CZ304303B6

CZ304303B6 - Vlákna založená na hydrofobizovaném hyaluronanu, způsob jejich přípravy a použití, textilie na jejich bázi a použití

Info

Publication number: CZ304303B6
Application number: CZ2012-841A
Authority: CZ
Inventors: Jolana Ščudlová; Jiří Běťák; Lucie Wolfová; Radovan Buffa; Klára Šlezingrová; Pavel Klein; Ilona Matějková; Martin Bobek; Tomáš Pitucha; Vladimír Velebný; Romana Šuláková
Original assignee: Contipro Biotech S.R.O.
Priority date: 2012-11-27
Filing date: 2012-11-27
Publication date: 2014-02-19
Also published as: WO2014082611A8; EP2925916B1; WO2014082611A1; JP2016505722A; CZ2012841A3; HUE045741T2; US20150308016A1; ES2748638T3; DK2925916T3; RU2015125075A; KR102090614B1; EP2925916A1; BR112015012198A2; KR20150090167A; PL2925916T3; AR093619A1

Abstract

Řešení se týká biodegradabilních vláken, která jsou založena na hydrofobizovaném hyaluronanu, konkrétně na bázi hyaluronanu C.sub.11 .n.- C.sub.18.n.-acylovaného na hydroxylových skupinách kyseliny hyaluronové, a jejich použití. Dále se řešení týká přípravy těchto vláken, která je realizována pomocí metody mokrého zvlákňování v koagulační lázni obsahující vodný roztok organické kyseliny, produktem jsou poté nekonečné monofily, které lze následně zpracovat na nitě a dále na tkaniny, pleteniny či netkané textilie. Tyto tkaniny, pleteniny či netkané textilie jsou použitelné například pro výrobu implantovatelných chirurgických materiálů pro humánní a veterinární medicínu.

Description

Vlákna založená na hydrofobizovaném hyaluronanu, způsob jejich přípravy a použití, textilie na jejich bázi a použití

Oblast techniky

Vynález se týká přípravy biodegradabilních vláken, která jsou založena na hydrofobizovaném hyaluronanu. Příprava vláken je realizována pomocí metody mokrého zvlákňování (jet spinning), produktem jsou poté nekonečné monofily, které lze následně zpracovat na nitě a dále na tkaniny, pleteniny, či netkané textilie. Výsledná vlákna mají vynikající zpracovatelské vlastnosti (pevnost, tažnost). Aplikační využití těchto vláken je směrování do medicíny, zejména do oblasti chirurgických materiálů, tkáňového inženýrství a systémů pro řízené uvolňování léčiv.

Dosavadní stav techniky

Hyaluronan (HA) je lineární polysacharid složený z opakujících se disacharidických jednotek tvořených kyselinou glukuronovou, kteráje β—1,3 glykosidickou vazbou spojena sN-acetylglukosaminem. Disacharidové podjednotky jsou mezi sebou svázány vazbou β—1,4. Jedná se o látku, která se přirozeně nachází v organismu, kde plní zejména funkci organizátora extracelulární matrix (EMS). Navíc díky tomu, že interaguje s receptory buněk, je hyaluronan schopen nejenom je poutat k EMS, nýbrž také prostřednictvím této interakce buňky i určitým způsobem regulovat. Navíc díky svému složené je hyaluronan schopen vázat značné množství vody a tudíž tkáně hydratovat a zabezpečit tak nejenom transport živin a kyslíku k jednotlivým buňkám, nýbrž také přenos regulačních faktorů mezi buňkami [1]. Další velkou výhodou hyaluronanu je skutečnost, že se průmyslově dá získávat v prakticky neomezeném množství a ve velmi vysoké čistotě pomocí fermentace streptokoků [2],

To, že hyaluronan je látka tělu vlastní, která není navíc imunogenní, teratogenní či jinak toxická, interaguje se specifickými buněčnými receptory, silně hydratuje tkáně a lubrikuje klouby či pohyb víčka po oční bulvě ji předurčuje pro řadu aplikací v medicíně [3 až 5],

Jednou ze zajímavých aplikačních forem by mohly být různé textilní výrobky, tkaniny, pleteniny či netkané textilie pro externí či interní užití. To však vyžaduje, aby byla k dispozici vlákna, která na jedné straně budou schopna vázat na svůj povrch či nést ve své struktuře biologicky aktivní látky a navíc se díky své chemické struktuře budou v organismu řízené rozkládat a současně budou mít takové fyzikální a mechanické vlastnosti, které dovolí jejich textilní zpracování. V současné době lze v literatuře nalézt popis použití mokrého zvlákňování (wet spinningu) k výrobě vláken a filmů z hyaluronátu draselného (Rupprecht [6]) nebo vápenatého (Sheehan [7]). Zvláknění je v tomto případě prováděno do roztoku ethanolu s obsahem 0,1 M KCl nebo odpovídající vápenaté soli. Připravená vlákna jsou velmi dobře rozpustná ve vodě a již ve vlhkém prostředí se rozpadají, přičemž řádově v několika desítkách sekund ztrácejí jak svůj tvar, tak i mechanické vlastnosti. Výše uvedené vlastnosti zcela zásadním způsobem omezují aplikační možnosti nativního hyaluronanu. Dosud neexistuje na trhu žádný přípravek, který by nativní vlákna připravená z hyaluronanu využíval.

Příprava vláken z nativního hyaluronanu je chráněna patentem WO 2009/050389. Vlákna jsou získávána srážením v lázni koncentrované kyseliny octové (80 až 90%). Následně jsou vlákna sušena a dloužena. Vzhledem k tomu, že jsou připravována z nativního hyaluronanu, jsou velmi dobře rozpustná ve vodě. K omezení rozpustnosti autoři uvádějí, že lze vlákno povrchově upravit pomocí hydrofobních látek rostlinného nebo živočišného původu. Oproti tomu, jsou námi připravená vlákna z hydrofobizovaného hyaluronanu nerozpustná ihned po přípravě, nemusí se tedy později přidávat další látky pro povrchovou úpravu, a proto je celý proces technologicky i ekonomicky výrazně jednodušší.

- 1 CZ 304303 B6

Patentová přihláška CZ PV 2010-1001 využívá k přípravě vláken z kyseliny hyaluronové také kyselinu 1 až 99 % hmotn., avšak ve směsi s alkoholem 1 až 99 % hmotn, který má vláknům dodávat vyšší pevnost. Nárokují si také použití kyseliny fosforečné a metalizačních lázní. Pro koagulaci upřednostňují kyselinu mravenčí, octovou, propionovou se směsi s methanolem, ethanolem, propan-l-olem nebo propan-2-olem. Opět se jedná o rozpustná vlákna oproti námi použitému hydrofobizovanému HA. Stejné vymezení se týká i patentové přihlášky US 2011/0263724 Al.

Výše popsaná rozpustnost vláken z nativního hyaluronanu může být odstraněna použitím vhodných chemicky modifikovaných derivátů na bázi hyaluronanu.

V patentu EP 216 453 A2 autoři zvlákňovali pomocí wet spinningu estery kyseliny hyaluronové v lázni ethanol+DMSO. Konkrétně se jednalo o ethyl-ester (HYAFF7) a benzyl-ester (HYAFF11). Esterifikuje se karboxylová skupina, esterifikace probíhá vazbou aktivovaného alkylu na karboxylovou skupinu kyseliny glukuronové, kteráje ovšem podle současných poznatků [8] významná pro specifickou vazbu kyseliny hyaluronové a buněčné receptory (CD44).

Naproti tomu hydrofobizované hyaluronany, ze kterých vycházíme v rámci této přihlášky vynálezu, jsou modifikovány pouze na hydroxylových skupinách, proto tedy biologické vlastnosti karboxylové skupiny zůstávají zachovány v plném rozsahu, tak, jako v případě nativního hyaluronanu.

Jelikož použitá lázeň ve výše uvedeném patentu neumožňuje dosáhnout mechanických vlastností požadovaných pro tvorbu nekonečného monofilu, autoři patentů je využívají pouze pro tvorbu netkaných textilií.

I další patenty od firmy Fidia Advanced Biopolymers se zabývají, tvorbou vláken a netkaných textilií z esterů kyseliny hyaluronové, jedná se o tyto patenty WO 93/11803, WO 98/08876, US 5658582, US 006632802 B2, US 2004/0192643 Al. Příprava vláken je stejná u všech patentů. Nejprve se rozpouští estery kyseliny hyaluronové v DMSO, následuje koagulace do absolutního ethanolu. Délka vláken se pohybuje v rozmezí 5 až 100 mm. Jejich krátká délka je dána značnou křehkostí vláken, kterou způsobuje použitá koagulační lázeň - absolutní ethanol, jak je dokázáno i v našem příkladu 20. Proto si také autoři těchto patentů nárokují pouze netkané textilie, jelikož svým technologickým postupem, zejména zvolenou srážecí lázni, nejsou schopni vyrobit nekonečné vlákno. V případě naší přihlášky vynálezu je závěrem příprava nekonečných vláken ajejich zpracování do podoby pravidelně strukturované textilie (tkanina, pletenina), u kterých lze předpokládat homogenní distribuci monofilamentu a vyšší tahové a flexibilní vlastnosti.

Dále jsou patentově chráněna směsná vlákna, kde deriváty hyaluronanu představují vedlejší komponentu, s obsahem max. do 10 % hmotn. Zbytek zvlákňovací suroviny zaujímají jiné polysacharidy, například gelan, přihláška vynálezu WO 2007/006403. Autoři svým technologickým postupem nejsou schopni zvláknit hyaluronan jako nosný polymer, proto ho do vláken přidávají v malém množství k jinému nosnějšímu polymeru.

Obdobná situace je popsána ve WO 2007/009728 A2, kde autoři zvlákňují karboxymethylcelulózu s deriváty kyseliny hyaluronové. Komponenty jsou rozpuštěny v DMSO a jsou vysráženy v koagulační lázni chloridu zinečnatého v ethanolu, nebo bromidu zinečnatém v ethanolu. Autoři zde již neuvádí, jak velké množství zinku zůstává obsaženo ve vláknech. Vyšší obsah zinku coby těžkého kovu je přitom cytotoxický. To dokazují i vlákna připravená dle příkladu 6 a přiložený graf viability 5.

Přihláška vynálezu US 2011/0237539 Al si nárokuje výrobu hemostatických vláken na bázi polysacharidů. Autoři uvádějí směsi materiálů: alginát, chitosan, kyselina hyaluronová a želatina. Jako koagulační roztok pro směs kyseliny hyaluronové a chitosanu si nárokují suspenzi hydroxidu sodného, methanolu a vody. Pro směs želatiny a chitosanu si nárokují stejnou lázeň hydroxi-2CZ 304303 B6 du sodného, methanolu a vody. Pro zvláknění směsi kyseliny hyaluronové a alginátů si nárokují suspenzi chloridu vápenatého, ethanolu a vody. Ovšem opět používají kyselinu hyaluronovou jako jednu z komponent, proto není kyselina hyaluronová brána jako nosný polymer vytvořených vláken.

Z hlediska aplikací vláken připravených z esterů hyaluronanu jsou patentována krátká vlákna, zejména netkané textilie (US 5 658 582), také jsou krátká vlákna využita k přípravě gázy, šicích materiálů, sítí, netkaných textilií (WO 98/08876, US 006632802 B2), nebo také k přípravě obvazového materiálu (WO 2007/003905). Přihláška vynálezu US 2004/0192643 Al také udává výsledky z preklinické a klinické studie materiálu HYAFF7 a HYAFF 11 proti po-operačním srůstům. Materiál testují ve formě gázy a netkané textilie.

Odkazy:

1. Radlice a kol., Injectablehyaluronic acid derivativewithpharmaceuticals/cells, patent US 20020076810 Al.

2. Lee S.A, VanSteenberg M., Ruppreht A.; Spectroscopic studies of the physical properties of hyaluronate fílms: the origin of the phase transition; Carbohydrate Polymers·, 1995; 28; 6167.

3. Guillaumie F., Furrer P., Felt-Bayens, O., Fuhlendorff B. L., Nymand S.; Comparative studies of various hyaluronic acids produced by microbial fermentation for potential topical opthalmic applications. Journal of Biomedical Materials Research Part A; 2009; 1421— 1430.

4. Miller R. J., Avila L. Z.; Chemistry and Biology of Hyaluronan: Medicinal Uses of Modified Hyaluronate. Elsevier Ltd. 2004. 505-528.

5. Juhlin L.; Hyaluronan in skin; Journal oflnterrnal Medicine', 1997; 242; 61-66.

6. Rupprecht A.; Wet Spinning of Hyaluronic Acid. Preparation of Oriented Samples; Acta Chemica Scandinavica; 1979; 33; 779-780.

7. Sheehan J. K., Atkins E.D.T., Nieduszynski I.A.; X-ray diffraction studies on the connective tissue polysacharides; J. Mol. Biol. 1975; 91; 153-163.

8. Banerji S., Wright A. J. a kol.; Structures of the Cd44-hyaluronan comlex provide insight into a fundamental carboxyhydrate-protein interaction; Nátuře structural and molecular biology- 2007; 14; 234-239.

9. Káš Jan, Kodíček Milan, Valentová Olga; Laboratorní techniky biochemie, VŠCHT Praha, 138-139. ISBN: 80-7080-586-2.

Podstata vynálezu

Nedostatky vyplývající ze stavu techniky, jako je okamžitá rozpustnost vláken připravených z nativního hyaluronanu, jsou v tomto vynálezu vyřešeny použitím hydrofobizovaného hyaluronanu. K modifikaci hyaluronanu dochází přednostně na primárním alkoholu N-acetyl-glukosaminu, ale k acylací může též docházet na sekundárních alkoholech kyseliny glukuronové. Acylačními činidly jsou anhydridy mastných kyselin s přednostní délkou řetězce Cn - Ci₈. Stupeň substituce hydrofobizovaných hyaluronanů vhodných pro zvlákňování je pro:

-3 CZ 304303 B6 deriváty Cn - C_]2 s výhodou 30 % a vyšší deriváty Cj₃ - C₁₅ s výhodou 20 % a vyšší deriváty C,₆ - C_]g s výhodou 5 % a vyšší.

Termínem „stupeň substituce“ se rozumí počet Cn - C₁₈-arylů připojených na 100 dimerů hyaluronanu. Například 5 % znamená, že 5 z každých 100 dimerů hyaluronanu je substituováno Cn Ci₈-acyly. Při substituci je atom vodíku z primární OH skupiny N-acetyl-glukosaminu nebo ze sekundárních OH skupin kyseliny glukuronové nahrazen Cn - C_]8-acylem.

Způsob přípravy vláken na bázi hyaluronanu Cn - C]₈-acylovaného na hydroxylových skupinách kyseliny hyaluronové, s výhodou acylovaného přednostně na primárním alkoholu N-acetylglukosaminu, podle vynálezu probíhá tak, že se připraví zvlákňovací roztok obsahující acylovaný hyaluronanu o koncentraci v rozmezí 0,01 až 15 % hmotn. ve směsi vody a propan-2-olu, kde obsah vody je v rozmezí 30 až 90 % obj. obsah propan-2-olu je 10 až 70 % obj. Ve výhodném provedení se použije palmitoyl-hyaluronan. Tento zvlákňovací roztok se zavádí do koagulační lázně obsahující vodný roztok organické kyseliny nebo její soli alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, kde kyselina je vybrána ze skupiny zahrnující kyselinu mléčnou, vinnou, citrónovou, jablečnou, askorbovou, šťavelovou nebo jejich kombinaci, za vzniku vláken. Vlákna se následně promyjí alkoholem, například ethanolem, propan-l-olem nebo propan-2-olem, a suší. Případně se vlákna po promytí mohou i dloužit. Koncentrace vodného roztoku organické kyseliny v koagulační lázni je pro kyselinu mléčnou 0,5 až 30 % hmotn., pro kyselinu vinnou 0,01 až 57 % hmotn., pro kyselinu citrónovou 0,5 až 42 % hmotn., pro kyselinu jablečnou 0,5 až 50 % hmotn., pro kyselinu askorbovou 0,5 až 25 % hmotn. a pro kyselinu šťavelovou 0,5 až 60 % hmotn. S výhodou je koagulační lázeň tvořena nasyceným vodným roztokem organické kyseliny. V jednom výhodném provedení je koagulační lázeň tvořena nasyceným vodným roztokem kyseliny mléčné. Před zavedením do koagulační lázně se zvlákňovací roztok s výhodou odplyní. Teplota koagulační lázně je v rozmezí 15 až 45 °C a doba pobytu vláken v koagulační lázni je v rozmezí od 10 sekund až 24 h.

Dále se vynález týká vláken na bázi hyaluronanu Cn - C₁₈-acylovaného na hydroxylových skupinách kyseliny hyaluronové, které mají průměr 50 až 300 pm a pevnost v tahu v rozmezí 0,3 až 1 cN/dtex a tažnost v rozmezí 10 až 40 %. Vlákna se mohou použít pro výrobu pletených, tkaných nebo netkaných textilií. Textilie z vláken podle vynálezu se mohou použít například pro výrobu implantovatelných chirurgických materiálů pro humánní a veterinární medicínu.

Důležité je, že oproti derivátům popsaným v patentových spisech EP 216 453 A2, WO 93/11803, WO 98/08876, US 5 658 582, US 006632802 B2 a US 2004/0192643 Al zůstávají zachovány veškeré přítomné karboxylové skupiny kyseliny glukuronové, což jsou skupiny odpovědné za biologické vlastnosti.

Navíc je také využito nových a efektivnějších srážecích lázní se sníženou škodlivostí na lidské zdraví a životní prostředí. Jedná se o netoxické, nevýbušné a nehořlavé roztoky oproti lázním využívaným v CZ PV 2010-1001.

-4CZ 304303 B6

	třída nebezpečnosti	H věty	Pvěty
kyselina mravenči dle PV2010-1001	C, hořlavý	H226, H314	P210.P260, P280, P305+P351+P338, P301+P330+P331
kyselina octová dle PV2010-1001	C, hořlavý	H226, H314	P210.P260, P280, P305+P351+P338, P301+P330+P332
kyselina propionová dle PV2010-1001	C	H314	P280, P301+P330+P331, P305+P351+P338
	třída nebezpečnosti	H věty	P věty
kyselina citrónová	Xi	H319	P280, P305+P351+P338
kyselina D,L jablečná	Χη,Χί	H302, H318, H315, H335	P261, P280, P305+P351+P338
kyselina vinná	Xi	H319, H335, H315	P280, P305+P351+P338
kyselina mléčná	Xi	H315, K318	P280, P305+P351+P338
Kyselina askorbová
Kyselina šťavelová	Xn	H302, H312	P302+P352

Vlákna z hydrofobizovaného hyaluronanu mají ve srovnání s vlákny z nativního hyaluronanu výrazně lepší textilně-zpracovatelské vlastnosti, které jsou dány především zvýšenou tažností. V tomto řešení již nedochází k lámání vláken a je možné vlákna vyrobit v délce několika stovek metrů až kilometrů, přičemž lze vlákna dále zpracovávat běžnými textilními technikami jako je tkaní, pletení atd. na provozních strojích.

Tažnost je velmi důležitá pro zpracování vláken. Při tkaní dochází k dynamickému namáhání osnovy a útku při tvorbě prošlupu a prohozu útku. U pletení se vyskytuje dynamické namáhání nitě při odtahu cívky a utahování očka [Učební texty Technické university Liberec]. Hodnoty tažností vláken jsou převážně dány použitým acylovaným hyaluronanem a předpoklad k dobré tažností vychází zjeho chemické struktury [Rogovin Z. A. Chemie a technologie umělých vláken, 1956],

Použití nárokovaných organických kyselin jako srážecích lázní není zcela zřejmé, jelikož oproti zmiňovaným kyselinám v patentové přihlášce CZ PV2010-1001 (kyselina mravenčí, octová, propionová) se jedná o kyseliny v tuhém skupenství. Pokusy připravit vlákna pouze ve vodě nebo pouze v alkoholu nebyly úspěšné. Bylo tedy zapotřebí experimentálně vyzkoušet nejvhodnější směsi z hlediska pevnosti a tažnosti vláken, tak aby bylo možné získaná vlákna textilně zpracovávat na provozních textilních strojích.

Dalším příkladem nejednoznačnosti je i použití kyseliny mléčné jako srážecí lázně. Kyselina mléčná je běžně k dostání jako 80% vodný roztok, tento roztok je velmi viskózní, proto srážení vláken do tohoto roztoku není možné.

Experimentálně se ukázalo jako optimální toto koncentrační složení:

kyselina mléčná - s výhodou 0,5 až 30% vodný roztok kyselina vinná - s výhodou 0,01% až nasycený roztok (57%) kyselina citrónová - s výhodou 0,5% až nasycený roztok (42%) kyselina jablečná - s výhodou 0,5 až 50% kyselina askorbová - s výhodou 0,5% až nasycený roztok (25%) nebo jakákoliv kombinace výše uvedeného.

Překvapivé je, že při použití silnější kyseliny (mravenčí, citrónové, mléčné, jablečné, vinné) by se dalo očekávat, že síla kyseliny bude mít vliv na snížení molekulové hmotnosti acylovaného

-5 CZ 304303 B6 hyaluronanu (kyselá hydrolýza sacharidů). Snížení molekulové hmotnosti vede ke snížení pevnosti vláken [Hladík V., Textilní vlákna, 1970]. Ale pouze při použití vodného roztoku kyseliny mravenčí i směsi mravenčí s alkoholem (propan-2-ol) v poměru 4:1 (viz CZ PV2010-1001) se vznikající vlákna z hydrofobizovaného HA nepodařilo odvíjet pomocí navíjecích válců k dalším operacím. Vlákno se při pokusu o odvíjení (zvýšení nároků na pevnost) trhalo. Nízká pevnost je způsobená poklesem molekulové hmotnosti.

Ovšem při použití nárokovaných lázní (kyselina vinná, citrónová, mléčná, jablečná, askorbová) není pevnost nikterak nízká. Z výsledků měření na SEC-MALLS vláken připravených pomocí různých lázní vyplývá, že u vláken připravených pomocí kyseliny citrónové, mléčné, jablečné, vinné se sice Mw snižuje, ale vlastnosti vláken zůstávají zachovány.

	připraveno dle	MwHA [kDa]	p Ka	pevnost [cN/dtex]	tažnost [%]
Hydrofobizovaný hyaluronan	příkladu 1	253	-
kyselina mravenčí	příkladu 25	88	3,75	nebylo možné proměřit
Kyselina octová	příkladu 26	167	4,76	5,60	16,13
Kyselina propionové	příkladu 24	193	4,88	3,00	11,00
kyselina askorbová	příkladu 10	120	4,1	9,37	21,07
Kyselina mléčná	příkladu 12	137	3,86	5,77	21,90
Kyselina jablečná	příkladu 11	130	3,46	7,50	25,83
Kyselina citrónová	příkladu 5	106	3,15	7,80	20,53
Kyselina vinná	příkladu 8	95	3,01	4,93	16,49

Podstata vynálezu tedy spočívá ve využití uvedených hydrofobizovaných hyaluronanů v kombinaci s uvedenými lázněmi, díky čemuž tato vlákna vykazují nové, vylepšené vlastnosti v podobě nerozpustných, biodegradabilních nekonečných vláken se zvýšenou tažnosti. Díky tomuto lze tato vlákna zpracovávat běžnými textilními technologiemi, jako je tkaní, pletení atd. Zpracování je možné na běžných provozních zařízeních (příklad 29), což doposud s vlákny z nativního HA nebo z derivátů HA nebylo možné. V patentové přihlášce CZ PV 2010-1001 jsou uvedeny prakticky pouze ručně vytvořené tkaniny. Ale na vlákna zpracovávaná textilními stoji jsou kladeny vyšší nároky na pevnosti a především tažnosti.

Z hlediska odbouratelnosti v organismu se jako nejvýhodnější výchozí acylovaný hyaluronan jeví palmitoyl hyaluronan. Kyselina palmitová je součástí živočišného (tělesného) tuku. Palmitátový řetězec se běžně v těle odbourává β—oxidací.

Vlákna jsou připravována pomocí technologie mokrého zvlákňování (wet spinning). Specifické pro přípravu těchto vláken jsou koagulační lázně, které jsou složeny z:

- vodných roztoků organických kyselin

- vodných roztoků solí organických kyselin

- nebo jakákoliv kombinace výše uvedených

Koncentrace roztoků pro přípravu vláken se pohybuje od 0,01% až po nasycené. S výhodou se využívá nasycených roztoků.

Vlákna získaná ze srážecí lázně jsou dále promývána nižším alkoholem (ethanol, propan-l-ol, propan-2-ol) a s výhodou mohou být dloužena. Získaná vlákna mají v průměru 50 až 300 pm, dle použitých vláknících parametrů (vláknící tryska, extruzní rychlost a rychlost navíjení, poměr dloužení) ajsou vyráběna jako nekonečné monofilamenty a dále zakrucována do formy skaných

-6CZ 304303 B6 kabílků vhodných pro strojové zpracování textilními technikami. Vlákna jsou ve vodě nerozpustná, pouze botnají. Nevykazují cytotoxické vlastnosti a jsou enzymaticky degradovatelná. Pevnost i tažnost je vyhovující pro jejich další zpracování, jako je zakrucování do nití nebo pro přípravu pletených, tkaných či netkaných textilií.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje monofil připravený dle příkladu 12, zobrazený pomocí skenovací elektronové mikroskopie.

Obr. 2 a obr. 3 znázorňují grafy vypovídající o vlivu acylovaných hyaluronanů využívaných k výrobě vláken na viabilitu buněk. Konkrétně obr. 2 znázorňuje výsledky z testů vlivu palmitoylu hyaluronanu připraveného dle příkladu 1 na viabilitu. V grafu je vynesena viabilita buněk (v procentech kontroly v čase 0) v závislosti na čase (hodiny). Obrázek 3 znázorňuje výsledky z testů vliv palmitoylu hyaluronanu připraveného dle příkladu 4 na viabilitu. V grafu je vynesena viabilita buněk (v procentech kontroly v čase 0) v závislosti na čase (hodiny).

Obr. 4 až 8 znázorňují grafy vypovídající o výsledcích vlivu vláken získaných z různých srážecích lázní na viabilitu buněk. Konkrétně obr. 4 znázorňuje výsledky vlivu vláken připravených podle příkladu 3 (srážecí lázeň vodný roztok kyseliny citrónové) na viabilitu buněk, obr. 5 znázorňuje výsledky vlivu vláken připravených podle příkladu 12 (srážecí lázeň vodný roztok kyseliny mléčné) na viabilitu buněk, obr. 6 znázorňuje výsledky vlivu vláken připravených podle příkladu 8 (srážecí lázeň vodný roztok kyseliny vinné) na viabilitu buněk, obr. 7 znázorňuje výsledky vlivu vláken připravených podle příkladu 11 (srážecí lázeň vodný roztok kyseliny jablekné) na viabilitu buněk.

Obr. 8 znázorňuje graf vypovídající o vlivu degradačních produktů vláken na viabilitu buněk.

Obr. 9 znázorňuje nitě z palmitoylu hyaluronanu. Vlevo nit ze dvou monofilů, vpravo nit ze tří monofilů.

Obr. 10 znázorňuje ukázku zpracování vláken z hydrofobního hyaluronanu do zátažné jedno lícní pleteniny (bílá část).

Obr. 11 znázorňuje ukázku zpracování vláken z hydrofobního hyaluronanu do zátažné oboulícní pleteniny.

Obr. 12 znázorňuje ukázku zpracování vláken z hydrofobního hyaluronanu do tubulámí pleteniny.

Příklady provedení vynálezu

Molekulová hmotnost byla měřena pomocí HPLC od firmy Shimadzu, který je doplněn detektorem rozptylu světla miniDAWN firmy Watt Technologies (tzv. metoda SEC-MALLS). Pokud není uvedeno jinak, uvedené molekulové hmotnosti jsou hmotnostně střední.

Identifikace a stanovení stupně substituce bylo provedeno pomocí NMR. Stupeň substituce (DS) byl vypočten z integrálu signálů příslušného substituentu (tzn. C16 acyl) a signálu CH₃-G1cN při 2,0 ppm. Stupeň substituce 100 % odpovídá navázání jednoho substituentu na jednu dimerovou jednotku hyaluronanu. NMR spektra acylovaných hyaluronanů byla naměřena na BRUKER AVANCE 500 (500 MHz) v D₂O, ve směsi D₂O/2—propanol—d₈ v poměru 4:1. Chemické posuny byly kalibrovány vůči vnitřnímu standardu deuterované 3-trimethylsilylpropanové kyselině (TSPA). Byla proměřena tato spektra: ‘H NMR, ¹³C NMR, HH COSY, HSQC a DOSY-NMR.

-7CZ 304303 B6

Pro zpracování experimentálních dat byl použit software firmy Bruker TOPSPIN 1.2 a software Spin Works 3.1.

Acylované hyaluronany (palmitoylhyaluronan, stearoylhyaluronan) byly připravovány obdobným způsobem dle příkladu 1. Stupeň substituce se řídí použitými ekvivalenty, uvedené rozmezí je následující:

HDA 0,5 eq	HDA 1 eq	HDA 2 eq
DS <12 %	DS 12% až 30%	DS 35 % až 55 %

Acylované undekanoylhyaluronanu byly připraveny obdobným způsobem dle příkladu 2.

Snímky ze skenovacího elektronového mikroskopu byly pořízeny na přístroji Tescan VEGA II LSU s wolframovou katodou a maximálním rozlišení 3 mm. Urychlovací napětí primárního svazku bylo 5 kV, pracovní vzdálenost 3 až 4 mm snímky byly pořízeny v režimu vysokého vakua.

Příklad 1

Hyaluronan sodný (15 g; 250 kDa) byl rozpuštěn ve 300 ml destilované vody, po úplném rozpuštění hyaluronanu sodného (HA-Na) bylo k roztoku přidáno 300 ml tetrahydrofuranu (THF). Poté byl do roztoku přidán triethylamin (TEA) (2,5 eq), dimethylaminopyridin (DMAP) (0,04 eq) a anhydrid kyseliny palmitové (HDA) (2 eq). Tento roztok byl míchán 2 h při laboratorní teplotě a poté 0,5 h při 45 °C (teplota roztoku). Do homogenního roztoku bylo následně přidáno 300 ml destilované vody s 5 eq NaCI (vztaženo na HA-Na) a 300 ml destilované vody na vypláchnutí reakční baňky. Roztok byl promíchán a posléze vysrážen 900 ml 100% propan-2-olem, promyt lx 100% propan-2-olem (500 ml) a 4x 80% propan-2-olem (500 ml) a 2x 100% propan-2-olem (500 ml). Vlhký palmitoyl hyaluronan byl sušen v sušárně 48 hodin při 40 °C. Vykazoval stupeň substituce 36 % (stanoveno z NMR) a Mw 250 kDa.

Příklad 2

5,0 g hyaluronanu sodného (12,5 mmol, 250 kDa) bylo rozpouštěno ve 100 ml destilované vody. Poté bylo přidáno 70 ml THF. Poté se do roztoku přidaly TEA (7,0 ml; 4 eq.) a DMAP (153,0 mg; 0,1 eq.). Současně byla rozpuštěna kyselina undekanová (9,3 g; 4 eq) v 30 ml THF, poté se do roztoku přidal TEA (7,0 ml; 4 eq.) a ethyl-chlorformiát (4,76 ml, 4 eq.). Aktivace kyseliny probíhala při 0 až 5 °C po dobu 15 min. Po aktivaci kyseliny byla sraženina, tj. směsný anhydrid kyseliny undekanové a ethyl-chlorformiátu, zfiltrována do připraveného roztoku HA. Reakce probíhala po dobu 5 h při pokojové teplotě. Poté se reakční směs naředila 50 ml vody s přídavkem 4,0 g NaCI. Acylovaný hyaluronan byl z reakční směsi izolován srážením za použití 4-násobku absolutního propan-2-olu. Po dekantací se sraženina opakovaně promyla nejprve vodným roztokem propan-2-olu (80% obj.) a potom absolutním propan-2-olem. Sraženina byla poté sušena po dobu 48 h při teplotě 40 °C. Stanovený stupeň substituce byl 37 % (stanoveno z NMR).

Příklad 3

Navážka 1 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 36 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 10 ml demi vody a 10 ml propan-2-olu. Vzniklý 5,3% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μίτηϊη“¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil nasycený vodný roztok kyseliny citrónové o laboratorní teplotě.

-8CZ 304303 B6

Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 ηιτηίη'¹ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec zčásti ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo k promývání, cca 1 h.

Příklad 4

Navážka 1,3 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 15 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 10 ml demi vody a 10 ml propan-2-olu. Vzniklý 6,8% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 pbmin“¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil nasycený vodný roztok kyseliny citrónové o laboratorní teplotě. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 ηνηιίη'¹ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec zčásti ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo k promývání, cca 1 h.

Příklad 5

Navážka 1,32 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 46 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 11 ml demi vody a 11 ml propan-2-olu. Vzniklý 6,3% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μίτηίη ¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil nasycený vodný roztok kyseliny citrónové o laboratorní teplotě. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 mmin“¹ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec zčásti ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo k promývání, cca 1 h.

Příklad 6

Navážka 0,95 g stearoylu hyaluronanu o stupni substituce 35 % a Mw 130 kDa byla rozpuštěna ve směsi 10 ml demi vody a 10 ml propan-2-olu. Vzniklý 5% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μίτηίη“¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil nasycený vodný roztok kyseliny citrónové o laboratorní teplotě. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 nrmin“’ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec zčásti ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo k promývání, cca 1 h.

Příklad 7

Navážka 0,5 g undekanoylu hyaluronanu o stupni substituce 37 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 10 ml demi vody a 10 ml propan-2-olu. Vzniklý 2,7% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μίτηίη“¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil nasycený vodný roztok kyseliny citrónové o laboratorní teplotě. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 nrmin“¹ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec z části ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo k promývání, cca 1 h.

Příklad 8

Navážka 1,32 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 46 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 11 ml demi vody a 11 ml propan-2-olu. Vzniklý 6,3% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μίτηίη ¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil nasycený vodný roztok kyseliny vinné o laboratorní teplotě. Vlák-9CZ 304303 B6 no procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 m-min ¹ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec z části ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo k promývání, cca 1 h.

Příklad 9

Navážka 1,1 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 52 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 10 ml demi vody a 10 ml propan-2-olu. Vzniklý 5,7% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μΙ-min”¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil nasycený vodný roztok kyseliny citrónové o laboratorní teplotě. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní lychlostí 1,2 m-min ¹ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec zčásti ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo k promývání, cca 1 h.

Příklad 10

Navážka 1,32 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 46 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 11 ml demi vody a 11 ml propan-2-olu. Vzniklý 6,3% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μΙ-min”¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil nasycený vodný roztok kyseliny askorbové o laboratorní teplotě. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 m-min”¹ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec zčásti ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo k promývání, cca 1 h.

Příklad 11

Navážka 1,32 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 46 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 11 ml demi vody a 11 ml propan-2-olu. Vzniklý 6,3% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μΙ-min”¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil 50% vodný roztok kyseliny jablečné o laboratorní teplotě. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 m-min”¹ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec zčásti ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo kpromývání, cca 1 h.

Příklad 12

Navážka 1,32 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 46 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 11 ml demi vody a 11 ml propan-2-olu. Vzniklý 6,3% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μΙ-min”¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil 20% vodný roztok kyseliny mléčné o laboratorní teplotě. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 m-min ¹ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec zčásti ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo kpromývání, cca 1 h.

Příklad 13

Navážka 1,32 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 46 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 11 ml demi vody a 11 ml propan-2-olu. Vzniklý 6,3% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μΙ-min”¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil 20% vodný roztok kyseliny mléčné o laboratorní teplotě. Vlákno

- 10CZ 304303 B6 procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 nr min ¹ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec z části ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo k promývání, cca 1 h. Poslední válec byl od předposledního urychlen na 1,4 nrmin', docházelo tedy k dloužení vláken asi o 20 %.

Příklad 14

Navážka 1,32 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 46 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 11 ml demi vody a 11 ml propan-2-olu. Vzniklý 6,3% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μίτηίη ¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil 50% vodný roztok kyseliny šťavelové. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 nrmin¹ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec z části ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo k promývání, cca 1 h.

Příklad 15

Navážka 1,3 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 15 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 10 ml demi vody a 10 ml propan-2-olu. Vzniklý 6,8% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μίτηίη ¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil roztok kyseliny mléčné ve složení: 80 % hmotn. propan-2-ol, 18 % hmotn. kyselina mléčná, 2 % hmotn. voda o laboratorní teplotě. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 nrmin ¹ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec z části ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo k promývání, cca 1 h.

Příklad 16

Navážka 0,95 g stearoylu hyaluronanu o stupni substituce 35 % a Mw 130 kDa byla rozpuštěna ve směsi 10 ml demi vody a 10 ml propan-2-olu. Vzniklý 5% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μίτηίη ¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil roztok kyseliny mléčné ve složení: 80 % hmotn. propan-2-ol, 18 % hmotn. kyselina mléčná, 2 % hmotn. voda o laboratorní teplotě. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 nrmin ¹ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec z části ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo k promývání, cca 1 h.

Příklad 17

Navážka 0,5 g undekanoylu hyaluronanu o stupni substituce 37 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 10 ml demi vody a 10 ml propan-2-olu. Vzniklý 2,7% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μίτηίη“¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil roztok kyseliny mléčné ve složení: 80 % hmotn. Propan-2-ol, (100%), 18 % hmotn. kyselina mléčná, 2 % hmotn. voda o laboratorní teplotě. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 nrmin“¹ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec z části ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo k promývání, cca 1 h.

Příklad 18

Navážka 1,3 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 15 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 10 ml demi vody a 10 ml propan-2-olu. Vzniklý 6,8% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μίτηίη¹ přiváděn do koagulační

- 11 CZ 304303 B6 lázně. Koagulační lázeň tvořil roztok o složení 33 % hmotn. kyseliny benzoové a 67 % hmotn. propan-2-olu o laboratorní teplotě. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 nrmin ¹a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec z části ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo k promývání, cca 1 h.

Soli organických kyselin

Příklad 19

Navážka 1 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 36 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 10 ml demi vody a 10 ml propan-2-olu. Vzniklý 5,3% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μίτηϊη”¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil nasycený vodný roztok citronanu (tri)sodného o laboratorní teplotě. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 nrmin”¹ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec z části ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo k promývání, cca 1 h.

Příklad 20

Navážka 1 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 36 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 10 ml demi vody a 10 ml propan-2-olu. Vzniklý 5,3% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μίττιίη¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil nasycený vodný roztok octanu hořečnatého o laboratorní teplotě. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 nrmin ¹ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec zčásti ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo k promývání, cca 1 h.

Příklad 21

Navážka 1 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 36 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 10 ml demi vody a 10 ml propan-2-olu. Vzniklý 5,3% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μίτηϊη¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil nasycený vodný roztok octanu sodného o laboratorní teplotě. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 nrmin ¹ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a do nádoby obsahující 100% propan-2-olu, kde docházelo k promývání, cca 1 h.

Srovnávací příklady 22 až 24

Příklad 22

Srovnání s lázní použitou v dokumentech WO 93/11803, WO 98/08876, US 5658582, US 006632802 B2, US 2004/0192643 Al.

Navážka 1 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 36 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 10 ml demi vody a 10 ml propan-2-olu. Vzniklý 5,3% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μίτηϊη ¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil roztok absolutního ethanolu. Vzniklé vlákno nebylo možné odtahovat soustavou navíjecích válců, jelikož docházelo kjeho trhání. Podařilo se získat maximálně 100 mm dlouhé kousky, které byly vytaženy pomocí pinzety.

- 12CZ 304303 B6

Příklad 23

Srovnání s lázní použitou v dokumentech WO 2009/050379, CZ PV 2010-1001.

Navážka 1,32 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 46 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 11 ml demi vody a 11 ml propan-2-olu. Vzniklý 6,3% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μίτηίη ¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil alkoholový roztok o složení 98% kyseliny octové a 100% propan2-olu (obj. poměr 4:1) o laboratorní teplotě. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí l,2nrmin^_1 a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec zčásti ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo k promývání, cca 1 h.

Příklad 24

Srovnání s lázní použitou v dokumentu CZ PV 2010-1001.

Navážka 1,32 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 46 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 11 ml demi vody a 11 ml propan-2-olu. Vzniklý 6,3% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μΐιη in¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil alkoholový roztok o složení 98% kyseliny mravenčí a 100% propan-2-olu (obj. poměr 4:1) o laboratorní teplotě. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 nrmin ¹ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno. Při odtahu se vlákno velmi často trhalo (nedostatečná pevnost) byly získány 300 mm kousky.

Příklad 25

Navážka 1,32 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 46 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 11 ml demi vody a 11 ml propan-2-olu. Vzniklý 6,3% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 pfmiif¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil vodný roztok o složení 98% kyseliny propionové o laboratorní teplotě. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 nrmin ¹ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec z části ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo k promývání, cca 1 h.

Příklad 26

Navážka 1,32 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 46 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 11 ml demi vody a 11 ml propan-2-olu. Vzniklý 6,3% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μίτηίη ¹ přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil vodný roztok o složení 98% kyseliny octové o laboratorní teplotě. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 nrmin ¹ a pomocí soustavy navíjecích válců bylo odtahováno a navíjeno na válec zčásti ponořený do 100% propan-2-olu, kde docházelo k promývání, cca 1 h.

Příklad 27

Navážka 1,32 g palmitoylu hyaluronanu o stupni substituce 46 % a Mw 250 kDa byla rozpuštěna ve směsi 11 ml demi vody a 11 ml propan-2-olu. Vzniklý 6,3% roztok byl odplyněn centrifugací a pomocí dávkovače NEXUS 6000 byl extruzní rychlostí 200 μίτηίη^-1 přiváděn do koagulační lázně. Koagulační lázeň tvořil vodný roztok o složení 98% kyseliny mravenčí o laboratorní teplotě. Vlákno procházelo 0,4 m dlouhou lázní rychlostí 1,2 nrmin ¹ a pomocí soustavy navíjecích

- 13 CZ 304303 B6 válců bylo odtahováno. Při odtahu se vlákno velmi často trhalo (nedostatečná pevnost) byly získány 300 mm kousky.

Příklad 28

Biodegradabilita vláken byla testována v prostředí enzymů hyaluronidázy (bovinní testikulámí hyaluronidázy, Sigma Aldrich) a esterázy (esteráza z králičích jater, Sigma Aldrich).

Metodou sledování degradace vláken v přítomnosti enzymů je stanovení rozpustného podílu (oligosacharidů hyaluronanu) pomocí Somogyiho - Nelsonova činidla [9], Při stanovení enzymatické degradace vláken bylo postupováno následovně:

Vlákna připravená obdobným způsobem jako v příkladu 12, byla odměřena na konstantní délku 400 mm, při konstantní hmotnosti 100 mg, smotána do panenky, vložena do 500 μΐ mikrozkumavky eppendorf a zalita sterilním PBS po dobu 24 hodin, aby se vlákna propláchla. Po odsátí proplachového PBS byla zkumavka doplněna čerstvým pufrem (500 μΐ). Od každého vlákna byly připraveny vždy 3 vzorky:

A) vlákno jen v PBS (kontrola):

B) vlákno v PBS s bovinní testikulámí hyaluronidázou (200 U)

C) vlákno v PBS s hyaluronidázou (BTH; 200 U) a s králičí jatemí esterázou (CHE; 20 U).

Protože i enzymy mohou být zdrojem redukujících konců, byla pro všechna vlákna připravena ještě kontrola na pozadí, tj. samotný PBS, PBS+BTH a PBS+BTH+CHE. Absorbance pozadí byla při měření odečítána od absorbance vzorků s vlákny.

Po přidání enzymů k vláknům a po promíchání byly odebírány vzorky v časech 0, 2, 4 a 6 hodin. Odebrané vzorky (60 μΐ) byly uloženy do -20 °C v 200 μΐ mikrozkumavkách. Před vlastní analýzou byly vzorky podrobeny tepelné degradaci (60 minut, 100 °C), aby byl minimalizován vliv různé MW odštěpených fragmentů. Volné redukující konce byly stanoveny reakcí se Somogyiho a Nelsonovým činidlem [9] v následující modifikaci: 50 μΐ vzorku bylo smícháno se stejným objemem čerstvě připraveného Somogyiho činidla. Směs byla po promíchání 15 minut inkubována vtermobloku při 100 °C. Po ochlazení bylo přidáno 100 μΐ Nelsonova činidla, vzorky byly promíchány, krátce odstředěny, 125 μΐ barevného produktu bylo přeneseno do mikrotitrační 96jamkové destičky a byla změřena absorbance při 540 nm. Po odečtení pozadí byly z kalibrační přímky zjištěny hodnoty ekvivalentů glukózy (= počet volných redukujících konců).

- 14CZ 304303 B6

Výsledky z degradací - závislost rychlosti enzymatické degradace na stupni substituce acylovaného hyaluronanu

			koncentrace volných redukujících konců (mM)
acylovaný hyaluronan	st substituce	lázeň srážecí	Ohod	2 hod	4 hod	6 hod
Palmitoyl HA	15 %	20% vodný roztok kyseliny mléčné	0,0026	0,8271	0,9501	1,2202
Palmitoyl HA	36%	20% vodný roztok kyseliny mléčné	0	0,1826	0,3464	0,3826
Palmitoyl HA	52%	20% vodný roztok kyseliny mléčné	0,0026	0,2014	0,2764	0,2943
Stearoyl HA	37%	20% vodný roztok kyseliny mléčné	0,86	0,182	0,23	0,302
Undekanoyl HA	37%	20% vodný roztok kyseliny mléčné	0,129	0,469	0,578	0,585

Závěrem tedy je, že připravená vlákna jsou biodegradabilní. Rychlost degradace je dána použitým acylovaným hyaluronanem ajeho stupněm substituce.

Příklad 29

Cytotoxicity acylovaných hyaluronanů a vláken byly sledovány pomocí MTT testu na kultuře myších kožních fibroblastů 3T3 po dobu 72 hodin. Acylovaný hyaluronan i vlákna byly naváženy a v laminámím boxu byly ponořeny do izopropanolu, dokud nebyl izopropanol odpařen. Suché acylované hyaluronany/vlákna jsou transportovány do růstového média (3600 pg/ml vláken a 1000 pg/ml acylovaného hyaluronanu) a ponechána přes noc botnat. Vlákna byla rozmixovaná ultraturaxem do získání homogenní suspenze. Další testovací možností byl také extrakt z vláken nebo filtrát směsi, přefiltrovaný přes lOOprn filtr. Avšak tyto úpravy neměly vliv na viabilitu, proto byla další vlákna testována pouze jako rozmixovaná suspenze.

Z výsledků viabilitních zkoušek vyplývá, že ani acylovaný hyaluronan ani připravená vlákna nijak signifikantně neovlivňují viabilitu buněk.

Příklad 30

Vlákna byla degradována za použití enzymů hyaluronidázy a esterázy. Ke 20 mg smotkům vláken v 750 μΐ PBS bylo přidáno 20 U esterázy a 200 U hyaluronidázy. Vlákna s enzymy byla ponechána 72 hodin při teplotě 37 °C. Následně byla tato směs použita k ovlivnění buněk. Testované koncentrace byly dle koncentrace vláken, z níž byl připravený supernatant, 1000, 500 a 100 pg/ml. Buněčná linie a postup testů viabilit je stejný jako v příkladu 25. Byla provedena 3 nezávislá opakování a data byla statisticky vyhodnocena Studentovým testem.

Z výsledků viability degradačních produktů vyplývá, že ani degradační produkty vláken nijak signifikantně neovlivňují viabilitu buněk.

Výsledky z testů viability degradačních produktů, kde:

- 15CZ 304303 B6

označení	Vlákno dle příkladu	lázeň
a	3	Vodný roztok kyseliny citrónové
b	8	Vodný roztok kyseliny vinné
c	12	Vodný roztok kyseliny mléčné
k	kontrola	Vlákno z nativního hyaluronanu

Příklad 31

Mechanicky byla vlákna testována v tahu, na jednostupňovém trhacím stroji Instrom 3343, použitá hlava 100 N. Během zkoušky dochází nejprve k přednapnutí vlákna rychlostí 1 mm · min ¹ až do síly 0,05 N. Po napnutí jsou síla i deformace automaticky vynulovány, následně proběhne zkouška, rychlostí 10 mm · min ¹ až do přetrhu vlákna. Tahové zkoušky probíhaly při laboratorní ío teplotě a laboratorní relativní vlhkosti.

Pevnost a deformace při přetrhu byly brány z mediánu alespoň 5 platných měření. Vlákna dosahují pevnosti 3 až 10 cN · dtex¹ v závislosti na koncentraci acylovaného hyaluronanu a na stupni substituce acylovaného hyaluronanu, a také na míře dloužení. Deformace dosahuje hodnot 5 až

40 % v závislosti na výše uvedených parametrech. Uvedené hodnoty pevností a tažností v tabulkách jsou střední.

	připraveno dle	Mw HA [kDa]	p Ka	pevnost [cN/dtex]	tažnost [%1
Hydrofobizovaný HA	příkladu 1	253	-	-
kyselina mravenčí	příkladu 27	88	3,75	nebylo možné proměřit
Kyselina octová	příkladu 26	167	4,76	0,56	16,13
Kyselina propionová	příkladu 25	193	4,88	0,30	11,00
kyselina askorbová	příkladu 10	120	4,1	0,94	21,07
Kyselina mléčná	příkladu 12	137	3,86	0,58	21,90
Kyselina jablečná	příkladu 11	130	3,46	0,75	25,83
Kyselina citrónová	příkladu 5	106	3,15	0,78	20,53
Kyselina vinná	příkladu 8	95	3,01	0,49	16,49

Tabulka s hodnotami pevnosti a deformace vláken z palmitoylu hyaluronanu připravených obdobným způsobem jako v příkladu 12 a 13.

Lázeň	Dle příkladu	Koncentrace [%]	st. substituce [%]	Jemnost [tex]	Pevnost cN/dtex	Tažnost [%i -
20 % vodný roztok mléčné	13	5,7	52	12,2	0,93	39
20 % vodný roztok mléčné	12	7	15	16,3	0,56	13
20 % vodný roztok mléčné	12	7,4	8	16,1	0,47	5
20 % vodný roztok mléčné	12	6	41	15	0,55	37
20 % vodný roztok mléčné	12	6	36	17	0,47	29
20 % vodný roztok mléčné	13	6,3	48	11,2	0,86	20
20 % vodný roztok mléčné	13	6,3	48	11	0,86	17

-16CZ 304303 B6

Z měření mechanických vlastností vláken a experimentálních zkoušek vyplývá, že vlákna jsou schopná textilního zpracování.

Příklad 32

Vlákna z palmitoylu hyaluronanu (vlákna připravená obdobným způsobem jako je uvedeno v příkladu 12) byla seskána na skácím zařízení při otáčkách vřetene 1400 ot · min ¹ a rychlosti podávání monofilamentu 4 nrmin“’. Nitě z palmitoylu hyaluronanu jsou znázorněny na obr. 9.

Příklad 33

Vlákna, připravená obdobným způsobem jako v příkladu 12 byla textilně zpracována na provozním plochém zátažném pletacím stroji Shima-Seiki s automatickou volbou jehel do formy zátažné jednolícní pleteniny (obrázek 10) a dále pak do formy zátažné oboulícní pleteniny (obrázek 11).

Vlákna, připravená obdobným způsobem jako v příkladu 12, byla textilně zpracována na provozním okrouhlém zátažném pletacím stroji Harry Lucas do formy okrouhlé pleteniny (obrázek 12).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy vláken na bázi hyaluronanu Cn - Cig-acylovaného na hydroxylových skupinách hyaluronanu, vyznačující se tím, že se připraví zvlákňovací roztok obsahující acylovaný hyaluronan o koncentraci v rozmezí 0,01 až 15 % hmotn. ve směsi vody a propan-2olu, kde obsah vody je v rozmezí 30 až 90 % obj. obsah propan-2-olu je 10 až 70 % obj., načež se zvlákňovací roztok zavádí do koagulační lázně obsahující vodný roztok organické kyseliny nebo její soli alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, kde kyselina je vybrána ze skupiny zahrnující kyselinu mléčnou, vinnou, citrónovou, jablečnou, askorbovou, šťavelovou nebo jejich kombinaci, za vzniku vláken, která se následně promyjí alkoholem a suší.
2. Způsob přípravy podle nároku 1, vyznačující se tím, že hyaluronan je acylovaný přednostně na primárním alkoholu N-acetyl-glukosaminu.
3. Způsob přípravy podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že hyaluronan je vybrán ze skupiny zahrnující hyaluronany Cn -C^-acylované se stupněm substituce 30 % a vyšším, C₁₃ - Ci₅-acylované se stupněm substituce 20 % a vyšším, a C_]6 - C₁₈-acylované se stupněm substituce 5 % a vyšším.
4. Způsob přípravy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že hyaluronan je palmitoyl hyaluronan.
5. Způsob přípravy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že koncentrace vodného roztoku organické kyseliny v koagulační lázni je pro kyselinu mléčnou 0,5 až 30 % hmotn., pro kyselinu vinnou 0,01 až 57 % hmotn., pro kyselinu citrónovou 0,5 až 42 % hmotn., pro kyselinu jablečnou 0,5 až 50 % hmotn., pro kyselinu askorbovou 0,5 až 25 % hmotn., pro kyselinu šťavelovou 0,5 až 60 % hmotn.

- 17CZ 304303 B6
6. Způsob přípravy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že koagulační lázeň je tvořena nasyceným vodným roztokem organické kyseliny.
7. Způsob přípravy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že koagulační lázeň je tvořena nasyceným vodným roztokem kyseliny mléčné.
8. Způsob přípravy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se zvlákňovací roztok před zavedením do koagulační lázně odplyní.
9. Způsob přípravy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že teplota koagulační lázně je v rozmezí od 15 do 45 °C a doba pobytu vláken v koagulační lázni je v rozmezí od 10 sekund až 24 h.
10. Způsob přípravy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se vlákna promyjí alkoholem vybraným ze skupiny zahrnující ethanol, propan-l-ol a propan-2ol.
11. Způsob přípravy podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se vlákna po promytí alkoholem dlouží.
12. Vlákno na bázi hyaluronanu Cn - Ci₈-acylovaného na hydroxylových skupinách hyaluronanu, vyznačující se tím, že má průměr 50 až 300 pm a pevnost v tahu v rozmezí 0,3 až 1 cN/dtex a tažnost v rozmezí 10 až 40 %.
13. Použití vlákna definovaného v nároku 12 pro výrobu pletených, tkaných nebo netkaných textilií.
14. Textilie na bázi vláken definovaných v nároku 12.
15. Použití textilií na bázi vláken definovaných v nároku 12 pro výrobu implantovatelných chirurgických materiálů pro humánní a veterinární medicínu.