 0.05)，且投予5X的E2無法有效改善經MPTP處理小鼠的運動協調功能。相反地，投予2.5X或5X的HA-C17 -E2可明顯地改善經MPTP處理小鼠的運動協調功能(*，p＜ 0.05)。
上文實驗例提出了多個活體外與活體內的實驗結果，這些資料證實此處提出的玻尿酸複合物能夠提高樹突棘密度、改善認知功能(例如學習與記憶)，且可提升感覺運動功能。綜合觀之，這些實驗資料顯示此處提出的玻尿酸複合物確實能在小鼠與大鼠體內防止神經退化之發生，因此可作為開發神經退化性疾病治療藥物的優先候選藥物，所述神經退化性疾病例如阿茲海默症、巴金森氏症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、多發性硬化症、杭丁頓氏症、額顳癡呆、癲癇、神經性疼痛或共濟失調。
當可理解，上文所述的實施方式僅為例示，且所屬技術領域中具有通常知識者可做出各種修改。上文的說明、實驗例與數據完整地描述了本發明的例示性實施方式的結構與運用。雖然上文實施方式已具體地或參照一或多個個別的實施方式揭露了本發明的多種實施方式，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，當可對其進行各種更動而不至於悖離本發明之原理與精神。
無
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與下文實施例、附隨申請專利範圍與圖式能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：
圖1繪式根據本揭示內容一實驗例，合成HA-βALA-C3 /C17 雌二醇(HA-E2)玻尿酸複合物的路徑；
圖2A及圖2B分別是根據本揭示內容一實驗例，雌二醇(E2)及HA-E2的UPLC分析結果；
圖3繪式根據本揭示內容一實驗例，HA-C17 -E2玻尿酸複合物對活體外粒腺體膜電位(MMP)水平之作用；
圖4A及圖4B分別繪式根據本揭示內容一實驗例，HA-E2玻尿酸複合物對APP/PS1轉基因小鼠體內血清及海馬迴中Aβ42水平之改變在活體內的作用；
圖5繪式根據本揭示內容一實驗例，合成HA-C17 -E2玻尿酸複合物的路徑；
圖6A及圖6B分別顯示根據本揭示內容一實驗例，HA-C17 -E2玻尿酸複合物對OHE大鼠之游泳距離及游泳時間在活體內的作用；
圖7A及圖7B分別顯示根據本揭示內容一實驗例，HA-C17 -E2玻尿酸複合物對OHE大鼠在目標象限中之游泳距離及游泳時間在活體內的作用；
圖8A及圖8B分別顯示根據本揭示內容一實驗例，HA-C17 -E2玻尿酸複合物對OHE大鼠之游泳距離及游泳時間在活體內的作用；
圖9A及圖9B分別顯示根據本揭示內容一實驗例，HA-C17 -E2玻尿酸複合物對OHE大鼠在目標象限中之游泳距離及游泳時間在活體內的作用；
圖10A及圖10B為代表性顯微照片，其分別顯示根據本揭示內容一實驗例，HA-C17 -E2玻尿酸複合物對海馬迴CA1中錐體神經元的遠端根尖及遠端基底樹突在活體內的作用；
圖11A及圖11B為代表性顯微照片，其分別顯示根據本揭示內容一實驗例，HA-C17 -E2玻尿酸複合物對OHE大鼠之海馬迴CA1錐體神經元的根尖及基底樹突棘密度在活體內的作用；以及
圖12顯示根據本揭示內容一實驗例，HA-C17 -E2玻尿酸複合物對經MPTP處理之小鼠的學習能力在活體內的作用。
Figure 109118583-A0101-11-0002-1

Claims (10)

  1. 一種玻尿酸複合物，包含： 一玻尿酸(玻尿酸acid，HA)或其衍生物或鹽類； 一性荷爾蒙，其係選自由以下物質所組成的群組：雌酮、雌二醇、雌三醇、睪固酮以及11-去氧皮質固酮；以及 一連接物，將該性荷爾蒙共價連接至該HA或其衍生物或鹽類之多個雙醣單元中的一個。
  2. 如請求項1所述的玻尿酸複合物，其中該連接物係選自由以下物質所組成的群組：一或多個胺基酸、脂肪、二醯肼-C2 -C20 二酸以及C2 -C20 二酸。
  3. 如請求項1所述的玻尿酸複合物，其中該玻尿酸複合物的性荷爾蒙取代度為0.1至60%。
  4. 如請求項1所述的玻尿酸複合物，其中該HA或其衍生物或鹽類的重量平均分子量(Mw)為約5至500 kDa。
  5. 如請求項2所述的玻尿酸複合物，其中該連接物係共價連接至該性荷爾蒙的羥基(–OH)。
  6. 如請求項2所述的玻尿酸複合物，其中該胺基酸為β-丙胺酸(β-ALA)。
  7. 如請求項2所述的玻尿酸複合物，其中該二醯肼-C2 -C20 二酸為己二酸二醯肼(adipic dihydrazide，ADH)-琥珀酸酯。
  8. 如請求項2所述的玻尿酸複合物，其中該C2 -C20 二酸為琥珀酸。
  9. 一種藥學組合物，包含一有效量的如請求項1至8任一項所述的玻尿酸複合物，以及一藥學尚可接受的賦型劑。
  10. 一種玻尿酸複合物於製備用以治療或防止神經退化性疾病之藥物的用途，其中該玻尿酸複合物係如請求項1至8任一項所述。
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