KR20210005945A - 진피 충전제 및 이의 적용 - Google Patents
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Abstract
본원의 개시내용은 광개시된 진피 충전제, 히알루론산-rh콜라겐 이중 가교된 진피 충전제 및 히알루론산-rh콜라겐 반상호투과 네트워크(semi interpenetrated network), 뿐만 아니라 이들의 사용 방법에 관한 것이며, 각각은 식물-유래 인간 콜라겐을 포함한다.
Description
식물-유래 인간 콜라겐, 및 세포성 성장 촉진 스캐폴드(scaffold)를 포함하는 광개시된 및 이중 가교된 진피 충전제, 뿐만 아니라 일부 경우 연조직 강화를 위해 진피 충전제를 사용하는 방법이 본원에 개시된다.
콜라겐은 척추동물 및 많은 다른 다세포 유기체의 구조적 온전성에 책임이 있는 주요 단백질이다. 콜라겐은 결합 조직의 주요 구성요소를 포함하고, 신체에서 발견되는 단백질 중 대략 30%를 포함하여 포유류에서 가장 풍부한 단백질이다. 콜라겐의 손실 또는 악화는 노화 또는 상해의 결과로서 발생할 수 있다(문헌[Olsen 등, Adv Drug Deliv Rev. 2003 Nov. 28; 55(12):1547-67]).
노화의 하나의 보편적인 양태는 주름(line), 잔주름(fine line), 또는 주름살(wrinkle)의 발달이다. 조직-추출 콜라겐의 사용을 수반하는 치료는 주름, 잔주름, 또는 주름살을 감소시키거나 없애는 데 사용되어 왔다. 유사한 치료는 흉터를 감소시키는 데 사용되어 왔다.
콜라겐은 또한, 힘줄의 구성요소이다. 통상 운동 및 신체 활동과 관련된 보편적인 상해인 건병증(tendinopathy)은 힘줄의 콜라겐 섬유의 변성 및 잘못된 배열(disordered arrangement)과 관련이 있다. 상해를 입은 힘줄의 치유는 특정 세포의 조화된 활성 및 상해 부근에서 관련 성장 인자(GF)의 연장된 존재를 필요로 한다. 건병증은 현재 근골격병에 대한 주된 이유이다(문헌[Kaux 등(Jan. 2011) J. Sport. Sci. Med. January:238-253]). 건병증은 힘줄 및 인대에서 그리고 그 주위에서 발병하는 여러 가지 통증성 상태를 지칭하며, 이는 힘줄의 과용으로 인한 병리학적 변화와 결과적인 재생 반응 사이의 불균형으로부터 발생하는 경향이 있다(문헌[Andres 등 (2008) Clin. Orthop. Relat. Res. 466:1539-1554]). 건병증은 콜라겐의 변성 및 잘못된 배열과 관련이 있으며(문헌[Maffulli 등 (2003) Clin. Sport. Med. 22:675-692]), 이따금 섬유 미세 인열, 혈관질(vascularity)의 증가 및 경미한 염증의 존재와 관련이 있다(문헌[Khan 등 (1999) Sport. Med. 27(6):393-408]). 임상적으로, 건병증은 힘줄 강성의 개시, 활동-관련 통증, 기능성 저하 및 이따금 국소화된 팽윤을 특징으로 한다(문헌[Kaux 2011; Andres 2008]). 콜라겐 섬유는 정상적인 밀착적이며 평행하고 다발로 된 외양 대신에 동일하지 않고 불규칙한 주름형성(crimping), 이완(loosening), 및 증가된 파형(waviness)을 제시한다(Mafulli 2003). 집단이 더 고령에서 활동적이기 때문에, 힘줄 상해의 발생률은 다가오는 수십년 이내에 상승할 것으로 예상된다. 물리치료법, 약리학적 치료 및 이들의 조합을 포함하여 건병증에 대한 광범위하게 다양한 치료가 이용 가능하지만, 임상 결과는 만족할 만하지 않고 증상의 재발이 보편적이다(Kaux 2011). 건병증의 치료를 위한 자가 혈소판 풍부 혈장(PRP)의 주사는 지난 수십년간 광범위한 관심을 받았다(문헌[Delong 등 (2016) Curr. Orthpaedic Pract. 22:514-523]; [Kaux 등 (2012) Wound Repair Regen. 20:748-756]; [Yuan 등 (2013) Muscles. Ligaments Tendons J. 3(3):139-49]; [Di Matteo 등 (2015) Musculoskelet. Surg. 99(1):1-9]). PRP는 고농도의 혈소판을 함유하는 혈액의 혈장 분획이다. 상해를 입은 부위에 주사 시, 혈소판은 치유 과정을 촉진하는 것으로 생각되는 다양한 유형의 성장 인자(GF)를 방출한다. PRP-관련 GF 중에서, 혈관-내피 성장 인자(VEGF), 형질전환 베타 성장 인자(TGF-베타), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 혈소판 유래 표피 성장 인자(PDEGF), 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 표피 성장 인자(EGF) 및 간세포 성장 인자(HGF)가 보고되었다(Delong 2016; Yuan 2013; 문헌[Harrison 등 (2011) Am. J. Sports Med. 39(4):729-734]). 많은 시험관내 연구 및 생체내 모델은, PRP 치료가 콜라겐 발현 및 세포외 기질 성장을 증강시키며, 혈관신생을 자극하고, 세포 이동, 분화 및 증식을 증가시켜, 힘줄 상해의 치유를 지지함을 보여준다(Yuan 2013; 문헌[Kajikawa 등(2008) J. Cell. Physiol. 215(3):837-845]; 문헌[Zhang 등 (2010) Am. J. Sports Med. 38(12):2477-2486]). 그러나, PRP 치료의 효능의 명확한 임상 증거는 제한되어 있다(Delong 2016; Yuan 2013; Moraes 등 (2014)).
콜라겐은 대부분의 조직 세포외 기질(ECM)의 우세한 구성요소 및 1차 구조-기계적 결정인자로서 역할을 한다[예를 들어, 문헌[Kadler K. Birth Defects Res C Embryo Today. 2004; 72:1-11]; [Kadler KE, Baldock C, Bella J, Boot-Handford RP. J Cell Sci. 2007; 120:1955-1958.]; [Kreger ST. Biopolymers. 2010 93(8): 690-707] 참조]. 트로포콜라겐은 전형적으로, 우선형(right-handed) 삼중-나선형 트로포콜라겐을 형성하기 위해 접합되는 프로콜라겐의 3개의 좌선형(left-handed) 나선(통상 2개의 동일한 나선과 제3의 별개의 나선)으로 구성되어, 원섬유의 형성을 초래한다.
네이티브 콜라겐의 배치 및 대부분의 특성은 분자의 95% 초과를 이루는 삼중 나선 도메인에 의해 결정된다. 이 도메인은 3개의 알파 사슬로 구성되며, 각각의 알파 사슬은 로프-유사 방식으로 싸인(wrapped) 대략 1,000개의 아미노산을 함유하여 밀착된 삼중 나선 구조를 형성한다. 삼중 나선은, 인접한 아미노산을 연결하는 펩타이드 결합이 분자의 내부 내에 묻히는 방식으로 감겨서, 콜라겐 분자는 펩신과 같은 프로테아제에 의한 공격에 저항적이다.
I형 콜라겐은 원형적인(prototypical) 원섬유성 콜라겐을 나타내고, 뼈, 힘줄, 피부, 동맥 및 폐를 포함한 대부분의 조직에서 주요한 콜라겐 유형이다. I형 콜라겐 섬유는 큰 인장 강도 및 제한된 신장성(extensibility)을 제공한다. I형 콜라겐의 가장 풍부한 분자 유형은 2개의 상이한 알파 사슬[알파 1(I)]2 및 알파 2(I)로 이루어진 이종삼량체(heterotrimer)이다(문헌[Inkinen, Connective Tissue Formation in Wound Healing an Experimental Study, Academic Dissertation, Sep. 2003. University of Helsinki, Faculty of Science, Department of Biosciences, Division of Biochemistry]).
모든 원섬유성 콜라겐 분자에서, 3개의 폴리펩타이드 사슬은 반복성 Gly-X-Y 트리플렛(triplet)으로부터 작제되며, 이때, X 및 Y는 임의의 아미노산일 수 있으나 빈번하게는 이미노산 프롤린 및 하이드록시프롤린이다. 콜라겐은 특히 글리신, 프롤린 및 하이드록시프롤린 아미노산 잔기가 풍부하고, 콜라겐 가닥의 단백질 서열은 종종 반복성 아미노산 서열을 갖는다. 프로콜라겐은 프로필 및 라이신 잔기에 하이드록실기가 첨가되어 변형된다. 이들 하이드록실화 반응은 각각 프롤릴-4-하이드록실라제 및 라이실-하이드록실라제에 의해 촉매화된다. 그 후에, 라이신 잔기 상의 하이드록실기가 글리코실화되고, 삼중 나선이 후속적으로 형성된다.
원섬유-형성 콜라겐의 중요한 특질은, 이러한 콜라겐이 구형(globular) N-말단 및 C-말단 신장 프로펩타이드를 함유하는 전구체 프로콜라겐으로서 합성된다는 점이다. 프로콜라겐의 생합성은, 프롤린 및 라이신 하이드록실화, N-연결 및 O-연결 글리코실화, 및 사슬내 이황화-결합 형성과 사슬간 이황화-결합 형성 둘 다를 포함한 많은 상이한 번역-후 변형을 수반하는 복잡한 과정이다. 이들 변형을 수행하는 효소는 조화된 방식으로 작용하여, 올바르게 정렬되고 열적으로 안정한 삼중-나선형 분자의 접힘(folding) 및 조립을 보장한다.
3구성원(triconstituent) 폴리펩타이드 사슬은 조면 소포체(RER) 내에서 조립되어, 프로콜라겐을 형성한다. 폴리펩타이드 사슬이 소포체(ER) 막을 가로질러 공동-번역적으로 전좌되므로, 프롤린 및 라이신 잔기의 프롤릴-4-하이드록실라제(P4H)-의존적 하이드록실화가 Gly-X-Y 반복 영역 내에서 발생한다. 콜라겐의 최종적인 삼중-나선 구조의 안정성은 콜라겐 사슬의 P4H-매개 하이드록실화에 고도로 의존한다. 라이실 하이드록실라제(LH, EC 1.14.11.4), 갈락토실트랜스퍼라제(EC 2.4.1.50) 및 글루코실트랜스퍼라제(EC 2.4.1.66)는 콜라겐의 번역후 변형에 관여하는 효소이다. 이들은 특정 위치에서 라이실 잔기를 하이드록시라이실, 갈락토실하이드록시라이실 및 글루코실갈락토실 하이드록시라이실 잔기로 순차적으로 변형시킨다. 이들 구조는 콜라겐에 독특하고 이들의 기능적 활성에 필수적이다(문헌[Wang 등 (2002) Matrix Biology, 21(7): 559-566]). 단일 인간 효소, 라이실 하이드록실라제 3(LH3)는 하이드록시라이신 연결 탄수화물 형성에서 모든 3개의 연속 단계를 촉매화할 수 있다(문헌[Wang 등 (2002) Matrix Biology, 21(7): 559-566]). 일단 폴리펩타이드 사슬이 소포체의 루멘 내로 완전히 전좌되면, 그 후에 3개의 프로-알파 사슬이 이들의 C-프로펩타이드를 통해 결합되어 삼량체성 분자를 형성하며, 이때, Gly-X-Y 반복 영역은 이의 C-말단 단부에서 핵형성점(nucleation point)을 형성하여, 사슬의 올바른 정렬을 보장한다. 그 후에, Gly-X-Y 영역은 C-투(to)-N 방향으로 접혀서, 삼중 나선을 형성한다(문헌[Khoshnoodi 등 (2006) J. Biol. Chem. 281:38117-38121]).
체온에서 삼중 나선의 안정성을 보장하기 위해서는 프롤린 잔기의 하이드록실화가 필요하고 삼중 나선은 일단 형성되면 하이드로실화 효소에 대한 기질로서 더 이상 역할을 하지 않으므로, 폴리펩타이드 사슬 변형과 삼중-나선 형성 사이의 일시적인 관계가 결정적이다. C-프로펩타이드(및 더 작은 정도까지는 N-프로펩타이드)는 세포 밖으로의 프로콜라겐의 통과 동안 이러한 프로콜라겐을 가용성으로 유지시킨다(문헌[Bulleid 등 (2000) Biochem. Socy. Transact., 28(4): 350-353]). 세포외 기질 내로의 프로콜라겐 분자의 분비 후에 또는 분비 동안에, 프로펩타이드는 프로콜라겐 N-프로테이나제 및 C-프로테이나제에 의해 제거되어, 원섬유로의 콜라겐 분자의 자발적인 자가-조립을 촉발한다(문헌[Hulmes, 2002, J. Struct. Biol. January-February; 137(1-2):2-10]). 프로콜라겐 N-프로테이나제 및 C-프로테이나제에 의한 프로펩타이드의 제거는 프로콜라겐의 용해도를 10,000-배 초과만큼 낮추고, 37℃에서 섬유로의 콜라겐의 자가-조립을 개시하는 데 필요하다. 이러한 조립 과정에 결정적인 것은, N/C 프로테이나제를 이용한 분해 후 잔존하는 N-말단 및 C-말단 프로펩타이드의 비-삼중-나선형 잔여물인 짧은 텔로펩타이드이다. 이들 펩타이드는 원섬유 구조 내에서 콜라겐 분자의 올바른 공유 등록(registration)을 보장하고 이들의 가교 가능한 알데하이드를 통해 자가-조립의 임계 농도를 낮추는 작용을 한다(문헌[Bulleid 등 (2000) Biochem. Socy. Transact., 28(4): 350-353]).
네이티브 콜라겐은 일반적으로, 원섬유 형태로 나란히 패킹되는 텔로펩타이드-함유 콜라겐 분자로서 결합 조직에 존재한다. 각각의 세로방향 경로는, 다음의 연속적인 측면으로 인접한 세로방향 경로에 비해 엇갈린 약간의 세로방향 공간과 함께 단부-대-단부 배치로 정렬된 분자로 이루어진다. 이러한 방식으로, 갭은 주어진 세로방향 경로에서 연속적인 분자의 대향(facing) 단부 영역 사이에서 생성되고, 이에 측방향으로 인접한 평행의 세포방향 경로에서 분자의 엇갈린 면에 의해 결합된다.
네이티브 동물 콜라겐의 분산 및 가용화는, 콜라겐의 요망되는 특징을 부여하는 기본적인, 강성의 삼중-나선 구조에 영향을 주지 않으면서 분자간 결합을 교란시키고 면역원성 비-나선형 텔로펩타이드를 제거하는 다양한 단백질분해성 효소를 사용하여 달성될 수 있다(정제된 가용성 콜라겐의 일반적인 제조 방법에 대해 미국 특허 제3,934,852호; 제3,121,049호; 제3,131,130호; 제3,314,861호; 제3,530,037호; 제3,949,073호; 제4,233,360호 및 제4,488,911호 참조). 생성된 가용성 아텔로콜라겐은 후속적으로, 낮은 pH 및 높은 이온 강도에서 반복된 침전에 의해, 뒤이어 낮은 pH에서 세척 및 재-가용화에 의해 정제될 수 있다. 그렇지만, 가용성 조제물은 전형적으로, 단백질 조제물의 균질성을 저하시키는 가교된 콜라겐 사슬에 의해 오염된다.
콜라겐은 인체 기능에서 이의 독특한 특징 및 다양한 프로파일로 인해, 구조적 온전성을 지지하며 세포성 침윤을 유도하고 조직 재생을 촉진하기 위한 조직 복구에 사용하기 위해 여러 가지 생체적합성 물질로부터 선택되었다. 5 가지 주요 콜라겐 유형 중에서, I형 콜라겐은 인체에서 가장 풍부한 형태의 콜라겐이다.
I형 콜라겐은 생물활성 접착 부위를 통해 조직 세포를 지지할 수 있는 원섬유성 하이드로겔로 자가-조립할 수 있다. 콜라겐에의 메타크릴레이트기의 첨가는 콜라겐 메타크릴레이트(CMA)를 생성하며, 이는 분해에 더 저항성이다(문헌[Gaudet 등 Biointerphases (2012) 7:25-33]). 콜라겐의 티올화는 점착 및 점막접착 특성을 향상시킬 수 있고, 팽윤 능력에 영향을 준다(문헌[Duggan 등, Eur. J. Pharm. Biopharm. (April 2015) 91:75-81]).
콜라겐의 독특한 특성은 재생 의학 생성물에서의 이의 용도에 기여하였다. 콜라겐은 약제학(지혈성 압박 붕대(haemostatic compress), 스펀지, 치유 드레싱), 의학(보철물, 예컨대 심장판, 힘줄 및 인대, 피부 대체물, 충전제), 치과학(잇몸 임플란트/잇몸 질환) 및 미용(첨가제, 주름방지제, 방향 성분용 미세용기)을 포함한 무수한 적용에 필요한 특징을 생체물질에 제공한다. 모든 상술된 시장에서 제작된 콜라겐계 생성물은 이의 생성을 위해 다량의 원(raw) 콜라겐 물질을 필요로 한다.
인간 및 동물-유래 콜라겐, 예컨대 카데바 또는 동물 공급원(소, 돼지 또는 말), 및 콜라겐계 생성물은 적용, 주사, 이식, 및 경구 섭취에 사용되어 왔다. 용도는 손상된 뼈 또는 연골 구조의 복구 또는 부분 교체를 위한 요망되는 형상으로의 예비-성형, 손상된 관절 내로의 주사, 및 진피 충전제로서의 주사를 포함한다.
동물-유래 콜라겐 (인간-유래 콜라겐 포함)의 사용은 비-통상적인 감염성 병원체에 의한 오염의 가능한 위험으로 인해 문제가 된다. 박테리아 또는 바이러스 오염에 의해 상승되는 위험이 완전히 제어될 수 있는 한편, 프리온은 덜 억제 가능하고 상당한 건강상 위험을 제시한다. 단백질-유사 성질을 갖는 것으로 보이는 이들 감염성 병원체는 퇴행성 동물 뇌병증(양 떨림병(sheep trembling disease), 소 해면상 뇌병증(bovine spongiform encephalopathy)) 및 인간 뇌병증(크로이펠츠-야콥병, 게르스트만-슈트로이슬러 증후군(Gerstmann-Straussler syndrome), 및 쿠루병(kuru disease))의 발병에 관여한다. 다른 질환(예를 들어, 후천성 면역 결핍 증후군[AIDS], 간염, 광견병, 일부 암) 또한, 수혜자에게 전파될 수 있다. 뇌병증 및 일부 다른 질환의 발병 전의 너무 긴 시간으로 인해, 형식적인 제어는 수행하기 어렵다. (일반적으로, 문헌[Castrow etal. (1983) J. Am. Acad. Dermatol. 9(6):889-93]; [Siegle 등 (1984) Arch. Dermatol. 120(2):183-187] 참조).
더욱이, 일부 환자에서, 인간 또는 동물 콜라겐에 의한 치료는 알레르기를 포함한 세포성 또는 체액성 면역 반응을 촉발한다. 게다가, 콜라겐의 품질은 일반적으로, 공급 카데바 또는 유기체의 연령에 따라 저하되거나 다른 인자에 대한 대상체를 저하시킬 수 있다. 게다가, 추출 과정은 이의 생물학적 및 기계적 기능을 악화시키는 유의한 구조적 손상을 유발한다(문헌[Stein등 (2009) Biomacromolecules 10(9):2640-2645]; 문헌[Shilo 등 (2013) Tissue Eng. Part A 19(13-14):1519-1526]; 문헌[Shoseyov 등 (2013) Tiss. Eng. Part A 19(13-14):1527]).
콜라겐 사슬을 발현하는 식물은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, WO 2005/035442; 미국 특허 제6,617,431호; 미국 공보 제2002/0098578호; 미국 공보 제2002/0142391호; 문헌[Merle 등 (2002) FEBS Letters 515: 114-118]; [Ruggiero 등. (Mar. 3, 2000) FEBS Lett. 469(1):132-6] 참조). 이러한 식물이 콜라겐 사슬뿐만 아니라 콜라겐을 생성하는 데 사용될 수 있으나, 이러한 사슬은 잘못 하이드록실화되어서 이것이 자가-조립되며, 이는 다리끝(planta)에서든 아니든 간에, 고유적으로 불안정한 콜라겐을 야기한다. 예를 들어, 식물이 하이드록시프롤린-함유 단백질을 합성할 수 있긴 하지만, 식물 세포에서 하이드록시프롤린의 합성에 책임 있는 프롤릴 하이드록실라제는 포유류 P4H와 비교하여 상대적으로 느슨한 기질 서열 특이성을 나타내어, Gly-X-Y 트리플렛(triplet)의 Y 위치에서만 하이드록시프롤린을 함유하는 콜라겐의 생성은 콜라겐 및 P4H 유전자의 식물 공동-발현을 필요로 한다(문헌[Olsen 등 (2003) Adv. Drug Deliv. Rev., 55(12): 1547-1567]).
식물-유래 프로테아제, 예컨대 피신(ficin) 및/또는 파파인에 의한 동물-유래 "불용성 콜라겐"의 가공 또한, 당업계에 알려져 있다(미국 특허 제4,597,762호, 제5,670,369호, 제5,316,942호, 제5,997,895호 및 제5,814,328호).
식물에 천연적으로 존재하는 하이드록실화 머시너리에 의존하는 인간 콜라겐을 생성하기 위한 시도는 프롤린 하이드록실화에서 불량한 콜라겐을 초래하였다(문헌[Merle 등 (2002) FEBS Letters 515: 114-118]). 이러한 콜라겐은 30℃ 미만의 온도에서 이의 삼중 나선형 구조를 용융시키거나 상실한다. 콜라겐 및 프롤릴-하이드록실라제의 공동-발현은 체온에서 적용하기에 생물학적으로 적당한 안정한 하이드록실화 콜라겐을 초래한다(문헌[Merle 등 (2002) FEBS Letters 515: 114-118]).
담배에서 발현되는 인간 콜라겐의 하이드록시라이신은 소 콜라겐에서 발견되는 하이드록시라이신의 2% 미만을 형성한다(0.04%의 잔기/1.88%의 잔기). 이는, 식물 내인성 라이실 하이드록실라제가 콜라겐에서 라이신을 충분히 하이드록실화시키기에는 불안정함을 시사한다.
최근의 기술 발전은 이종삼량체성 I형 콜라겐을 인코딩하는 5개의 인간 유전자를 담배 식물 내에 도입함으로써 미접촉(naive) 인간 I형 콜라겐(rh콜라겐)(COLLPLANTTM, 이스라엘 소재; 또한 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 SIGMA-ALDRICH®에서 입수 가능함)의 정제를 위한 시스템의 발달을 초래하였다[예를 들어, 문헌[Stein H. (2009) Biomacromolecules 10:2640-5]; [Yaari 등 (2013) Tiss. Eng. Part A 19(13/14): 1502-1506]; [Willard 등 (2013) Tiss. Eng. Part A 19(13/14): 1507-1518]; [Shilo 등 (2013) Tiss. Eng. Part A 19(13/14): 1519-1526]; [Shoseyov 등 (2013) Tiss. Eng Part A 19:1527-1533]; 및 [Shoseyov 등 (Jan./Feb. 2014) Bioengineered 5:1, 1-4] 참조]. 단백질은 콜라겐의 독특한 특성을 이용하는 비용 효과적인 산업적 과정을 통해 균질할 때까지 정제된다. 또한, WO 2006/035442, WO 2009/053985, 및 이로부터 유래되는 특허 및 특허 출원을 참조하며, 이들은 모두 전체가 본원에 제시되는 것처럼 참조에 의해 포함된다.
부분적으로 변성되고 세포 결합 도메인이 제거될 수 있는 조직-추출된 콜라겐과 비교하여, 식물-유래 인간 콜라겐 I형은 더 일관된 구조 및 더 많은 수의 세포 결합 도메인을 가진다(문헌[Shoseyov 등 (Jan./Feb. 2014) Bioengineered 5:1, 1-4]; [Majumdar 등 (2015) J. Biomed. Mater. Res. Part B: Appl. Biomater. 104B: 300-307]). rh콜라겐은 기능적인 3-차원(3D) 매트릭스 및 스캐폴딩을 형성할 수 있으며, 이때, 3D 물체가 3D 바이오-프린팅을 통해 상기 물체의 컴퓨터 모델을 이용하는 층별(layerwise) 방식으로 제작되는 과정인 적층 제작(AM)에 적용된다. 더욱이, rh콜라겐은 일반적으로, 조직-추출된 콜라겐의 면역원성 및 질환 이전 문제가 결여되어 있다.
적어도 하나의 유형의 콜라겐 알파 사슬을 발현하고 내인성 P4H 활성이 없는 서브세포성 구획에서 상기 사슬의 축적을 가능하게 함으로써 식물에서 콜라겐을 생성하는 방법이 이용 가능하며(미국 특허 제8,455,717호), 마찬가지로 프로테아제에 의한 치료를 통해 비-동물 세포-유래 인간 텔로펩타이드-포함 콜라겐으로부터 아텔로콜라겐을 생성시키는 방법이 이용 가능하다(미국 특허 제8,759,487호).
I형 콜라겐 및 rh콜라겐은 3D-바이오프린팅에서 빌딩 물질의 주요 구성요소로서 사용되기 위한 후보인 것으로 간주된다. 다양한 유형의 스캐폴딩은 미용 및 다른 재구성 적용에 사용되어 왔다.
게다가, 연조직 강화, 예를 들어, 주름살의 감소를 위한 진피 충전제의 사용이 증가되어 왔다. 진피 충전제를 사용하는 하나의 가능한 방법은 중합성 진피 충전제 물질을 요망되는 영역 내로 주사하고, 뒤이어 상기 충전제를 요망되는 형태(conformation)로 윤곽시키거나 성형하는 단계를 포함한다. 다양한 방법 중 하나에 의한 물질의 중합 및 가교는 주사된 물질에서 단량체를 형질전환시켜 중합체 및 사슬을 형성할 수 있으며, 이는 네트워크를 형성하여, 요망되는 성형된 형태를 보유할 수 있다. 중합체를 형성하고 중합체를 가교시키는 많은 방법이 존재한다. 다른 방법은 단량체 용액에서 반응성 화학종을 생성하는 광-반응성 시약 및 광-유도성 반응을 수반한다. 예를 들어, 미국 특허 제9,795,711호; 미국 특허 제8,945,624호; 미국 특허 제6,352,710호; 및 미국 공보 제2009/0324722호, 뿐만 아니라 문헌[Elisseeff 등 (March 1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 3104-3107]을 참조한다.
그러나, 이들 접근법 중 적어도 일부는 조직-유래 콜라겐 또는 비-콜라겐 중합체(예를 들어, 폴리(비닐 알코올), 히알루론산, 또는 폴리에틸렌 글리콜)에 계속 초점을 맞추고 있다. 더욱이, 조직 추출된 콜라겐의 사용은 20℃보다 높은 온도에서 생리학적 조건 하에 자발적인 겔 형성을 구동하는, 온도 및 이온 강도에 대한 상기 콜라겐의 민감도로 인해 제한된다[예를 들어, PureCol, Advanced BioMatrix, Inc. 참조]. 조직 추출된-콜라겐의 겔의 전형적인 온도-의존적 형성은 정확한 유동성을 유의하게 방해한다. 적용 시까지 콜라겐을 저온에서 유지시키는 것은 이러한 현상에 대한 가능한 해결방안이지만, 심각한 기술적 한계를 암시한다. 또 다른 해결방안은, 이들 조건 하에 젤-유사로 되지 않는 변성된 형태의 콜라겐인 젤라틴의 사용이다. 그러나, 젤라틴은 네이티브 콜라겐의 진짜(genuine) 조직 및 세포 상호작용이 결여되어 있어서, 중대한 생물학적 기능이 상실된다. 더욱이, 점도는 미세-게이지 바늘을 사용하여 진피 아래에 주사되는 것을 더욱 어렵게 만들고, 또한 젤라틴을 더 작은 공동(cavity) 내로 확산시키고 성형하는 것을 더욱 어렵게 만든다.
그러므로, 조율 가능한 유변학적 및 기계학적 특성을 갖는 향상된 주사용 진피 충전제, 및 이의 방법 및 용도를 갖는 것에 대한 요구가 있으며, 고도로 바람직하고 유리할 것이다.
일 양태에서, 이중 가교된 진피 충전제가 개시되며, 상기 이중 가교된 진피 충전제는,
(a) 식물-유래 인간 콜라겐; 및
(b) 가교 히알루론산
을 포함하고, 여기서, 상기 식물-유래 인간 콜라겐은 가교 히알루론산에 가교된다.
관련 양태에서, 식물-유래 인간 콜라겐은
(a) 1형 재조합 인간 콜라겐(rh콜라겐)을 포함하거나;
(b) 상기 가교 히알루론산은 가교 히알루론산 및 비-가교 히알루론산을 포함하거나;
(c) 이들의 조합이다.
관련 양태에서, 가교된 히알루론산을 연결시키는 가교제는 식물-유래 인간 콜라겐을 가교된 히알루론산과 연결시키는 가교제와 상이하거나;
상기 가교된 히알루론산 : 상기 식물-유래 인간 콜라겐의 비는 4:1 내지 1:2 범위를 포함하거나; 이들의 조합이다. 추가의 관련 양태에서, 히알루론산을 가교시키는 가교제 및 식물-유래 인간 콜라겐을 가교시키는 가교제는 독립적으로, 1, 4-부탄디올 디글리시딜 에테르(BBDE), 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카르보디이미드 메트요오다이드(EDC), Ν,Ν'-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC), Ν,Ν'-디이소프로필카르보디이미드(DIC)로부터 선택된다[다른 가능한 가교제를 참조하시오].
본원의 하나의 양태에서, 가교 히알루론산에 가교된 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 이중 가교된 진피 충전제를 제조하는 방법이 개시되며, 상기 방법은,
(a) 히알루론산을 가교시키는 단계;
(b) 가교 히알루론산을 중화시키는 단계;
(c) 식물-유래 인간 콜라겐을 중화시키는 단계;
(d) 중화된 가교 히알루론산을 중화된 식물-유래 인간 콜라겐과 혼합하는 단계;
(e) 더 낮은 분자량의 히알루론산(MW HA)을 첨가하는 단계;
(f) 가교 히알루론산과 식물-유래 인간 콜라겐의 믹스를 가교시키는 단계; 및
(g) 이중 가교된 가교 히알루론산-식물-유래 인간 콜라겐 진피 충전제를 투석시키는 단계를 포함한다.
관련 양태에서, 식물-유래 인간 콜라겐은 1형 재조합 인간 콜라겐(rh콜라겐)을 포함하거나; 단계 (a)의 가교된 히알루론산을 연결시키는 가교제는 단계 (e)의 식물-유래 인간 콜라겐을 가교 히알루론산과 연결시키는 가교제와 상이하거나; 이들의 조합이다. 관련 양태에서, 가교 히알루론산 : 식물-유래 인간 콜라겐의 비는 4:1 내지 1:2의 범위를 포함하거나; 히알루론산을 가교시키는 가교제 및 식물-유래 인간 콜라겐을 가교시키는 가교제는 독립적으로, 1, 4-부탄디올 디글리시딜 에테르(BBDE), 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카르보디이미드 메트요오다이드(EDC), Ν,Ν'-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC), Ν,Ν'-디이소프로필카르보디이미드(DIC) 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
게다가, 일 양태에서, 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법이 개시되며, 상기 방법은,
(a) 중합성 용액을 상기 조직 공간 내로 도입하는 단계로서, 상기 중합성 용액이,
(i) 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐;
(ii) 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 유도체, 산화된 셀룰로스(OC) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체 또는 이의 변형된 유도체, 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 이의 변형된 유도체, 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA) 또는 이의 변형된 유도체, 카르복시메틸셀룰로스 또는 이의 변형된 유도체, 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 이의 변형된 유도체, 또는 이들의 조합; 및
(iii) 광개시제를 포함하는, 단계; 및
(b) 상기 공간에 대해 피상적인 표피의 표면에 광을 적용하여, 중합을 유도하는 단계를 포함한다.
관련 양태에서, 중합성 용액 구성요소는 대략 동일한 장소 및 대략 동일한 시기에 독립적으로 조직 공간 내로 도입되며, 여기서, 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐 및 광개시제는 상기 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 유도체와 함께 그리고 이로부터 독립적으로 도입되고, 상기 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 유도체, 상기 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 유도체, 산화된 셀룰로스(OC) 또는 상기 이의 변형된 유도체, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체 또는 상기 이의 변형된 유도체, 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 상기 이의 변형된 유도체, 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA) 또는 상기 이의 변형된 유도체, 카르복시메틸셀룰로스 또는 상기 이의 변형된 유도체, 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 상기 이의 변형된 유도체, 또는 상기 이들의 조합은 대략 동일한 시기에 독립적으로 상기 조직 공간 내로 도입된다. 또 다른 관련 양태에서, 상기 방법은 중합성 용액 또는 상기 중합성 용액의 구성요소를 상기 조직 공간 내의 요망되는 배치(configuration) 내로 성형하거나(molding) 형상화하는(sculpting) 단계를 추가로 포함하며, 여기서, 상기 단계는 광을 적용하는 단계와 동시적이거나 이에 후속적이다.
또 다른 관련 양태에서, 중합성 용액 구성요소는 혼합물로서 함께 조직 공간 내로 도입되며, 여기서, 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐 및 광개시제는 상기 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 유도체, 또는 상기 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 유도체, 또는 상기 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 유도체, 또는 상기 산화된 셀룰로스(OC) 또는 상기 이의 변형된 유도체, 또는 상기 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체 또는 상기 이의 변형된 유도체, 또는 상기 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 상기 이의 변형된 유도체, 또는 상기 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA) 또는 상기 이의 변형된 유도체, 또는 상기 카르복시메틸셀룰로스 또는 상기 이의 변형된 유도체, 또는 상기 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 상기 이의 변형된 유도체, 또는 이들의 조합과 함께 도입된다.
또 다른 관련 양태에서, 중합성 용액 구성요소는 서로 독립적으로 조직 공간 내로 도입되며, 여기서, 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐 및 광개시제는 상기 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 유도체, 또는 상기 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 유도체, 또는 상기 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 유도체, 또는 상기 산화된 셀룰로스(OC) 또는 상기 이의 변형된 유도체, 또는 상기 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체 또는 상기 이의 변형된 유도체, 또는 상기 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 상기 이의 변형된 유도체, 또는 상기 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA) 또는 상기 이의 변형된 유도체, 또는 상기 카르복시메틸셀룰로스 또는 상기 이의 변형된 유도체, 또는 상기 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 상기 이의 변형된 유도체, 또는 상기 이들의 조합과 함께 그리고 이들로부터 독립적으로 도입된다.
또 다른 관련 양태에서, 조직 공간 내로 도입 후, 상기 방법은 중합성 용액 또는 상기 중합성 용액의 구성요소를 상기 조직 공간 내의 요망되는 배치 내로 성형하거나 형상화하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서, 상기 단계는 광을 적용하는 단계와 동시적이거나 이에 후속적이다.
또 다른 관련 양태에서, 상기 방법은 비-치료적이고, 상기 성형하거나 형상화하는 단계는 주름, 접힘, 잔주름, 주름살 또는 흉터, 또는 이들의 조합을 감소시킨다.
또 다른 관련 양태에서,
(a) 상기 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐은 메타크릴레이트화된 또는 티올화된 1형 인간 재조합 콜라겐(rh콜라겐)이거나;
(b) 상기 히알루론산(HA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 산화된 셀룰로스(OC), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체, 트리칼슘 포스페이트(TCP), 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA), 카르복시메틸셀룰로스, 또는 결정질 나노셀룰로스(CNC)의 변형된 유도체는 메타크릴레이트화된 유도체 또는 티올화된 유도체를 포함하거나;
(c) 상기 히알루론산(HA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 산화된 셀룰로스(OC), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체, 트리칼슘 포스페이트(TCP), 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA), 카르복시메틸셀룰로스, 또는 결정질 나노셀룰로스(CNC)는 가교 히알루론산(HA), 가교 폴리(비닐 알코올)(PVA), 가교 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 가교 산화된 셀룰로스(OC), 가교 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체, 가교 트리칼슘 포스페이트(TCP), 가교 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA), 가교 카르복시메틸셀룰로스, 또는 가교된 결정질 나노셀룰로스(CNC)를 포함하거나;
(d) (a)와 (b)의 조합, 또는 (a)와 (c)의 조합이다.
추가의 관련 양태에서, MA-rh콜라겐이 선택되고 히알루론산 또는 이의 유도체, 또는 가교 히알루론산이 선택되는 경우, HA : MA-rh콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1이다.
본원의 일 양태에서, 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법이 개시되며, 상기 방법은 이중 가교된 진피 충전제를 상기 조직 공간 내로 도입하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 이중 가교된 진피 충전제는,
(a) 식물-유래 인간 콜라겐; 및
(b) 가교 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 산화된 셀룰로스(OC) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 카르복시메틸셀룰로스 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교된 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 또는 이들의 조합을 포함하며;
상기 식물-유래 인간 콜라겐은 가교된 가교 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 산화된 셀룰로스(OC) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 카르복시메틸셀룰로스 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교된 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 이의 변형된 가교 유도체에 가교된다.
관련 양태에서, 식물-유래 인간 콜라겐은 1형 인간 재조합 콜라겐(rh콜라겐), 또는 이의 MA 또는 티올화된 유도체이거나; 히알루론산(HA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 산화된 셀룰로스(OC), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체, 트리칼슘 포스페이트(TCP), 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA), 카르복시메틸셀룰로스, 또는 결정질 나노셀룰로스(CNC)의 변형된 유도체는 메타크릴레이트화된 유도체 또는 티올화된 유도체를 포함하거나; 이들의 조합이다.
또 다른 관련 양태에서, 가교 HA가 선택되는 경우, 상기 가교 HA : 상기 식물-유래 인간 콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1이다.
관련 양태에서, 상기 방법은 비-치료적이고, 주름, 접힘, 잔주름, 주름살 또는 흉터, 또는 이들의 조합을 감소시킨다.
본원의 일 양태에서, 조직 강화에 사용하기 위한 중합성 용액 또는 비-중합성 용액이 개시되며, 여기서,
(a) 상기 중합성 용액은 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐 및 가시광의 적용 전에 또는 이와 동시에 중합을 유도하기 위한 광개시제를 포함하거나,
(b) 상기 비-중합성 용액은 식물-유래 인간 콜라겐, 및 가교 히알루론산, 가교 PVA, 가교 PGE 또는 가교 OC를 포함하는 이중 가교된 진피 충전제를 포함하며, 여기서, 상기 식물-유래 인간 콜라겐은 상기 가교 히알루론산, 상기 가교 PVA, 상기 가교 PGE 또는 상기 가교 OC에 가교되고;
상기 사용은 상기 중합성 용액 또는 비-중합성 용액을 표피 아래의 조직 공간 내로 주사하고, 뒤이어 상기 중합성 용액 또는 비-중합성 용액을 요망되는 배치로 성형하거나 형상화하여, 주름, 접힘, 잔주름, 주름살 또는 흉터를 감소시키는 단계를 포함한다.
관련 양태에서, 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐은 메타크릴레이트화되거나 티올레이트화되거나; 중합성 용액은 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 유도체 또는 이의 광중합성 변형된 유도체, 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 유도체 또는 이의 광중합성 변형된 유도체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 유도체 또는 이의 광중합성 변형된 유도체, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체 또는 이의 변형된 유도체 또는 이의 광중합성 변형된 유도체, 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 이의 변형된 유도체 또는 이의 광중합성 변형된 유도체, 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA) 또는 이의 변형된 유도체 또는 이의 광중합성 변형된 유도체, 카르복시메틸셀룰로스 또는 이의 변형된 유도체 또는 이의 광중합성 변형된 유도체, 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 이의 변형된 유도체 또는 이의 광중합성 변형된 유도체, 또는 이들의 조합을 포함하며, 여기서, 선택적으로 이의 유도체는 메타크릴레이트화된 유도체 또는 티올화된 유도체; 또는 이들의 조합을 포함한다.
또 다른 관련 양태에서, 조직 강화는 임의의 의학적 또는 치과적(잇몸 임플란트/잇몸 질환) 상태의 결과로서 필요하다. 추가의 관련 양태에서, 조직 강화는 주름, 접힘, 잔주름, 주름살 또는 흉터, 또는 이들의 조합을 감소시킨다.
본원의 일 양태에서, 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 촉진 스캐폴드를 유도하는 방법이 개시되며, 상기 방법은 용액을 상기 조직 공간 내로 도입하는 단계를 포함하며, 상기 용액은,
(a) 식물-유래 인간 콜라겐; 및
(b) 적어도 하나의 성장 인자 또는 이의 공급원을 포함하며,
여기서, 상기 방법은 콜라겐-포함 조직의 치유 또는 교체를 촉진한다.
관련 양태에서, 식물-유래 콜라겐은 1형 재조합 인간 콜라겐(rh콜라겐)을 포함하거나; 적어도 하나의 성장 인자의 공급원은 혈장 또는 혈청-풍부 혈장을 포함하거나; 콜라겐-포함 조직은 피부를 포함하거나; 이들의 조합이다.
또 다른 양태에서, 상기 방법은 비-치료적이고, 상기 세포성 성장 촉진 스캐폴드는 조직 공간에서 충전되어, 주름, 접힘, 잔주름, 주름살 또는 흉터, 또는 이들의 조합을 감소시킨다.
본원의 일 양태에서, 세포성 성장 촉진 스캐폴드를 유도하는 데 사용하기 위한 용액이 개시되며, 상기 용액은 식물-유래 인간 콜라겐 및 적어도 하나의 성장 인자 또는 이의 공급원을 포함하며, 여기서, 상기 사용은 상기 용액을 피부 아래의 조직 공간 내로 주사하는 단계를 포함하고, 상기 사용은 콜라겐-포함 피부 조직의 분해 또는 상해로 인한 치유 또는 교체를 촉진하기 위한 것이다.
관련 양태에서, 식물-유래 콜라겐은 1형 재조합 인간 콜라겐(rh콜라겐)을 포함하거나; 적어도 하나의 성장 인자의 공급원은 혈장 또는 혈청-풍부 혈장을 포함하거나; 콜라겐-포함 조직은 피부를 포함하거나; 이들의 조합이다.
또 다른 관련 양태에서, rh콜라겐은 이의 메타크릴레이트 또는 티올 유도체를 포함한다.
관련 양태에서, 상기 방법에 사용되는 용액은 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 유도체, 산화된 셀룰로스(OC) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체 또는 이의 변형된 유도체, 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 이의 변형된 유도체, 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA) 또는 이의 변형된 유도체, 카르복시메틸셀룰로스 또는 이의 변형된 유도체, 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 이의 변형된 유도체, 또는 이들의 조합, 및 가시광의 적용 전에 또는 이와 동시에 중합을 유도하기 위한 광개시제; 가교 히알루론산, 가교 PVA, 가교 PGE, 또는 가교 OC를 포함하며, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐은 가교 히알루론산, 가교 PVA, 가교 PGE, 또는 가교 OC에 가교된다.
관련 양태에서, 상기 방법은 비-치료적이고, 상기 세포성 성장 촉진 스캐폴드는 조직 공간에서 충전되어, 주름, 접힘, 잔주름, 주름살 또는 흉터, 또는 이들의 조합을 감소시킨다.
본원에서 세포성 성장 촉진 스캐폴드를 유도하는 데 사용하기 위한 용액이 개시되며, 상기 용액은 식물-유래 인간 콜라겐 및 적어도 하나의 성장 인자 또는 이의 공급원을 포함하며, 여기서, 상기 사용은 상기 용액을 피부 아래의 조직 공간 내로 주사하는 단계를 포함하고, 상기 사용은 콜라겐-포함 조직의 분해 또는 상해로 인한 치유 또는 교체를 촉진하기 위한 것이다.
관련 양태에서, 적어도 하나의 성장 인자의 공급원은 혈장 또는 혈청-풍부 혈장을 포함하거나; 식물-유래 콜라겐은 1형 재조합 인간 콜라겐(rh콜라겐)을 포함하거나; 콜라겐-포함 조직은 피부를 포함하거나; 이들의 조합이다.
또 다른 관련 양태에서, 사용을 위한 용액은 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 유도체, 산화된 셀룰로스(OC) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체 또는 이의 변형된 유도체, 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 이의 변형된 유도체, 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA) 또는 이의 변형된 유도체, 카르복시메틸셀룰로스 또는 이의 변형된 유도체, 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 이의 변형된 유도체, 또는 이들의 조합, 및 가시광의 적용 전에 또는 이와 동시에 중합을 유도하기 위한 광개시제; 가교 히알루론산, 가교 PVA, 가교 PGE, 또는 가교 OC를 추가로 포함하며, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐은 가교 히알루론산, 가교 PVA, 가교 PGE, 또는 가교 OC에 가교된다.
본원의 일 양태에서, 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법이 개시되며, 상기 방법은 (a) 중합성 용액을 조직 공간 내로 도입하는 단계로서, 상기 중합성 용액이 (i) 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐; 및 (ii) 광개시제를 포함하는, 단계; 및 상기 공간에 대해 피상적인 표피의 표면에 광을 적용하여, 중합을 유도하는 단계를 포함한다.
관련 양태에서, 중합성 용액은, 상기 중합성 용액을 상기 조직 공간 내의 요망되는 배치로 성형하거나 형상화하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서, 상기 단계는 광을 적용하는 단계와 동시적이거나 이에 후속적이다.
또 다른 관련 양태에서, 상기 방법은 비-치료적이고, 상기 성형하거나 형상화하는 단계는 주름, 접힘, 잔주름, 주름살 또는 흉터, 또는 이들의 조합을 감소시킨다.
또 다른 관련 양태에서, 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐은 메타크릴레이트화된 또는 티올화된 1형 인간 재조합 콜라겐(rh콜라겐)이다.
본 발명의 다른 목적, 특질 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도면으로부터 명확해질 것이다.
도 1a 내지 도 1d는 시험 식물을 형질전환시키는 데 이전에 사용된 다양한 발현 카세트 및 벡터의 작제를 예시한다. 연구의 일부로서 합성된 모든 코딩 서열은 담배에서 발현을 위해 최적화되었다. 도 1a는 본 발명의 일부 구현예에 따른 식물 발현 벡터 내로의 I형 콜라겐 알파 I 사슬 또는 II형 콜라겐 알파 2 사슬의 클로닝 계획을 보여주며; 도 1b는 본 발명의 일부 구현예에 따른 식물 발현 벡터 내로의 효소 프롤릴-4-하이드록시라제(P4H)의 클로닝 계획을 보여주고; 도 1c는 본 발명의 일부 구현예에 따른 식물 발현 벡터 내로의 프로테이나제 C 또는 프로테이나제 N의 클로닝 계획을 보여주며; 도 1d는 본 발명의 일부 구현예에 따른 식물 발현 벡터 내로의 라이실 하이드록실라제 3(LH3)의 클로닝 계획을 보여준다.
도 2는 이전에 사용된 다양한 공동-형질전환 접근법을 예시한다. 각각의 발현 카세트는 코딩 서열의 단축 명칭(short name)으로 표시된다. 코딩 서열은 표 1에 명시되어 있다. 각각의 공동-형질전환은 2개의 pBINPLUS 바이너리 벡터에 의해 수행되었다. 각각의 직사각형은 1, 2 또는 3개의 발현 카세트를 운반하는 단일 pBINPLUS 벡터를 나타낸다. 프로모터 및 종결자는 실시예 1에 명시되어 있다.
도 3은 콜라겐 알파 1(324 bp 단편) 또는 콜라겐 알파 2(537 bp 단편) 또는 둘 다에 대해 양성인 식물을 보여주는 형질전환체의 이전의 멀티플렉스 PCR 스크리닝이다.
도 4는 공동-형질전환 2, 3 및 4에 의해 생성된 유전자이식 식물의 이전의 웨스턴 블롯 분석이다. 총 가용성 단백질은 담배 공동-형질전환체 #2, #3 및 #4로부터 추출되었고, 항-콜라겐 I 항체(Chemicon Inc.로부터의 #AB745)로 시험되었다. 크기 마커는 Fermentas Inc.로부터의 #SM0671이었다. W.T.는 야생형 담배이다. 양성 콜라겐 밴드는 콜라겐 I형 알파 1 또는 알파 2 또는 둘 다에 대해 PCR 양성인 식물에서 가시적이다. 인간 태반으로부터의 500 ng 콜라겐 I형의 양성 대조군 밴드(인간 태반으로부터 펩신 분해에 의해 추출된, Chemicon Inc.로부터의 #CC050)는 유전자이식 식물로부터의 시료에서 총 가용성 단백질(약 150 μg) 중 약 0.3%를 나타낸다. 인간 콜라겐 시료에서 약 140 kDa에서의 더 큰 밴드는 콜라겐 I형 항체(Chemicon Inc.로부터의 #MAB1913)의 항 카르복시-말단 프로-펩타이드에 의해 검출 가능한 바와 같은 이의 C-프로펩타이드를 갖는 프로콜라겐이다. 인간 콜라겐 시료에서 약 120 kDa에서의 더 작은 밴드는 프로펩타이드가 없는 콜라겐이다. 프롤린 풍부 단백질(콜라겐 포함)은 이의 흔치 않은 조성으로 인해, 폴리아크릴아미드 겔 상에서 예상된 것보다 더 높은 분자 질량을 갖는 밴드로서 일관적으로 이동한다. 따라서, 약 95 kDa의 분자량을 갖는 프로펩타이드가 없는 콜라겐 사슬은 약 120 kDa의 밴드로서 이동한다.
도 5는 공동-형질전환 #8(콜라겐 사슬에 번역적으로 융합된 아포플라스트 신호를 운반함)에 의해 생성된 유전자이식 식물의 이전의 웨스턴 블롯 분석이다. 총 가용성 단백질은 유전자이식 담배 잎으로부터 추출되었고, 항-콜라겐 I 항체(Chemicon Inc.로부터의 #AB745)로 시험되었다. 양성 콜라겐 알파 2 밴드는 식물 8-141에서 가시적이다. 인간 태반으로부터의 콜라겐 I형(Chemicon Inc.로부터의 #CC050)은 대조군으로서 역할을 한다.
도 6a 및 도 6b는 열 처리 및 트립신 또는 펩신 분해에 의해 이전에 정성화된 바와 같이 콜라겐 삼중 나선 조립 및 열적 안정성을 예시한다. 도 6a에서, 담배 2-9(콜라겐 알파1만 발현하고 P4H를 발현하지 않음) 및 3-5(콜라겐 알파 1+2 둘 다 및 인간 P4H 알파 및 베타 서브유닛을 발현함)로부터의 총 가용성 단백질은 열 처리(38℃ 또는 43℃에서 15분)되었고, 뒤이어 트립신 분해(실온[RT]에서 20분)되고, 웨스턴 블롯 절차에서 항-콜라겐 I 항체로 시험되었다. 양성 대조군은 w.t. 담배의 500 ng 인간 콜라겐 I+총 가용성 단백질의 시료였다. 도 6b에서, 총 가용성 단백질은 유전자이식 담배 13-6(화살표에 의해 표시된 콜라겐 I 알파 1 및 알파 2 사슬, 인간 P4H 알파 및 베타 서브유닛 및 인간 LH3을 발현함)으로부터 추출되고, 열 처리(33℃, 38℃ 또는 42℃에서 20분)되며, 얼음 상에서 즉각적으로 냉각되어, 삼중 나선의 재조립을 방지하고, 실온(약 22℃)에서 30분 동안 펩신과 함께 인큐베이션되고, 뒤이어 표준 웨스턴 블롯 절차에서 항-콜라겐 I 항체(Chemicon Inc.로부터의 #AB745)로 시험되었다. 양성 대조군은 50 ng 인간 콜라겐 I(펩신 분해에 의해 인간 태반으로부터 추출된, Chemicon Inc.로부터의 #CC050)의 시료였으며, 이는 야생형(w.t., wt) 담배로부터 추출된 총 가용성 단백질에 첨가되었다.
도 7은 야생형 담배 상에서 수행된 이전의 노던 블롯 분석을 예시한다. 블롯은 담배 P4H cDNA로 프로브화되었다.
도 8은 공동-형질전환 2, 3 및 13에 의해 생성된 유전자이식 식물의 이전의 웨스턴 블롯 분석이다. 총 가용성 단백질은 담배 공동-형질전환체로부터 추출되고, 항-인간 P4H 알파와 베타 및 항-콜라겐 I 항체로 시험되었다.
도 9는 정상적인 광 요법 하에 성장된 교잡 육종 액포 표적화된 식물 A(2-300 +20-279); 및 암실에서 8일 동안 성장된 13-652 액포 표적화된 식물의 이전의 웨스턴 블롯 분석(레인 1)이다. 모든 식물은 외인성 col1, col2, P4H-알파 및 P4H-베타, 뿐만 아니라 LH3(PCR 확증됨)를 발현한다.
도 10은 트립신에 의한 분해 후 담배-잎 유래의 정제된 콜라겐을 보여준다. 콜라겐은 재료 및 방법 섹션에 상술된 바와 같이, 100 mM Tris 완충제에서 분쇄된 담배 식물 유전자이식 잎 라인 넘버 13-6으로부터 정제되며, 원심분리되고, 단백질분해되며, 높은 염 농도 충전제에서 침전되었다. 재현탁 후, 콜라겐-함유 펠렛은 세척되며, 투석되고, 최종 생성물로 농축되었다. 이러한 겔은 수집된 콜라겐 시료의 쿠마시 염색 분석을 도시하며, 이때, 레인 1 및 레인 2는 300 mg/L 트립신에 의한 프로콜라겐의 분해 후 생성된 콜라겐이다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(0.5 mg/ml)이 로딩되었고, 콜라겐 1형 알파 1 및 알파 2 사슬에 대한 양성 대조군으로서 진행되었다.
도 11은 다양한 농도의 트립신에 의한 분해 후 담배-잎 유래의 정제된 콜라겐을 보여준다. 콜라겐은 20 mg/L 트립신(레인 1 내지 7) 또는 30 mg/L(레인 8 내지 10)에 의한 분해 후 도 10에서와 같이 추출되고 정제되었다. 생성물은 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 쿠마시계 염색 용액으로 분석되었다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(0.5 mg/ml)이 로딩되었고, 콜라겐 1형 알파 1 및 알파 2 사슬에 대한 양성 대조군으로서 진행되었다.
도 12는 트립신 및 펩신에 의한 분해 후 담배-잎 유래의 정제된 콜라겐을 보여준다. 콜라겐은 30 mg/L 트립신 및 1 μg/200 ml 펩신(레인 1 내지 2)에 의한 분해 후 도 10에서와 같이 추출되고 정제되었다. 생성물은 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 쿠마시계 염색 용액으로 분석되었다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(0.5 mg/ml)이 로딩되었고, 콜라겐 1형 알파 1 및 알파 2 사슬에 대한 양성 대조군으로서 진행되었다.
도 13은 서브틸리신(Subtilisin) 또는 브로멜라인(Bromelain)에 의한 프로콜라겐의 분해 시 수득된 콜라겐 사슬을 보여준다. 콜라겐은 100 mM Tris 완충제에서 분쇄된 담배 식물 유전자이식 잎 라인 넘버 13-361로부터 정제되며, 원심분리되고, 3시간 또는 6시간 동안 인큐베이션된 서브틸리신(1 내지 25 mg/L) 또는 브로멜라인(1 내지 25 mg/L)에 의해 단백질분해되었다. 시료는 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 니트로셀룰로스 막에 블롯팅되었다. 콜라겐 사슬은 항-콜라겐 I을 사용하여 면역검출되었다. 균질화 및 원심분리 후 수집된 비처리된 상층액은 콜라겐-무함유 음성 대조군(레인 3 내지 4sup)으로서 역할을 하였다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(2.5 μg)은 알파 1 및 알파 2 사슬(레인 1)에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
도 14는 파파인에 의한 프로콜라겐의 분해 시 수득된 콜라겐 사슬을 보여준다. 콜라겐은 100 mM Tris 완충제에서 분쇄된 담배 식물 유전자이식 잎 라인 넘버 13-361로부터 정제되며, 원심분리되고, 3시간 또는 6시간의 인큐베이션 기간에 걸쳐 파파인(1 내지 25 mg/L)으로 단백질분해되었다. 시료는 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 니트로셀룰로스 막에 블롯팅되었다. 콜라겐 사슬은 항-콜라겐 I을 사용하여 면역검출되었다. 균질화, 원심분리 및 효소 없이 15℃에서 3시간 동안(레인 3) 또는 6시간(레인 2) 동안의 인큐베이션 후 수집된 비처리된 상층액은 콜라겐-무함유 음성 대조군으로서 역할을 하였다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(2.5 μg)은 알파 1 및 알파 2 사슬(레인 1)에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
도 15는 피신 또는 사비나제(Savinase)에 의한 프로콜라겐의 분해 시 수득된 콜라겐 사슬을 보여준다. 콜라겐은 100 mM Tris 완충제에서 분쇄된 담배 식물 유전자이식 잎 라인 넘버 13-361로부터 정제되며, 원심분리되고, 3시간 또는 6시간의 인큐베이션 기간에 걸쳐 피신(1 내지 25 mg/L) 또는 사비나제(1 내지 25 mg/L)로 단백질분해되었다. 시료는 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 니트로셀룰로스 막에 블롯팅되었다. 콜라겐 사슬은 항-콜라겐 I을 사용하여 면역검출되었다. 단백질분해 전 수집된 비처리된 상층액은 콜라겐-무함유 음성 대조군(레인 3)으로서 역할을 하였다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(2.5 μg)은 알파 1 및 알파 2 사슬(레인 1)에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
도 16은 프로타멕스(Protamex) 또는 알칼라제(Alcalase)에 의한 프로콜라겐의 분해 시 수득된 콜라겐 사슬을 보여준다. 콜라겐은 100 mM Tris 완충제에서 분쇄된 담배 식물 유전자이식 잎 라인 넘버 13-361로부터 정제되며, 원심분리되고, 3시간 또는 6시간의 인큐베이션 기간에 걸쳐 프로타멕스(1 내지 25 mg/L) 또는 알칼라제(1 내지 25 mg/L)로 단백질분해되었다. 시료는 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 니트로셀룰로스 막에 블롯팅되었다. 콜라겐 사슬은 항-콜라겐 I을 사용하여 면역검출되었다. 단백질분해 전 수집된 비처리된 상층액은 콜라겐-무함유 음성 대조군(레인 14)으로서 역할을 하였다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(2.5 μg)은 알파 1 및 알파 2 사슬(레인 1)에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
도 17은 에스페라제(Esperase) 또는 뉴트라제(Neutrase)에 의한 프로콜라겐의 분해 시 수득된 콜라겐 사슬을 보여준다. 콜라겐은 100 mM Tris 완충제에서 분쇄된 담배 식물 유전자이식 잎 라인 넘버 13-361로부터 정제되며, 원심분리되고, 3시간 또는 6시간의 인큐베이션 기간 후 에스페라제(1 내지 25 mg/L) 또는 뉴트라제(1 내지 25 mg/L)로 단백질분해되었다. 시료는 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 니트로셀룰로스 막에 블롯팅되었다. 콜라겐 사슬은 항-콜라겐 I을 사용하여 면역검출되었다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(2.5 μg)은 알파 1 및 알파 2 사슬(레인 1)에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
도 18은 에스페라제 8.0 L 또는 알칼라제에 의한 프로콜라겐의 분해 시 수득된 콜라겐 사슬을 보여준다. 콜라겐은 100 mM Tris 완충제에서 분쇄된 담배 식물 유전자이식 잎 라인 넘버 13-361로부터 정제되며, 원심분리되고, 3시간 또는 6시간의 인큐베이션 기간 후 에스페라제(1 내지 25 mg/L) 또는 뉴트라제(1 내지 25 mg/L)로 단백질분해되었다. 시료는 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 니트로셀룰로스 막에 블롯팅되었다. 콜라겐 사슬은 항-콜라겐 I을 사용하여 면역검출되었다. 균질화, 원심분리 및 단백질분해성 효소 없이 15℃에서 3시간 동안(레인 3) 또는 6시간(레인 2) 동안의 인큐베이션 후 수집된 비처리된 상층액은 콜라겐-무함유 음성 대조군으로서 역할을 하였다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(2.5 μg)은 알파 1 및 알파 2 사슬(레인 1)에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
도 19는 피신에 의한 프로콜라겐의 분해 후 다양한 정제 단계에서 수득된 콜라겐 사슬을 보여준다. 콜라겐은 100 mM Tris 완충제에서 분쇄된 담배 식물 유전자이식 잎 라인 넘버 13-361로부터 정제되며, 원심분리되고, 15℃에서 3시간의 인큐베이션 기간 후 피신(5 mg/L)으로 단백질분해되었다. 시료는 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 니트로셀룰로스 막에 블롯팅되었다. 콜라겐 사슬은 항-콜라겐 I을 사용하여 면역검출되었다. 분쇄, 원심분리 및 상층액과 피신의 인큐베이션 후 수집된 시료는 레인 5에 로딩되었다. 레인 6 내지 레인 14는 정제 과정 중 상이한 단계에서 피신-처리된 콜라겐의 시료를 도시한다: 레인 6: 피신 인큐베이션 및 원심분리 후 시료; 레인 7: 염 침전 및 0.5 M 아세트산 중 재현탁 후; 레인 8: 부가된 원심분리 단계와 함께 레인 7에서와 같은 시료; 레인 9: 0.5 M 아세트산 중 재현탁 및 원심분리 후 레인 8에서와 같은 시료; 레인 10: 10 mM HCl 중 재현탁 및 투석 후 성숙한 콜라겐 레인 11: 부가적인 여과 단계와 함께 레인 10에서와 같은 시료; 레인 12:부가적인 5X 농축 단계와 함께 레인 11에서와 같은 시료; 레인 13: 부가적인 20X 농축 단계와 함께 레인 11에서와 같은 시료; 레인 14: 부가적인 5X 농축 단계와 함께 레인 13에서와 같은 시료. 비처리된 프로콜라겐 시료(레인 3 내지 4)는 음성 대조군으로서 역할을 하였다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(2.5 μg)은 알파 1 및 알파 2 사슬(레인 1)에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
도 20은 피신에 의한 프로콜라겐의 분해 후 다양한 정제 단계에서 수득된 콜라겐 사슬을 보여준다. 콜라겐은 100 mM Tris 완충제에서 분쇄된 담배 식물 유전자이식 잎 라인 넘버 13-361로부터 정제되며, 원심분리되고, 15℃에서 3시간의 인큐베이션 기간 후 피신(5 mg/L)으로 단백질분해되었다. 시료는 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 니트로셀룰로스 막에 블롯팅되었다. 콜라겐 사슬은 항-콜라겐 I을 사용하여 면역검출되었다. 분쇄, 원심분리 및 상층액과 피신의 인큐베이션 후 수집된 시료는 레인 5에 로딩되었다. 레인 6 내지 레인 14는 정제 과정 중 상이한 단계에서 피신-처리된 콜라겐의 시료를 도시한다: 레인 6: 피신 인큐베이션 및 원심분리 후 시료; 레인 7: 염 침전 및 0.5 M 아세트산 중 재현탁 후; 레인 8: 부가된 원심분리 단계와 함께 레인 7에서와 같은 시료; 레인 9: 0.5 M 아세트산 중 재현탁 및 원심분리 후 레인 8에서와 같은 시료; 레인 10: 10 mM HCl 중 재현탁 및 투석 후 성숙한 콜라겐 레인 11: 부가적인 여과 단계와 함께 레인 10에서와 같은 시료; 레인 12:부가적인 5X 농축 단계와 함께 레인 11에서와 같은 시료; 레인 13: 부가적인 20X 농축 단계와 함께 레인 11에서와 같은 시료; 레인 14: 부가적인 5X 농축 단계와 함께 레인 13에서와 같은 시료. 비처리된 프로콜라겐 시료(레인 3 내지 4)는 음성 대조군으로서 역할을 하였다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(2.5 μg)은 알파 1 및 알파 2 사슬(레인 1)에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
도 21은 정제의 다양한 단계에서 포스트-피신 처리된 시료의 콜라겐 함량을 보여준다. 콜라겐-함유 시료는 재료 및 방법 섹션에서 기재된 반응기 크기 AMS-기초 정제 절차의 각각의 추출 및 정제 단계에서 수집되었다. 시료는 프로펩타이드 제거를 위해 피신(5 mg/L, 15℃, 3시간)으로 처리되었으며, 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 쿠마시계 염색 용액으로 염색되었다.
도 22는 식용-등급 피신에 의한 프로콜라겐 절단의 최적화: 피신 농도 및 반응 시간의 최적화를 보여준다. AMS-펠렛화된 프로콜라겐-발현 담배 잎 추출물은 추출 완충제에 재현탁된 다음, 증가하는 농도의 식용-등급 피신(5 내지 15 mg/L)과 함께 인큐베이션되었다. 그 후에, 반응 혼합물은 15℃에서 1시간 내지 3시간 동안 인큐베이션되었다. 절단은 원심분리에 의해 종료되었고, 단백질 시료는 8% SDS-PAGE 상에서 분리되며, 니트로셀룰로스 막으로 이전되고, 항-콜라겐 I과 함께 알파-1 및 알파-2 콜라겐 사슬에 대해 면역블로팅되었다. 프로콜라겐 밴드는 백색 화살표로 표시되는 한편, 적색 화살표는 절단된 콜라겐 밴드를 표시한다.
도 23a 내지 도 23c는 약제-등급 피신에 의한 프로콜라겐 절단의 최적화: 피신 농도 및 반응 시간의 최적화를 보여준다. AMS-펠렛화된 프로콜라겐-발현 담배 잎 추출물은 추출 완충제에 재현탁된 다음, 증가하는 농도의 약제-등급 피신(2.5 내지 10 mg/L)과 함께 인큐베이션되었다. 그 후에, 반응 혼합물은 15℃에서 0.5시간 내지 3시간 동안 인큐베이션되었다. 절단은 원심분리에 의해 종료되었고, 단백질 시료는 8% SDS-PAGE 상에서 분리되며, 니트로셀룰로스 막으로 이전되고, 항-콜라겐 I과 함께 알파-1 및 알파-2 콜라겐 사슬에 대해 면역블로팅되었다. 화살표는 프로콜라겐 밴드 및 콜라겐 밴드를 표시한다.
도 24a 내지 도 24b는 약제-등급 피신에 의한 프로콜라겐 절단의 최적화: 반응 완충제에서 pH 및 염 농도의 최적화를 보여준다. AMS-펠렛화된 프로콜라겐-발현 담배 잎 추출물은 다양한 pH 값(5.5 내지 9.5)에서 증가하는 NaCl 농도(0.5 M 내지 3 M)로 10 mg/L 약제-등급 피신을 함유하는 추출 완충제에 재현탁되었다. 그 후에, 반응 혼합물은 15℃에서 1시간 동안 인큐베이션되었다. 절단은 원심분리에 의해 종료되었고, 생성된 펠렛과 상층액 둘 다의 단백질 시료는 8% SDS-PAGE 상에서 분리되며, 니트로셀룰로스 막으로 이전되고, 항-콜라겐 I과 함께 알파-1 및 알파-2 콜라겐 사슬에 대해 면역블로팅되었다. 화살표는 콜라겐 밴드를 표시한다.
도 25는 약제-등급 피신에 의한 프로콜라겐 절단의 최적화: 반응 완충제에서 EDTA 및 L-시스테인 농도의 최적화를 보여준다. AMS-펠렛화된 프로콜라겐-발현 담배 잎 추출물은 다양한 농도의 L-시스테인(10 mM 내지 100 mM--농도의 상단 패널) 및 EDTA(8 mM 내지 80 mM--농도의 하단 패널)를 함유하는 추출 완충제(pH 7.5)에 재현탁되었다. 그 후에, 시료는 15℃에서 1시간 동안 1 mg/L 약제-등급 피신과 함께 인큐베이션되었다. 절단은 원심분리에 의해 종료되었고, 단백질 시료는 8% SDS-PAGE 상에서 분리되며, 니트로셀룰로스 막으로 이전되고, 항-콜라겐 I과 함께 알파-1 및 알파-2 콜라겐 사슬에 대해 면역블로팅되었다.
도 26은 pH 7.5에서 재조합 트립신에 의한 효과적인 프로콜라겐 분해를 보여준다. AMS-펠렛화된 프로콜라겐-발현 담배 잎 추출물은 L-시스테인 및 EDTA를 함유하는 추출 완충제(pH 7.5)에 재현탁되었다. 그 후에, 시료는 15℃에서 1시간 내지 3시간 동안 30 mg/L 내지 100 mg/L 재조합 트립신과 함께 인큐베이션되었다. 절단은 원심분리에 의해 종료되었고, 단백질 시료는 8% SDS-PAGE 상에서 분리되며, 니트로셀룰로스 막으로 이전되고, 항-콜라겐 I과 함께 알파-1 및 알파-2 콜라겐 사슬에 대해 면역블로팅되었다.
도 27은 점도(eta[η], cP)를 전단율의 함수로서 보여주며, 실선- 포스페이트 완충 식염수(PBS) 중 2.7 mg/mL 소 콜라겐, 파선 PBS 중 2.79 mg/mL rh콜라겐. ▼: 4℃에서의 측정, ▲: 37℃에서의 측정이다.
도 28은 점도를 전단율의 함수로서 보여주며, FB 중 3.4 mg/mL 소 콜라겐. ▼: 4℃에서의 측정, ▲: 37℃에서 측정이다.
도 29는 점도를 전단율의 함수로서 보여주며, PBS 중 10 mg/mL rh콜라겐-MA. ▲: 4℃에서의 측정, ▼: 37℃에서 측정이다.
도 30은 HA/ HAMA의 첨가와 함께 그리고 첨가 없이 DMEM 중 rh콜라겐-MA의 점도 측정을 보여준다.
도 31은 광가교 전(상단 그래프)과 후(하단 그래프)에 상이한 농도에서 rh콜라겐-MA 제제의 저장 계수 및 손실 계수와 tan 위상 천이각(phase shift angle)을 보여준다.
도 32는 주파수 스윕(frequency sweep) 시험에서 기록되고 1 Hz에서 플롯화된 37℃에서의 G' 및 G" 값을 보여준다.
도 33a 내지 도 33c는 rh콜라겐 및 rh콜라겐 메타크릴레이트의 가공에 대한 순서도를 제공한다. 도 33a는 프로콜라겐 및 콜라겐의 업스트림 단리 및 가공을 보여준다(단계 A 내지 단계 H). 도 33b 내지 도 33c는 다운스트림 가공의 2개 위상을 보여준다(각각 단계 I 내지 단계 M 및 단계 N 내지 단계 P 및 단계 Z).
도 34는 5:1(실선형 곡선), 2:1(파선형 곡선), 1:2(점선형 곡선)의 collMA:PVAMA 비에서 5 mg/ml rh콜라겐 메타크릴레이트(CollMA)(실선형 검정색 곡선) 및 5 mg/ml 콜라겐 MA + 폴리비닐 알코올 메타크릴레이트(PVMA)(연회색 곡선)의 점도(eta[η], cP)를 보여준다. 5 mg/ml rh콜라겐 메타크릴레이트의 점도는 비교를 위해 보고된다(검정색 곡선).
도 35는 5:1(실선형 곡선), 2:1(파선형 곡선)의 collMA:HAMA 비에서 5 mg/ml CollMA(실선형 검정색 곡선) 및 5 mg/ml 콜라겐 MA + 히알루론산 메타크릴레이트(HAMA)(회색 곡선)의 점도를 보여준다. 5 mg/ml rh콜라겐 메타크릴레이트의 점도는 비교를 위해 보고된다(실선형 검정색 곡선). 이들 물질은 아직 가교되지 않았지만 주사 후에는 가교될 것이다. 점도는 물질의 주사성(injectability)을 대표한다. (HAMA - HA 메타크릴레이트; 콜라겐 MA (ColMA) - rh콜라겐 메타크릴레이트.)
도 36은 5:1(실선형 곡선), 2:1(파선형 곡선), 1:2(점선형 곡선)의 collMA:OC 비에서 5 mg/ml CollMA(실선형 검정색 곡선) 및 5 mg/ml 콜라겐 MA + 산화된 셀룰로스(OC)(회색 곡선)의 점도를 보여준다. 5 mg/ml rh콜라겐 메타크릴레이트의 점도는 비교를 위해 보고된다(실선형 검정색 곡선).
도 37은 도 33 내지 도 35로부터의 데이터의 비교를 제공한다. 이는 5:1(실선형 곡선), 2:1(파선형 곡선), 1:2(점선형 곡선)의 비에서 5 mg/ml CollMA(실선형 검정색 곡선) 및 5 mg/ml 콜라겐 MA + 상이한 첨가제(도면에서 표시된 바와 같이 연회색 내지 진회색 곡선)의 점도를 보여준다. 5 mg/ml rh콜라겐 메타크릴레이트의 점도는 비교를 위해 보고된다(실선형 검정색 곡선).
도 38은 2:1의 collMA:첨가제 비에서 rh콜라겐 메타크릴레이트(ColMA) + 첨가제의 중합된 스캐폴드를 보여준다. ColMA 단독은 폴리비닐 알코올 메타크릴레이트(PVMA), 히알루론산 메타크릴레이트(HAMA), 또는 산화된 셀룰로스(OC)와 조합된 ColMA와 비교되었다. 용액은 광개시제 2-하이드록시-4'-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논(0.1%)과 혼합되고, 자외선(uv) 광(365 nm)으로 20초 동안 조사되었다.
도 39는 생존력 연구를 보여준다. 상단 그래프: rh콜라겐-PRP 매트릭스(검정색)로부터 방출되는 GF의 존재 하에, 활성화된 PRP(회색)로부터 방출되는 GF의 존재 하에 배양되고 기아 조건(흰색) 하에 배양된 경우, 정상적인 인간 섬유아세포(nHDF) 생존력(및 증식)의 비교이다. 데이터는 2명의 상이한 공여자로부터 추출된 PRP로 수행된 2개의 상이한 섬유아세포 증식 검정법의 평균이다. *유의한 차이(p<0.0002). 하단 삽도: PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스(a)로부터 방출되는 GF의 존재 하에, 활성화된 PRP(b)로부터 방출되는 GF의 존재 하에 증식되고 기아 조건(c) 하에 배양된 nHDF 세포의 현미경 이미지이다. 이미지는 세포가 접종된 후 7일째에 촬영되었다.
도 40은 스캐폴드 중량을 시간의 함수로서 보여준다(각각의 포인트는 6개의 스캐폴드의 평균이며, 시점 당 2 마리의 래트이고, 래트 당 3회의 주사임).
도 41a 내지 도 41b는 피하 래트 모델을 사용하는 2개의 연구를 보여준다. 피하 래트 모델에서 (a) 시간의 함수로서 PDGF 함량 (b) 시간의 함수로서 VEGF 함량이다. *PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스와 PRP 단독 사이의 유의한 차이(p<0.038) 및 rh콜라겐 매트릭스 단독과 PRP 단독 사이의 유의한 차이(p<0.004)이다. **rh콜라겐 매트릭스 단독과 PRP 단독 사이의 유의한 차이(p<0.021) 및 rh콜라겐 매트릭스 단독과 PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스 사이의 유의한 차이(a), 및 PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스와 PRP 단독 사이의 유의한 차이 및 PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스와 rh콜라겐 매트릭스 단독 사이의 유의한 차이(p<0.007)(b)이다.
도 42는 래트 모델에서 45일(또는 30일)에 걸쳐 주사된 매트릭스 내의 공칭(nominal) PDGF 및 VEGF 함량의 적분을 보여준다.
도 43a 내지 도 43c는 PRP 또는 rh콜라겐/PRP 매트릭스로 치료된 건병증의 래트 모델에서 아킬레스 건의 조직병리학적 채점을 보여준다. (a) 성숙한 섬유증, (b) 단핵 염증 세포의 존재, 및 (c) 미성숙 과립화 조직의 존재.
도 44는 32-게이지 바늘 및 1 ml 주사기로부터 가교 히알루론산(HA)(검정색 곡선 -□), 가교 히알루론산(HA) + 단량체성 콜라겐(▼), 또는 가교 히알루론산(HA) + 원섬유화된 콜라겐(▲)의 주사에 필요한 발현력(expression force)(뉴튼, N)의 비교를 보여준다(Becton Dickinson [BD], ref. 309628). 가교 HA + 단량체성 콜라겐 및 가교 HA + 원섬유화된 콜라겐은 반-상호투과된 네트워크이며, 여기서, 콜라겐은 어떤 것에도 가교되지 않는다.
도 45는 32-게이지 바늘 및 1 ml 주사기로부터 가교 히알루론산(HA)(검정색) 또는 가교 히알루론산(HA)과 콜라겐의 이중 가교된 네트워크(회색)의 주사에 필요한 발현력(뉴튼, N)의 비교를 보여준다(Becton Dickinson [BD], ref. 309628).
도 46은 가교 히알루론산(HA)(검정색), 가교 히알루론산(HA) + 단량체성 콜라겐(▼), 또는 가교 히알루론산(HA) + 원섬유화된 콜라겐(▲)의 점도(eta[η], cP)의 비교를 보여준다.
도 47은 가교 히알루론산(HA)(검정색) 또는 가교 히알루론산(HA)과 콜라겐의 이중 가교된 네트워크(회색)의 점도(eta[η], cP)의 비교를 보여준다.
도 48a 내지 도 48b는 (a) 메타크릴레이트화된 콜라겐(collMA/rh콜라겐MA) 용액의 상부에 놓인 마우스 패치 및 (B) 피부를 통한 백색 발광 다이오드(LED) 토치에 의한 조사 시 피부로 중합되고 통합된 메타크릴레이트화된 콜라겐(collMA/rh콜라겐MA)의 사진을 보여준다.
도 49는 진피 충전제 구성요소의 2개의 예를 보여준다. 좌측면에는 가교 히알루론산(HA) 및 rh콜라겐을 포함하는 반-상호투과된 진피 충전제의 계획이 있다. 우측면에는 가교 히알루론산 및 rh콜라겐을 포함하는 이중 가교된 진피 충전제의 계획이 있으며, 여기서, 가교 HA는 rh콜라겐에 추가로 가교된다. 연회색 막대는 HA-가교제를 표시하며, 검정색 스트랜드는 HA를 나타내고, rh콜라겐은 얇은 회색 스트랜드로서 표시되며, 가교 HA를 rh콜라겐에 가교시키는 제2 가교제는 검정색 원으로서 표시된다.
도 50은 원추(1-도(degree)) 대 플레이트 배치(C35/1)를 사용하는 HAAKE-RHEO STRESS 600TM 기기(THERMO SCIENTIFICTM)를 사용하여 측정된 다양한 이중 가교된 제제에 대한 저장 계수 및 손실 계수의 유변학적 측정을 도시하는 그래프를 보여준다. 주파수 스윕 측정은 0.8%의 일정한 변형 및 0.02 Hz 내지 100 Hz 범위의 주파수에서 수행되었다. 상업적으로 입수 가능한 진피 충전제와 비교하여 대표적인 이중 가교된 제제(표 7 참조)의 저장 계수(실선) 및 손실 계수(파선)이다(실선 및 파선: 검정색 실선 - 상업적으로 입수 가능한 생성물; 실선 ▼- 제제 2; 실선 □ - 제제 2A; 실선 상향 오각형- 제제 3; 실선 하향 오각형 - 제제 1A; 실선 ○ - 제제 1; 파선 ▲ - 상업적으로 입수 가능한 생성물 G''; 파선 ▼ - 제제 2G''; 파선 □ - 제제 2A-G''; 파선 ○- 제제 1G''; 파선 하향 오각형- 제제 1A G''; 파선 상향 오각형 - 제제 3'').
도 51은 도 50에서 보고된 제제의 저장 계수 및 손실 계수의 f=1 Hz에서의 비교를 도시하는 그래프를 보여준다. (열린 막대 G' [Pa]; 회색 막대 G'' [Pa])
도 52는 제제 2, 2A 및 3(표 8)에 사용되는 1 ml LUER-LOKTM 주사기(BECTON-DICKINSONTM) 및 30 G 바늘이 장착된 MULTI-TEST 1-i MECMESINTM 압축 시험기 머신을 사용하여 측정된, 선택된 이중 가교된 제제의 주사성을 도시하는 그래프를 보여준다. 상업적으로 입수 가능한 진피 충전제는 이중 가교된 제제와 비교하기 위해 포함된다. 대표적인 이중 가교된 제제의 플런저 치환(plunger displacement)(12 mm/분)의 함수로서의 발현력이 상업적으로 입수 가능한 진피 충전제와 비교되었다. (검정색 ▲ 상업적으로 입수 가능한 진피 충전제; 회색 □ - 제제 3; 회색 상향 오각형 - 제제 2; 회색 ▼ - 제제 2A)
도 53은 고도로 가교된 히알루론산(HA), rh콜라겐 메타크릴레이트(MA), 및/또는 가시광에 의한 광경화 전의 rh콜라겐(파선) 및 광경화 후의 rh콜라겐(실선)의 다양한 조합(표 10 참조)에 대한 저장 계수 및 손실 계수의 유변학적 측정을 도시하는 그래프를, 고도로 가교된 HA(검정색의 간헐적인 선이 옆으로 되어 있는 삼각형)와 비교하여 보여준다. 광경화 전에, 저장 계수 및 손실 계수는 원추(1-도) 대 플레이트 배치(C35/1)를 사용하는 HAAKE-RHEO STRESS 600TM 기기(THERMO SCIENTIFICTM)를 사용하여 측정되었다. 주파수 스윕 측정은 0.8%의 일정한 변형 및 0.02 Hz 내지 100 Hz 범위의 주파수에서 수행되었다. 광경화(백색 LED 플래시광에 의한 6분 동안의 가시광 조사) 후에, 저장 계수 및 손실 계수는 톱니형 플레이트 대 플레이트 형태(PP20)를 사용하는 HAAKE-RHEO STRESS 600TM 기기(THERMO SCIENTIFICTM)를 사용하여 측정되었다. 주파수 스윕 측정은 3 Pa의 일정한 전단율, 0.02 Hz 내지 100 Hz 범위의 주파수에서 0.3 N의 일정한 정상적인 하중 하에 수행되었다. (실선 ▲ - 제제 4-이후; 실선 ▼ - 제제 5-이후; 실선 □ - 제제 6-이후; 파선 상향 오각형 - 제제 4-이전; 파선 하향 오각형 - 제제 5-이전; 파선 ○ - 제제 6-이전; 파선-점선형의 검정색 옆으로 된 삼각형 - 고도로 가교된 HA)
도 54는 F = 1 Hz의 주파수에서, 표 10에서 제제 4, 5 및 6, 뿐만 아니라 비-경화성의 고도로 가교된 HA의 광경화 전과 후에 저장 계수 및 손실 계수의 비교를 도시하는 그래프를 보여준다. (열린 막대 G' [Pa]; 회색 막대 G'' [Pa])
도 55는 모든 시료에 사용되는 1 ml LUER-LOKTM 주사기(BECTON-DICKINSONTM) 및 30 G 바늘이 장착된 MULTI-TEST 1-i MECMESINTM 압축 시험기 머신을 사용하여 측정된, 선택된 이중 가교된 제제의 주사성을 도시하는 그래프를 보여준다. 대표적인 이중 가교된 제제의 플런저 치환(12 mm/분)의 함수로서의 발현력이 고도로 가교된 HA와 비교되었다. (검정색 ▲ - 고도로 가교된 HA; 회색 ▼- 제제 4; 회색 □ - 제제 5; 회색 ○ -제제 6)
도 56은 제제 2, 2A 및 대조군(상업적으로 입수 가능한 진피 충전제)을 Sprague Dawley 래트의 등 내로 피하 주사한 후 제7일의 대표적인 조직학 이미지를 제시한다. 각각의 사례에서, 화살표는 제제 2 및 2A(중증이 아님)에서 증강된 면역 반응을 나타내며, 이는 조직 재생의 개시를 나타낸다.
도 57은 도 56에서 분석된 조직으로부터 제제 2, 2A 및 대조군의 제7일의 조직학 점수를 제시한다. (검정색 - 대조군; 연회색 제제 2; 진회색 제제 2A)
도 58은 제7일, 제14일 및 제20일에 광경화성 진피 충전제의 광경화성 조직학 채점 결과를 제시한다. (검정색 - 대조군의 고도로 가교된 HA; 회색 - 제제 4 고도로 가교된 HA 및 rhColMA)
도 59는 제제 4(회색 - 고도로 가교된 HA + rhColMA) 대 대조군(검정색 - 고도로 가교된 HA)의 주사 후 제7일 및 제14일에 섬유증 점수 결과를 제시한다.
도 2는 이전에 사용된 다양한 공동-형질전환 접근법을 예시한다. 각각의 발현 카세트는 코딩 서열의 단축 명칭(short name)으로 표시된다. 코딩 서열은 표 1에 명시되어 있다. 각각의 공동-형질전환은 2개의 pBINPLUS 바이너리 벡터에 의해 수행되었다. 각각의 직사각형은 1, 2 또는 3개의 발현 카세트를 운반하는 단일 pBINPLUS 벡터를 나타낸다. 프로모터 및 종결자는 실시예 1에 명시되어 있다.
도 3은 콜라겐 알파 1(324 bp 단편) 또는 콜라겐 알파 2(537 bp 단편) 또는 둘 다에 대해 양성인 식물을 보여주는 형질전환체의 이전의 멀티플렉스 PCR 스크리닝이다.
도 4는 공동-형질전환 2, 3 및 4에 의해 생성된 유전자이식 식물의 이전의 웨스턴 블롯 분석이다. 총 가용성 단백질은 담배 공동-형질전환체 #2, #3 및 #4로부터 추출되었고, 항-콜라겐 I 항체(Chemicon Inc.로부터의 #AB745)로 시험되었다. 크기 마커는 Fermentas Inc.로부터의 #SM0671이었다. W.T.는 야생형 담배이다. 양성 콜라겐 밴드는 콜라겐 I형 알파 1 또는 알파 2 또는 둘 다에 대해 PCR 양성인 식물에서 가시적이다. 인간 태반으로부터의 500 ng 콜라겐 I형의 양성 대조군 밴드(인간 태반으로부터 펩신 분해에 의해 추출된, Chemicon Inc.로부터의 #CC050)는 유전자이식 식물로부터의 시료에서 총 가용성 단백질(약 150 μg) 중 약 0.3%를 나타낸다. 인간 콜라겐 시료에서 약 140 kDa에서의 더 큰 밴드는 콜라겐 I형 항체(Chemicon Inc.로부터의 #MAB1913)의 항 카르복시-말단 프로-펩타이드에 의해 검출 가능한 바와 같은 이의 C-프로펩타이드를 갖는 프로콜라겐이다. 인간 콜라겐 시료에서 약 120 kDa에서의 더 작은 밴드는 프로펩타이드가 없는 콜라겐이다. 프롤린 풍부 단백질(콜라겐 포함)은 이의 흔치 않은 조성으로 인해, 폴리아크릴아미드 겔 상에서 예상된 것보다 더 높은 분자 질량을 갖는 밴드로서 일관적으로 이동한다. 따라서, 약 95 kDa의 분자량을 갖는 프로펩타이드가 없는 콜라겐 사슬은 약 120 kDa의 밴드로서 이동한다.
도 5는 공동-형질전환 #8(콜라겐 사슬에 번역적으로 융합된 아포플라스트 신호를 운반함)에 의해 생성된 유전자이식 식물의 이전의 웨스턴 블롯 분석이다. 총 가용성 단백질은 유전자이식 담배 잎으로부터 추출되었고, 항-콜라겐 I 항체(Chemicon Inc.로부터의 #AB745)로 시험되었다. 양성 콜라겐 알파 2 밴드는 식물 8-141에서 가시적이다. 인간 태반으로부터의 콜라겐 I형(Chemicon Inc.로부터의 #CC050)은 대조군으로서 역할을 한다.
도 6a 및 도 6b는 열 처리 및 트립신 또는 펩신 분해에 의해 이전에 정성화된 바와 같이 콜라겐 삼중 나선 조립 및 열적 안정성을 예시한다. 도 6a에서, 담배 2-9(콜라겐 알파1만 발현하고 P4H를 발현하지 않음) 및 3-5(콜라겐 알파 1+2 둘 다 및 인간 P4H 알파 및 베타 서브유닛을 발현함)로부터의 총 가용성 단백질은 열 처리(38℃ 또는 43℃에서 15분)되었고, 뒤이어 트립신 분해(실온[RT]에서 20분)되고, 웨스턴 블롯 절차에서 항-콜라겐 I 항체로 시험되었다. 양성 대조군은 w.t. 담배의 500 ng 인간 콜라겐 I+총 가용성 단백질의 시료였다. 도 6b에서, 총 가용성 단백질은 유전자이식 담배 13-6(화살표에 의해 표시된 콜라겐 I 알파 1 및 알파 2 사슬, 인간 P4H 알파 및 베타 서브유닛 및 인간 LH3을 발현함)으로부터 추출되고, 열 처리(33℃, 38℃ 또는 42℃에서 20분)되며, 얼음 상에서 즉각적으로 냉각되어, 삼중 나선의 재조립을 방지하고, 실온(약 22℃)에서 30분 동안 펩신과 함께 인큐베이션되고, 뒤이어 표준 웨스턴 블롯 절차에서 항-콜라겐 I 항체(Chemicon Inc.로부터의 #AB745)로 시험되었다. 양성 대조군은 50 ng 인간 콜라겐 I(펩신 분해에 의해 인간 태반으로부터 추출된, Chemicon Inc.로부터의 #CC050)의 시료였으며, 이는 야생형(w.t., wt) 담배로부터 추출된 총 가용성 단백질에 첨가되었다.
도 7은 야생형 담배 상에서 수행된 이전의 노던 블롯 분석을 예시한다. 블롯은 담배 P4H cDNA로 프로브화되었다.
도 8은 공동-형질전환 2, 3 및 13에 의해 생성된 유전자이식 식물의 이전의 웨스턴 블롯 분석이다. 총 가용성 단백질은 담배 공동-형질전환체로부터 추출되고, 항-인간 P4H 알파와 베타 및 항-콜라겐 I 항체로 시험되었다.
도 9는 정상적인 광 요법 하에 성장된 교잡 육종 액포 표적화된 식물 A(2-300 +20-279); 및 암실에서 8일 동안 성장된 13-652 액포 표적화된 식물의 이전의 웨스턴 블롯 분석(레인 1)이다. 모든 식물은 외인성 col1, col2, P4H-알파 및 P4H-베타, 뿐만 아니라 LH3(PCR 확증됨)를 발현한다.
도 10은 트립신에 의한 분해 후 담배-잎 유래의 정제된 콜라겐을 보여준다. 콜라겐은 재료 및 방법 섹션에 상술된 바와 같이, 100 mM Tris 완충제에서 분쇄된 담배 식물 유전자이식 잎 라인 넘버 13-6으로부터 정제되며, 원심분리되고, 단백질분해되며, 높은 염 농도 충전제에서 침전되었다. 재현탁 후, 콜라겐-함유 펠렛은 세척되며, 투석되고, 최종 생성물로 농축되었다. 이러한 겔은 수집된 콜라겐 시료의 쿠마시 염색 분석을 도시하며, 이때, 레인 1 및 레인 2는 300 mg/L 트립신에 의한 프로콜라겐의 분해 후 생성된 콜라겐이다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(0.5 mg/ml)이 로딩되었고, 콜라겐 1형 알파 1 및 알파 2 사슬에 대한 양성 대조군으로서 진행되었다.
도 11은 다양한 농도의 트립신에 의한 분해 후 담배-잎 유래의 정제된 콜라겐을 보여준다. 콜라겐은 20 mg/L 트립신(레인 1 내지 7) 또는 30 mg/L(레인 8 내지 10)에 의한 분해 후 도 10에서와 같이 추출되고 정제되었다. 생성물은 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 쿠마시계 염색 용액으로 분석되었다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(0.5 mg/ml)이 로딩되었고, 콜라겐 1형 알파 1 및 알파 2 사슬에 대한 양성 대조군으로서 진행되었다.
도 12는 트립신 및 펩신에 의한 분해 후 담배-잎 유래의 정제된 콜라겐을 보여준다. 콜라겐은 30 mg/L 트립신 및 1 μg/200 ml 펩신(레인 1 내지 2)에 의한 분해 후 도 10에서와 같이 추출되고 정제되었다. 생성물은 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 쿠마시계 염색 용액으로 분석되었다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(0.5 mg/ml)이 로딩되었고, 콜라겐 1형 알파 1 및 알파 2 사슬에 대한 양성 대조군으로서 진행되었다.
도 13은 서브틸리신(Subtilisin) 또는 브로멜라인(Bromelain)에 의한 프로콜라겐의 분해 시 수득된 콜라겐 사슬을 보여준다. 콜라겐은 100 mM Tris 완충제에서 분쇄된 담배 식물 유전자이식 잎 라인 넘버 13-361로부터 정제되며, 원심분리되고, 3시간 또는 6시간 동안 인큐베이션된 서브틸리신(1 내지 25 mg/L) 또는 브로멜라인(1 내지 25 mg/L)에 의해 단백질분해되었다. 시료는 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 니트로셀룰로스 막에 블롯팅되었다. 콜라겐 사슬은 항-콜라겐 I을 사용하여 면역검출되었다. 균질화 및 원심분리 후 수집된 비처리된 상층액은 콜라겐-무함유 음성 대조군(레인 3 내지 4sup)으로서 역할을 하였다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(2.5 μg)은 알파 1 및 알파 2 사슬(레인 1)에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
도 14는 파파인에 의한 프로콜라겐의 분해 시 수득된 콜라겐 사슬을 보여준다. 콜라겐은 100 mM Tris 완충제에서 분쇄된 담배 식물 유전자이식 잎 라인 넘버 13-361로부터 정제되며, 원심분리되고, 3시간 또는 6시간의 인큐베이션 기간에 걸쳐 파파인(1 내지 25 mg/L)으로 단백질분해되었다. 시료는 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 니트로셀룰로스 막에 블롯팅되었다. 콜라겐 사슬은 항-콜라겐 I을 사용하여 면역검출되었다. 균질화, 원심분리 및 효소 없이 15℃에서 3시간 동안(레인 3) 또는 6시간(레인 2) 동안의 인큐베이션 후 수집된 비처리된 상층액은 콜라겐-무함유 음성 대조군으로서 역할을 하였다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(2.5 μg)은 알파 1 및 알파 2 사슬(레인 1)에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
도 15는 피신 또는 사비나제(Savinase)에 의한 프로콜라겐의 분해 시 수득된 콜라겐 사슬을 보여준다. 콜라겐은 100 mM Tris 완충제에서 분쇄된 담배 식물 유전자이식 잎 라인 넘버 13-361로부터 정제되며, 원심분리되고, 3시간 또는 6시간의 인큐베이션 기간에 걸쳐 피신(1 내지 25 mg/L) 또는 사비나제(1 내지 25 mg/L)로 단백질분해되었다. 시료는 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 니트로셀룰로스 막에 블롯팅되었다. 콜라겐 사슬은 항-콜라겐 I을 사용하여 면역검출되었다. 단백질분해 전 수집된 비처리된 상층액은 콜라겐-무함유 음성 대조군(레인 3)으로서 역할을 하였다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(2.5 μg)은 알파 1 및 알파 2 사슬(레인 1)에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
도 16은 프로타멕스(Protamex) 또는 알칼라제(Alcalase)에 의한 프로콜라겐의 분해 시 수득된 콜라겐 사슬을 보여준다. 콜라겐은 100 mM Tris 완충제에서 분쇄된 담배 식물 유전자이식 잎 라인 넘버 13-361로부터 정제되며, 원심분리되고, 3시간 또는 6시간의 인큐베이션 기간에 걸쳐 프로타멕스(1 내지 25 mg/L) 또는 알칼라제(1 내지 25 mg/L)로 단백질분해되었다. 시료는 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 니트로셀룰로스 막에 블롯팅되었다. 콜라겐 사슬은 항-콜라겐 I을 사용하여 면역검출되었다. 단백질분해 전 수집된 비처리된 상층액은 콜라겐-무함유 음성 대조군(레인 14)으로서 역할을 하였다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(2.5 μg)은 알파 1 및 알파 2 사슬(레인 1)에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
도 17은 에스페라제(Esperase) 또는 뉴트라제(Neutrase)에 의한 프로콜라겐의 분해 시 수득된 콜라겐 사슬을 보여준다. 콜라겐은 100 mM Tris 완충제에서 분쇄된 담배 식물 유전자이식 잎 라인 넘버 13-361로부터 정제되며, 원심분리되고, 3시간 또는 6시간의 인큐베이션 기간 후 에스페라제(1 내지 25 mg/L) 또는 뉴트라제(1 내지 25 mg/L)로 단백질분해되었다. 시료는 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 니트로셀룰로스 막에 블롯팅되었다. 콜라겐 사슬은 항-콜라겐 I을 사용하여 면역검출되었다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(2.5 μg)은 알파 1 및 알파 2 사슬(레인 1)에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
도 18은 에스페라제 8.0 L 또는 알칼라제에 의한 프로콜라겐의 분해 시 수득된 콜라겐 사슬을 보여준다. 콜라겐은 100 mM Tris 완충제에서 분쇄된 담배 식물 유전자이식 잎 라인 넘버 13-361로부터 정제되며, 원심분리되고, 3시간 또는 6시간의 인큐베이션 기간 후 에스페라제(1 내지 25 mg/L) 또는 뉴트라제(1 내지 25 mg/L)로 단백질분해되었다. 시료는 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 니트로셀룰로스 막에 블롯팅되었다. 콜라겐 사슬은 항-콜라겐 I을 사용하여 면역검출되었다. 균질화, 원심분리 및 단백질분해성 효소 없이 15℃에서 3시간 동안(레인 3) 또는 6시간(레인 2) 동안의 인큐베이션 후 수집된 비처리된 상층액은 콜라겐-무함유 음성 대조군으로서 역할을 하였다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(2.5 μg)은 알파 1 및 알파 2 사슬(레인 1)에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
도 19는 피신에 의한 프로콜라겐의 분해 후 다양한 정제 단계에서 수득된 콜라겐 사슬을 보여준다. 콜라겐은 100 mM Tris 완충제에서 분쇄된 담배 식물 유전자이식 잎 라인 넘버 13-361로부터 정제되며, 원심분리되고, 15℃에서 3시간의 인큐베이션 기간 후 피신(5 mg/L)으로 단백질분해되었다. 시료는 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 니트로셀룰로스 막에 블롯팅되었다. 콜라겐 사슬은 항-콜라겐 I을 사용하여 면역검출되었다. 분쇄, 원심분리 및 상층액과 피신의 인큐베이션 후 수집된 시료는 레인 5에 로딩되었다. 레인 6 내지 레인 14는 정제 과정 중 상이한 단계에서 피신-처리된 콜라겐의 시료를 도시한다: 레인 6: 피신 인큐베이션 및 원심분리 후 시료; 레인 7: 염 침전 및 0.5 M 아세트산 중 재현탁 후; 레인 8: 부가된 원심분리 단계와 함께 레인 7에서와 같은 시료; 레인 9: 0.5 M 아세트산 중 재현탁 및 원심분리 후 레인 8에서와 같은 시료; 레인 10: 10 mM HCl 중 재현탁 및 투석 후 성숙한 콜라겐 레인 11: 부가적인 여과 단계와 함께 레인 10에서와 같은 시료; 레인 12:부가적인 5X 농축 단계와 함께 레인 11에서와 같은 시료; 레인 13: 부가적인 20X 농축 단계와 함께 레인 11에서와 같은 시료; 레인 14: 부가적인 5X 농축 단계와 함께 레인 13에서와 같은 시료. 비처리된 프로콜라겐 시료(레인 3 내지 4)는 음성 대조군으로서 역할을 하였다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(2.5 μg)은 알파 1 및 알파 2 사슬(레인 1)에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
도 20은 피신에 의한 프로콜라겐의 분해 후 다양한 정제 단계에서 수득된 콜라겐 사슬을 보여준다. 콜라겐은 100 mM Tris 완충제에서 분쇄된 담배 식물 유전자이식 잎 라인 넘버 13-361로부터 정제되며, 원심분리되고, 15℃에서 3시간의 인큐베이션 기간 후 피신(5 mg/L)으로 단백질분해되었다. 시료는 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 니트로셀룰로스 막에 블롯팅되었다. 콜라겐 사슬은 항-콜라겐 I을 사용하여 면역검출되었다. 분쇄, 원심분리 및 상층액과 피신의 인큐베이션 후 수집된 시료는 레인 5에 로딩되었다. 레인 6 내지 레인 14는 정제 과정 중 상이한 단계에서 피신-처리된 콜라겐의 시료를 도시한다: 레인 6: 피신 인큐베이션 및 원심분리 후 시료; 레인 7: 염 침전 및 0.5 M 아세트산 중 재현탁 후; 레인 8: 부가된 원심분리 단계와 함께 레인 7에서와 같은 시료; 레인 9: 0.5 M 아세트산 중 재현탁 및 원심분리 후 레인 8에서와 같은 시료; 레인 10: 10 mM HCl 중 재현탁 및 투석 후 성숙한 콜라겐 레인 11: 부가적인 여과 단계와 함께 레인 10에서와 같은 시료; 레인 12:부가적인 5X 농축 단계와 함께 레인 11에서와 같은 시료; 레인 13: 부가적인 20X 농축 단계와 함께 레인 11에서와 같은 시료; 레인 14: 부가적인 5X 농축 단계와 함께 레인 13에서와 같은 시료. 비처리된 프로콜라겐 시료(레인 3 내지 4)는 음성 대조군으로서 역할을 하였다. 프로펩타이드-무함유 돼지-유래 콜라겐(2.5 μg)은 알파 1 및 알파 2 사슬(레인 1)에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다.
도 21은 정제의 다양한 단계에서 포스트-피신 처리된 시료의 콜라겐 함량을 보여준다. 콜라겐-함유 시료는 재료 및 방법 섹션에서 기재된 반응기 크기 AMS-기초 정제 절차의 각각의 추출 및 정제 단계에서 수집되었다. 시료는 프로펩타이드 제거를 위해 피신(5 mg/L, 15℃, 3시간)으로 처리되었으며, 10% SDS PAGE 상에서 분리되고, 쿠마시계 염색 용액으로 염색되었다.
도 22는 식용-등급 피신에 의한 프로콜라겐 절단의 최적화: 피신 농도 및 반응 시간의 최적화를 보여준다. AMS-펠렛화된 프로콜라겐-발현 담배 잎 추출물은 추출 완충제에 재현탁된 다음, 증가하는 농도의 식용-등급 피신(5 내지 15 mg/L)과 함께 인큐베이션되었다. 그 후에, 반응 혼합물은 15℃에서 1시간 내지 3시간 동안 인큐베이션되었다. 절단은 원심분리에 의해 종료되었고, 단백질 시료는 8% SDS-PAGE 상에서 분리되며, 니트로셀룰로스 막으로 이전되고, 항-콜라겐 I과 함께 알파-1 및 알파-2 콜라겐 사슬에 대해 면역블로팅되었다. 프로콜라겐 밴드는 백색 화살표로 표시되는 한편, 적색 화살표는 절단된 콜라겐 밴드를 표시한다.
도 23a 내지 도 23c는 약제-등급 피신에 의한 프로콜라겐 절단의 최적화: 피신 농도 및 반응 시간의 최적화를 보여준다. AMS-펠렛화된 프로콜라겐-발현 담배 잎 추출물은 추출 완충제에 재현탁된 다음, 증가하는 농도의 약제-등급 피신(2.5 내지 10 mg/L)과 함께 인큐베이션되었다. 그 후에, 반응 혼합물은 15℃에서 0.5시간 내지 3시간 동안 인큐베이션되었다. 절단은 원심분리에 의해 종료되었고, 단백질 시료는 8% SDS-PAGE 상에서 분리되며, 니트로셀룰로스 막으로 이전되고, 항-콜라겐 I과 함께 알파-1 및 알파-2 콜라겐 사슬에 대해 면역블로팅되었다. 화살표는 프로콜라겐 밴드 및 콜라겐 밴드를 표시한다.
도 24a 내지 도 24b는 약제-등급 피신에 의한 프로콜라겐 절단의 최적화: 반응 완충제에서 pH 및 염 농도의 최적화를 보여준다. AMS-펠렛화된 프로콜라겐-발현 담배 잎 추출물은 다양한 pH 값(5.5 내지 9.5)에서 증가하는 NaCl 농도(0.5 M 내지 3 M)로 10 mg/L 약제-등급 피신을 함유하는 추출 완충제에 재현탁되었다. 그 후에, 반응 혼합물은 15℃에서 1시간 동안 인큐베이션되었다. 절단은 원심분리에 의해 종료되었고, 생성된 펠렛과 상층액 둘 다의 단백질 시료는 8% SDS-PAGE 상에서 분리되며, 니트로셀룰로스 막으로 이전되고, 항-콜라겐 I과 함께 알파-1 및 알파-2 콜라겐 사슬에 대해 면역블로팅되었다. 화살표는 콜라겐 밴드를 표시한다.
도 25는 약제-등급 피신에 의한 프로콜라겐 절단의 최적화: 반응 완충제에서 EDTA 및 L-시스테인 농도의 최적화를 보여준다. AMS-펠렛화된 프로콜라겐-발현 담배 잎 추출물은 다양한 농도의 L-시스테인(10 mM 내지 100 mM--농도의 상단 패널) 및 EDTA(8 mM 내지 80 mM--농도의 하단 패널)를 함유하는 추출 완충제(pH 7.5)에 재현탁되었다. 그 후에, 시료는 15℃에서 1시간 동안 1 mg/L 약제-등급 피신과 함께 인큐베이션되었다. 절단은 원심분리에 의해 종료되었고, 단백질 시료는 8% SDS-PAGE 상에서 분리되며, 니트로셀룰로스 막으로 이전되고, 항-콜라겐 I과 함께 알파-1 및 알파-2 콜라겐 사슬에 대해 면역블로팅되었다.
도 26은 pH 7.5에서 재조합 트립신에 의한 효과적인 프로콜라겐 분해를 보여준다. AMS-펠렛화된 프로콜라겐-발현 담배 잎 추출물은 L-시스테인 및 EDTA를 함유하는 추출 완충제(pH 7.5)에 재현탁되었다. 그 후에, 시료는 15℃에서 1시간 내지 3시간 동안 30 mg/L 내지 100 mg/L 재조합 트립신과 함께 인큐베이션되었다. 절단은 원심분리에 의해 종료되었고, 단백질 시료는 8% SDS-PAGE 상에서 분리되며, 니트로셀룰로스 막으로 이전되고, 항-콜라겐 I과 함께 알파-1 및 알파-2 콜라겐 사슬에 대해 면역블로팅되었다.
도 27은 점도(eta[η], cP)를 전단율의 함수로서 보여주며, 실선- 포스페이트 완충 식염수(PBS) 중 2.7 mg/mL 소 콜라겐, 파선 PBS 중 2.79 mg/mL rh콜라겐. ▼: 4℃에서의 측정, ▲: 37℃에서의 측정이다.
도 28은 점도를 전단율의 함수로서 보여주며, FB 중 3.4 mg/mL 소 콜라겐. ▼: 4℃에서의 측정, ▲: 37℃에서 측정이다.
도 29는 점도를 전단율의 함수로서 보여주며, PBS 중 10 mg/mL rh콜라겐-MA. ▲: 4℃에서의 측정, ▼: 37℃에서 측정이다.
도 30은 HA/ HAMA의 첨가와 함께 그리고 첨가 없이 DMEM 중 rh콜라겐-MA의 점도 측정을 보여준다.
도 31은 광가교 전(상단 그래프)과 후(하단 그래프)에 상이한 농도에서 rh콜라겐-MA 제제의 저장 계수 및 손실 계수와 tan 위상 천이각(phase shift angle)을 보여준다.
도 32는 주파수 스윕(frequency sweep) 시험에서 기록되고 1 Hz에서 플롯화된 37℃에서의 G' 및 G" 값을 보여준다.
도 33a 내지 도 33c는 rh콜라겐 및 rh콜라겐 메타크릴레이트의 가공에 대한 순서도를 제공한다. 도 33a는 프로콜라겐 및 콜라겐의 업스트림 단리 및 가공을 보여준다(단계 A 내지 단계 H). 도 33b 내지 도 33c는 다운스트림 가공의 2개 위상을 보여준다(각각 단계 I 내지 단계 M 및 단계 N 내지 단계 P 및 단계 Z).
도 34는 5:1(실선형 곡선), 2:1(파선형 곡선), 1:2(점선형 곡선)의 collMA:PVAMA 비에서 5 mg/ml rh콜라겐 메타크릴레이트(CollMA)(실선형 검정색 곡선) 및 5 mg/ml 콜라겐 MA + 폴리비닐 알코올 메타크릴레이트(PVMA)(연회색 곡선)의 점도(eta[η], cP)를 보여준다. 5 mg/ml rh콜라겐 메타크릴레이트의 점도는 비교를 위해 보고된다(검정색 곡선).
도 35는 5:1(실선형 곡선), 2:1(파선형 곡선)의 collMA:HAMA 비에서 5 mg/ml CollMA(실선형 검정색 곡선) 및 5 mg/ml 콜라겐 MA + 히알루론산 메타크릴레이트(HAMA)(회색 곡선)의 점도를 보여준다. 5 mg/ml rh콜라겐 메타크릴레이트의 점도는 비교를 위해 보고된다(실선형 검정색 곡선). 이들 물질은 아직 가교되지 않았지만 주사 후에는 가교될 것이다. 점도는 물질의 주사성(injectability)을 대표한다. (HAMA - HA 메타크릴레이트; 콜라겐 MA (ColMA) - rh콜라겐 메타크릴레이트.)
도 36은 5:1(실선형 곡선), 2:1(파선형 곡선), 1:2(점선형 곡선)의 collMA:OC 비에서 5 mg/ml CollMA(실선형 검정색 곡선) 및 5 mg/ml 콜라겐 MA + 산화된 셀룰로스(OC)(회색 곡선)의 점도를 보여준다. 5 mg/ml rh콜라겐 메타크릴레이트의 점도는 비교를 위해 보고된다(실선형 검정색 곡선).
도 37은 도 33 내지 도 35로부터의 데이터의 비교를 제공한다. 이는 5:1(실선형 곡선), 2:1(파선형 곡선), 1:2(점선형 곡선)의 비에서 5 mg/ml CollMA(실선형 검정색 곡선) 및 5 mg/ml 콜라겐 MA + 상이한 첨가제(도면에서 표시된 바와 같이 연회색 내지 진회색 곡선)의 점도를 보여준다. 5 mg/ml rh콜라겐 메타크릴레이트의 점도는 비교를 위해 보고된다(실선형 검정색 곡선).
도 38은 2:1의 collMA:첨가제 비에서 rh콜라겐 메타크릴레이트(ColMA) + 첨가제의 중합된 스캐폴드를 보여준다. ColMA 단독은 폴리비닐 알코올 메타크릴레이트(PVMA), 히알루론산 메타크릴레이트(HAMA), 또는 산화된 셀룰로스(OC)와 조합된 ColMA와 비교되었다. 용액은 광개시제 2-하이드록시-4'-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논(0.1%)과 혼합되고, 자외선(uv) 광(365 nm)으로 20초 동안 조사되었다.
도 39는 생존력 연구를 보여준다. 상단 그래프: rh콜라겐-PRP 매트릭스(검정색)로부터 방출되는 GF의 존재 하에, 활성화된 PRP(회색)로부터 방출되는 GF의 존재 하에 배양되고 기아 조건(흰색) 하에 배양된 경우, 정상적인 인간 섬유아세포(nHDF) 생존력(및 증식)의 비교이다. 데이터는 2명의 상이한 공여자로부터 추출된 PRP로 수행된 2개의 상이한 섬유아세포 증식 검정법의 평균이다. *유의한 차이(p<0.0002). 하단 삽도: PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스(a)로부터 방출되는 GF의 존재 하에, 활성화된 PRP(b)로부터 방출되는 GF의 존재 하에 증식되고 기아 조건(c) 하에 배양된 nHDF 세포의 현미경 이미지이다. 이미지는 세포가 접종된 후 7일째에 촬영되었다.
도 40은 스캐폴드 중량을 시간의 함수로서 보여준다(각각의 포인트는 6개의 스캐폴드의 평균이며, 시점 당 2 마리의 래트이고, 래트 당 3회의 주사임).
도 41a 내지 도 41b는 피하 래트 모델을 사용하는 2개의 연구를 보여준다. 피하 래트 모델에서 (a) 시간의 함수로서 PDGF 함량 (b) 시간의 함수로서 VEGF 함량이다. *PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스와 PRP 단독 사이의 유의한 차이(p<0.038) 및 rh콜라겐 매트릭스 단독과 PRP 단독 사이의 유의한 차이(p<0.004)이다. **rh콜라겐 매트릭스 단독과 PRP 단독 사이의 유의한 차이(p<0.021) 및 rh콜라겐 매트릭스 단독과 PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스 사이의 유의한 차이(a), 및 PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스와 PRP 단독 사이의 유의한 차이 및 PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스와 rh콜라겐 매트릭스 단독 사이의 유의한 차이(p<0.007)(b)이다.
도 42는 래트 모델에서 45일(또는 30일)에 걸쳐 주사된 매트릭스 내의 공칭(nominal) PDGF 및 VEGF 함량의 적분을 보여준다.
도 43a 내지 도 43c는 PRP 또는 rh콜라겐/PRP 매트릭스로 치료된 건병증의 래트 모델에서 아킬레스 건의 조직병리학적 채점을 보여준다. (a) 성숙한 섬유증, (b) 단핵 염증 세포의 존재, 및 (c) 미성숙 과립화 조직의 존재.
도 44는 32-게이지 바늘 및 1 ml 주사기로부터 가교 히알루론산(HA)(검정색 곡선 -□), 가교 히알루론산(HA) + 단량체성 콜라겐(▼), 또는 가교 히알루론산(HA) + 원섬유화된 콜라겐(▲)의 주사에 필요한 발현력(expression force)(뉴튼, N)의 비교를 보여준다(Becton Dickinson [BD], ref. 309628). 가교 HA + 단량체성 콜라겐 및 가교 HA + 원섬유화된 콜라겐은 반-상호투과된 네트워크이며, 여기서, 콜라겐은 어떤 것에도 가교되지 않는다.
도 45는 32-게이지 바늘 및 1 ml 주사기로부터 가교 히알루론산(HA)(검정색) 또는 가교 히알루론산(HA)과 콜라겐의 이중 가교된 네트워크(회색)의 주사에 필요한 발현력(뉴튼, N)의 비교를 보여준다(Becton Dickinson [BD], ref. 309628).
도 46은 가교 히알루론산(HA)(검정색), 가교 히알루론산(HA) + 단량체성 콜라겐(▼), 또는 가교 히알루론산(HA) + 원섬유화된 콜라겐(▲)의 점도(eta[η], cP)의 비교를 보여준다.
도 47은 가교 히알루론산(HA)(검정색) 또는 가교 히알루론산(HA)과 콜라겐의 이중 가교된 네트워크(회색)의 점도(eta[η], cP)의 비교를 보여준다.
도 48a 내지 도 48b는 (a) 메타크릴레이트화된 콜라겐(collMA/rh콜라겐MA) 용액의 상부에 놓인 마우스 패치 및 (B) 피부를 통한 백색 발광 다이오드(LED) 토치에 의한 조사 시 피부로 중합되고 통합된 메타크릴레이트화된 콜라겐(collMA/rh콜라겐MA)의 사진을 보여준다.
도 49는 진피 충전제 구성요소의 2개의 예를 보여준다. 좌측면에는 가교 히알루론산(HA) 및 rh콜라겐을 포함하는 반-상호투과된 진피 충전제의 계획이 있다. 우측면에는 가교 히알루론산 및 rh콜라겐을 포함하는 이중 가교된 진피 충전제의 계획이 있으며, 여기서, 가교 HA는 rh콜라겐에 추가로 가교된다. 연회색 막대는 HA-가교제를 표시하며, 검정색 스트랜드는 HA를 나타내고, rh콜라겐은 얇은 회색 스트랜드로서 표시되며, 가교 HA를 rh콜라겐에 가교시키는 제2 가교제는 검정색 원으로서 표시된다.
도 50은 원추(1-도(degree)) 대 플레이트 배치(C35/1)를 사용하는 HAAKE-RHEO STRESS 600TM 기기(THERMO SCIENTIFICTM)를 사용하여 측정된 다양한 이중 가교된 제제에 대한 저장 계수 및 손실 계수의 유변학적 측정을 도시하는 그래프를 보여준다. 주파수 스윕 측정은 0.8%의 일정한 변형 및 0.02 Hz 내지 100 Hz 범위의 주파수에서 수행되었다. 상업적으로 입수 가능한 진피 충전제와 비교하여 대표적인 이중 가교된 제제(표 7 참조)의 저장 계수(실선) 및 손실 계수(파선)이다(실선 및 파선: 검정색 실선 - 상업적으로 입수 가능한 생성물; 실선 ▼- 제제 2; 실선 □ - 제제 2A; 실선 상향 오각형- 제제 3; 실선 하향 오각형 - 제제 1A; 실선 ○ - 제제 1; 파선 ▲ - 상업적으로 입수 가능한 생성물 G''; 파선 ▼ - 제제 2G''; 파선 □ - 제제 2A-G''; 파선 ○- 제제 1G''; 파선 하향 오각형- 제제 1A G''; 파선 상향 오각형 - 제제 3'').
도 51은 도 50에서 보고된 제제의 저장 계수 및 손실 계수의 f=1 Hz에서의 비교를 도시하는 그래프를 보여준다. (열린 막대 G' [Pa]; 회색 막대 G'' [Pa])
도 52는 제제 2, 2A 및 3(표 8)에 사용되는 1 ml LUER-LOKTM 주사기(BECTON-DICKINSONTM) 및 30 G 바늘이 장착된 MULTI-TEST 1-i MECMESINTM 압축 시험기 머신을 사용하여 측정된, 선택된 이중 가교된 제제의 주사성을 도시하는 그래프를 보여준다. 상업적으로 입수 가능한 진피 충전제는 이중 가교된 제제와 비교하기 위해 포함된다. 대표적인 이중 가교된 제제의 플런저 치환(plunger displacement)(12 mm/분)의 함수로서의 발현력이 상업적으로 입수 가능한 진피 충전제와 비교되었다. (검정색 ▲ 상업적으로 입수 가능한 진피 충전제; 회색 □ - 제제 3; 회색 상향 오각형 - 제제 2; 회색 ▼ - 제제 2A)
도 53은 고도로 가교된 히알루론산(HA), rh콜라겐 메타크릴레이트(MA), 및/또는 가시광에 의한 광경화 전의 rh콜라겐(파선) 및 광경화 후의 rh콜라겐(실선)의 다양한 조합(표 10 참조)에 대한 저장 계수 및 손실 계수의 유변학적 측정을 도시하는 그래프를, 고도로 가교된 HA(검정색의 간헐적인 선이 옆으로 되어 있는 삼각형)와 비교하여 보여준다. 광경화 전에, 저장 계수 및 손실 계수는 원추(1-도) 대 플레이트 배치(C35/1)를 사용하는 HAAKE-RHEO STRESS 600TM 기기(THERMO SCIENTIFICTM)를 사용하여 측정되었다. 주파수 스윕 측정은 0.8%의 일정한 변형 및 0.02 Hz 내지 100 Hz 범위의 주파수에서 수행되었다. 광경화(백색 LED 플래시광에 의한 6분 동안의 가시광 조사) 후에, 저장 계수 및 손실 계수는 톱니형 플레이트 대 플레이트 형태(PP20)를 사용하는 HAAKE-RHEO STRESS 600TM 기기(THERMO SCIENTIFICTM)를 사용하여 측정되었다. 주파수 스윕 측정은 3 Pa의 일정한 전단율, 0.02 Hz 내지 100 Hz 범위의 주파수에서 0.3 N의 일정한 정상적인 하중 하에 수행되었다. (실선 ▲ - 제제 4-이후; 실선 ▼ - 제제 5-이후; 실선 □ - 제제 6-이후; 파선 상향 오각형 - 제제 4-이전; 파선 하향 오각형 - 제제 5-이전; 파선 ○ - 제제 6-이전; 파선-점선형의 검정색 옆으로 된 삼각형 - 고도로 가교된 HA)
도 54는 F = 1 Hz의 주파수에서, 표 10에서 제제 4, 5 및 6, 뿐만 아니라 비-경화성의 고도로 가교된 HA의 광경화 전과 후에 저장 계수 및 손실 계수의 비교를 도시하는 그래프를 보여준다. (열린 막대 G' [Pa]; 회색 막대 G'' [Pa])
도 55는 모든 시료에 사용되는 1 ml LUER-LOKTM 주사기(BECTON-DICKINSONTM) 및 30 G 바늘이 장착된 MULTI-TEST 1-i MECMESINTM 압축 시험기 머신을 사용하여 측정된, 선택된 이중 가교된 제제의 주사성을 도시하는 그래프를 보여준다. 대표적인 이중 가교된 제제의 플런저 치환(12 mm/분)의 함수로서의 발현력이 고도로 가교된 HA와 비교되었다. (검정색 ▲ - 고도로 가교된 HA; 회색 ▼- 제제 4; 회색 □ - 제제 5; 회색 ○ -제제 6)
도 56은 제제 2, 2A 및 대조군(상업적으로 입수 가능한 진피 충전제)을 Sprague Dawley 래트의 등 내로 피하 주사한 후 제7일의 대표적인 조직학 이미지를 제시한다. 각각의 사례에서, 화살표는 제제 2 및 2A(중증이 아님)에서 증강된 면역 반응을 나타내며, 이는 조직 재생의 개시를 나타낸다.
도 57은 도 56에서 분석된 조직으로부터 제제 2, 2A 및 대조군의 제7일의 조직학 점수를 제시한다. (검정색 - 대조군; 연회색 제제 2; 진회색 제제 2A)
도 58은 제7일, 제14일 및 제20일에 광경화성 진피 충전제의 광경화성 조직학 채점 결과를 제시한다. (검정색 - 대조군의 고도로 가교된 HA; 회색 - 제제 4 고도로 가교된 HA 및 rhColMA)
도 59는 제제 4(회색 - 고도로 가교된 HA + rhColMA) 대 대조군(검정색 - 고도로 가교된 HA)의 주사 후 제7일 및 제14일에 섬유증 점수 결과를 제시한다.
본원에서, 광개시된 진피 충전제 및 이중 가교된 진피 충전제, 및 세포성 성장 촉진 스캐폴드, 및 예를 들어 비제한적으로 연조직 강화를 위해 이들을 사용하는 방법이 개시된다.
콜라겐-생성 식물은 콜라겐 사슬뿐만 아니라 콜라겐을 생성하는 데 사용될 수 있으나, 이러한 사슬은 잘못 하이드록실화되어서 이것이 자가-조립되며, 이는 다리끝(planta)에서든 아니든 간에, 본 출원의 식물-유래 인간 콜라겐과는 대조적으로 고유적으로 불안정한 콜라겐을 야기한다.
본 중합성의 그리고 이중 가교된 용액, 및 실시하기 위한 사용 방법을 감소시키기 위해, 실무자는 콜라겐 사슬의 올바른 하이드록실화를 보장하여 인간 I형 콜라겐의 특징(예를 들어, 분자 구조, 온도 안정성, 세포성 상호작용)을 긴밀하게 모방하는 콜라겐의 다리끝-내(in-planta) 생성을 가능하게 하는 식물 발현 접근법을 고안하였다.
일 양태에서, 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은,
(a) 중합성 용액을 상기 조직 공간 내로 도입하는 단계로서, 상기 중합성 용액이,
(i) 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐; 및
(ii) 광개시제를 포함하는, 단계; 및
(b) 상기 공간에 대해 피상적인 표피의 표면에 광을 적용하여, 중합을 유도하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 광을 적용하는 단계 전에, 또는 이와 동시에, 중합성 용액을 상기 조직 공간 내의 요망되는 배치로 성형하거나 형상화하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 성형하거나 형상화하는 단계는 주름, 접힘, 잔주름, 주름살 또는 흉터를 감소시킨다.
더욱 또 다른 특정 구현예에서, 중합체 용액은 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 유도체, 산화된 셀룰로스(OC) 또는 이의 변형된 유도체, 또는 이들의 조합을 포함하는 충전제를 추가로 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 단리된 식물-유래 인간 콜라겐은 선택적으로, 예컨대 히알루론산(HA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 산화된 셀룰로스(OC), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체, 트리칼슘 포스페이트(TCP), 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA), 카르복시메틸셀룰로스, 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 이들의 조합과 함께 제제화된다.
변형된 유도체는 예를 들어, HA, PVA, PEG, 또는 OC의 광중합성 버전을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 변형은 메타크릴화 또는 티올화를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 더욱 또 다른 특정 구현예에서, 광원은 발광 다이오드(LED), 레이저, 제논 램프 등으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 제제에서 메타크릴레이트 rh콜라겐은 조명 조건 하에서만 그 자체에 가교된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 제제에서 메타크릴레이트 rh콜라겐은 조명 조건 하에서 티올화된 rh콜라겐에 가교된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 제제에서 메타크릴레이트 rh콜라겐은 조명 조건 하에서 임의의 MA/티올화된 첨가제에 가교된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 제제에서 메타크릴레이트 rh콜라겐은 조명 조건 하에서 메타크릴화된 HA에 가교된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 제제에서 메타크릴레이트 rh콜라겐은 조명 조건 하에서 티올화된 HA에 가교된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 제제에서 메타크릴레이트 rh콜라겐은 조명 조건 하에서 메타크릴화된 PVA에 가교된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 제제에서 메타크릴레이트 rh콜라겐은 조명 조건 하에서 티올화된 PVA에 가교된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 제제에서 메타크릴레이트 rh콜라겐은 조명 조건 하에서 메타크릴화된 PEG에 가교된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 제제에서 메타크릴레이트 rh콜라겐은 조명 조건 하에서 티올화된 PEG에 가교된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 제제에서 메타크릴레이트 rh콜라겐은 조명 조건 하에서 메타크릴화된 OC에 가교된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 제제에서 메타크릴레이트 rh콜라겐은 조명 조건 하에서 티올화된 OC에 가교된다.
당업자는 광경화성 제제가 경화 전에 실제로 반(semi) IPN이고 경화 후에 IPN(상호투과된 네트워크)으로 된다는 것을 알 것이다. IPN은 2개의 얽혀진 네트워크를 포괄할 수 있으며, 각각의 하나는 그 자체에 가교되고 다른 것에는 가교되지 않는다.
일부 구현예에서, 가교된 제제는, 비-변형된 rh콜라겐이 조명 하에 가교될 수 없어서 최종 강성(stiffness)을 증강시키지 않으므로, rh콜라겐의 최종적인 총 양을 감소시키지 않으면서 (광을 이용한) 가교 후 강성을 조율하기 위한 비-변형된 rh콜라겐의 비를 포함한다. 메타크릴레이트화된 HA 또한, 이러한 최종 제제에 첨가될 수 있다.
일부 구현예에서, HA 또는 MA-HA는 실시예 23에 기재된 바와 같이 가교제, 예를 들어 비제한적으로 BDDE를 사용하여 그 자체에 가교될 수 있다. 일부 구현예에서, HA 또는 MA-HA를 가교시키는 가교제는 디비닐 설폰(DVS) 또는 글루타르알데하이드를 포함한다. 소정의 구현예에서, BDDE 가교 HA 또는 MA-HA는 rh콜라겐 또는 MA-rh콜라겐에 추가로 가교되지 않아, 상호투과된 네트워크라고 하는 것을 생성한다(도 49 좌측면).
더욱 또 다른 특정 구현예에서, 식물-유래 콜라겐은 rh콜라겐을 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 식물-유래 콜라겐은 유전적으로 변형된 식물로부터 수득된다. 또 다른 특정 구현예에서, 유전적으로 변형된 식물은 담배, 옥수수, 알팔파, 쌀, 감자, 대두, 토마토, 밀, 보리, 카놀라, 당근, 및 면으로부터 선택되는 유전적으로 변형된 식물이다. 특히, 유전적으로 변형된 식물은 담배 식물이다.
더욱 또 다른 특정 구현예에서, 유전적으로 변형된 식물은 COL1, COL2, P4H-알파, P4H-베타, 및 LH3로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 데옥시리보핵산(DNA)의 적어도 하나의 유전자 서열의 발현성 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 식물-유래 인간 콜라겐은 SEQ ID NO: 3에 제시된 바와 같고 유전적으로 변형된 식물에서 발현되는 바와 같은 적어도 변형된 하나의 인간 콜라겐 알파-1 사슬; 및 SEQ ID NO: 6에 제시된 바와 같고 유전적으로 변형된 식물에서 발현되는 바와 같은 적어도 하나의 변형된 인간 콜라겐 알파-2 사슬을 포함하고; 상기 유전적으로 변형된 식물은 외인성 프롤릴-4-하이드록실라제(P4H)를 추가로 발현한다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 방법은 라이실 하이드록실라제(LH), 프로테아제 N, 및 프로테아제 C로 이루어진 군으로부터 선택되는 외인성 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 특정 구현예에서, 인간 콜라겐 알파-1 사슬은 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같은 서열에 의해 인코딩된다. 또 다른 특정 구현예에서, 인간 콜라겐 알파-2 사슬은 SEQ ID NO: 4에 제시된 바와 같은 서열에 의해 인코딩된다.
더욱 또 다른 구현예에서, 외인성 P4H는 포유류 P4H이다. 특히, 외인성 P4H는 인간 P4H이다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 인간 콜라겐 알파-1을 식물 또는 유전적으로 변형된 식물의 액포로 표적화시키고, 이를 피신으로 분해시키는 단계를 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 인간 콜라겐 알파-2를 식물 또는 유전적으로 변형된 식물의 액포로 표적화시키고, 이를 피신으로 분해시키는 단계를 추가로 포함한다.
더욱 또 다른 구현예에서, 식물-유래 인간 콜라겐은 아텔로콜라겐이다. 또 다른 구현예에서, 식물-유래 인간 콜라겐은 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 4로부터 유래되는 아미노산(AA) 서열을 갖는 아텔로콜라겐이다. 아텔로콜라겐은 프로콜라겐의 (예를 들어, 피신을 이용한) 효소적 분해에 의해 유래되며, 이는 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 4의 생성물이다.
더욱 또 다른 구현예에서, 광개시제는 가시광에 반응하여 중합성 용액의 중합을 유도한다. 특히, 가시광은 390 nm 내지 800 nm의 파장을 갖는다. 특히, 광개시제는 에오신 Y+ 트리에탄올아민, 리보플라빈 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 광개시제는 자외선(uv) 광에 반응하여 중합성 용액의 중합을 유도한다. 특히, 광개시제는 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP) 또는 1-[4 2-하이드록시-1-[4-(2-하이드록시에톡시)페닐]-2-메틸프로판-1-온(IRGACURE® 2959)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 광개시제는 적외선 광에 반응하여 중합성 용액의 중합을 유도한다.
더욱 또 다른 구현예에서, 중합성 용액은 27 게이지 내지 33 게이지 범위의 중공 바늘 또는 캐뉼라를 통해 조직 공간 내로 도입된다.
더욱 또 다른 구현예에서, 조직 공간 내의 중합성 용액은 수동 마사지를 통해 요망되는 배치로 성형되거나 형상화된다. 또 다른 구현예에서, 조직 공간 내의 중합성 용액은 성형 또는 형상화 기구를 통해 요망되는 배치로 성형되거나 형상화된다.
더욱 또 다른 구현예에서, 조직 공간 내의 중합성 용액은 실온에서 본질적으로 비-겔화 가능하다. 또 다른 구현예에서, 조직 공간 내의 중합성 용액은 37℃에서 본질적으로 비-겔화 가능하다. 더욱 또 다른 구현예에서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 중합성 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 동물-유래 콜라겐, 예를 들어 비제한적으로 소, 돼지 또는 말 콜라겐을 포함하는 유사한 중합성 용액과 비교하여 실온에서 감소된 점도를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 중합성 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 동물-유래 콜라겐을 포함하는 유사한 중합성 용액과 비교하여 37℃에서 감소된 점도를 갖는다.
전체적으로 사용되는 바와 같이, 용어 "동물-유래 콜라겐"은 소, 돼지 또는 말 콜라겐 또는 래트 꼬리 콜라겐을 포괄할 수 있고, 인간 유래 콜라겐과 대조적이다.
더욱 또 다른 구현예에서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 중합성 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 동물-유래 콜라겐을 포함하는 유사한 중합성 용액과 비교하여 실온에서 감소된 힘으로 상기 조직 공간 내로 도입된다. 더욱 또 다른 구현예에서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 중합성 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 동물-유래 콜라겐을 포함하는 유사한 중합성 용액과 비교하여 37℃에서 감소된 힘으로 상기 조직 공간 내로 도입된다.
또 다른 양태에서, 주름, 접힘, 잔주름, 주름살, 또는 흉터를 감소시키기 위한, 표피 아래의 조직 공간 내로 주사되는 중합성 용액의 용도가 본원에 개시되며, 상기 중합성 용액은 메타크릴화된 또는 티올화된 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐 및 가시광의 적용 전에 또는 이와 동시에 중합을 유도하기 위한 광개시제를 포함하고 주름, 접힘, 잔주름, 주름살, 또는 흉터를 감소시키기 위해 상기 중합성 용액을 요망되는 배치로 성형하거나 형상화한다. 특정 구현예에서, 중합체 용액은 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 유도체, 산화된 셀룰로스(OC) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체 또는 이의 변형된 유도체, 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 이의 변형된 유도체, 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA) 또는 이의 변형된 유도체, 카르복시메틸셀룰로스 또는 이의 변형된 유도체, 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 이의 변형된 유도체, 또는 이들 중 임의의 조합을 포함하는 충전제를 추가로 포함한다.
변형된 유도체는 예를 들어, HA, PVA, PEG, OC, PMMA, TCP, CaHA, 카르복시메틸셀룰로스, 또는 CNC의 광중합성 버전을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 변형은 메타크릴화 또는 티올화를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
또 다른 양태에서, 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은,
(a) 중합성 용액을 상기 조직 공간 내로 도입하는 단계를 포함하고, 상기 중합성 용액은 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함한다.
본 기술은 부분적으로는, 광원, 예컨대 기사광원을 이용한 광활성화 시 중합 가능한 성형성 조성물을 형성하는 미용적 및 의학적 콜라겐-기초 중합 충전제에 관한 것이다. 중합성 충전제는 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐을 광개시제와 함께 포함한다.
본 관심 기술은 전형적으로 침습적인 수술적 개입 또는 일반적인 마취 없이, 맞춤형의 윤곽형(contoured) 진피 충전제 또는 임플란트의 인 시추 형성을 가능하게 하는 이점을 가진다. 일반적으로, 콜라겐-기초 중합성 용액은 피부 아래의(즉, 표피 아래의) 조직 공간 내로 도입되고, 중합은 피부 표면에, 즉, 신체의 외부로부터 또는 피부의 외부로부터 표피까지 적용되는 가시광에의 노출에 의해 유도된다.
인 시추 중합 방법은 가시광원을 이용한 활성화 시 불용성의 가교된 가교성 네트워크를 형성할 수 있는 중합체 구성요소를 포함하는 중합성 용액을 사용하는 미용적 및 의학적 교정(corrective) 및/또는 증강 절차를 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 진피 충전제 또는 세포성 성장 촉진 스캐폴드는 미용적 용도를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 진피 충전제 또는 세포성 성장 촉진 스캐폴드는 의학적 교정 용도를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 진피 충전제 또는 세포성 성장 촉진 스캐폴드는 예를 들어 비제한적으로 조직 강화와 같은 증강 절차에 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 이중 가교된 진피 충전제는 미용적 용도를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 이중 가교된 진피 충전제는 의학적 교정 용도를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 이중 가교된 진피 충전제는 의학적 또는 치과적(잇몸 임플란트/잇몸 질환) 상태의 결과로서 필요하다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 이중 가교된 진피 충전제는 피부 강화를 필요로 하는 의학적 질환의 결과로서 필요하다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 이중 가교된 진피 충전제는 예를 들어 비제한적으로 조직 강화와 같은 증강 절차에 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 광경화성 진피 충전제는 미용적 용도를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 광경화성 진피 충전제는 의학적 교정 용도를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 광경화성 진피 충전제는 의학적 또는 치과적(잇몸 임플란트/잇몸 질환) 상태의 결과로서 필요하다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 광경화성 진피 충전제는 피부 강화를 필요로 하는 의학적 질환의 결과로서 필요하다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 광경화성 진피 충전제는 예를 들어 비제한적으로 조직 강화와 같은 증강 절차에 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 세포성 성장 촉진 스캐폴드는 미용적 용도를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 세포성 성장 촉진 스캐폴드는 의학적 교정 용도를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 세포성 성장 촉진 스캐폴드 진피 충전제는 의학적 또는 치과적(잇몸 임플란트/잇몸 질환) 상태의 결과로서 필요하다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 세포성 성장 촉진 스캐폴드 진피 충전제는 피부 강화를 필요로 하는 의학적 질환의 결과로서 필요하다. 일부 구현예에서, 의학적 교정 용도는 건염을 치료하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 세포성 성장 촉진 스캐폴드는 예를 들어 비제한적으로 조직 강화와 같은 증강 절차에 사용하기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 조직 강화는 피부 조직의 강화이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 세포성 성장 촉진 스캐폴드를 포함하는 진피 충전제의 용도는 인간에서이다. 일부 구현예에서, 인간에서 본원에 개시된 세포성 성장 촉진 스캐폴드를 포함하는 진피 충전제의 용도는 주름, 접힘, 잔주름, 주름살, 또는 흉터, 또는 이들의 임의의 조합을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 주름, 접힘, 잔주름, 주름살, 또는 흉터, 또는 이들의 임의의 조합의 감소는 미용적 목적을 위한 것이다. 일부 구현예에서, 주름, 접힘, 잔주름, 주름살, 또는 흉터, 또는 이들의 임의의 조합의 감소는 미용적 목적을 위한 것이다. 일부 구현예에서, 인간에서 본원에 개시된 세포성 성장 촉진 스캐폴드를 포함하는 진피 충전제의 용도는 조직, 예를 들어 비제한적으로 표피 또는 피부 조직을 강화시킨다. 일부 구현예에서, 조직 강화는 미용 목적을 위한 것이다. 일부 구현예에서, 조직 강화는 의학적 치료를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 조직 강화는 증강 절차의 일부이다. 일부 구현예에서, 조직 강화는 피부 증강 절차의 일부이다.
일부 구현예에서, 조직 강화는 임의의 의학적 또는 치과적(잇몸 질환/잇몸 임플란트) 상태의 결과로서 필요하다.
소정의 구현예에서, 본원에 기재된 용도를 위한 진피 충전제는, 상이한 구성요소가 그 자체에 가교될 수 있으나 서로 가교되지는 않는 상호투과된(IPN) 네트워크 또는 반-상호투과된(반-IPN) 네트워크를 포함한다. 일부 구현예에서, IPN 또는 반-IPN 진피 충전제는 rh콜라겐 및 충전제, 예컨대 히알루론산(HA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 산화된 셀룰로스(OC), 또는 이의 유도체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, IPN 또는 반-IPN은 rh콜라겐 및 가교 HA를 포함한다. 일부 구현예에서, IPN 또는 반-IPN은 rh콜라겐 유도체, 예를 들어 비제한적으로 메타크릴레이트화된 rh콜라겐 또는 티올 rh콜라겐 및/또는 충전제의 유도체, 예를 들어 비제한적으로 메타크릴레이트화된 HA, PVA, PEG, 또는 OC, 또는 티올화된 HA, PVA, PEG, 또는 OC, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 진피 충전제를 포함하는 IPN 또는 반-IPN 네트워크 또는 이중 가교된 네트워크는 충전제, 예를 들어 비제한적으로 HA, PVA, PEG, 또는 OC : rh콜라겐의 비를 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1로 포함한다. 일부 구현예에서, 진피 충전제를 포함하는 IPN 또는 반-IPN 네트워크는 MA-충전제, 예를 들어 비제한적으로 HA, PVA, PEG, 또는 OC : rh콜라겐의 비를 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1로 포함한다. 일부 구현예에서, 진피 충전제를 포함하는 IPN 또는 반-IPN 네트워크는 충전제, 예를 들어 비제한적으로 HA, PVA, PEG, 또는 OC : MA-rh콜라겐의 비를 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1로 포함한다. 일부 구현예에서, 진피 충전제를 포함하는 IPN 또는 반-IPN 네트워크는 MA-충전제 : MA-rh콜라겐의 비를 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1로 포함한다.
일부 구현예에서, 진피 충전제를 포함하는 IPN 또는 반-IPN 또는 이중 가교된 충전제는 HA : rh콜라겐의 비를 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1로 포함한다. 일부 구현예에서, 진피 충전제를 포함하는 IPN 또는 반-IPN 또는 이중 가교된 충전제는 MA-HA : rh콜라겐의 비를 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1로 포함한다. 일부 구현예에서, 진피 충전제를 포함하는 IPN 또는 반-IPN 네트워크는 HA : MA-rh콜라겐의 비를 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1로 포함한다. 일부 구현예에서, 진피 충전제를 포함하는 IPN 또는 반-IPN 네트워크는 MA-HA : MA-rh콜라겐의 비를 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1로 포함한다.
일부 구현예에서, 진피 충전제를 포함하는 IPN 또는 반-IPN 또는 이중 가교된 충전제는 충전제 : rh콜라겐의 비를 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1로 포함한다. 일부 구현예에서, 진피 충전제를 포함하는 IPN 또는 반-IPN 또는 이중 가교된 충전제는 MA-HA, 또는 MA-PVA, 또는 MA-PEG, 또는 MA-OC : rh콜라겐의 비를 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1로 포함한다. 일부 구현예에서, 진피 충전제를 포함하는 IPN 또는 반-IPN는 MA-HA, 또는 MA-PVA, 또는 MA-PEG, 또는 MA-OC : MA-rh콜라겐의 비를 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1로 포함한다. 일부 구현예에서, 진피 충전제를 포함하는 IPN 또는 반-IPN는 MA-HA, 또는 MA-PVA, 또는 MA-PEG, 또는 MA-OC : MA-rh콜라겐의 비를 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1로 포함한다.
일부 구현예에서, 진피 충전제 또는 이중 가교된 진피 충전제를 포함하는 IPN 또는 반-IPN 네트워크는 세포성 성장 촉진 스캐폴드를 포함한다.
소정의 구현예에서, 본원에 기재된 용도를 위한 진피 충전제는, 적어도 하나의 구성요소, 예를 들어 비제한적으로 rh콜라겐이 메타크릴레이트-rh콜라겐 유도체 또는 티올-rh콜라겐 유도체를 포함하는 광경화성 진피 충전제를 포함한다. 일부 구현예에서, 경화성 진피 충전제는 rh콜라겐 및 충전제, 예컨대 히알루론산(HA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 산화된 셀룰로스(OC), 또는 이의 유도체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 광경화성 진피 충전제는 MA-rh콜라겐 및 HA 또는 이의 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 광경화성 진피 충전제는 rh콜라겐 유도체, 예를 들어 비제한적으로 메타크릴레이트화된 rh콜라겐 또는 티올 rh콜라겐 및/또는 충전제의 유도체, 예를 들어 비제한적으로 메타크릴레이트화된 HA, PVA, PEG, 또는 OC, 또는 티올화된 HA, PVA, PEG, 또는 OC, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 광경화성 진피 충전제는 충전제, 예를 들어 비제한적으로 HA, PVA, PEG, 또는 OC, 또는 이의 유도체 : rh콜라겐의 비를 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1로 포함한다. 일부 구현예에서, 광경화성 진피 충전제는 충전제, 예를 들어 비제한적으로 HA, PVA, PEG, 또는 OC, 또는 이의 유도체 : MA-rh콜라겐의 비를 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1로 포함한다. 일부 구현예에서, 광경화성 진피 충전제는 충전제, 예를 들어 비제한적으로 HA, PVA, PEG, 또는 OC : 티올-rh콜라겐의 비를 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1로 포함한다. 일부 구현예에서, 광경화성 진피 충전제는 MA-충전제 : MA-rh콜라겐의 비를 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1로 포함한다.
일부 구현예에서, 광경화성 진피 충전제는 HA : MA-rh콜라겐의 비를 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1, 1:3, 1:4, 1:5, 또는 0:1로 포함한다. 일부 구현예에서, 광경화성 진피 충전제는 MA-HA : MA-rh콜라겐의 비를 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1로 포함한다. 일부 구현예에서, 광경화성 진피 충전제는 PVA, PEG, 또는 OC : MA-rh콜라겐의 비를 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1로 포함한다. 일부 구현예에서, 광경화성 진피 충전제는 MA-PVA, MA-HA-, 또는 OC : MA-rh콜라겐을 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1의 비로 포함한다. 일부 구현예에서, 광경화성 진피 충전제의 HA 구성요소는 가교 HA 또는 가교 MA-HA를 포함한다.
본 출원 전체에서, 진피 충전제 및 이의 용도의 다양한 구현예는 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의 및 간결성을 위한 것이며, 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 이에, 범위의 설명은 모든 가능한 하위 범위뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 수치 값을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1:1 내지 6:1과 같은 범위의 설명은 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1 내지 5.9:1, 1:1.1 내지 1:1.9 등과 같은 하위 범위, 뿐만 아니라 해당 범위 및 이의 분수 내의 개별 숫자, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
수치 범위가 본원에 제시될 때마다, 제시된 범위 내의 임의의 인용된 수치(분수 또는 정수)를 포함하는 것으로 의미된다. 어구 제1 제시된 숫자와 제2 제시된 숫자 "사이의 "범위의/범위" 및 제1 제시된 숫자 "내지" 제2 제시된 숫자의 "범위의/범위"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용되고, 제1 제시된 숫자와 제2 제시된 숫자 및 그 사이의 모든 분수 및 정수를 포함하는 것으로 의미된다.
예를 들어, 본 개시내용은 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐을 단독으로 또는 충전제, 예컨대 히알루론산(HA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 산화된 셀룰로스(OC), 또는 이들의 조합과 함께 포함하는, 표피 아래의 조직 공간을 위한 진피 충전제를 제공하며, 이는 가교되어, 광개시제의 존재 하에 가시광 활성화 시 인 시추에서 수-불용성, 가교된 중합체 조제물을 형성하는 진피 충전제를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 콜라겐은 메타크릴레이트화되거나 티올화된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 용도를 위해 제공되는 진피 충전제는 IPN 또는 반-IPN 네트워크를 형성한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 용도를 위해 제공되는 진피 충전제는 이중 가교된 네트워크를 형성한다.
소정의 구현예에서, 본원에 기재된 용도를 위해 제공되는 이중 가교된 진피 충전제는 가교 충전제, 예컨대 가교 히알루론산(HA), 가교 폴리(비닐 알코올)(PVA), 가교 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 가교 산화된 셀룰로스(OC), 또는 이의 가교된 유도체, 또는 이들의 조합에 가교된 rh콜라겐을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본원에 기재된 용도를 위해 제공된 이중 가교된 진피 충전제는 메타크릴레이트화된-가교 또는 티올화된-가교 충전제, 예컨대 HA, PVA, PEG, 또는 OC에 추가로 가교된 rh콜라겐을 포함한다.
소정의 구현예에서, 이중 가교된 진피 충전제에서, 가교된 충전제 : rh콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1이다. 소정의 구현예에서, 이중 가교된 진피 충전제에서, MA-충전제 : rh콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1이다. 소정의 구현예에서, 이중 가교된 진피 충전제에서, 가교된 충전제 : MA-rh콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1이다. 소정의 구현예에서, 이중 가교된 진피 충전제에서, MA-충전제 : MA-rh콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1이다. 소정의 구현예에서, 이중 가교된 진피 충전제에서, 티올화된-충전제 : rh콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1이다. 소정의 구현예에서, 이중 가교된 진피 충전제에서, 가교된 충전제 : 티올화된-rh콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1이다. 소정의 구현예에서, 이중 가교된 진피 충전제에서, 티올화된-충전제 : 티올화된-rh콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1이다.
소정의 구현예에서, 이중 가교된 진피 충전제에서, 가교 HA : 가교 MA-HA는 rh콜라겐 또는 메타크릴레이트화된 rh콜라겐 또는 티올 rh콜라겐에 추가로 가교되어, 이중 가교된 진피 충전제를 초래한다. 소정의 구현예에서, 이중 가교된 진피 충전제에서, 가교된 HA : rh콜라겐 또는 메틸화된 rh콜라겐 또는 티올 rh콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1이다. 소정의 구현예에서, 이중 가교된 진피 충전제에서, 가교된 MA-HA : rh콜라겐 또는 메틸화된 rh콜라겐 또는 티올 rh콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1이다. 소정의 구현예에서, 이중 가교된 진피 충전제에서, 가교된 MA-HA : rh콜라겐 또는 메틸화된 rh콜라겐 또는 티올 rh콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1이다.
소정의 구현예에서, 이중 가교된 진피 충전제에서, 가교 PVA, PEG, 또는 OC, 또는 가교 MA-PVA, MA-PEG, 또는 MA-OC는 rh콜라겐 또는 메타크릴레이트화된 rh콜라겐에 추가로 가교되어, 이중 가교된 진피 충전제를 초래한다. 소정의 구현예에서, 이중 가교된 진피 충전제에서, 가교 PVA, PEG, 또는 OC : rh콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1이다. 소정의 구현예에서, 이중 가교된 진피 충전제에서, 가교 MA- PVA, MA-PEG, 또는 MA-OC : rh콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1이다. 소정의 구현예에서, 이중 가교된 진피 충전제에서, 가교 PVA, PEG, 또는 OC : MA-rh콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1이다. 소정의 구현예에서, 이중 가교된 진피 충전제에서, 가교 MA- PVA, MA-PEG, 또는 MA-OC : MArh콜라겐 또는 티올 rh콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1이다.
소정의 구현예에서, 이중 가교된 진피 충전제에서, 가교 티올-PVA, 티올-PEG, 또는 티올-OC는 rh콜라겐 또는 메타크릴레이트화된 rh콜라겐에 추가로 가교되어, 이중 가교된 진피 충전제를 초래한다. 소정의 구현예에서, 이중 가교된 진피 충전제에서, 가교된 티올-PVA, 티올-PEG, 또는 티올-OC : rh콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1이다. 소정의 구현예에서, 이중 가교된 진피 충전제에서, 가교된 티올-PVA, 티올-PEG, 또는 티올-OC : MArh콜라겐 또는 티올 rh콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1이다.
일부 구현예에서, 히알루론산을 콜라겐에 가교시킬 수 있는 임의의 수용성 커플링제가 사용될 수 있다. 커플링제의 일부 비제한적인 예는 카르보디이미드, 예컨대 Ν,Ν'-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC), Ν,Ν'-디이소프로필카르보디이미드(DIC), 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 등을 포함한다. 카르보디이미드 커플링제는 연결의 일부가 되지 않으면서 에스테르 또는 아미드 결합 형성을 용이하게 할 수 있다. 다시 말해, 에스테르 결합 또는 아미드 결합은 히알루론산 또는 콜라겐 중 하나로부터의 카르복실레이트기, 및 다른 것들로부터의 하이드록실기 또는 아민기로부터 원자를 포함할 수 있다. 그러나, 가교기의 일부가 되는 다른 커플링제가 사용될 수 있다. 커플링제의 농도는 다양할 수 있다. 일부 구현예에서, 커플링제는 약 2 mM 내지 약 150 mM, 약 2 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 50 mM로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 커플링제는 약 20 mM 내지 약 100 mM, 약 2 mM 내지 약 50 mM, 또는 약 50 mM의 농도로 존재하는 EDC이다. 일부 구현예에서, 커플링제는 rh콜라겐 내 유리 아민의 수의 10-배 내지 100-배와 동일한 EDC의 양으로 존재하는 EDC이다. 일부 구현예에서, 커플링제는 rh콜라겐 내 유리 아민의 수의 50-배와 동일한 EDC의 양으로 존재하는 EDC이다. 카르보디이미드 농도를 약 50 mM 이하로 증가시키는 것은, 더 큰 하이드로겔 강성 및/또는 더 적은 팽윤을 갖는 가교된 거대분자 매트릭스를 초래할 수 있다.
당업자는, 충전제가 그 자체에 가교된 다음 rh콜라겐에도 가교되는 이중 가교를 포함하는 진피 충전제가, 단일 반응에서 단일 유형의 가교제를 사용하는 콜라겐 및 HA의 직접 가교를 포함하는 진피 충전제와 별개임을 이해할 것이다. 이러한 진피 충전제의 특성은 상이하다.
예로서, 본 중합성 용액은 피부 표면 바로 아래의 다양한 루멘 및 보이드(void)를 차단시키거나 충전하는 데 사용될 수 있다. 그러므로, 본 기술은 숙주, 예컨대 인간 환자에서 조직을 증강시키는 방법을 제공하며, 여기서, 관심의 상기 중합성 용액은 당업계에 알려진 방법을 사용함으로써, 예컨대 중합성 용액을 증강이 필요한 조직 부위에 또는 조직 부위 내에 주사하고, 일단 적용되면, 위에 가로놓인(overlying) 체표면을 가시광에 노출시켜 침착된 중합성 용액의 중합을 유발함으로써 관심 부위에 도입된다.
"강화"는, 조직에 관심 중합체 또는 네트워크를 제공하거나, 이로 강화시키거나, 이로 교체함으로써, 결함, 특히 이러한 조직의 손실 또는 부재로 인한 결함을 복구, 예방 또는 경감시키는 것을 의미한다. 강화는 또한, 천연 구조 또는 특질의 보충, 즉, 예를 들어, 기존의 신체 일부, 예컨대 입술, 코, 유방, 귀, 기관의 일부, 턱, 뺨 등의 크기를 증가시키기 위한 이들 기존의 신체 일부에의 부가의 구축을 포함하는 것으로 의미된다. 그러므로, 조직 강화는 예컨대 얼굴, 목, 손, 발, 손가락, 및 발가락 내의 또는 그 위의주름, 접힘, 주름살, 흉터, 미미한 얼굴 함몰부, 구순구개열, 표면적인 주름 등의 충전 또는 감소; 손과 발, 손가락과 발가락을 포함하여 노화 또는 질환으로 인한 미미한 변형(deformity)의 교정; 말하기를 회복시키기 위한 성대 또는 성문의 강화; 수면선(sleep line) 및 표현선(expression line)의 진피 충전; 노화로 인한 진피 및 피부 조직 손실의 교체; 입술 강화; 눈 주위의 주름살 및 안와구(orbital groove)의 충전; 유방 강화; 턱 강화; 뺨 및/또는 코의 강화; 예를 들어, 지나친 지방흡입술 또는 다른 외상으로 인한 연조직, 피부 또는 피부에서의 압흔(indentation)의 충전; 여드름 또는 외상성 흉터 및 추피(rhytid)의 충전; 비순선(nasolabial line), 비미간선(nasoglabellar line) 및 구강하선(infraoral line)의 충전 등을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 관심의 중합성 용액은 사용 온도에서 전달 수단, 예컨대 미세 수술용 바늘(예를 들어, 적어도 27 게이지, 적어도 33 게이지 또는 더 미세한 게이지를 갖는 바늘)을 통한 압출 준비에 적합한 점도를 갖는 중합성 용액을 포괄한다. 그러므로, "주사성"인 용액은 적합한 전달 장치, 예컨대, 수술용 바늘, 다른 수술 기기, 또는 다른 전달 수단, 예컨대 내시경 또는 경피 추간판절체 시술에 사용되는 장비를 통한 유동을 허용하는 텍스처 및 점도를 갖는 용액이다. 그러므로, 관심의 중합성 용액은 당업계에 알려진 바와 같은 적합한 어플리케이터, 예컨대 카테터, 캐뉼라, 바늘, 주사기, 관형 기구 등을 통해 주사 가능하다.
중합성 용액은 일단 조직 공간 내로 주사되면, 전형적으로 중합의 광개시가 촉발된 후에, 조직 공간 내에서 요망되는 윤곽으로 조작, 마사지, 성형 또는 형상화될 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 조작, 마사지, 성형 또는 형상화는 겔화 공정 동안 수행된다. 중합성, 중합화, 또는 부분적으로 중합된 용액은 예를 들어, 형상화 수단, 예컨대 편평한 또는 곡선형 표면을 갖는 수술용 압저기(surgical depressor) 또는 다른 툴이나 기기, 손가락, 손바닥, 손가락 관절 등을 사용하여 외부 조작에 의해 형상화될 수 있다.
놀랍게도, 본 방법의 유전적으로 변형된, 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐은 향상된 콜라겐-함유 진피 충전제, 및 더 작은 게이지의 바늘 및 저하된 주사력의 사용을 가능하게 함으로써, 뿐만 아니라 더 작은 조직 공간을 충전시키는 이의 능력에 의해 향상된 진피 충전 방법을 제공한다.
주사의 "발현력(expression force)"(뉴튼, N)은 바늘 또는 캐뉼라로부터 주사에 필요한 힘을 포함한다.
"절대 점도"("동점도")는 힘이 적용되는 경우 유동에 대한 유체의 저항력이다. 절대 점도는 속도에 대한 힘의 비에 비례한다. 그리스 문자 η(eta)는 계산에서 절대 점도를 나타낸다. 많은 보편적인 유체가 0.5 cP 내지 1,000 cP의 점도를 갖기 때문에 절대 점도는 보편적으로 cP로 측정된다.
"겔"은 거대분자의 분리를 위한 매질로서 사용되는 유기 중합체의 반강성 슬라브(slab) 또는 실린더이다. 겔은 실질적으로 희석된 가교 시스템이며, 정상-상태에서 유동을 나타내지 않는다. 겔은 원칙적으로, 중량에 의해 액체이지만, 액체의 일부 특성, 예컨대 변형성을 보유하는 한편 액체 내의 3-차원 가교 네트워크로 인해 부분적으로 고체로서 거동한다. 겔은, 겔에게 이의 구조(경도)를 제공하고 접착제 스틱(점착성)에 기여하는 유체 내에서의 가교이다. 그 결과, 겔은 고체 내에서의 액체 분자의 분산액, 즉, 고체 매질 내에 분산된 액체 입자로서 여겨질 수 있다. "겔화 시간"은 중합성 용액이 겔을 형성하는 데 소요되는 시간이다.
"하이드로겔"은 친수성이며, 이따금 물이 분산 매질인 콜로이드 겔로서 발견되는 중합체 사슬의 네트워크이다. 하이드로겔은 고도로 흡수성인(예를 들어, 90% 초과의 물을 함유할 수 있는) 중합체성 네트워크이고, 이의 유의한 수분 함량으로 인해 천연 조직과 매우 유사한 가요성을 가진다.
"중합체"는 일련의 반복 서브유닛으로 이루어진 거대분자이다. 기본적인 반복 서브유닛은 "단량체"로 알려져 있다. 그룹으로서, 중합체는 이의 인장 강도 및 탄성에 대해 알려져 있다.
"광개시제"는 방사선(UV 또는 가시광)에 노출 시, 반응성 화학종(유리 라디칼, 양이온 또는 음이온)을 생성하는 분자이다. 본 발명의 광개시제는 중합성 용액의 중합을 유도한다. 본 방법에 유용한 광개시제의 예는 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트 (LAP), 1-[4 2-하이드록시-1-[4-(2-하이드록시에톡시)페닐]-2-메틸프로판-1-온(IRGACURE® 2959), 에오신 Y+트리에탄올아민, 또는 리보플라빈을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
메타크릴레이트는 메타크릴산으로부터 유래되는 에스테르 또는 염이다. 메타크릴레이트는 아크릴레이트 중합체를 형성하는, 중합체 플라스틱 내의 보편적인 단량체이다. 콜라겐에의 메타크릴레이트기의 첨가는 광경화성인 콜라겐 메타크릴레이트(rh콜라겐-MA 또는 MA-rh콜라겐)를 초래한다. 히알루론산(HA)에의 메타크릴레이트기의 첨가는 광경화성인 히알루론산-메타크릴레이트(HAMA 또는 MA-HA)를 초래한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 진피 충전제에 사용되는 rh콜라겐은 비-변형된 rh콜라겐과 MA-rh콜라겐의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-변형된 rh콜라겐 : MA-rh콜라겐의 비는 약 1:0, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 0:1, 2:1, 3:1, 또는 4:1이다. 일부 구현예에서, MA-rh콜라겐의 최종 농도 범위는 약 0 mg/ml 내지 12 mg/ml를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-변형된 rh콜라겐의 최종 농도 범위는 약 0 mg/ml 내지 12 mg/ml를 포함한다. 일부 구현예에서, MA-rh콜라겐의 최종 농도 범위는 약 0 mg/ml 내지 12 mg/ml을 포함하고, 비-변형된 rh콜라겐의 최종 농도 범위는 약 0 mg/ml 내지 12 mg/ml를 포함한다. 일부 구현예에서, MA-rh콜라겐의 최종 농도 범위는 약 0 mg/ml 내지 6 mg/ml를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-변형된 rh콜라겐의 최종 농도 범위는 약 0 mg/ml 내지 6 mg/ml를 포함한다. 일부 구현예에서, MA-rh콜라겐의 최종 농도는 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 mg/ml를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-변형된-rh콜라겐의 최종 농도는 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 mg/ml를 포함한다.
티올은 탄소-결합 설피드릴(R-SH) 기(여기서, R은 알킬 또는 다른 유기 치환체를 나타냄)를 함유하는 유기황 화합물이다. 콜라겐의 티올화는 점착 및 점막접착 특성을 향상시킬 수 있고, 팽윤 능력에 영향을 준다.
광은 전자기 방사선 형태이다. "가시광"은 380 nm 내지 800 nm 범위 또는 적어도 390 nm 내지 700 nm 범위의 파장을 갖는 광이다. "자외선광"은 더 짧은 파장을 갖는 한편, "적외선"은 더 긴 파장을 갖는다.
조명 수단은 사용되는 광개시제를 활성화시키기에 적합한 광원일 수 있고, 신체의 외부로부터 광개시제를 활성화시킬 수 있다. 열적 개시제가 사용될 수 있으므로 적외선 광원이 사용될 수 있고 자외선-활성화된 개시제가 사용될 수 있으므로 적합한 자외선 광원이 사용될 수 있는 한편, 바람직한 광원은 백색 광원이다. 그러므로, 적합한 광개시제가 사용되어, 개시제 및 광원의 최대 흡수가 조율된다. 본원 상기에 언급된 바와 같이, 하나의 이러한 가시광원은 발광 다이오드(LED)이다. 다른 적합한 광원은 겔화가 신체에서 발생하는 한, 피부 표면 아래 등의 부위에서, 전자기 방사선을 신체에, 필요하다면 상기 부위에, 또는 피부 표면 위로부터 적용함으로써 사용될 수 있다. 전자기 방사선은 겔화를 가능하게 하는 강도로, 시간 동안 그리고 기간 동안 적용된다. 광원은 피부 표면 위에 또는 피부 표면 상에 직접적으로, 전형적으로 성형된 또는 형상화된 중합성 용액의 장소 위에 놓일 수 있다.
일부 구현예의 단량체 용액은 약학 분야에 알려진 바와 같은 임의의 여러 가지 다른 물질, 예컨대 불활성 물질, 예컨대 보존제, 충전제, 부형제 또는 희석제, 약리학적 활성 분자 또는 작용제, 예컨대 저분자 또는 생물학적 작용제, 세포 등을 함유할 수 있다. 그러므로, 적합한 불활성 작용제 또는 생물학적 활성제가 단량체 용액에 첨가될 수 있다. 생물학적 활성제의 경우, 상기 활성제는 관심의 중합된 또는 네트워크화된 구조 부위 또는 그 부근에서 약리학적 작용을 국소적으로 발휘할 수 있거나, 형성된 스캐폴드, 매트릭스 또는 네트워크로부터 방출되어 인접 조직 공간을 통해 이동할 수 있거나 더 적은 국소 효과를 위해 순환계로 들어갈 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 관심의 중합성 용액 방법은 또한, 다른 피부학, 정형외과학, 미용학 및 다른 의학적 치료와 조합되어 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 중합성 용액은 기지의 충전제와 혼합되어, 성형 가능하며 윤곽 가능하고 긴 체류 시간 등을 갖는 조성물을 제공한다. 충전제의 예는 히알루론산(HA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 산화된 셀룰로스(OC), 또는 이의 변형된 유도체, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 반액체상 중 중합성 용액은 반액체상 중 기지의 충전제와 마찬가지로 독립적으로 진피 내로 주사되고, 함께 성형 가능하며 윤곽 가능하고 긴 체류 시간 등을 갖는 조성물을 제공할 것이다. 독립적으로 주사될 수 있는 충전제의 예는 히알루론산(HA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 산화된 셀룰로스(OC), 또는 이의 변형된 유도체, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 반액체상 중 중합성 용액은 혼합물로서 진피 내로 주사되고, 함께 성형 가능하며 윤곽 가능하고 긴 체류 시간 등을 갖는 조성물을 제공할 것이다. rh콜라겐과 함께 주사될 수 있는 충전제의 예는 히알루론산(HA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 산화된 셀룰로스(OC), 또는 이의 변형된 유도체, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
더욱 또 다른 양태에서, 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 촉진 스캐폴드를 유도하는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 용액을 상기 조직 공간 내로 도입하는 단계를 포함하며, 상기 용액은 (a) 식물-유래 인간 콜라겐; 및 (b) 적어도 하나의 성장 인자 또는 이의 공급원을 포함한다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 성장 인자의 공급원은 혈장 또는 혈청-풍부 혈장을 포함한다.
일 구현예에서, 세포성 성장 촉진 스캐폴드는 콜라겐-포함 조직의 분해 또는 상해로 인한 치유 또는 교체를 촉진한다. 일 구현예에서, 콜라겐-포함 조직은 힘줄, 인대, 피부, 각막, 연골, 혈관, 창자, 추간판, 근육, 뼈 또는 치아로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 세포성 성장 촉진 스캐폴드는 건염의 치유를 촉진한다.
일 구현예에서, 식물-유래 콜라겐은 rh콜라겐을 포함한다. 일 구현예에서, 식물-유래 콜라겐은 유전적으로 변형된 식물로부터 수득된다. 다양한 구현예에서, 유전적으로 변형된 식물은 담배, 옥수수, 알팔파, 쌀, 감자, 대두, 토마토, 밀, 보리, 카놀라, 당근, 및 면으로부터 선택되는 유전적으로 변형된 식물이다. 일 구현예에서, 유전적으로 변형된 식물은 담배 식물이다.
일 구현예에서, 유전적으로 변형된 식물은 COL1, COL2, P4H-알파, P4H-베타, 및 LH3로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 데옥시리보핵산(DNA)의 적어도 하나의 유전자 서열의 발현성 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 식물-유래 인간 콜라겐은 SEQ ID NO: 3에 제시된 바와 같고 유전적으로 변형된 식물에서 발현되는 바와 같은 적어도 변형된 하나의 인간 콜라겐 알파-1 사슬; 및 SEQ ID NO: 6에 제시된 바와 같고 유전적으로 변형된 식물에서 발현되는 바와 같은 적어도 하나의 변형된 인간 콜라겐 알파-2 사슬을 포함하고; 상기 유전적으로 변형된 식물은 외인성 프롤릴-4-하이드록실라제(P4H)를 추가로 발현한다.
또 다른 특정 구현예에서, 상기 방법은 라이실 하이드록실라제(LH), 프로테아제 N, 및 프로테아제 C로 이루어진 군으로부터 선택되는 외인성 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 추가로 포함한다.
하나의 특정 구현예에서, 인간 콜라겐 알파-1 사슬은 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같은 서열에 의해 인코딩된다. 또 다른 특정 구현예에서, 인간 콜라겐 알파-2 사슬은 SEQ ID NO: 2에 제시된 바와 같은 서열에 의해 인코딩된다.
일 구현예에서, 외인성 P4H는 포유류 P4H이다. 하나의 특정 구현예에서, 외인성 P4H는 인간 P4H이다.
일 구현예에서, 상기 방법은 인간 콜라겐 알파-1을 식물 또는 유전적으로 변형된 식물의 액포로 표적화시키고, 이를 피신으로 분해시키는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 인간 콜라겐 알파-2를 식물 또는 유전적으로 변형된 식물의 액포로 표적화시키고, 이를 피신으로 분해시키는 단계를 추가로 포함한다.
하나의 특정 구현예에서, 식물-유래 인간 콜라겐은 아텔로콜라겐이다.
당업자는, 용어 "진피 충전제"가 일부 구현예에서 식물-유래 인간 콜라겐, 예를 들어, 1형 재조합 인간 콜라겐(rh콜라겐) 또는 이의 유도체를 포함하는 용액을 포괄함을 이해할 것이다. 용어 "진피 충전제"는 또한 일부 구현예에서, 모두 동일한 의미 및 품질을 갖는, 식물-유래 인간 콜라겐, 예를 들어, 1형 재조합 인간 콜라겐(rh콜라겐) 또는 이의 유도체, 및 충전제 또는 이의 유도체, 또는 가교된 충전제 또는 이의 유도체를 포함하는 용액을 포괄하며, 여기서, 진피 충전제는 조직 구조를 강화시키는 데 사용될 수 있거나, 주름, 접힘, 잔주름, 주름살, 또는 흉터, 또는 이들의 임의의 조합을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
당업자는, 본원에 기재된 진피 충전제가 상이한 제제, 예를 들어 비제한적으로,
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rh콜라겐 또는 이의 MA 또는 티올 유도체;
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rh콜라겐 또는 rh콜라겐-MA 또는 rh콜라겐-티올, 및 이의 충전제 또는 유도체를 포함하는 IPN 또는 반-IPN 또는 이중 가교된 네트워크;
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rh콜라겐 또는 rh콜라겐-MA 또는 rh콜라겐-티올, 및 HA 또는 MA-HA 또는 티올-HA를 포함하는 IPN 또는 반-IPN 또는 이중 가교된 네트워크;
ㆍ
rh콜라겐 또는 rh콜라겐-MA 또는 rh콜라겐-티올, 및 PVA 또는 MA-PVA 또는 티올-PVA를 포함하는 IPN 또는 반-IPN 또는 이중 가교된 네트워크;
ㆍ
rh콜라겐 또는 rh콜라겐-MA 또는 rh콜라겐-티올, 및 PEG 또는 MA-PEG 또는 티올-PEG를 포함하는 IPN 또는 반-IPN 또는 이중 가교된 네트워크;
ㆍ
rh콜라겐 또는 rh콜라겐-MA 또는 rh콜라겐-티올, 및 OC 또는 MA-OC 또는 티올-OC를 포함하는 IPN 또는 반-IPN 또는 이중 가교된 네트워크;
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rh콜라겐을 포함하는 IPN 또는 반-IPN 또는 이중 가교된 네트워크 또는 세포성 성장 촉진 스캐폴드, 및 고농도의 혈소판을 함유하는 혈액의 자가 혈소판 풍부 혈장(PRP) 분획;
ㆍ
IPN 또는 반-IPN 또는 이중 가교된 네트워크 또는 세포성 성장 촉진 스캐폴드로서, 각각이 rh콜라겐 및 고농도의 혈소판을 함유하는 혈액의 자가 혈소판 풍부 혈장(PRP) 분획을 포함하며, 여기서, 혈소판은 혈관-내피 성장 인자(VEGF), 형질전환 베타 성장 인자(TGF-베타), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 혈소판 유래 표피 성장 인자(PDEGF), 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 표피 성장 인자(EGF) 또는 간세포 성장 인자(HGF), 또는 이들의 조합을 포함하는 다양한 유형의 성장 인자(GF)를 방출하는, IPN 또는 반-IPN 또는 이중 가교된 네트워크 또는 세포성 성장 촉진 스캐폴드;
ㆍ
가교된 충전제 또는 이의 유도체에 가교된 rh콜라겐 또는 rh콜라겐-MA 또는 rh콜라겐-티올을 포함하는 이중 가교된 진피 충전제;
ㆍ
가교된 HA 또는 가교된 MA-HA 또는 가교된 티올-HA에 가교된 rh콜라겐 또는 rh콜라겐-MA 또는 rh콜라겐-티올을 포함하는 이중 가교된 진피 충전제;
ㆍ
가교된 PVA 또는 가교된 MA-PVA 또는 가교된 티올-PVA에 가교된 rh콜라겐 또는 rh콜라겐-MA 또는 rh콜라겐-티올을 포함하는 이중 가교된 진피 충전제;
ㆍ
가교된 PEG 또는 가교된 MA-PEG 또는 가교된 티올-PEG에 가교된 rh콜라겐 또는 rh콜라겐-MA 또는 rh콜라겐-티올을 포함하는 이중 가교된 진피 충전제; 또는
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가교된 OC 또는 가교된 MA-OC 또는 가교된 티올-OC에 가교된 rh콜라겐 또는 rh콜라겐-MA 또는 rh콜라겐-티올을 포함하는 이중 가교된 진피 충전제를 포함함을 이해할 것이다.
당업자는 일부 구현예에서, 용어 "세포성 성장 촉진 스캐폴드"는 콜라겐 및 혈액 또는 이의 구성요소의 자가 혈소판 풍부 혈장(PRP) 분획을 포함하는 진피 충전제를 포괄함을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, PRP는 "세포"를 포함하지는 않지만, 성장 인자 및 피브리노겐과 프로-트롬빈과 같은 혈장 구성요소를 함유하는 (세포 기원의) 막성 소낭(membranous vesicle)을 포함한다. 일부 구현예에서, "세포성 성장 촉진 스캐폴드"는 콜라겐 및 혈액 또는 이의 구성요소의 자가 혈소판 풍부 혈장(PRP) 분획, 및 적어도 부가적인 충전제 구성요소를 포함하는 진피 충전제를 포괄한다.
일부 구현예에서, 세포성 성장 촉진 스캐폴드는, 고농도의 혈소판을 함유하는 혈액의 자가 혈소판 풍부 혈장(PRP) 분획을 추가로 포함하는 IPN 네트워크, 반-IPN 네트워크, 또는 이중 가교된 진피 충전제일 수 있는 진피 충전제를 포함하며, 여기서, 혈액의 자가 PRP 분획은 고농도의 혈소판을 함유하며, 혈소판은 혈관-내피 성장 인자(VEGF), 형질전환 베타 성장 인자(TGF-베타), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 혈소판 유래 표피 성장 인자(PDEGF), 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 표피 성장 인자(EGF) 또는 간세포 성장 인자(HGF), 또는 이들의 조합을 포함하는 다양한 유형의 성장 인자(GF)를 방출한다. 일부 구현예에서, 세포성 성장 촉진 스캐폴드는, 혈관-내피 성장 인자(VEGF), 형질전환 베타 성장 인자(TGF-베타), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 혈소판 유래 표피 성장 인자(PDEGF), 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 표피 성장 인자(EGF) 또는 간세포 성장 인자(HGF), 또는 이들의 조합을 포함하는 적어도 하나의 성장 인자를 추가로 포함하는 IPN 네트워크, 반-IPN 네트워크, 또는 이중 가교된 진피 충전제를 포함하는 진피 충전제를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포성 성장 촉진 스캐폴드는 PRP 구성요소의 서브세트 또는 분획을 추가로 포함하는 IPN 네트워크, 반-IPN 네트워크, 또는 이중 가교된 진피 충전제를 포함하는 진피 충전제를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 진피 충전제는 중합성 용액을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 진피 충전제는 비-중합성 용액을 포함한다. 일부 구현예에서, 진피 충전제 용액의 중합은 생체내에서 발생한다. 일부 구현예에서, 중합성 진피 충전제 용액의 구성요소는 함께 주사된 다음, 중합되어 경화된 진피 충전제를 형성한다. 일부 구현예에서, 중합성 진피 충전제 용액의 구성요소는 독립적으로 주사된 다음, 중합되어 경화된 진피 충전제를 형성한다. 독립적으로 주사 진피 충전제 구성요소의 독특한 접근법의 일례는 일부 구현예에서, 충전제, 예를 들어 비제한적으로 HA 또는 이의 유도체를 피부 진피 내로 주사하는 단계, 및 메타크릴레이트화된 rh콜라겐 또는 티올-rh콜라겐을 제1 주사의 근접한 부근 내의 피부 진피 내로 별도로 주사하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서, 상기 구성요소는 반액체상에 존재한 다음, 인 시추에서 가교된다. 이러한 접근법은 일부 구현예에서, 진피 충전제 구성요소를 광 중합에 의해 함께 경화시키기 전에 더 용이한 주사 및 인 시추 형상화를 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 진피 충전제는 연조직 강화 방법에 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 진피 충전제는 세포 증식을 증강시킨다. 일부 구현예에서, 연조직 강화 방법에 제공되고 사용되는 진피 충전제는 시간이 경과함에 따라 분해된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 진피 충전제는 연조직 강화 방법에 사용되며, 여기서, 상기 진피 충전제는 표피 아래의 조직 공간을 충전시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 진피 충전제는 연조직 강화 방법에 사용되며, 여기서, 상기 사용은 주름, 접힘, 잔주름, 주름살, 또는 흉터를 감소시킨다.
일 구현예에서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 동물-유래 콜라겐을 포함하는 유사한 용액과 비교하여 실온에서 감소된 점도를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 동물-유래 콜라겐을 포함하는 유사한 용액과 비교하여 37℃에서 감소된 점도를 갖는다. 더욱 또 다른 구현예에서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 동물-유래 콜라겐을 포함하는 유사한 용액과 비교하여 실온에서 감소된 힘으로 상기 조직 공간 내로 도입된다. 더욱 또 다른 구현예에서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 동물-유래 콜라겐을 포함하는 유사한 용액과 비교하여 37℃에서 감소된 힘으로 상기 조직 공간 내로 도입된다. 하나의 특정 구현예에서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 동물-유래 콜라겐을 포함하는 유사한 용액과 비교하여 증가된 스캐폴딩 형성을 갖거나 세포 성장에서 증가를 촉진한다.
더욱 또 다른 구현예에서, 세포성 성장 촉진 스캐폴드를 유도하기 위한, 표피 아래의 조직 공간 내로 주사되는 용액의 용도가 본원에 개시되며, 상기 용액은 콜라겐-포함 조직의 분해 또는 상해로 인한 치유 또는 교체를 촉진하기 위해 식물-유래 인간 콜라겐 및 적어도 하나의 성장 인자 또는 이의 공급원을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 성장 인자의 공급원은 혈장 또는 혈청-풍부 혈장을 포함한다.
구현예에서, 콜라겐-포함 조직은 힘줄, 인대, 피부, 각막, 연골, 혈관, 창자, 추간판, 근육, 뼈 또는 치아로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 세포성 성장 촉진 스캐폴드는 건염의 치유를 촉진한다. 구현예에서, 콜라겐-포함 조직은 피부이다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 식물이 제공되며, 상기 식물은 적어도 하나의 유형의 콜라겐 알파 사슬을 발현시키고, 내인성 P4H 활성이 없는 서브세포성 구획에서 상기 사슬을 축적시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "유전적으로 변형된 식물"은 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열로 안정하게 또는 일시적으로 형질전환되는 임의의 하등(예를 들어, 이끼) 또는 고등(유관) 식물 또는 이들의(예를 들어, 세포 현탁액의) 조직 또는 단리된 세포를 지칭한다. 식물의 예는 담배, 옥수수, 알팔파, 쌀, 감자, 대두, 토마토, 밀, 보리, 카놀라, 면, 당근, 뿐만 아니라 이끼와 같은 하등 식물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "콜라겐 사슬"은 콜라겐 서브유닛, 예컨대 콜라겐 섬유, 바람직하게는 I형 섬유의 알파 1 또는 알파 2 사슬을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 어구 "콜라겐"은 I형 콜라겐의 경우 2개의 알파 1 사슬 및 하나의 알파 2 사슬을 포함하는 조립된 콜라겐 삼량체를 지칭한다. 콜라겐 섬유는 말단 프로펩타이드 C 및 N이 없는 콜라겐이다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "내인성 P4H 활성이 없는 서브세포성 구획"은 식물 P4H 또는 식물-유사 P4H 활성을 갖는 효소를 포함하지 않는 세포의 임의의 구획화된 영역을 지칭한다. 이러한 서브세포성 구획의 예는 액포, 아포플라스트 및 세포질, 뿐만 아니라 엽록체, 미토콘드리아 등과 같은 세포소기관을 포함한다.
임의의 유형의 콜라겐 사슬은 본 발명의 유전적으로 변형된 식물에 의해 발현될 수 있다. 예는 원섬유-형성 콜라겐(I형, II형, III형, V형 및 XI형), 네트워크-형성 콜라겐(IV형, VIII형 및 X형), 원섬유 표면과 관련된 콜라겐(IX형, XII형 및 XIV형), 막관통 단백질로서 발생하는 콜라겐(XIII형 및 XVII형)을 포함하거나, 11-nm 주기적 비드형 필라멘트(periodic beaded filaments)(VI형)를 형성한다.
일 구현예에서, 발현되는 콜라겐 사슬은 I형 콜라겐의 알파 1 및/또는 알파 2이다. 발현된 콜라겐 알파 사슬은 임의의 포유류로부터 유래된 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 특정 구현예에서, 콜라겐 알파 사슬을 인코딩하는 서열은 인간이고, SEQ ID NO: 1 및 4로 제시된다.
전형적으로, 식물에서 발현되는 알파 콜라겐 사슬은 이의 말단 프로펩타이드(즉, 프로펩타이드 C 및 프로펩타이드 N)를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.
식물 단백질분해 활성에 의한 프로콜라겐의 가공은 인간에서의 정상적인 가공과 상이하고, 프로펩타이드 C는 식물 단백질분해 활성에 의해 제거되지만 절단 부위는 알려져 있지 않다. C 프로펩타이드의 절단은 트리머(trimmer)의 조립 전에 프로콜라겐 펩타이드 상에서 발생할 수 있다(3개의 C-프로펩타이드의 결합은 트리머의 조립을 개시하는 데 필수적임).
식물 단백질분해 활성에 의한 N-프로펩타이드 절단은 성숙한 식물에서 발생되지만, 묘목에서는 발생하지 않는다. 이러한 절단은 N 텔로펩타이드로부터 2개의 아미노산(17개 중 2개)을 제거한다.
C-프로펩타이드(및 더 작은 정도까지는 N-프로펩타이드)는 동물 세포를 통한 프로콜라겐의 통과 동안 이러한 프로콜라겐을 가용성으로 유지시키고(Bulleid 등, 2000), 식물 세포에서 유사한 효과를 갖는 것으로 예상된다. 세포외 기질 내로의 프로콜라겐 분자의 분비 후에 또는 분비 동안에, 프로펩타이드는 프로콜라겐 N-프로테이나제 및 C-프로테이나제에 의해 제거되어, 원섬유로의 콜라겐 분자의 자발적인 자가-조립을 촉발한다. 프로콜라겐 N-프로테이나제 및 C-프로테이나제에 의한 프로펩타이드의 제거는 프로콜라겐의 용해도를 10,000-배 초과만큼 낮추고, 섬유로의 콜라겐의 자가-조립을 개시하는 데 필요하고 충분하다. 이러한 조립 과정에 결정직인 것은 삼중-나선형 도메인의 단부에서 텔로펩타이드라고 하는 짧은 비-삼중-나선형 펩타이드이며, 이러한 펩타이드는 원섬유 구조 내에서 콜라겐 분자의 올바른 공유 등록을 보장하고 이들의 가교 가능한 알데하이드를 통해 자가-조립의 임계 농도를 낮추는 작용을 한다. 펩신은 콜라겐의 생성 동안 프로펩타이드를 절단할 수 있다. 그러나, 펩신은 텔로펩타이드를 손상시키고, 그 결과, 펩신-추출된 콜라겐은 정돈된 원섬유성 구조를 형성할 수 없다.
인간 P4H의 베타 서브유닛을 형성하는 단백질 이황화 이소머라제(PDI)는 트리머 조립 전에 C-프로펩타이드에 결합하며, 이로써 사슬 조립 동안 분자 샤페론으로서 또한 작용하는 것으로 제시되었다.
상이한 식물에서 발현되는 인간 프로콜라겐 I N-프로테이나제 및 프로콜라겐 C-프로테이나제의 사용은, 네이티브 인간 콜라겐과 더욱 유사하고 정돈된 원섬유성 구조를 형성할 수 있는 콜라겐을 생성시킬 수 있다.
N 펩타이드 또는 C 프로펩타이드 또는 둘 다, 발현된 콜라겐 사슬에 포함되는 경우, 본 발명의 유전적으로 변형된 식물은 또한 각각의 프로테아제(즉, C 또는 N 또는 둘 다)를 발현할 수 있다. 이러한 프로테아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 18(프로테아제 C) 및 20(프로테아제 N)에 의해 예시된다. 이러한 프로테아제는, 이들 프로테아제가 콜라겐 사슬과 동일한 서브세포성 구획에 축적되도록 발현될 수 있다.
내인성 P4H 활성이 없는 서브세포성 구획에서의 발현된 콜라겐 사슬의 축적은 몇몇 접근법 중 임의의 하나를 통해 수행될 수 있다.
예를 들어, 발현된 콜라겐 사슬은 발현된 단백질을 아포플라스트 또는 세포소기관(예를 들어, 엽록체)과 같은 서브세포성 구획으로 표적화시키기 위한 신호 서열을 포함할 수 있다. 적합한 신호 서열의 예는 엽록체 수송 펩타이드(Swiss-Prot 엔트리 P07689에 포함되며, 아미노산 1 내지 57) 및 미토콘드리아 수송 펩타이드(Swiss-Prot 엔트리 P46643에 포함되며, 아미노산 1 내지 28)를 포함한다. 후속하는 실시예 섹션은 적합한 신호 서열의 부가적인 예, 뿐만 아니라 식물 세포에서 콜라겐 사슬의 발현에서 이러한 신호 서열을 이용하기 위한 가이드라인을 제공한다.
대안적으로, 콜라겐 사슬의 서열은, 식물에서 발현되는 경우 콜라겐의 세포성 국소화를 변경시키는 방식으로 변형될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 식물의 ER은 콜라겐 사슬을 올바르게 하이드록실화시킬 수 없는 P4H를 포함한다. 콜라겐 알파 사슬은 본연적으로, 콜라겐이 번역-후 변형(잘못된 하이드록실화를 포함함)되는 ER 내로 이러한 발현된 콜라겐을 지시하는 ER 표적화 서열을 포함한다. 그러므로, ER 표적화 서열의 제거는 콜라겐 사슬이 세포질에 축적되게 할 것이며, 이러한 콜라겐 사슬은 임의의 하이드록실화를 포함하는 번역-후 변형이 없다.
후속하는 실시예 섹션의 실시예 1은 ER 서열이 없는 콜라겐 서열의 생성을 기재한다.
더욱 대안적으로, 콜라겐 사슬은 엽록체 또는 미토콘드리아와 같이 세포소기관을 함유하는 DNA에서 발현되고 축적될 수 있다. 엽록체 발현에 대한 추가의 설명은 본원 하기에 제공된다.
상기 언급된 바와 같이, 알파 사슬의 하이드록실화는 안정한 I형 콜라겐의 조립에 필요하다. 본 발명의 유전적으로 변형된 식물에 의해 발현되는 알파 사슬이 내인성 P4H 활성이 없는 구획에 축적되기 때문에, 이러한 사슬은 식물, 식물 조직 또는 세포로부터 단리되고 시험관내에서 하이드록실화되어야 한다. 이러한 하이드록실화는 Turpeenniemi-Hujanen 및 Myllyla에 의해 기재된 방법에 의해 달성될 수 있다(문헌[Concomitant hydroxylation of proline and lysine residues in collagen using purified enzymes in vitro. Biochim Biophys Acta. 1984 Jul. 16; 800(1):59-65]).
이러한 시험관내 하이드록실화가 올바르게 하이드록실화된 콜라겐 사슬을 야기할 수 있긴 하지만, 이는 달성하기 어렵고 비용이 많이 들 수 있다.
시험관내 하이드록실화의 한계를 극복하기 위해, 본 발명의 유전적으로 변형된 식물은 바람직하게는 또한, 콜라겐 알파 사슬(들)을 올바르게 하이드록실화[즉, Gly-X-Y 트리플렛의 프롤린(Y) 위치만 하이드록실화]시킬 수 있는 P4H를 공동-발현한다. P4H는 2개의 서브유닛, 알파 및 베타로 이루어진 효소이다. 둘 다 활성 효소를 형성하는 데 필요한 한편, 베타 서브유닛은 또한 샤페론 기능을 소유한다.
본 발명의 유전적으로 변형된 식물에 의해 발현되는 P4H는 바람직하게는, 예를 들어 SEQ ID NO:12 및 14에 의해 인코딩되는 인간 P4H이다. 게다가, 증강된 기질 특이성을 나타내는 P4H 돌연변이체, 또는 P4H 상동체(homologue)가 또한 사용될 수 있다.
적합한 P4H 상동체는 NCBI 기탁 NP_179363에 의해 식별된 아라비돕시스 옥시도리덕타제(Arabidopsis oxidoreductase)에 의해 예시된다. 본 발명자들에 의해 수행되는 이러한 단백질 서열 및 인간 P4H 알파 서브유닛의 짝별 정렬(pairwise alignment)은, 식물의 임의의 기지의 P4H 상동체의 기능적 도메인들 사이의 최고 상동성을 드러내었다.
P4H가 발현된 콜라겐 사슬과 공동-축적될 필요가 있기 때문에, 이의 코딩 서열은 바람직하게는 그에 따라 변형된다(신호 서열의 첨가, ER 표적화를 방지할 수 있는 결실 등).
포유류 세포에서, 콜라겐은 또한, 라이실 하이드록실라제, 갈락토실트랜스퍼라제 및 글루코실트랜스퍼라제에 의해 변형된다. 이들 효소는 라이실 잔기를 하이드록시라이실, 갈락토실하이드록시라이실 및 글루코실갈락토실 하이드록시라이실 잔기로 순차적으로 변형시킨다. 단일 인간 효소, 라이실 하이드록실라제 3(LH3)는 하이드록시라이신 연결 탄수화물 형성에서 모든 3개의 연속 단계를 촉매화할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 유전적으로 변형된 식물은 바람직하게는 또한, 포유류 LH3를 발현한다. SEQ ID NO: 22에 의해 제시된 것과 같은 LH3 코딩 서열은 이러한 목적에 사용될 수 있다.
상기 기재된 콜라겐 사슬(들) 및 변형 효소는, 식물 기능성 프로모터의 전사 조절 하에 배치된 알파 사슬 및/또는 변형 효소(예를 들어, P4H 및 LH3)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 안정하게 통합된 핵산 작제물 또는 일시적으로 발현된 핵산 작제물로부터 발현될 수 있다. 이러한 핵산 작제물(이는 본원에서, 발현 작제물이라고도 함)은 전체 식물, 한정된 식물 조직 또는 한정된 식물 세포 전체를 통해 또는 식물의 한정된 발달 단계에서 발현을 위해 배치될 수 있다. 이러한 작제물은 또한, 선별 마커(예를 들어, 항생제 내성), 인핸서 요소 및 박테리아 복제를 위한 복제 기원을 포함할 수 있다.
2개의 발현 가능한 삽입물(예를 들어, 2개의 알파 사슬 유형, 또는 알파 사슬과 P4H)을 포함하는 작제물은 바람직하게는 각각의 삽입물에 대한 개별 프로모터를 포함하거나, 대안적으로 이러한 작제물은 단일 프로모터로부터의 삽입 서열 둘 다를 포함하는 단일 전사물 키메라를 발현할 수 있음이 이해될 것이다. 이러한 경우, 키메라 전사물은 2개의 삽입물 서열 사이에 IRES 서열을 포함하여, 다운스트림 삽입물이 이로부터 번역될 수 있게 된다.
조직 특이적이거나, 발달적으로 특이적이거나, 구성적이거나 유도적일 수 있는 많은 식물 기능성 발현 프로모터 및 인핸서는 본 발명의 작제물에 의해 이용될 수 있으며, 일부 예는 본원 하기에 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, 후속하는 명세서 및 청구항 섹션에서, 어구 "식물 프로모터" 또는 "프로모터"는 식물 세포(DNA 함유 세포소기관을 포함함)에서 유전자 발현을 지시할 수 있는 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 식물, 박테리아, 바이러스, 진균류 또는 동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 이러한 프로모터는 구성적일 수 있으며, 즉, 복수의 식물 조직에서 높은 수준의 유전자 발현을 지시할 수 있거나, 이러한 프로모터는 조직 특이적일 수 있으며, 즉, 특정 식물 조직 또는 조직들에서 유전자 발현을 지시할 수 있거나, 이러한 프로모터는 유도적일 수 있으며, 즉, 자극 하에 유전자 발현을 지시할 수 있거나, 이러한 프로모터는 키메라일 수 있으며, 즉, 적어도 2개의 상이한 프로모터의 일부로 형성될 수 있다.
그러므로, 이용되는 식물 프로모터는 구성적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 유도적 프로모터, 또는 키메라 프로모터일 수 있다.
구성적 식물 프로모터의 예는 비제한적으로, CaMV35S 및 CaMV19S 프로모터, FMV34S 프로모터, 사탕수수 바실리포름 반드나바이러스(sugarcane bacilliform badnavirus) 프로모터, CsVMV 프로모터, 아라비돕시스 ACT2/ACT8 액틴 프로모터, 아라비돕시스 유비퀴틴 UBQI 프로모터, 보리 잎 티오닌 BTH6 프로모터, 및 쌀 액틴 프로모터를 포함한다.
조직 특이적 프로모터의 예는 비제한적으로, 콩 파세올린(phaseolin) 저장 단백질 프로모터, DLEC 프로모터, PHS 프로모터, 제인(zein) 저장 단백질 프로모터, 대두로부터의 콘글루틴 감마(conglutin gamma) 프로모터, AT2S1 유전자 프로모터, 아라비돕시스로부터의 ACT11 액틴 프로모터, 브라씨카 나푸스(Brassica napus)로부터의 napA 프로모터 및 감자 파타틴(patatin) 유전자 프로모터를 포함한다.
유도적 프로모터는 예를 들어, 광, 온도, 화학물질, 가뭄, 높은 염도, 삼투성 쇼크, 산화제 조건을 포함하는 스트레스 조건과 같은 특정 자극에 의해 또는 병원성(pathogenicity)의 경우 유도되는 프로모터이고, 비제한적으로, 완두콩 rbcS 유전자로부터 유래된 광-유도적 프로모터, 알팔파 rbcS 유전자로부터의 프로모터, 가뭄 시 활성인 프로모터 DRE, MYC 및 MYB; 높은 염도 및 삼투성 쇼크에서 활성인 프로모터 INT, INPS, prxEa, Ha hsp17.7G4 및 RD21, 및 병원성 스트레스에서 활성인 프로모터 hsr203J 및 str246C를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 의해 이용되는 프로모터는, 작제 삽입물의 과발현이 식물 형질전환 후 수행되게 하는 강한 구성적 프로모터이다.
본 발명에서 사용되는 임의의 작제물 유형은 각각의 작제물 유형에서 동일한 또는 상이한 선별 마커를 사용하여 동일한 식물 내로 공동-형질전환될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 대안적으로, 제1 작제물 유형이 제1 식물 내로 도입될 수 있는 한편, 제2 작제물 유형은 제2 동종동계(isogenic) 식물 내로 도입될 수 있으며, 이후에 이로부터 생성되는 유전자이식 식물은 교배될 수 있고 이중 형질전환체에 대해 자손이 선별될 수 있다. 이러한 자손의 추가의 자가-교배는 두 작제물 모두에 대해 동형접합성인 주(line)를 생성시키기 위해 이용될 수 있다.
핵산 작제물을 단자엽(monocotyledonous) 식물 및 쌍자엽(dicotyledenous) 식물 둘 다 내로 도입하는 다양한 방법이 존재한다(문헌[Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225]; [Shimamoto 등, Nature (1989) 338:274-276]). 이러한 방법은 식물 게놈 내로의 핵산 작제물 또는 이의 일부의 안정한 통합, 또는 이들 서열이 식물의 자손에 의해 유전되지 않는 핵산 작제물의 일시적 발현에 의존한다.
게다가, 핵산 작제물이 DNA 또는 엽록체와 같은 DNA-함유 세포소기관 내로 직접적으로 도입될 수 있는 몇몇 방법이 존재한다.
외인성 서열의 안정한 게놈 통합, 예컨대 식물 게놈 내로의 본 발명의 핵산 작제물 내에 포함되는 것을 수행하는 2 가지 원칙적인 방법이 존재한다:
(i) 아그로박테리움-매개 유전자 이전: 문헌[Klee 등 (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486]; [Klee and Rogers in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25]; [Gatenby, in Plant Biotechnology, eds. Kung, S. and Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112].
(ii) 직접적인 DNA 흡수: 문헌[Paszkowski et al., in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68]; 원형질체 내로의 DNA의 직접적인 흡수 방법, 문헌[Toriyama, K. 등 (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. DNA uptake induced by brief electric shock of Plant cells: Zhang 등 Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm 등 Nature (1986) 319:791-793. DNA injection into Plant cells or Tissues by particle bombardment, Klein 등 Bio/Technology (1988) 6:559-563]; [McCabe 등 Bio/Technology (1988) 6:923-926]; [Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209]; 마이크로피펫 시스템의 사용에 의해: 문헌[Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36]; [Neuhaus and Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217]; 또는 발아 포자와 함께 DNA의 직접적인 인큐베이션에 의해, 문헌[DeWet 등 in Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. and Mantell, S. H. and Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197-209]; 및 [Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719].
아그로박테리움 시스템은 식물 게놈 DNA 내로 통합되는 한정된 DNA 서열을 함유하는 플라스미드 벡터의 사용을 포함한다. 식물 조직의 접종 방법은 식물 종 및 아그로박테리움 전달 시스템에 따라 달라진다. 광범위하게 사용되는 접근법은, 전체 식물 분화의 개시를 위한 양호한 공급원을 제공하는 임의의 조직 외식편으로 수행될 수 있는 잎 원반(disc) 절차이다. 문헌[Horsch 등 in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9]. 보조 접근법은 진공 침윤과 조합된 아그로박테리움 전달 시스템을 이용한다. 아그로박테리움 시스템은 특히, 유전자이식 쌍자엽 식물의 생성에서 생존 가능하다.
식물 세포 내로의 직접적인 DNA 방법이 다양하게 존재한다. 전기영동에서, 원형질체는 강한 전기장에 짧게 노출된다. 미세주사에서, DNA는 매우 작은 마이크로피펫을 사용하여 세포 내로 직접 기계적으로 주사된다. 미세입자 충돌에서, DNA는 마그네슘 설페이트 결정, 텅스턴 입자 또는 금 입자와 같은 미세투사물(microprojectile) 상에 흡착되고, 상기 미세투사물은 세포 또는 식물 조직 내로 물리적으로 가속화된다.
형질전환 후, 식물 번식이 실시된다. 식물 번식의 가장 보편적인 방법은 종자(seed)에 의한 것이다. 그러나, 종자 번식에 의해 재생은, 종자가 멘델 법칙에 의해 지배되는 유전 분산(genetic variance)에 따라 식물에 의해 생성되기 때문에, 이형접합성으로 인해 작물에 균일성이 결여되는 결함을 갖는다. 기본적으로, 각각의 종자는 유전적으로 상이하고, 각각은 그 자체의 특정 속성을 갖고 성장할 것이다. 따라서, 재생되는 식물은 부모 유전자이식 식물의 동일한 속성 및 특징을 갖도록 형질전환된 식물이 생성되는 것이 바람직하다. 따라서, 형질전환된 식물의 신속하며 일관된 번식을 제공하는 미세번식(micropropagation)에 의해 상기 형질전환된 식물이 재생되는 것이 바람직하다.
본 발명의 핵산 작제물 내에 포함된 단리된 핵산을 일시적으로 발현시키기 위해 이용될 수 있는 일시적 발현 방법은 상기 기재된 바와 같지만 일시적 발현을 선호하는 조건 하에서의 미세주사 및 충돌, 및 핵산 작제물을 포함하는 포장된 또는 비포장된 재조합 바이러스 벡터가 식물 조직 또는 세포를 감염시키는 데 이용되어 그 안에서 확립된 번식성 재조합 바이러스가 비-바이러스성 핵산 서열을 발현하게 되는 바이러스-매개 발현을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
식물 숙주의 형질전환에 유용한 것으로 제시되었던 바이러스는 CaMV, TMV 및 BV를 포함한다. 식물 바이러스를 사용한 식물의 형질전환은 미국 특허 제4,855,237호(BGV), EP-A 67,553호(TMV), 일본 공개 출원 제63-14693호(TMV), EPA 194,809호(BV), EPA 278,667호(BV); 및 문헌[Gluzman, Y. 등, Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988)]에 기재되어 있다. 식물을 포함하여 많은 숙주에서 외래 DNA를 발현시키는 데 사용하기 위한 슈도바이러스 입자는 WO 87/06261호에 기재되어 있다.
식물에서 비-바이러스 외인성 핵산 서열의 도입 및 발현을 위한 식물 RNA 바이러스의 작제는 상기 참조문헌뿐만 아니라 문헌[Dawson, W. O. 등, Virology (1989) 172:285-292]; [Takamatsu 등 EMBO J. (1987) 6:307-311]; [French 등 Science (1986) 231:1294-1297]; 및 [Takamatsu 등 FEBS Letters (1990) 269:73-76]에 의해 실증된다.
바이러스가 DNA 바이러스인 경우, 작제는 바이러스 자체에 이루어질 수 있다. 대안적으로, 바이러스는 우선, 외래 DNA와 함께 요망되는 바이러스 벡터를 작제하는 용이성을 위해 박테리아 플라스미드 내로 클로닝될 수 있다. 그 후에, 바이러스는 플라스미드로부터 절제될 수 있다. 바이러스가 DNA 바이러스인 경우, 박테리아의 복제 기원은 바이러스 DNA에 부착될 수 있으며, 상기 바이러스 DNA는 그 후에 박테리아에 의해 복제된다. 이러한 DNA의 전사 및 번역은 피막(coat) 단백질을 생성할 것이며, 이러한 피막 단백질은 바이러스 DNA를 캡시드화(encapsidate)할 것이다. 바이러스가 RNA 바이러스인 경우, 상기 바이러스는 일반적으로 cDNA로서 클로닝되고 플라스미드 내로 삽입된다. 그 후에, 플라스미드는 모든 작제물을 만드는 데 사용된다. 그 후에, RNA 바이러스는, 플라스미드의 바이러스 서열을 전사시키고 바이러스 유전자를 번역하여, 바이러스 RNA를 캡시드화하는 피막 단백질(들)을 생성함으로써 생성된다.
식물에서 본 발명의 작제물에 포함된 것과 같이 비-바이러스 외인성 핵산 서열의 도입 및 발현을 위한 식물 RNA 바이러스의 작제는 상기 참조문헌뿐만 아니라 미국 특허 제5,316,931호에 의해 실증된다.
일 구현예에서, 네이티브 피막 단백질 코딩 서열이 바이러스 핵산으로부터 결실되었으며, 식물 숙주에서 발현시킬 수 있으며, 재조합 식물 바이러스 핵산을 포장하고, 재조합 식물 바이러스 핵산에 의한 숙주의 전신 감염을 보장하는 비-네이티브 식물 바이러스 피막 단백질 코딩 서열 및 비-네이티브 프로모터, 바람직하게는 비-네이티브 피막 단백질 코딩 서열의 서브게놈 프로모터가 삽입되었던 식물 바이러스 핵산이 제공된다. 대안적으로, 피막 단백질 유전자는 그 안에 비-네이티브 핵산 서열의 삽입에 의해 불활성화될 수 있어서, 단백질이 생성된다. 재조합 식물 바이러스 핵산은 하나 이상의 부가적인 비-네이티브 서브게놈 프로모터를 함유할 수 있다. 각각의 비-네이티브 서브게놈 프로모터는 식물 숙주에서 인접 유전자 또는 핵산 서열을 전사하거나 발현시킬 수 있고, 서로 그리고 네이티브 서브게놈 프로모터와 재조합할 수 없다. 비-네이티브(외래) 핵산 서열은, 하나 초과의 핵산 서열이 포함된다면 네이티브 식물 바이러스 서브게놈 프로모터 또는 네이티브 및 비-네이티브 식물 바이러스 서브게놈 프로모터에 인접하여 삽입될 수 있다. 비-네이티브 핵산 서열은 서브게놈 프로모터의 조절 하에 숙주 식물에서 전사되거나 발현되어 요망되는 생성물을 생성한다.
제2 구현예에서, 재조합 식물 바이러스 핵산은, 네이티브 피막 단백질 코딩 서열이 비-네이티브 피막 단백질 코딩 서열 대신에 비-네이티브 피막 단백질 서브게놈 프로모터 중 하나에 인접하여 배치되는 점을 제외하고는, 제1 구현예에서와 같이 제공된다.
제3 구현예에서, 네이티브 피막 단백질 유전자가 이의 서브게놈 프로모터에 인접해 있고 하나 이상의 비-네이티브 서브게놈 프로모터가 바이러스 핵산 내로 삽입되었던 재조합 식물 바이러스 핵산이 제공된다. 삽입된 비-네이티브 서브게놈 프로모터는 식물 숙주에서 인접 유전자를 전사하거나 발현시킬 수 있고, 서로 그리고 네이티브 서브게놈 프로모터와 재조합할 수 없다. 비-네이티브 핵산 서열은, 상기 서열이 서브게놈 프로모터의 조절 하에 숙주 식물에서 전사되거나 발현되어 요망되는 생성물을 생성하도록 비-네이티브 서브게놈 식물 바이러스 프로모터에 인접하여 삽입될 수 있다.
제4 구현예에서, 재조합 식물 바이러스 핵산은, 네이티브 피막 단백질 코딩 서열이 비-네이티브 피막 단백질 코딩 서열에 의해 교체되는 점을 제외하고는, 제3 구현예에서와 같이 제공된다.
바이러스 벡터는 재조합 식물 바이러스 핵산에 의해 인코딩된 피막 단백질에 의해 캡시드화되어, 재조합 식물 바이러스를 생성한다. 재조합 식물 바이러스 핵산 또는 재조합 식물 바이러스는 적절한 숙주 식물을 감염시키는 데 사용된다. 재조합 식물 바이러스 핵산은 숙주에서 복제되며, 숙주에서 전신 확산되고, 숙주에서 외래 유전자(들)(단리된 핵산)를 전사 또는 발현시켜, 요망되는 단백질을 생성할 수 있다.
외인성 핵산 서열을 엽록체의 게놈에 도입하는 기법은 알려져 있다. 이 기법은 하기 절차를 수반한다. 우선, 식물 세포는 화학적으로 처리되어, 세포 당 엽록체의 수를 약 1까지 감소시킨다. 그 후에, 외인성 핵산은, 적어도 하나의 외인성 핵산 분자를 엽록체 내에 도입시키는 목적으로 입자 충돌을 통해 입자 내로 도입된다. 외인성 핵산은, 이것이 엽록체에 고유한 효소에 의해 쉽게 수행되는 상동성 재조합을 통해 엽록체의 게놈 내로 통합 가능한 것으로 선택된다. 이를 위해, 외인성 핵산은 관심 유전자 외에도, 엽록체의 게놈으로부터 유래되는 적어도 하나의 핵산 신전부(stretch)를 포함한다. 게다가, 외인성 핵산은 선별 마커를 포함하고, 상기 선별 마커는 이러한 선별 후 엽록체의 모든 카피 또는 실질적으로 모든 카피가 외인서 핵산을 포함할 것인지 확인하기 위해 순차적인 선별 절차에 의해 역할을 한다. 이러한 기법에 관한 추가의 세부사항은 미국 특허 제4,945,050호 및 제5,693,507호에서 발견되며, 이들은 참조에 의해 본원에 포함된다. 그러므로, 폴리펩타이드는 엽록체의 단백질 발현 시스템에 의해 생성되고 엽록체의 내막 내로 통합될 수 있다.
상기 기재된 형질전환 접근법은 임의의 식물 종, 또는 이로부터 유래된 식물 조직 또는 단리된 식물 세포에서 콜라겐 사슬 및/또는 변형 효소, 뿐만 아니라 조립된 콜라겐(프로펩타이드가 있거나 없음)을 생성하는 데 사용될 수 있다.
바람직한 식물은, 본원에 기재된 콜라겐 사슬, 콜라겐 및/또는 가공 효소를 다량으로 축적시킬 수 있는 식물이다. 이러한 식물은 또한, 스트레스 조건에 대한 이들 식물의 내성 및 발현되는 구성요소 또는 조립된 콜라겐이 추출될 수 있는 용이성에 따라 선택될 수 있다. 바람직한 식물의 예는 담배, 옥수수, 알팔파, 쌀, 감자, 대두, 토마토, 밀, 보리, 카놀라 및 면을 포함한다.
콜라겐 섬유는 식품 및 미용 산업에서 널리 사용된다. 그러므로, 식물에 의해 발현되는 콜라겐 섬유 구성요소(알파 사슬) 및 변형 효소가 콜라겐의 산업적 합성에 이용되긴 하지만, 식물에서 완전한 콜라겐 생성은 이의 단순성 및 비용 효과성의 측면에서 바람직하다.
몇몇 접근법은 식물에서 I형 콜라겐을 생성시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 콜라겐 알파 1 사슬은 콜라겐 알파 1 및 P4H(및 선택적으로 LH3)를 발현하는 식물로부터 단리되고, 콜라겐 알파 2 및 P4H(및 선택적으로 LH3 및 프로테아제 C 및/또는 N)를 발현하는 식물로부터 단리되는 콜라겐 알파 2 사슬과 혼합될 수 있다. 콜라겐 알파 1 사슬 자체가 그 자체로 삼중 나선으로 조립되기 때문에, 콜라겐 알파 2 사슬과 혼합 및 복원시키기 전에 이러한 동종-삼량체를 변성시키는 것이 필요할 수 있다.
바람직하게는, 콜라겐 알파 1 및 P4H(및 선택적으로 LH3 및 프로테아제 C 및/또는 N)를 발현하는 제1 식물은, 콜라겐 알파 2를 발현하는 제2(및 바람직하게는 동종동계) 식물과 교배될 수 있거나, 대안적으로 알파 사슬 둘 다 발현하는 제1 식물은 P4H 및 선택적으로 LH3 및 프로테아제 C 및/또는 N을 발현하는 제2 식물과 교배될 수 있다.
상기 기재된 식물 육종 접근법이 2개의 개별적으로 형질전환된 식물을 이용하긴 하지만, 각각이 1개 또는 2개의 구성요소를 발현하는 3개 이상의 개별적으로 형질전환된 식물을 이용하는 접근법이 또한 이용될 수 있음을 주지해야 한다.
당업자는 다양한 식물 육종 기법을 잘 알고 있을 것이며, 이러한 기법에 대한 이러한 추가의 설명은 본원에 제공되지 않는다.
식물 육종 접근법이 바람직하긴 하지만, 콜라겐 알파 1 및 2, P4H 및 LH3(및 선택적으로 프로테아제 C 및/또는 N)를 발현하는 단일 식물은, 각각이 하나 이상의 발현 가능한 구성요소를 세포 내로 도입하기 위해 디자인된 몇몇 형질전환 사건을 통해 생성될 수 있다. 이러한 경우, 각각의 형질전환 사건의 안정성은 특정 선별 마커를 사용하여 확증될 수 있다.
임의의 경우, 형질전환 및 식물 육종 접근법은 임의의 수의 구성요소를 발현하는 임의의 식물을 생성시키는 데 사용될 수 있다. 현재 바람직한 것은 콜라겐 알파 1 및 2 사슬, P4H, LH3 및 적어도 하나의 프로테아제(예를 들어, 프로테아제 C 및/또는 N)를 발현하는 식물이다. 후속하는 실시예 섹션에 추가로 기재된 바와 같이, 이러한 식물은 42℃ 이하의 온도에서 안정성을 나타내는 콜라겐을 축적시킨다.
육종 또는 대안적으로 다중-형질전환된 식물로부터의 자손은, 핵산 또는 단백질 프로브(예를 들어, 항체)를 사용하여 외인성 mRNA 및/또는 폴리펩타이드의 존재를 확증함으로써 선택될 수 있다. 후자의 접근법은, 이것이 발현된 폴리펩타이드 구성요소의 국소화를 (예를 들어, 분획화된 식물 추출물을 프로브화함으로써) 가능하게 하므로, 올바른 가공 및 조립에 대한 잠재성을 또한 확증하기 때문에 바람직하다. 적합한 프로브의 예는 후속하는 실시예 섹션에 제공된다.
일단 콜라겐-발현 자손이 식별되면, 이러한 식물은 콜라겐 사슬뿐만 아니라 변형 효소의 발현을 최대화하는 조건 하에 추가로 배양된다.
이러한 유리 프롤린 축적은 본 발명의 유전적으로 변형된 식물에 의해 발현되는 콜라겐 사슬을 포함하는 상이한 프롤린-풍부 단백질의 생성을 용이하게 할 수 있기 때문에, 바람직한 배양 조건은 배양된 식물에서 유리 프롤린 축적을 증가시키는 조건이다.
물 고갈, 염류화(salinization), 저온, 고온, 병원체 감염, 중금속 독성, 혐기 생활(anaerobiosis), 영양소 부족, 대기중 오염 및 UV-조사를 포함한 광범위한 환경 스트레스에 반응하여 여러가지 식물에서 축적된다(Hare 및 Cress, 1997).
유리 프롤린은 또한, ABA와 같은 화합물 또는 구리 염, 파라콰트(paraquate), 살리실산 등과 같은 스트레스 유도 화합물에 의한 식물 또는 토양의 처리에 반응하여 축적될 수 있다.
그러므로, 콜라겐-발현 자손은 상이한 스트레스 조건(예를 들어, 50 mM 내지 250 mM 이하의 범위의 상이한 농도의 NaCl) 하에 성장될 수 있다. 콜라겐 생성을 추가로 증강시키기 위해, 콜라겐 발현에 미치는 다양한 스트레스 조건의 효과는 식물 생존력, 바이오매스 및 콜라겐 축적에 관하여 검사되고 최적화될 것이다.
식물 조직/세포는 바람직하게는 성숙 시 수합되고, 콜라겐 섬유는 잘 알려진 선행 기술의 추출 접근법을 사용하여 단리되며, 하나의 이러한 접근법은 하기에 상술된다.
유전자이식 식물의 잎은 액체 질소 하에 분말로 분쇄되고, 균질물은 0.2 M NaCl을 함유하는 0.5 M 아세트산에서 4℃에서 60시간 동안 추출된다. 불용성 물질은 원심분리에 의해 제거된다. 재조합 콜라겐을 함유하는 상층액은 0.4 M 및 0.7 M NaCl에서 염-분획화된다. 재조합 이종삼량체성 콜라겐을 함유하는 0.7 M NaCl 침전물은 0.1 M 아세트산에서 용해되고 이에 대해 투석되며, -20℃에서 저장된다(Ruggiero 등, 2000에 따른 것임).
일 구현예에서, 균질한, 가용성, 원섬유-형성 아텔로콜라겐을 생성시키기 위해 프로콜라겐을 가공하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, SDS PAGE에 의한 단백질분해 결과의 분석에 의해 본원에 제시된 바와 같이, 소정의 식물-유래 프로테아제(예를 들어, 파파인)는 나선형 영역(이들이 동물 공급원으로부터 기원하는 텔로콜라겐으로부터 텔로펩타이드를 제거할 수 있긴 하지만) 내에서 단백질분해 절단 없이 가용성 프로콜라겐으로부터 프로펩타이드 부분을 절단할 수 없는 한편, 다른 프로테아제(예를 들어, 에스퍼라제, 사비나제)는 가용성 프로콜라겐으로부터 프로펩타이드 영역을 효과적으로 절단하지 않아, 이로써 효과적인 원섬유형성을 방해한다. 세심한 실험을 통해, 본 발명자들은, 피신과 같은 특정 식물-유래 프로테아제, 및 뉴트라제 및 서브틸리신과 같은 박테리아-유래 프로테아제만 가용성 프로콜라겐으로부터 프로펩타이드 부분(텔로펩타이드를 포함함)을 올바르게 절단하는 데 사용되어, 비-동물 프로콜라겐의 나선형 영역을 분해하지 않으면서 가용성 아텔로콜라겐(도 13, 15, 17, 19 및 20)의 균질한 조제물을 생성시킬 수 있음을 밝혀내었다. 게다가, 본 발명자들은, 재조합 트립신 또한 올바른 절단을 할 수 있음을 보여주었다(도 26). 본 발명자들은 추가로, 피신에 의한 절단이 생성된 아텔로콜라겐이 이의 원섬유형성 용량을 보유하게 할 수 있음을 보여주었다(본원 하기의 실시예 섹션의 표 5).
그러므로, 일 양태에 따르면, 아텔로콜라겐을 생성시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 인간 재조합 텔로펩타이드-포함 콜라겐을 뉴트라제, 서브틸리신, 재조합 트립신, 재조합 펩신 및 피신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 인간 재조합 텔로펩타이드-포함 콜라겐은 비-동물 세포에서 발현되며, 이로써 아텔로콜라겐을 생성시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "텔로펩타이드-포함 콜라겐"은 아텔로콜라겐에 포함된 텔로펩타이드 잔여물보다 더 긴 텔로펩타이드를 포함하는 가용성 콜라겐 분자를 지칭한다. 그러므로, 텔로펩타이드-포함 콜라겐은 전장 프로펩타이드를 포함하는 프로콜라겐일 수 있다. 대안적으로, 텔로펩타이드-포함 콜라겐은 부분적으로 분해된 프로펩타이드를 포함하는 프로콜라겐 분자일 수 있다. 더욱 대안적으로, 텔로펩타이드-포함 콜라겐은 텔로콜라겐일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로콜라겐"은 N-말단 프로펩타이드, C-말단 프로펩타이드 또는 둘 다 포함하는 콜라겐 분자(예를 들어, 인간)를 지칭한다. 예시적인 인간 프로콜라겐 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 30, 31, 36 및 37로 제시된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "텔로콜라겐"은, 전형적으로 프로콜라겐에 포함되지만 텔로펩타이드를 여전히 함유하는 N-말단 프로펩타이드와 C-말단 프로펩타이드 둘 다 결여된 콜라겐 분자를 지칭한다. 본원 상기의 배경 섹션에서 언급된 바와 같이, 원섬유성 콜라겐의 텔로펩타이드는 네이티브 N/C 프로테이나제에 의한 분해 후의 N-말단 프로펩타이드 및 C-말단 프로펩타이드의 잔여물이다.
재조합 인간 텔로콜라겐은, 외인성 인간 프로콜라겐과 각각의 프로테아제(즉, C 또는 N 또는 둘 다) 둘 다 발현하도록 형질전환되었던 세포에서 생성될 수 있다. 이러한 프로테아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 39(프로테아제 C) 및 SEQ ID NO: 40(프로테아제 N)에 의해 예시된다. 이러한 프로테아제는, 본원 하기에서 추가로 기재된 바와 같이, 이들 프로테아제가 콜라겐 사슬과 동일한 서브세포성 구획에 축적되도록 발현될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아텔로콜라겐"은, 전형적으로 프로콜라겐에 포함되는 N-말단 프로펩타이드와 C-말단 프로펩타이드 둘 다 및 이의 텔로펩타이드의 적어도 일부가 결여되어 있으나 적합한 조건 하에 이것이 원섬유를 형성할 수 있도록 이의 텔로펩타이드의 충분한 부분을 포함하는 콜라겐 분자를 지칭한다.
임의의 유형의 아텔로콜라겐은 본원에 개시된 방법에 따라 생성될 수 있다. 예는 원섬유-형성 콜라겐(I형, II형, III형, V형 및 XI형), 네트워크-형성 콜라겐(IV형, VIII형 및 X형), 원섬유 표면과 관련된 콜라겐(IX형, XII형 및 XIV형), 막관통 단백질로서 발생하는 콜라겐(XIII형 및 XVII형)을 포함하거나, 11-nm 주기적 비드형 필라멘트(VI형)를 형성한다. 일 구현예에 따르면, 아텔로콜라겐은 I형 콜라겐의 알파 1 및/또는 알파 2 사슬을 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 형태의 콜라겐/아텔로콜라겐--예를 들어, 콜라게나제-내성 콜라겐 등이 본원에 개시된다.
재조합 인간 프로콜라겐 또는 텔로콜라겐은 비제한적으로 식물 세포 및 효모와 진균류와 같은 다른 진핵 세포를 포함한 임의의 비-동물 세포에서 발현될 수 있다.
인간 프로콜라겐 또는 텔로콜라겐이 생성될 수 있는 (즉, 발현될 수 있는) 식물은 하등(예를 들어, 이끼 및 조류) 또는 고등(유관) 식물 종일 수 있으며 이의 조직 또는 단리된 세포 및 추출물(예를 들어, 세포 현탁액)을 포함할 수 있다. 바람직한 식물은, 본원 하기에 기재된 콜라겐 사슬, 콜라겐 및/또는 가공 효소를 다량으로 축적시킬 수 있는 식물이다. 이러한 식물은 또한, 스트레스 조건에 대한 이들 식물의 내성 및 발현되는 구성요소 또는 조립된 콜라겐이 추출될 수 있는 용이성에 따라 선택될 수 있다. 인간 프로콜라겐이 발현될 수 있는 식물의 예는 담배, 옥수수, 알팔파, 쌀, 감자, 대두, 토마토, 밀, 보리, 카놀라, 당근, 상추 및 면을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
재조합 인간 프로콜라겐은 전형적으로, 인간 프로콜라겐을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열에 의한 안정한 또는 일시적인 형질전환에 의해 수행된다.
인간 프로콜라겐을 인코딩하는 예시적인 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 32, 33, 41, 및 42로 제시된다.
언급된 바와 같이, 인간 텔로콜라겐의 생성은 전형적으로, 인간 프로콜라겐을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열 및 관련 프로테아제를 인코딩하는 적어도 하나의 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열에 의한 안정한 또는 일시적인 형질전환에 의해 수행된다.
콜라겐의 삼중-나선형 구조의 안정성은 콜라겐 사슬 내에서 하이드록시프롤린의 잔기를 형성하기 위해 효소 프롤릴-4-하이드록실라제(P4H)에 의한 프롤린의 하이드록실화를 필요로 한다. 식물이 하이드록시프롤린-함유 단백질을 합성할 수 있긴 하지만, 식물 세포에서 하이드록시프롤린의 합성에 책임 있는 프롤릴 하이드록실라제는 포유류 P4H와 비교하여 상대적으로 느슨한 기질 서열 특이성을 나타낸다. 그러므로, Gly-X-Y 트리플렛의 Y 위치에서만 하이드록시프롤린을 함유하는 콜라겐의 생성은 콜라겐 및 인간 또는 포유류 P4H 유전자의 식물 공동-발현을 필요로 한다.
그러므로, 일 구현예에 따르면, 프로콜라겐 또는 텔로콜라겐은 내인성 P4H 활성이 없는 식물의 서브세포성 구획에서 발현된다. 본원에 사용된 바와 같이, 어구 "내인성 P4H 활성이 없는 서브세포성 구획"은 식물 P4H 또는 식물-유사 P4H 활성을 갖는 효소를 포함하지 않는 세포의 임의의 구획화된 영역을 지칭한다. 일 구현예에 따르면, 서브세포성 구획은 액포이다.
내인성 P4H 활성이 없는 서브세포성 구획에서의 발현된 프로콜라겐의 축적은 몇몇 접근법 중 임의의 하나를 통해 영향을 받을 수 있다.
예를 들어, 발현된 프로콜라겐/텔로콜라겐 사슬은 발현된 단백질을 아포플라스트 또는 세포소기관(예를 들어, 엽록체)과 같은 서브세포성 구획으로 표적화시키기 위한 신호 서열을 포함할 수 있다. 적합한 신호 서열의 예는 엽록체 수송 펩타이드(Swiss-Prot 엔트리 P07689에 포함되며, 아미노산 1 내지 57) 및 미토콘드리아 수송 펩타이드(Swiss-Prot 엔트리 P46643에 포함되며, 아미노산 1 내지 28)를 포함한다.
대안적으로, 프로콜라겐의 서열은, 식물에서 발현되는 경우 프로콜라겐의 세포성 국소화를 변경시키는 방식으로 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 인간 프로콜라겐과 P4H 둘 다 공동-발현하며, 프로콜라겐 알파 사슬(들)을 올바르게 하이드록실화[즉, Gly-X-Y 트리플렛의 프롤린(Y) 위치만 하이드록실화]시킬 수 있는 유전적으로 변형된 세포가 본원에 개시된다. P4H는 Genbank 번호 P07237 및 P13674에 제시된 바와 같은 2개의 서브유닛, 알파 및 베타로 이루어진 효소이다. 서브유닛 둘 다 활성 효소를 형성하는 데 필요한 한편, 베타 서브유닛은 또한 샤페론 기능을 소유한다.
본 발명의 유전적으로 변형된 세포에 의해 발현되는 P4H는 바람직하게는, 예를 들어 SEQ ID NO:34 및 35에 의해 인코딩되는 인간 P4H이다. 게다가, 증강된 기질 특이성을 나타내는 P4H 돌연변이체, 또는 P4H 상동체가 또한 사용될 수 있다. 적합한 P4H 상동체는 NCBI 기탁 NP__179363에 의해 식별된 아라비돕시스 옥시도리덕타제에 의해 예시된다.
P4H가 발현된 프로콜라겐 사슬과 공동-축적되는 것이 필수적이기 때문에, 이의 코딩 서열은 바람직하게는 그에 따라 (예를 들어, 신호 서열의 첨가 또는 결실 등에 의해) 변형된다.
포유류 세포에서, 콜라겐은 또한, 라이실 하이드록실라제, 갈락토실트랜스퍼라제 및 글루코실트랜스퍼라제에 의해 변형된다. 이들 효소는 특정 위치에서 라이실 잔기를 하이드록시라이실, 갈락토실하이드록시라이실 및 글루코실갈락토실 하이드록시라이실 잔기로 순차적으로 변형시킨다. Genbank 번호 O60568에 제시된 바와 같은 단일 인간 효소, 라이실 하이드록실라제 3(LH3)는 하이드록시라이신-연결 탄수화물 형성에서 제시된 바와 같이 모든 3개의 연속 단계를 촉매화할 수 있다.
그러므로, 본원에 개시된 유전적으로 변형된 세포는 또한, 포유류 LH3을 발현할 수 있다. SEQ ID NO: 38에 의해 제시된 것과 같은 LH3 코딩 서열은 이러한 목적에 사용될 수 있다.
상기 기재된 프로콜라겐(들) 및 변형 효소는, 기능성 프로모터의 전사 조절 하에 배치된 프로콜라겐 알파 사슬 및/또는 변형 효소(예를 들어, P4H 및 LH3)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 안정하게 통합된 핵산 작제물 또는 일시적으로 발현된 핵산 작제물로부터 발현될 수 있다. 이러한 핵산 작제물(이는 본원에서, 발현 작제물이라고도 함)은 전체 유기체(예를 들어, 식물, 한정된 식물 조직 또는 한정된 세포) 전체를 통해 및/또는 유기체의 한정된 발달 단계에서 발현을 위해 배치될 수 있다. 이러한 작제물은 또한, 선별 마커(예를 들어, 항생제 내성), 인핸서 요소 및 박테리아 복제를 위한 복제 기원을 포함할 수 있다.
2개의 발현 가능한 삽입물(예를 들어, 2개의 프로콜라겐 알파 사슬 유형, 또는 프로콜라겐 알파 사슬과 P4H)을 포함하는 작제물은 바람직하게는 각각의 삽입물에 대한 개별 프로모터를 포함하거나, 대안적으로 이러한 작제물은 단일 프로모터 하에 삽입 서열 둘 다를 포함하는 단일 전사물 키메라를 발현할 수 있음이 이해될 것이다. 이러한 경우, 키메라 전사물은 2개의 삽입물 서열 사이에 리보솜내 진입 영역(IRES; intraribosomal entry region) 서열을 포함할 수 있어서, 다운스트림 삽입물이 이로부터 번역될 수 있게 된다.
조직 특이적이거나, 발달적으로 특이적이거나, 구성적이거나 유도적일 수 있는 많은 기능성 발현 프로모터 및 인핸서는 본 발명의 작제물에 의해 이용될 수 있으며, 일부 예는 본원 하기에 제공된다.
이용되는 형질전환 기법과 상관없이, 일단 프로콜라겐-발현 자손이 식별되면, 이러한 식물은 이의 발현을 최대화하는 조건 하에 추가로 배양된다. 형질전환된 식물로부터의 자손은, 핵산 또는 단백질 프로브(예를 들어, 항체)를 사용하여 외인성 mRNA 및/또는 폴리펩타이드의 존재를 확증함으로써 선택될 수 있다. 후자의 접근법은 발현된 폴리펩타이드 구성요소의 국소화를 (예를 들어, 분획화된 식물 추출물을 프로브화함으로써) 가능하게 하므로, 외래 단백질의 올바른 가공 및 조립에 대한 식물의 잠재성을 또한 확증하기 때문에 바람직하다.
이러한 식물의 배양 후, 텔로펩타이드-포함 콜라겐은 전형적으로 수합된다. 식물 조직/세포는 바람직하게는 성숙 시 수합되고, 프로콜라겐 섬유는 추출 접근법을 사용하여 단리된다. 바람직하게는, 수합은, 프로콜라겐이 프로테아제 효소에 의해 절단될 수 있는 상태로 잔존하도록 수행된다. 일 구현예에 따르면, 조(crude) 추출물은 본 발명의 유전자이식 식물로부터 생성되고, 후속적으로 프로테아제 효소와 접촉된다. 식물 조 추출물을 생성시키기 위한 예시적인 방법은 본원 하기의 실시예 섹션에 기재된다.
프로펩타이드 또는 텔로펩타이드-포함 콜라겐은 프로테아제와의 인큐베이션 전에 본 발명의 유전적으로 조작된 세포로부터 정제될 수 있거나, 대안적으로 프로테아제와 인큐베이션 후 정제될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 더욱 대안적으로, 프로펩타이드 또는 텔로펩타이드-포함 콜라겐은 프로테아제 처리 전에 부분적으로 정제될 수 있고, 그 후에 프로테아제 처리 후에 완전히 정제될 수 있다. 더욱 대안적으로, 프로펩타이드 또는 텔로펩타이드-포함 콜라겐은 다른 추출/정제 절차와 동시에 프로테아제로 처리될 수 있다.
본 발명의 텔로펩타이드-포함 콜라겐을 정제하거나 반-정제하는 예시적인 방법은 암모늄 설페이트 등을 이용한 염석(salting out) 및/또는 한외여과에 의한 저분자의 제거를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
본원 상기의 배경기술에 기재된 바와 같이, 의학적 목적을 위한 동물 공급원 물질을 사용하는 데 있어서 위험이 수반된다. 이러한 위험은 또한, 식물에서 발현되는 프로콜라겐을 아텔로콜라겐으로 가공하는 데 사용되는 단백질분해성 효소를 선택하는 경우에 관련이 있다. 동물-유래 공급원 효소, 예컨대 트립신 또는 펩신의 적용은 그 자체가 최종 조제물을 질환 보균체(carrier)로 오염시킬 수 있다. 따라서, 모든 구성요소가 동물 공급원이 없는 생성 시스템을 고안하는 것이 요망된다.
특정 프로테아제만 재조합 프로펩타이드 또는 텔로펩타이드-포함 콜라겐을 올바르게 절단할 수 있음이 본원에 개시되었다. 이들은 소정이 식물 유래 프로테아제, 예를 들어, 피신(EC 3.4.22.3) 및 소정의 박테리아 유래 프로테아제, 예를 들어, 서브틸리신(EC 3.4.21.62), 뉴트라제를 포함한다. 일부 구현예에서, rh트립신 및 rh펩신과 같은 재조합 효소의 용도가 본원에 개시된다. 이러한 효소, 예를 들어, 피그 트리(Fig tree) 라텍스(Sigma, 카탈로그 #F4125 및 Europe Biochem)로부터의 피신, 바실러스 리헤니포르미스(Bacillus licheniformis)(Sigma, 카탈로그 #P5459)로부터의 서브틸리신, 박테리움 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)(Novozymes, 카탈로그 #PW201041)로부터의 뉴트라제, 및 옥수수에서 발현되는 재조합 인간 트립신인 TrypZean. TM(Sigma 카탈로그 #T3449)이 상업적으로 입수 가능하다.
프로콜라겐 또는 텔로콜라겐은 바람직하게는, 프로테아제가 이로부터 프로펩타이드 또는 텔로펩타이드를 절단할 수 있게 하는 조건 하에 프로테아제와 접촉된다. 전형적으로, 조건은 선택되는 특정 프로테아제에 따라 결정된다. 그러므로, 예를 들어, 프로콜라겐은 1 mg/ml 내지 25 mg/ml의 농도 및 약 10℃ 내지 20℃의 온도에서 15시간 이하 동안 프로테아제와 함께 인큐베이션될 수 있다.
프로테아제 분해 후, 생성된 아텔로콜라겐은 예를 들어, 하기의 실시예 섹션에 기재된 바와 같이 염 침전에 의해 추가로 정제될 수 있어서, 최종 생성물은 뉴트라제, 서브틸리신, 피신 및 재조합 인간 트립신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제에 의해 식물 또는 식물-세포 생성된 프로콜라겐으로부터 가공되었고 당업계에 알려진 방법(예를 들어, 쿠마시 염색을 통한 크기 분석, 웨스턴 분석 등)을 사용하여 분석되었던 아텔로콜라겐의 정제된 조성물을 포함한다.
정제 후, 아텔로콜라겐은 산성 용액(예를 들어, 10 mM HCl)의 첨가에 의해 재가용화될 수 있다. 이러한 산성 용액은 정제된 아텔로콜라겐의 저장에 유용하다.
본 발명자들은, 피신에 의한 분해 후, 아텔로콜라겐이 상기 기재된 산 용액의 중화 시 원섬유를 형성하는 상기 아텔로콜라겐의 능력을 유지시킴을 보여주었다. 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 생성된 정제되고 재가용화된 아텔로콜라겐 중 적어도 70%는 원섬유를 형성할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 생성된 정제되고 재가용화된 아텔로콜라겐 중 적어도 88%는 원섬유를 형성할 수 있다.
원섬유를 형성하는 능력은, 생성된 아텔로콜라겐이 비제한적으로 미용적 수술, 화상 환자의 치유 보조, 뼈 및 광범위하게 다양한 치과, 치아 및 수술적 목적의 재건을 포함한 의학적 목적에 유용하다.
배경기술 섹션에서 주지된 바와 같이, I형 콜라겐은 3D-바이오프린팅에서 빌딩 물질의 주요 구성요소로서 사용되기 위한 완벽한 후보인 것으로 간주된다. 이러한 천연 중합체에 의해 부여되는 유의한 이점에도 불구하고, 많은 인자는 3D 바이오프린팅에 대한 이의 사용을 방해한다. 이러한 목적을 위한 조직 추출된 콜라겐의 사용은 20℃보다 높은 온도에서 생리학적 조건 하에 자발적인 겔 형성을 구동하는, 온도 및 이온 강도에 대한 상기 콜라겐의 민감도로 인해 제한된다[예를 들어, PureCol, Advanced BioMatrix, Inc. 참조]. 조직 추출된-콜라겐의 겔의 전형적인 온도-의존적 형성은 프린팅 동안 정확한 유동성을 유의하게 방해한다. 적용 시까지 프린팅 매질을 저온에서 유지시키는 것은 이러한 현상에 대한 가능한 해결방안이지만, 심각한 기술적 한계를 암시한다. 또 다른 해결방안은, 이들 조건 하에 젤-유사로 되지 않는 변성된 형태의 콜라겐인 젤라틴의 사용이다. 그러나, 젤라틴은 네이티브 콜라겐의 진짜 조직 및 세포 상호작용이 결여되어 있어서, 중대한 생물학적 기능이 상실된다.
최근의 기술 발전은 이종삼량체성 I형 콜라겐을 인코딩하는 5개의 인간 유전자를 담배 식물 내에 도입함으로써 미접촉 인간 I형 콜라겐(rh콜라겐)(COLLPLANTTM, 이스라엘 소재; 또한 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 SIGMA-ALDRICH®에서 입수 가능함)의 정제를 위한 시스템의 발달을 초래하였다. 단백질은 콜라겐의 독특한 특성을 이용하는 비용 효과적인 산업적 과정을 통해 균질할 때까지 정제된다. 또한, WO 2006/035442, WO 2009/053985, 및 이로부터 유래되는 특허 및 특허 출원을 참조하며, 이들은 모두 전체가 본원에 제시되는 것처럼 참조에 의해 포함된다.
그러므로, 일 양태에 따르면, 유전적으로 변형된 식물이 본원에 개시되며, 상기 식물은 적어도 하나의 유형의 콜라겐 알파 사슬을 발현시키고, 내인성 P4H 활성이 없는 서브세포성 구획에서 상기 사슬을 축적시킬 수 있다.
I형 콜라겐 및 rh콜라겐은 3D-바이오프린팅에서 빌딩 물질의 주요 구성요소로서 사용되기 위한 후보인 것으로 간주된다. 다양한 유형의 스캐폴딩은 미용 및 다른 재구성 적용에 사용되어 왔다.
게다가, 연조직 강화, 예를 들어, 주름살의 감소를 위한 진피 충전제의 사용이 증가되어 왔다. 진피 충전제를 사용하는 하나의 가능한 방법은 중합성 진피 충전제 물질을 요망되는 영역 내로 주사하고, 뒤이어 상기 충전제를 요망되는 형태로 윤곽시키거나 성형하는 단계를 포함한다. 다양한 방법 중 하나에 의한 물질의 중합 및 가교는 주사된 물질에서 단량체를 형질전환시켜 중합체 및 사슬을 형성할 수 있으며, 이는 네트워크를 형성하여, 요망되는 성형된 형태를 보유할 수 있다. 중합체를 형성하고 중합체를 가교시키는 많은 방법이 존재한다. 다른 방법은 단량체 용액에서 반응성 화학종을 생성하는 광-반응성 시약 및 광-유도성 반응을 수반한다.
그러나, 이들 접근법 중 적어도 일부는 조직-유래 콜라겐 또는 비-콜라겐 중합체(예를 들어, 폴리(비닐 알코올) 또는 히알루론산)에 계속 초점을 맞추고 있다. 더욱이, 조직 추출된 콜라겐의 사용은 20℃보다 높은 온도에서 생리학적 조건 하에 자발적인 겔 형성을 구동하는, 온도 및 이온 강도에 대한 상기 콜라겐의 민감도로 인해 제한된다[예를 들어, PureCol, Advanced BioMatrix, Inc. 참조]. 조직 추출된-콜라겐의 겔의 전형적인 온도-의존적 형성은 정확한 유동성을 유의하게 방해한다. 적용 시까지 콜라겐을 저온에서 유지시키는 것은 이러한 현상에 대한 가능한 해결방안이지만, 심각한 기술적 한계를 암시한다. 또 다른 해결방안은, 이들 조건 하에 젤-유사로 되지 않는 변성된 형태의 콜라겐인 젤라틴의 사용이다. 그러나, 젤라틴은 네이티브 콜라겐의 진짜 조직 및 세포 상호작용이 결여되어 있어서, 중대한 생물학적 기능이 상실된다. 더욱이, 점도는 미세-게이지 바늘을 사용하여 진피 아래에 주사되는 것을 더욱 어렵게 만들고, 또한 젤라틴을 더 작은 공동 내로 확산시키고 성형하는 것을 더욱 어렵게 만든다.
본원에 개시된 진피 충전제 및 이의 용도의 구현예는,
1. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 상기 방법은,
a. 중합성 용액을 상기 조직 공간 내로 도입하는 단계로서, 상기 중합성 용액이,
i. 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐; 및
ii. 광개시제를 포함하는, 단계; 및
b. 상기 공간에 대해 피상적인 표피의 표면에 광을 적용하여, 중합을 유도하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 상기 방법은,
(a) 중합성 용액을 상기 조직 공간 내의 요망되는 배치로 성형하거나 형상화하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서, 상기 단계는 광을 적용하는 단계와 동시적이거나 이에 후속적인, 방법.
3. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 성형하거나 형상화하는 단계는 주름, 접힘, 잔주름, 주름살 또는 흉터를 감소시키는, 방법.
4. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐은 메타크릴레이트화되거나 티올레이트화되는, 방법.
5. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 중합체 용액은 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 유도체, 산화된 셀룰로스(OC) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체 또는 이의 변형된 유도체, 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 이의 변형된 유도체, 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA) 또는 이의 변형된 유도체, 카르복시메틸셀룰로스 또는 이의 변형된 유도체, 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 이의 변형된 유도체, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 방법.
6. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 히알루론산(HA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 산화된 셀룰로스(OC), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체, 트리칼슘 포스페이트(TCP), 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA), 카르복시메틸셀룰로스, 또는 결정질 나노셀룰로스(CNC)의 변형된 유도체는 광중합성 변형된 유도체를 포함하는, 방법.
7. 제5항에 있어서, 히알루론산(HA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 산화된 셀룰로스(OC), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체, 트리칼슘 포스페이트(TCP), 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA), 카르복시메틸셀룰로스, 또는 결정질 나노셀룰로스(CNC)의 변형된 유도체는 메타크릴레이트화된 유도체 또는 티올화된 유도체를 포함하는, 방법.
8. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 콜라겐은 rh콜라겐을 포함하는, 방법.
9. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 콜라겐은 유전적으로 변형된 식물로부터 수득되는, 방법.
10. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 유전적으로 변형된 식물은 담배, 옥수수, 알팔파, 쌀, 감자, 대두, 토마토, 밀, 보리, 카놀라, 당근, 및 면으로부터 선택되는 유전적으로 변형된 식물인, 방법.
11. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 유전적으로 변형된 식물은 담배 식물인, 방법.
12. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 유전적으로 변형된 식물은 COL1, COL2, P4H-알파, P4H-베타, 및 LH3로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 데옥시리보핵산(DNA)의 적어도 하나의 유전자 서열의 발현성 서열을 포함하는, 방법.
13. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐은 SEQ ID NO: 3에 제시된 바와 같고 유전적으로 변형된 식물에서 발현되는 바와 같은 적어도 변형된 하나의 인간 콜라겐 알파-1 사슬; 및 SEQ ID NO: 6에 제시된 바와 같고 유전적으로 변형된 식물에서 발현되는 바와 같은 적어도 하나의 변형된 인간 콜라겐 알파-2 사슬을 포함하고; 상기 유전적으로 변형된 식물은 외인성 프롤릴-4-하이드록실라제(P4H)를 추가로 발현하는, 방법.
14. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 라이실 하이드록실라제(LH), 프로테아제 N, 및 프로테아제 C로 이루어진 군으로부터 선택되는 외인성 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
15. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 인간 콜라겐 알파-1 사슬은 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같은 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
16. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 인간 콜라겐 알파-2 사슬은 SEQ ID NO: 2에 제시된 바와 같은 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
17. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 외인성 P4H는 포유류 P4H인, 방법.
18. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 외인성 P4H는 인간 P4H인, 방법.
19. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 인간 콜라겐 알파-1을 식물 또는 유전적으로 변형된 식물의 액포로 표적화시키고, 이를 피신으로 분해시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
20. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 인간 콜라겐 알파-2를 식물 또는 유전적으로 변형된 식물의 액포로 표적화시키고, 이를 피신으로 분해시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
21. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐은 아텔로콜라겐인, 방법.
22. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 광원은 발광 다이오드(LED), 레이저, 또는 제논 램프를 포함하는, 방법.
23. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 광개시제는 가시광에 반응하여 중합성 용액의 중합을 유도하는, 방법.
24. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 가시광은 390 nm 내지 700 nm의 파장을 갖는, 방법.
25. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 광개시제는 에오신 Y+ 트리에탄올아민 또는 리보플라빈으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
26. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 광개시제는 자외선(uv)에 반응하여 중합성 용액의 중합을 유도하는, 방법.
27. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 광개시제는 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP) 또는 1-[4 2-하이드록시-1-[4-(2-하이드록시에톡시)페닐]-2-메틸프로판-1-온(IRGACURE® 2959)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
28. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 광개시제는 적외선광에 반응하여 중합성 용액의 중합을 유도하는, 방법.
29. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 중합성 용액은 27-게이지 내지 33-게이지 범위의 중공 바늘 또는 캐뉼라를 통해 상기 조직 공간 내로 도입되는, 방법.
30. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 상기 조직 공간 내의 중합성 용액은 수동 마사지를 통해 요망되는 배치로 성형되거나 형상화되는, 방법.
31. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 상기 조직 공간 내의 중합성 용액은 성형 또는 형상화 기구를 통해 요망되는 배치로 성형되거나 형상화되는, 방법.
32. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 상기 조직 공간 내의 중합성 용액은 실온에서 본질적으로 비-겔화 가능한 것인, 방법.
33. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 상기 조직 공간 내의 중합성 용액은 37℃에서 본질적으로 비-겔화 가능한 것인, 방법.
34. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 중합성 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 소 콜라겐을 포함하는 유사한 중합성 용액과 비교하여 실온에서 감소된 점도를 갖는, 방법.
35. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 중합성 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 소 콜라겐을 포함하는 유사한 중합성 용액과 비교하여 37℃에서 감소된 점도를 갖는, 방법.
36. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 중합성 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 소 콜라겐을 포함하는 유사한 중합성 용액과 비교하여 실온에서 감소된 힘으로 상기 조직 공간 내로 도입되는, 방법.
37. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 중합성 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직 추출된 인간 또는 소 콜라겐을 포함하는 유사한 중합성 용액과 비교하여 37℃에서 감소된 힘으로 상기 조직 공간 내로 도입되는, 방법.
38. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 중합성 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 소 콜라겐을 포함하는 유사한 중합성 용액과 비교하여 증가된 조직 강화를 갖는, 방법.
39. 주름, 접힘, 잔주름, 주름살, 또는 흉터를 감소시키기 위한, 표피 아래의 조직 공간 내로 주사되는 중합성 용액의 용도로서, 상기 중합성 용액은 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐 및 가시광의 적용 전에 또는 이와 동시에 중합을 유도하기 위한 광개시제를 포함하고 주름, 접힘, 잔주름, 주름살, 또는 흉터를 감소시키기 위해 상기 중합성 용액을 요망되는 배치로 성형하거나 형상화하는, 용도.
40. 주름, 접힘, 잔주름, 주름살, 또는 흉터를 감소시키기 위한, 표피 아래의 조직 공간 내로 주사되는 중합성 용액의 용도로서, 여기서, 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐은 메타크릴레이트화되거나 티올레이트화되는, 용도.
41. 주름, 접힘, 잔주름, 주름살, 또는 흉터를 감소시키기 위한, 표피 아래의 조직 공간 내로 주사되는 중합성 용액의 용도로서, 여기서, 상기 중합성 용액은 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체 또는 이의 변형된 유도체, 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 이의 변형된 유도체, 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA) 또는 이의 변형된 유도체, 카르복시메틸셀룰로스 또는 이의 변형된 유도체, 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 이의 변형된 유도체, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 용도.
42. 주름, 접힘, 잔주름, 주름살, 또는 흉터를 감소시키기 위한, 표피 아래의 조직 공간 내로 주사되는 중합성 용액의 용도로서, 여기서, 히알루론산(HA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 산화된 셀룰로스(OC), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체, 트리칼슘 포스페이트(TCP), 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA), 카르복시메틸셀룰로스, 또는 결정질 나노셀룰로스(CNC)의 변형된 유도체는 광중합성 변형된 유도체를 포함하는, 용도.
43. 주름, 접힘, 잔주름, 주름살, 또는 흉터를 감소시키기 위한, 표피 아래의 조직 공간 내로 주사되는 중합성 용액의 용도로서, 여기서, 히알루론산(HA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 산화된 셀룰로스(OC), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체, 트리칼슘 포스페이트(TCP), 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA), 카르복시메틸셀룰로스, 또는 결정질 나노셀룰로스(CNC)의 변형된 유도체는 메타크릴레이트화된 유도체 또는 티올화된 유도체를 포함하는, 용도.
44. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 상기 방법은,
중합성 용액을 상기 조직 공간 내로 도입하는 단계를 포함하고, 상기 중합성 용액은 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는, 방법.
45. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 상기 방법은,
(a) 중합성 용액을 상기 조직 공간 내의 요망되는 배치로 성형하거나 형상화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
46. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 성형하거나 형상화하는 단계는 주름, 접힘, 잔주름, 주름살 또는 흉터를 감소시키는, 방법.
47. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 중합성 용액은 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 유도체, 산화된 셀룰로스(OC) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체 또는 이의 변형된 유도체, 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 이의 변형된 유도체, 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA) 또는 이의 변형된 유도체, 카르복시메틸셀룰로스 또는 이의 변형된 유도체, 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 이의 변형된 유도체, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 방법.
48. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 콜라겐은 rh콜라겐을 포함하는, 방법.
49. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 콜라겐은 유전적으로 변형된 식물로부터 수득되는, 방법.
50. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 유전적으로 변형된 식물은 담배, 옥수수, 알팔파, 쌀, 감자, 대두, 토마토, 밀, 보리, 카놀라, 당근, 및 면으로부터 선택되는 유전적으로 변형된 식물인, 방법.
51. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 유전적으로 변형된 식물은 담배 식물인, 방법.
52. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 유전적으로 변형된 식물은 COL1, COL2, P4H-알파, P4H-베타, 및 LH3로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 데옥시리보핵산(DNA)의 적어도 하나의 유전자 서열의 발현성 서열을 포함하는, 방법.
53. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐은 SEQ ID NO: 3에 제시된 바와 같고 유전적으로 변형된 식물에서 발현되는 바와 같은 적어도 변형된 하나의 인간 콜라겐 알파-1 사슬; 및 SEQ ID NO: 6에 제시된 바와 같고 유전적으로 변형된 식물에서 발현되는 바와 같은 적어도 하나의 변형된 인간 콜라겐 알파-2 사슬을 포함하고; 상기 유전적으로 변형된 식물은 외인성 프롤릴-4-하이드록실라제(P4H)를 추가로 발현하는, 방법.
54. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 라이실 하이드록실라제(LH), 프로테아제 N, 및 프로테아제 C로 이루어진 군으로부터 선택되는 외인성 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
55. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 인간 콜라겐 알파-1 사슬은 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같은 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
56. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 인간 콜라겐 알파-2 사슬은 SEQ ID NO: 2에 제시된 바와 같은 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
57. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 외인성 P4H는 포유류 P4H인, 방법.
58. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 외인성 P4H는 인간 P4H인, 방법.
59. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 인간 콜라겐 알파-1을 식물 또는 유전적으로 변형된 식물의 액포로 표적화시키고, 이를 피신으로 분해시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
60. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 인간 콜라겐 알파-2를 식물 또는 유전적으로 변형된 식물의 액포로 표적화시키고, 이를 피신으로 분해시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
61. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐은 아텔로콜라겐인, 방법.
62. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 중합성 용액은 27-게이지 내지 33-게이지 범위의 중공 바늘 또는 캐뉼라를 통해 상기 조직 공간 내로 도입되는, 방법.
63. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 상기 조직 공간 내의 중합성 용액은 수동 마사지를 통해 요망되는 배치로 성형되거나 형상화되는, 방법.
64. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 상기 조직 공간 내의 중합성 용액은 성형 또는 형상화 기구를 통해 요망되는 배치로 성형되거나 형상화되는, 방법.
65. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 상기 조직 공간 내의 중합성 용액은 실온에서 본질적으로 비-겔화 가능한 것인, 방법.
66. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 상기 조직 공간 내의 중합성 용액은 37℃에서 본질적으로 비-겔화 가능한 것인, 방법.
67. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 중합성 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 소 콜라겐을 포함하는 유사한 중합성 용액과 비교하여 실온에서 감소된 점도를 갖는, 방법.
68. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 중합성 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 소 콜라겐을 포함하는 유사한 중합성 용액과 비교하여 37℃에서 감소된 점도를 갖는, 방법.
69. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 중합성 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 소 콜라겐을 포함하는 유사한 중합성 용액과 비교하여 실온에서 감소된 힘으로 상기 조직 공간 내로 도입되는, 방법.
70. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 중합성 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직 추출된 인간 또는 소 콜라겐을 포함하는 유사한 중합성 용액과 비교하여 37℃에서 감소된 힘으로 상기 조직 공간 내로 도입되는, 방법.
71. 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 중합성 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 소 콜라겐을 포함하는 유사한 중합성 용액과 비교하여 증가된 조직 강화를 갖는, 방법.
72. 주름, 접힘, 잔주름, 주름살, 또는 흉터를 감소시키기 위한, 표피 아래의 조직 공간 내로 주사되는 중합성 용액의 용도로서, 상기 중합성 용액은 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하고 주름, 접힘, 잔주름, 주름살, 또는 흉터를 감소시키기 위해 상기 중합성 용액을 요망되는 배치로 성형하거나 형상화하는, 용도.
73. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 용액을 상기 조직 공간 내로 도입하는 단계를 포함하며, 상기 용액은,
(a) 식물-유래 인간 콜라겐; 및
(b) 적어도 하나의 성장 인자 또는 이의 공급원을 포함하는, 방법.
74. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 성장 인자의 공급원은 혈장 또는 혈소판-풍부 혈장을 포함하는, 방법.
75. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 여기서, 상기 세포성 성장 스캐폴드는 콜라겐-포함 조직의 분해 또는 상해로 인한 치유 또는 교체를 촉진하는, 방법.
76. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 여기서, 콜라겐-포함 조직은 힘줄, 인대, 피부, 각막, 연골, 혈관, 창자, 추간판, 근육, 뼈 또는 치아로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
77. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 여기서, 상기 세포성 성장 스캐폴드는 건염의 치유를 촉진하는, 방법.
78. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 콜라겐은 rh콜라겐을 포함하는, 방법.
79. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 콜라겐은 유전적으로 변형된 식물로부터 수득되는, 방법.
80. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 여기서, 유전적으로 변형된 식물은 담배, 옥수수, 알팔파, 쌀, 감자, 대두, 토마토, 밀, 보리, 카놀라, 당근, 및 면으로부터 선택되는 유전적으로 변형된 식물인, 방법.
81. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 여기서, 유전적으로 변형된 식물은 담배 식물인, 방법.
82. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 여기서, 유전적으로 변형된 식물은 COL1, COL2, P4H-알파, P4H-베타, 및 LH3로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 데옥시리보핵산(DNA)의 적어도 하나의 유전자 서열의 발현성 서열을 포함하는, 방법.
83. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐은 SEQ ID NO: 3에 제시된 바와 같고 유전적으로 변형된 식물에서 발현되는 바와 같은 적어도 변형된 하나의 인간 콜라겐 알파-1 사슬; 및 SEQ ID NO: 6에 제시된 바와 같고 유전적으로 변형된 식물에서 발현되는 바와 같은 적어도 하나의 변형된 인간 콜라겐 알파-2 사슬을 포함하고; 상기 유전적으로 변형된 식물은 외인성 프롤릴-4-하이드록실라제(P4H)를 추가로 발현하는, 방법.
84. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 라이실 하이드록실라제(LH), 프로테아제 N, 및 프로테아제 C로 이루어진 군으로부터 선택되는 외인성 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
85. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 여기서, 인간 콜라겐 알파-1 사슬은 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같은 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
86. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 여기서, 인간 콜라겐 알파-2 사슬은 SEQ ID NO: 2에 제시된 바와 같은 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
87. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 여기서, 외인성 P4H는 포유류 P4H인, 방법.
88. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 여기서, 외인성 P4H는 인간 P4H인, 방법.
89. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 인간 콜라겐 알파-1을 식물 또는 유전적으로 변형된 식물의 액포로 표적화시키고, 이를 피신으로 분해시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
90. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 인간 콜라겐 알파-2를 식물 또는 유전적으로 변형된 식물의 액포로 표적화시키고, 이를 피신으로 분해시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
91. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐은 아텔로콜라겐인, 방법.
92. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 소 콜라겐을 포함하는 유사한 용액과 비교하여 실온에서 감소된 점도를 갖는, 방법.
93. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 소 콜라겐을 포함하는 유사한 용액과 비교하여 37℃에서 감소된 점도를 갖는, 방법.
94. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 소 콜라겐을 포함하는 유사한 용액과 비교하여 실온에서 감소된 힘으로 상기 조직 공간 내로 도입되는, 방법.
95. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 소 콜라겐을 포함하는 유사한 용액과 비교하여 37℃에서 감소된 힘으로 상기 조직 공간 내로 도입되는, 방법.
96. 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 여기서, 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 용액은 동일한 농도 및 제제에서 조직-추출된 인간 또는 소 콜라겐을 포함하는 유사한 용액과 비교하여 증가된 스캐폴딩 형성을 갖거나 세포 성장에서 증가를 촉진하는, 방법.
97. 세포성 성장 스캐폴드를 유도하기 위한, 표피 아래의 조직 공간 내로 주사되는 용액의 용도로서, 상기 용액은 콜라겐-포함 조직의 분해 또는 상해로 인한 치유 또는 교체를 촉진하기 위해 식물-유래 인간 콜라겐 및 적어도 하나의 성장 인자 또는 이의 공급원을 포함하는, 용도.
98. 세포성 성장 스캐폴드를 유도하기 위한, 표피 아래의 조직 공간 내로 주사되는 용액의 용도로서, 여기서, 적어도 하나의 성장 인자의 공급원은 혈장 또는 혈소판-풍부 혈장을 포함하는, 용도.
정의
본원에 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥상 명확하게 다르게 나타내지 않는 한, 복수 참조를 포함한다. 예를 들어, 용어 "분자"는 또한 복수의 분자를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 ± 10% 또는 ± 5%를 지칭한다.
용어 "포함한다(comprises)", "포함하는(comprising)", "포함한다(includes)", "포함하는(including)", "갖는" 및 이들의 활용은 "포함하지만 이로 제한되지 않는"을 의미한다.
용어 "로 구성된"은 "포함하고 이로 제한되는"을 의미한다.
용어 "본질적으로 구성된"은, 부가적인 성분, 단계 및/또는 부분이 청구된 조성물, 방법 또는 구조의 기본적인 특징 및 신규 특징을 실질적으로 변경시키지 않는 경우에만, 조성물, 방법 또는 구조가 부가적인 성분, 단계 및/또는 부분을 포함할 수 있음을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "방법"은 화학, 약리학, 생물학, 생화학 및 의학 분야의 실무자에게 알려진 방식, 수단, 기법 및 절차를 포함하지만 이에 제한되지 않는 주어진 작업 또는 상기 실무자에 의해서 알려진 방식, 수단, 기법 및 절차로부터 쉽게 개발되는 주어진 작업을 달성하기 위한 방식, 수단, 기법 및 절차를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "유전적으로 변형된 식물"은 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열로 안정하게 또는 일시적으로 형질전환되는 임의의 하등(예를 들어, 이끼) 또는 고등(유관) 식물 또는 이들의(예를 들어, 세포 현탁액의) 조직 또는 단리된 세포를 포괄한다. 식물의 예는 담배, 옥수수, 알팔파, 쌀, 감자, 대두, 토마토, 밀, 보리, 카놀라, 면, 당근, 뿐만 아니라 이끼와 같은 하등 식물을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "콜라겐 사슬"은 콜라겐 서브유닛, 예컨대 콜라겐 섬유, 바람직하게는 I형 섬유의 알파 1 또는 알파 2 사슬을 포괄한다. 본원에 사용된 바와 같이, 어구 "콜라겐"은 I형 콜라겐의 경우 2개의 알파 1 사슬 및 하나의 알파 2 사슬을 포함하는 조립된 콜라겐 삼량체를 지칭한다. 콜라겐 섬유는 말단 프로펩타이드 C 및 N이 없는 콜라겐이다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "텔로펩타이드-포함 콜라겐"은 아텔로콜라겐에 포함된 텔로펩타이드 잔여물보다 더 긴 텔로펩타이드를 포함하는 가용성 콜라겐 분자를 포괄한다. 그러므로, 텔로펩타이드-포함 콜라겐은 전장 프로펩타이드를 포함하는 프로콜라겐일 수 있다. 대안적으로, 텔로펩타이드-포함 콜라겐은 부분적으로 분해된 프로펩타이드를 포함하는 프로콜라겐 분자일 수 있다. 더욱 대안적으로, 텔로펩타이드-포함 콜라겐은 텔로콜라겐일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로콜라겐"은 N-말단 프로펩타이드, C-말단 프로펩타이드 또는 둘 다 포함하는 콜라겐 분자(예를 들어, 인간)를 포괄한다. 예시적인 인간 프로콜라겐 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1, 2, 7 및 8로 제시된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "텔로콜라겐"은, 전형적으로 프로콜라겐에 포함되지만 텔로펩타이드를 여전히 함유하는 N-말단 프로펩타이드와 C-말단 프로펩타이드 둘 다 결여된 콜라겐 분자를 포괄한다. 원섬유성 콜라겐의 텔로펩타이드는 네이티브 N/C 프로테이나제에 의한 분해 후의 N-말단 프로펩타이드 및 C-말단 프로펩타이드의 잔여물이다. 재조합 인간 텔로콜라겐은, 외인성 인간 프로콜라겐과 각각의 프로테아제(즉, C 또는 N 또는 둘 다) 둘 다 발현하도록 형질전환되었던 세포에서 생성될 수 있다. 이러한 프로테아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 10(프로테아제 C) 및 SEQ ID NO: 11(프로테아제 N)에 의해 예시된다. 이러한 프로테아제는, 본원 하기에서 추가로 기재된 바와 같이, 이들 프로테아제가 콜라겐 사슬과 동일한 서브세포성 구획에 축적되도록 발현될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아텔로콜라겐"은, 전형적으로 프로콜라겐에 포함되는 N-말단 프로펩타이드와 C-말단 프로펩타이드 둘 다 및 이의 텔로펩타이드의 적어도 일부가 결여되어 있으나 적합한 조건 하에 이것이 원섬유를 형성할 수 있도록 이의 텔로펩타이드의 충분한 부분을 포함하는 콜라겐 분자를 포괄한다. 임의의 유형의 아텔로콜라겐은 본 발명의 방법에 따라 생성될 수 있다. 예는 원섬유-형성 콜라겐(I형, II형, III형, V형 및 XI형), 네트워크-형성 콜라겐(IV형, VIII형 및 X형), 원섬유 표면과 관련된 콜라겐(IX형, XII형 및 XIV형), 막관통 단백질로서 발생하는 콜라겐(XIII형 및 XVII형)을 포함하거나, 11-nm 주기적 비드형 필라멘트(VI형)를 형성한다. 일 구현예에 따르면, 아텔로콜라겐은 I형 콜라겐의 알파 1 및/또는 알파 2 사슬을 포함한다.
본원에 개시된 진피 충전제는 일부 구현예에서 유전적으로 변형된 형태의 콜라겐/아텔로콜라겐--예를 들어, 콜라게나제-내성 콜라겐 등을 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "식물 프로모터" 또는 "프로모터"는 식물, 진균류 및 효모의 세포(DNA-함유 세포소기관을 포함함)에서 유전자 발현을 지시할 수 있는 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 식물, 박테리아, 바이러스, 진균류 또는 동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 이러한 프로모터는 구성적일 수 있으며, 즉, 복수의 조직에서 높은 수준의 유전자 발현을 지시할 수 있거나, 이러한 프로모터는 조직 특이적일 수 있으며, 즉, 특정 조직 또는 조직들에서 유전자 발현을 지시할 수 있거나, 이러한 프로모터는 유도적일 수 있으며, 즉, 자극 하에 유전자 발현을 지시할 수 있거나, 이러한 프로모터는 키메라일 수 있으며, 즉, 적어도 2개의 상이한 프로모터의 일부로 형성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "내인성 P4H 활성이 없는 서브세포성 구획"은 식물 P4H 또는 식물-유사 P4H 활성을 갖는 효소를 포함하지 않는 세포의 임의의 구획화된 영역을 지칭한다. 이러한 서브세포성 구획의 예는 액포, 아포플라스트 및 세포질, 뿐만 아니라 엽록체, 미토콘드리아 등과 같은 세포소기관을 포함한다.
본원 전체에 걸쳐, 어구 "빌딩 물질"은 어구 "비경화된 빌딩 물질" 또는 "비경화된 빌딩 물질 제제"를 포괄하고, 종합하여 본원에 기재된 바와 같이 층을 순차적으로 형성하는 데 사용되는 물질을 기재한다. 이러한 어구는, 최종 물체를 형성하는 비경화된 물질, 즉, 하나 이상의 비경화된 모델링 물질 제제(들), 및 선택적으로 또한, 지지체를 형성하는 데 사용되는 비경화된 물질, 즉, 비경화된 지지체 물질 제제를 포괄한다. 비경화된 빌딩 물질은 하나 이상의 모델링 제제를 포함할 수 있고, 물체의 상이한 부분이 상이한 모델링 제제의 경화 시 제조되도록 분배될 수 있고, 따라서, 상이한 경화된 모델링 물질 또는 경화된 모델링 물질의 상이한 혼합물로 제조된다.
본원에 사용된 바와 같이, "바이오프린팅"은, 본원에 기재된 바와 같은 자동화된 또는 반-자동화된, 컴퓨터-보조, 적층 제조 시스템과 융화성인 방법을 통해 생물학적 구성요소를 포함하는 하나 이상의 바이오-잉크 제제(들)를 이용하는 한편 적층 제조 과정을 실시하는 것을 의미한다.
본원 전체에 걸쳐, 바이오프린팅의 맥락에서, 용어 "물체"는 생물학적 구성요소를 적어도 이의 일부를 포함하는 적층 제조의 최종 생성물을 기재한다. 이러한 용어는 이러한 것이 비경화된 빌딩 물질의 일부로서 사용된다면, 지지체 물질의 제거 후, 본원에 기재된 바와 같이 바이오프린팅 방법에 의해 수득된 생성물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 생물학적 구성요소는 예를 들어, WO 2006/035442, WO 2009/053985, 및 이로부터 유래되는 특허 및 특허 출원에 기재된 바와 같은 재조합 인간 콜라겐을 포함하며, 이들은 모두 전체가 본원에 제시되는 것처럼 참조에 의해 포함된다.
본원 전체에 걸쳐 사용된 바와 같이, 용어 "물체"는 전체 물체 또는 이의 일부를 지칭한다.
본원 전체에 걸쳐, "경화성 물질"은 본원에 기재된 바와 같이 경화 조건에 노출 시, 고체화되거나 단단해져 본원에 기재된 바와 같이 경화된 성형 물질을 형성하는 화합물(단량체성 또는 올리고머성 또는 중합체성 화합물)이다. 경화성 물질은 전형적으로, 합한 에너지원에 노출 시 중합 및/또는 가교를 겪는 중합성 물질이다. 대안적으로, 경화성 물질은 온도 변화(예를 들어, 가열 또는 냉각)에 노출 시 고체화되거나 단단해지는 열-반응성 물질이다. 선택적으로, 경화성 물질은 생물학적 반응(예를 들어, 효소적-촉매 반응) 시 단단해진 또는 고체 물질을 형성하기 위해 반응을 겪는 생물학적 물질이다.
"경화 조건"은 경화 에너지(예를 들어, 온도, 방사선) 및/또는 경화를 촉진하는 물질 또는 시약을 포괄한다.
본원에 기재된 임의의 구현예 중 일부에서, 경화성 물질은 본원에 기재된 바와 같이 방사선에 노출 시 중합되거나 가교를 겪는 광중합성 물질이며, 일부 구현예에서 경화성 물질은 본원에 기재된 바와 같이 UV-vis 방사선에 노출 시 중합되거나 가교를 겪는 UV-경화성 또는 가시광-경화성 물질이다.
본원에 기재된 임의의 구현예 중 일부에서, 경화성 물질은 각각이 본원에 기재된 바와 같이 중합 가능한 단량체, 올리고머 또는 단쇄 중합체일 수 있다.
본원에서, 용어 "경화성"은 용어 "중합성" 및 "가교성"을 포괄한다.
본원에 사용된 바와 같이, "공중재배(aeroponics)"는 토양 또는 응집물 매질의 사용 없이 공기 또는 습한 환경에서 식물을 성장시키는 과정("농경술(geoponics)"로 알려져 있음)이다.
본원에 사용된 바와 같이, "수경재배(hydroponics)"는 물 용매 중 미네랄 영양소 용액을 사용하여 토양 없이 식물을 성장시키는 과정("농경술")이다.
본원에 사용된 바와 같이, "엔도구체(endosphere)"는 식물의 모든 내생식물(endophyte)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "삼출물"은 포어(pore) 또는 상처를 통해 유기체에 의해 배출되는 유체이다. "삼출"은 "삼출물"을 배출시키는 과정이다.
본원에 사용된 바와 같이, "수경재배"는 물 용매 중 미네랄 영양소 용액을 사용하여 토양 없이 식물을 성장시키는 과정("농경술")이다.
본원에 사용된 바와 같이, "이입(integression)" 또는 "이입 혼성화"는 단순 혼성화와는 달리 부모 종 중 하나와의 종간(interspecific) 하이브리드의 반복된 역교배(backcrossing)를 통해 하나의 종의 유전자 풀(pool)로부터의 유전자가 또 다른 종의 유전자 풀 내로 이동하여 부모 유전자의 복잡한 믹스를 초래하는 것("즉, "유전자 유동")이다.
본원에 사용된 바와 같이, "대사체(metabolome)"는 "생물학적 시료"(비제한적으로 세포, 세포소기관, 기관, 조직, 조직 추출물, 생물유체, 또는 유기체) 내에서 발견되는 저분자 화학물질의 완전한 세트이다. 대사체의 저분자 화학물질은 "내인성 대사물" 또는 "외인성 대사물"일 수 있다. "내인성 대사물"은 유기체에 의해 천연적으로 생성되고, 아미노산, 유기산, 핵산, 지방산, 아민, 당(sugar), 비타민, 보조인자, 안료 및 항생제를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. "외인성 화학물질"은 유기체에 의해 천연적으로 생성되지 않고, 약물, 환경적 오염물질, 식품 첨가제, 독소 및 다른 생체이물(xenobiotic)을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. "내인성 대사체"는 내인성 대사물로 이루어지는 한편, "외인성 대사체"는 "외인성 화학물질"로 이루어진다. "내인성 대사체"는 특히 식물, 진균류 및 원핵생물에 관하여 "1차 대사체" 및 "2차 대사체"로 이루어진다. "1차 대사체"는 "1차 대사물"(즉, 유기체의 정상적인 성장, 발달 및 생식에 직접적으로 관여하는 대사물)로 이루어지는 한편, "2차 대사체"는 "2차 대사물"(즉, 유기체의 정상적인 성장, 발달 또는 생식에 직접적으로 관여하지 않는 대사물)로 이루어진다. 2차 대사물은 종종 유의한 생태학적 기능을 가진다.
본원에 사용된 바와 같이, "대사물"은 통상 1,500 Da 미만의 분자량을 갖는 저분자이다. "대사물"은 당지질, 다당류, 짧은 펩타이드, 작은 올리고뉴클레오타이드, 유기산, 탁산, 알칼로이드 및 스트리고락톤(strigolactone)을 포함할 수 있으나 이들로 제한되는 것은 아닌 한편, 매우 큰 거대분자(예를 들어, 단백질, mRNA, rRNA 및 DNA)는 일반적으로 대사물이 아니고 대사체의 일부도 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "SILVA 데이터베이스"는 SILVA 리보솜 RNA 데이터베이스이다.
임의의 종류의 추가의 가공을 받는 것들을 포함하여 유기체로부터 수득된 모든 시료는 상기 유기체로부터 수득되는 것으로 간주된다.
DNA 단리, 시퀀싱, 증폭, 및/또는 클로닝 방법은 당업자에게 알려져 있다. DNA 증폭에 가장 보편적으로 사용되는 방법은 PCR이다(중합효소 연쇄 반응; 예를 들어, 문헌[PCR Basics: from background to Bench, Springer Verlag, 2000]; [Eckert 등, 1991. PCR Methods and Applications 1:17] 참조). 부가적인 적합한 증폭 방법은 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사 증폭 및 자가-지속형 서열 복제, 및 핵산-기초 서열 증폭(NASBA)을 포함한다. 마찬가지로, RNA 및 단백질 단리, 특징화 등을 위한 방법 및 단백질 발현 방법은 당업자에게 알려져 있다.
하기 실시예는 본원에 개시된 진피 충전제 및 이의 용도의 일부 구현예를 보다 완전히 예시하기 위해 제시된다. 그러나, 이는 결코 본원에 개시된 진피 충전제나 이의 용도의 넓은 범위를 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 당업자는 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 본원에 개시된 원리의 많은 변화 및 변형을 쉽게 고안할 수 있다.
실시예
실시예 1. 작제물 및 형질전환 계획.
이 연구에 사용되는 발현 카세트 및 벡터의 작제는 도 1a 내지 도 1d에 예시되어 있다(미국 특허 제8,455,717호 참조). 이 연구에서 모든 코딩 서열은 담배에서의 발현을 위해 최적화되고 요망되는 측면(flanking) 영역을 갖도록 화학적으로 합성되었다(SEQ ID NO: 1, 4, 7, 12, 14, 16, 18, 20, 22). 도 1a: 액포 신호 또는 아포플라스트 신호(SEQ ID NO: 7에 의해 인코딩됨)에 융합되거나 신호가 없는 Col1 및 Col2를 코딩하는 합성 유전자(SEQ ID NO: 1, 4)를 국화 rbcS1 프로모터 및 5' UTR(SEQ ID NO: 10)과 국화 rbcS1 3'UTR 및 종결자(SEQ ID NO: 11)로 이루어진 발현 카세트에서 클로닝하였다. 완전한 발현 카세트를 pBINPLUS 식물 형질전환 벡터의 다중 클로닝 부위에 클로닝하였다(문헌[van Engelen 등, 1995, Transgenic Res 4: 288-290]). 도 1b: 액포 신호에 또는 아포플라스트 신호(SEQ ID NO: 7에 의해 인코딩됨)에 융합되거나 신호가 없는 P4H 베타-인간, P4H 알파-인간 및 P4H-식물을 코딩하는 합성 유전자(SEQ ID NO: 12, 14 및 16)는 벡터 pJD330에 의해 운반된 CaMV 35S 프로모터 및 TMV 오메가 서열 및 아그로박테리움 노팔린 신서타제(NOS: Nopaline synthetase) 종결자로 이루어진 발현 카세트에서 클로닝하였다(문헌[Galili 등, 1987, Nucleic Acids Res 15: 3257-3273]). 완전한 발현 카세트를, Col1 또는 Col2의 발현 카세트를 운반하는 pBINPLUS 벡터의 다중 클로닝 부위에 클로닝하였다. 도 1c: 액포 신호에 또는 아포플라스트 신호(SEQ ID NO: 7에 의해 인코딩됨)에 융합된 프로테이나제 C 및 프로테이나제 N을 코딩하는 합성 유전자(SEQ ID NO: 18, 20)를 국화 rbcS1 프로모터 및 5' UTR(SEQ ID NO: 10)과 국화 rbcS1 3'UTR 및 종결자(SEQ ID NO: 11)로 이루어진 발현 카세트에서 클로닝하였다. 완전한 발현 카세트를 pBINPLUS 식물 형질전환 벡터의 다중 클로닝 부위에 클로닝하였다. 도 1d: 액포 신호에 또는 아포플라스트 신호(SEQ ID NO: 7에 의해 인코딩됨)에 융합되거나 신호가 없는 측면의 딸기 엽맥 줄무늬 바이러스(SVBV: Strawberry vein banding virus) 프로모터(NCBI 기탁 AF331666 REGION: 623.950 버전 AF331666.1 GI:13345788)가 있고 아그로박테리움 옥토핀 신타제(OCS) 종결자(NCBI 기탁 Z37515 REGION: 1344.1538 버전 Z37515.1 GI:886843)에 의해 종결되는 LH3을 코딩하는 합성 유전자(SEQ ID NO: 22)를 Col1 및 P4H 베타의 발현 카세트를 운반하는 pBINPLUS 벡터의 다중 클로닝 부위에 클로닝하였다.
숙주 식물 내로의 도 1a 내지 도 1d에 기재된 발현 카세트를 이용하는 공동-형질전환 계획은 도 2에 예시되어 있다. 각각의 발현 카세트 삽입물은 코딩 서열의 단축 명칭으로 표시된다. 코딩 서열 및 관련 SEQ ID NO.는 표 1에 기재되어 있다. 각각의 공동-형질전환은 2개의 pBINPLUS 바이너리 벡터에 의해 수행된다. 각각의 직사각형은 1, 2 또는 3개의 발현 카세트를 운반하는 단일 pBINPLUS 벡터를 나타낸다. 프로모터 및 종결자는 도 1a 내지 도 1d에 명시되어 있다.
실시예 2. 식물 콜라겐 발현.
하기 표 1에 열거된 단백질을 인코딩하는 합성 폴리뉴클레오타이드 서열을 담배 식물에서 발현을 위해 디자인되고 최적화하였다.
신호 펩타이드
1. 티올 프로테아제 알류라인(aleurain) 전구체에 대한 보리 유전자의 액포 신호 서열(NCBI 기탁 P05167 GI:113603) MAHARVLLLALAVLATAAVAVASSSSFADSNPIRPVTDRAASTLA (SEQ ID NO: 24).
2. 아라비돕시스 탈리아나 엔도-1,4-베타-글루카나제의 아포플라스트 신호(Cell, NCBI 기탁 CAA67156.1 GI:2440033); SEQ ID NO. 7에 의해 인코딩되는 SEQ ID NO. 9.
플라스미드의 작제
식물 발현 벡터를 실시예 1에 교시된 바와 같이 작제하였으며, 각각의 작제된 발현 벡터의 조성을 제한 분석 및 시퀀싱을 통해 확인하였다.
하기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터가 작제되었다:
1. 콜라겐 알파 1
2. 콜라겐 알파 1+인간 P4H 베타 서브유닛
3. 콜라겐 알파 1+인간 P4H 베타 서브유닛+인간 LH3
4. 콜라겐 알파 2
5. 콜라겐 알파 2+ 인간 P4H 알파 서브유닛
6. 콜라겐 알파 2+ 아라비돕시스 P4H
7. 인간 P4H 베타 서브유닛+인간 LH3
8. 인간 P4H 알파 서브유닛
각각의 상기 기재된 코딩 서열을 액포 수송 펩타이드에 또는 아포플라즘 수송 펩타이드에 번역적으로 융합시키거나, 임의의 수송 펩타이드 서열이 없었으며, 이러한 경우 세포질 축적이 예상된다.
식물 형질전환 및 PCR 스크리닝
담배 식물(니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum), Samsun NN)을 도 2에 교시된 형질전환 계획에 따라 상기 기재된 발현 벡터로 형질전환시켰다.
콜라겐 알파 1의 324 bp 단편 및 콜라겐 알파 2의 537 bp 단편을 증폭시킬 수 있도록 디자인된 4개의 프라이머를 사용한 멀티플렉스 PCR을 통해, 생성된 유전자이식 식물을 스크리닝하였다(표 2). 도 3은 하나의 멀티플렉스 PCR 스크린의 결과를 예시한다.
실시예 3. 유전자이식 담배 식물에서 인간 콜라겐의 검출.
500 mg의 잎을 0.5 ml 50 mM Tris-HCl pH=7.5에서 "완전" 프로테아제 저해제 칵테일(Roche Diagnostics GmbH로부터의 생성물 #1836145, 50 ml 완충제 중 1개의 정제)과 함께 분쇄함으로써 담배 형질전환체 2, 3 및 4로부터 총 가용성 단백질을 추출하였다. 조 추출물을 250 μl 4X와 혼합하였다. 10% 베타-머캅토-에탄올 및 8% SDS를 함유하는 시료 적용 완충제에서, 시료를 7분 동안 가열하고, 13,000 rpm에서 8분 동안 원심분리하였다. 20 μl의 상층액을 10% 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하고, 표준 웨스턴 블롯 절차에서 항-콜라겐 I(변성) 항체(Chemicon Inc.로부터의 #AB745)로 시험하였다(도 4). W.T.는 야생형 담배이다. 양성 콜라겐 밴드는 콜라겐 I형 알파 1 또는 알파 2 또는 둘 다에 대해 PCR 양성인 식물에서 가시적이다. 인간 태반으로부터의 500 ng 콜라겐 I형의 양성 대조군 밴드(Chemicon Inc.로부터의 #CC050)는 유전자이식 식물로부터의 시료에서 총 가용성 단백질(약 150 μg) 중 약 0.3%를 나타낸다.
콜라겐이 액포에 표적화되는 경우, 총 가용성 단백질의 약 1% 이하의 예상된 분자량에서 콜라겐을 발현하는 식물을 검출하였다(도 4). 아포플라스트로의 전장 콜라겐의 서브세포성 표적화를 성공적으로 달성하였다(도 5). 세포질에서 콜라겐을 발현하는 식물(즉, 표적화 펩타이드 없음)은 콜라겐을 검출 가능한 수준까지 축적시키지 않았으며, 이는 식물에서 콜라겐의 서브세포성 표적화가 성공에 결정적임을 보여준다.
게다가, N-프로펩타이드가 결여된 콜라겐이 유의한 단백질분해를 받았음을 보여준 Ruggiero 등 2000 및 Merle 등 2002의 연구와는 대조적으로, 본 접근법을 사용하여, C-프로펩타이드 및 N-프로펩타이드를 갖는 전장 콜라겐 단백질은 서브세포성 구획에서 높은 수준으로 축적되었다.
본 데이터는 또한, 각각이 상이한 콜라겐 사슬 유형을 발현하는 2개의 식물의 교배는, 이것이 최적의 수준의 각각의 사슬 유형을 발현하는 식물의 선택 및 후속적으로 요망되는 콜라겐 생성 식물을 달성하기 위한 식물 교배를 가능하게 한다는 점에서 유리함을 명확하게 보여준다.
본 발명의 식물에 의해 생성되는 콜라겐은 네이티브 프로펩타이드를 포함하고, 따라서, 단백질분해에 의해 정제된 인간 대조군보다 더 큰 단백질을 형성하는 것으로 예상된다. 하이드록실화 또는 글리코실화가 없는 콜라겐 알파 1 및 알파 2 사슬의 계산된 분자량은 하기: 프로펩타이드가 있는 Col1--136 kDa, 프로펩타이드가 없는 Col1--95 kDa, 프로펩타이드가 있는 Col2--127 kDa, 프로펩타이드가 없는 Col2--92 kDa이다.
도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 형질전환체 3-5 및 3-49에서 Col1 밴드는 다른 식물에서의 Col1 밴드보다 더 큰 것으로 보인다. 이는, 이들 식물에서 공동발현되고 인간 콜라겐 사슬과 동일한 서브세포성 구획(예를 들어, 액포)으로 표적화된 알파 서브유닛 및 베타 서브유닛으로 이루어진 인간 프롤린-4-하이드록실라제 완전효소에 의해 콜라겐 사슬에서 프롤린 하이드록실화를 나타낸다.
실시예 4. 유전자이식 식물에서 콜라겐 삼중 나선 조립 및 열적 안정성.
유전자이식 식물에서 콜라겐 삼중 나선의 조립 및 나선 열적 안정성을 열적 변성, 뒤이어 유전자이식 식물의 총 조 단백질 추출물의 트립신 또는 펩신 분해에 의해 시험하였다(도 6a 내지 도 6b).
제1 실험에서, 500 mg의 잎을 0.5 ml 50 mM Tris-HCl pH=7.5에서 분쇄하고 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 수집함으로써 담배 2-9(col 알파1만 발현하고 P4H를 발현하지 않음) 및 담배 3-5(col 알파1+2와 P4H 둘 다 발현함)로부터의 총 가용성 단백질을 추출하였다. 0 μl의 상층액을 열 처리(33℃ 또는 43℃에서 15분)하고, 그 후에 얼음 상에 즉시 배치하였다. 각각의 시료 6 .mu.l의 1 mg/ml 트립신을 50 mM Tris-HCl pH=7.5에 첨가함으로써 트립신 분해를 개시하였다. 시료를 실온(약 22℃)에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 10% 베타머캅토에탄올 및 8% SDS를 함유하는 20 μl 4X 시료 적용 완충제의 첨가에 의해 분해를 종료하고, 시료를 7분 동안 가열하고, 13,000 rpm에서 7분 동안 원심분리하였다. 50 μl의 상층액을 10% 폴리아크릴아미드 겔 상으로 로딩하고, 표준 웨스턴 블롯 절차를 사용하여 항-콜라겐 I 항체(Chemicon Inc.로부터의 #AB745)로 시험하였다. 양성 대조군은 500 ng 인간 콜라겐 I(펩신 분해에 의해 인간 태반으로부터 추출된, Chemicon Inc.로부터의 #CC050)의 시료였으며, 이는 w.t. 담배로부터 추출된 50 μl의 총 가용성 단백질에 첨가되었다.
도 6a에 제시된 바와 같이, 식물 #3-5에서 형성된 콜라겐 삼중 나선뿐만 아니라 대조군 인간 콜라겐은 33℃에서의 변성에 내성이었다. 대조적으로, 식물 #2-9에 의해 형성된 콜라겐은 33℃에서 변성되었다. 열적 안정성에서의 이러한 차이는, 콜라겐 알파 1과 콜라겐 알파 2 둘 다, 뿐만 아니라 P4H 베타 및 알파 서브유닛을 발현하는 형질전환체 #3-5에서 성공적인 삼중 나선 조립 및 번역후 프롤린 하이드록실화를 나타낸다.
형질전환체 #2-9에서의 2개의 밴드는 SDS 및 머캅토에탄올과 함께 7분간의 가열 후 안정한 이량체 또는 삼량체를 나타낼 수 있다. 유사한 밴드는 인간 콜라겐(상단 패널) 및 형질전환체 #3-5에서 가시적이다. 가능한 설명은, 라이신 옥시다제에 의한 2개의 라이신의 산화적 탈아민화 후 형성되는 상이한 삼중 나선에서 2개의 펩타이드 사이의 공유 결합(가교)이다.
제2 실험에서, 500 mg의 잎을 0.5 ml의 100 mM Tris-HCl pH=7.5 및 300 mM NaCl에서 분쇄하고 10,000 rpm에서 7분 동안 원심분리하고 상층액을 수집함으로써 담배 13-6(콜라겐 I 알파 및 알파 2 사슬을 발현하며--화살표로 표시됨, 인간 P4H 알파 및 베타 서브유닛 및 인간LH3을 발현함)으로부터의 총 가용성 단백질을 추출하였다. 50 μl의 상층액을 열 처리(33℃, 38℃ 또는 42℃에서 20분)하고, 그 후에 얼음 상에 즉시 배치하였다. 각각의 시료에 10 mM 아세트산 중 4.5 μl의 0.1M HCl 및 4 μl의 2.5 mg/ml 펩신을 첨가함으로써 펩신 분해를 개시하였다. 시료를 실온(약 22℃)에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 5 μl의 비완충된 1 M Tris를 첨가함으로써 분해를 종료하였다. 각각의 시료를, 10% 베타-머캅토-에탄올 및 8% SDS를 함유하는 22 μl 4X 시료 적용 완충제와 혼합하고, 시료를 7분 동안 가열하고, 13,000 rpm에서 7분 동안 원심분리하였다. 40 μl의 상층액을 10% 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하고, 표준 웨스턴 블롯 절차에서 항-콜라겐 I 항체(Chemicon Inc.로부터의 #AB745)로 시험하였다. 양성 대조군은 w.t. 담배로부터의 총 가용성 단백질에 첨가된 약 50 ng 인간 콜라겐 I(펩신 분해에 의해 인간 태반으로부터 추출된, Chemicon Inc.로부터의 #CC050)의 시료였다.
도 6b에 예시된 바와 같이, 식물 #13-6에서 형성된 콜라겐 삼중 나선은 42℃에서의 변성에 내성이었다. 프로펩타이드의 절단은 33℃에서 우선 가시적이고, 온도가 38℃까지 상승하고 다시 42℃까지 상승하는 경우 효율이 점차적으로 증가한다. 절단된 콜라겐 삼중 나선 도메인은 펩신 처리된 인간 콜라겐의 이동과 유사한 겔 상에서의 이동을 보여준다. 이 실험에 사용된 인간 콜라겐은 펩신 단백질분해에 의해 인간 태반으로부터 추출되었고, 따라서, 프로펩타이드 및 일부의 텔로펩타이드가 결여되어 있다.
실시예 5. 식물 P4H 발현.
네이티브 식물 P4H의 유도
담배 P4H cDNA를 클로닝하고 프로브로서 사용하여, 내인성 P4H 발현을 유도할 조건 및 처리를 결정하였다. 노던 블롯 분석(도 7)은, P4H가 생장점에서 상대적으로 높은 수준으로 그리고 잎에서 낮은 수준으로 발현됨을 명확하게 보여준다. P4H 수준은 마모 처리(하단 패널에서 "상처") 후 4시간째에 잎에서 유의하게 유도되었다. 유사한 결과는 다른 스트레스 조건(제시되지 않음)을 사용하여 달성되었다.
유전자이식 담배 식물에서 인간 P4H 알파 및 베타 서브유닛과 콜라겐 알파 1 및 알파 2 사슬의 검출
항-인간 P4H 알파 서브유닛 항체(ICN Biomedicals Inc.로부터의 #63-163), 항-인간 P4H 베타 서브유닛 항체(Chemicon Inc.로부터의 #NMAB2701) 및 항-콜라겐 I 항체(Chemicon Inc.로부터의 #AB745)를 사용하여 유전자이식 담배 식물에서 인간 P4H 알파 및 베타 서브유닛과 콜라겐 I형 알파 1 및 알파 2 사슬의 검출을 수행하였다. 이들 항체로 프로브화된 웨스턴 블롯의 결과는 도 8에 제시된다.
P4H 알파, P4H 베타 및 콜라겐 1 알파 1 및 알파 2 밴드의 발현을 식물 13-6(또한 인간 LH3으로 또한 형질전환됨)에서 확인하였다. 액포 신호 펩타이드를 포함하는 P4H 알파 및 베타의 계산된 분자량은 각각 65.5 kDa 및 53.4 kDa이다. 하이드록실화 또는 글리코실화가 없으며 프로펩타이드가 있는 콜라겐 알파 1 및 알파 2 사슬의 계산된 분자량은 각각 136 kDa 및 127 kDa이다.
실시예 6. 액포-표적화된 콜라겐은 암실-성장 식물에서 안정하게 발현된다.
콜라겐 발현 식물:
20-279 부모 담배 식물 주(line)를, P4H베타+LH3을 발현하는 발현 벡터 및 P4H알파를 발현하는 또 다른 발현 벡터로 공동-형질전환시킴으로써 생성하였다. 각각의 유전자는 알류라인, 식물 액포 티올 프로테아제의 액포 표적화 결정인자에 뒤이어 존재한다.
2-300 부모 담배 식물 주를, col1을 발현하는 발현 벡터 및 col2를 발현하는 또 다른 발현 벡터로 공동-형질전환시켜 생성하였다. 각각의 유전자는 알류라인, 식물 액포 티올 프로테아제의 액포 표적화 결정인자에 뒤이어 존재한다.
Col1, P4H베타 및 LH3을 인코딩하는 발현 벡터 및 Col2 및 P4H 알파를 인코딩하는 제2 발현 벡터로 담배 식물을 공동-형질전환시킴으로써 13-652 식물을 생성하였다. 각각의 유전자는 알류라인, 식물 액포 티올 프로테아제의 액포 표적화 결정인자에 뒤이어 존재하고, 벡터에 포함된 카세트 서열은 상기 실시예 1에 기재되어 있다.
명암 시험
6개의 13-6/52 동형접합체 식물의 분석. 잎 #4+5/6으로부터의 시료를 8일 동안 매일 동일한 시기(12:30)에, 규칙적인 조건(광 조건 하에 16시간 및 암 조건에서 8시간)에서 성장된 3개의 식물로부터 그리고 암실에서만 성장된 3개의 식물로부터 채취하였다.
총 단백질 추출 및 웨스턴 블롯 분석
90 mg의 담배 잎을 4℃에서 추출 완충제(Roche 카탈로그 번호, 04-693-116-001로부터 입수 가능한 100 mM Tris HCl pH=7.5, 프로테아제 저해제 칵테일)에서 믹서 밀 유형 MM301(Retsch)에 의해 균질화하였다. 30분의 원심분리(4℃에서 20,000Xg) 후, 상층액을 수집하였다. 단백질 시료를 8% SDS-PAGE(Laemmli 1970) 상에서 분획화하고, BIO-RADTM 단백질 TRANS-BLOTTM 기구를 사용하여 니트로셀룰로스 막으로 이전시켰다. 상기 막을 실온에서 3%(g/v) 탈지유(Difco)에서 30분 동안 블라킹시킨 다음, 상업적인 토끼 항-인간 콜라겐 I형 폴리클로날 항체(Chemicon)와 실온에서 밤새(o.n.) 반응시켰다. 상기 막을 물로 3회 내지 5회 헹군 다음, TBS에서 30분 동안 세척하였다. 2차 항체[알칼리 포스파타제(AP)에 공액된 염소 항 토끼-IgG 항체(Chemicon)]와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 상기 막을 물로 3회 내지 5회 헹구고, TBS에서 30분 동안 세척하였다. 니트로테트라졸륨 블루 클로라이드(NBT, Sigma) 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 p-톨루이딘 염(BCIP, Sigma)으로 실온에서 2시간 내지 o.n. 동안 면역검출을 수행하였다.
결과
도 9에 제시된 바와 같이, 액포 표적화된 콜라겐에 대해 유전자이식인 담배 식물은 프로-알파-1 및 프로-알파-2를 발현한다(레인 1). 암실 성장된 액포 표적화된 식물로부터의 콜라겐은 유사한 안정성(레인 2)을 나타내었으며, 이는 본 발명의 교시에 따라 생성된 콜라겐의 이례적인 안정성을 입증하였다.
실시예 7 내지 13.
일반적인 재료 및 방법
콜라겐 추출 및 효소 반응: 배합기에서, 300 g의 담배 잎을, 5 g PVPP 및 2 g의 활성탄이 보충된 냉각 추출 완충제(360 mg 포타슘-메타-비설파이트, 530 mg L-시스테인 및 1 g EDTA를 함유하는, 600 ml의 100 mM Tris-HCl pH 7.5)에서 배합하였다(또한 미국 특허 제8,759,487호 참조). 배합을 1-분 간격으로 5분 동안 수행하여, 온도를 15℃ 미만으로 유지시켰다. 조 추출물을 거즈 패드를 통해 여과하고, 25,000 g, 5℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 상층액을 수집하고; CaCl2를 10 mM의 최종 농도까지 첨가하였다. 상층액을 10 ml 시료로 분할하였다. 요망되는 효소를 본원 하기의 표 3에 제시된 조건에 따라 각각의 10 ml 시료에 첨가하였다.
효소 설명: 피크 트리 라텍스로부터의 피신(Sigma, 카탈로그 #F4125), 바실러스 리헤니포르미스로부터의 서브틸리신(Sigma, 카탈로그 #P5459-5gr), 파인애플 줄기로부터의 브로멜라인(Bromelain)(Sigma, 카탈로그 #B4882-10gr), 카리카 파파야(Carica papaya)로부터의 파파인(Fluka, 카탈로그 #76220-25gr), 친알칼리성 박테리움 바실러스 렌투스(Bacillus lentus)로부터의 사비나제 6.0 t 유형 W(Novozymes, 카탈로그 #PX92500501), 박테리움 아밀로리퀘파시엔스로부터의 뉴트라제 1.5 MG(Novozymes, 카탈로그 #PW201041), 프로타멕스(Protamex), 상업적인 바실러스 프로테이나제 복합체(Novozymes, 카탈로그 #PW2A1021), 알칼라제 3.0 T, 바실러스 서브틸리스 알칼리성 프로테이나제(Novozymes, 카탈로그 #PJ90000901), 에스퍼라제 6.0 T, 친알칼리성 박테리움 바실러스 렌투스(Novozymes, 카탈로그 #PE90110401), 알칼라제 2.4 L FG, 바실러스 서브틸리스 알칼리성 프로테이나제(Novozymes, 카탈로그 #PLN05330), 에스퍼라제 8.0 L, 친알칼리성 박테리움 바실러스 렌투스(Novozymes, 카탈로그 #PE00077)를 모두 Novozymes에 의해 기증받았다. 트립신, 췌장 트립신 6.0 S 유형 무염, 동물 췌장으로부터 유래(Novozymes, 카탈로그 #P245-D20). TRYPZEANTM, 옥수수에서 발현되는 재조합 트립신을 Sigma Chemical Co.(카탈로그 #: T3449)로부터 구매하였다.
아텔로콜라겐 농도의 결정: 실시예 9 내지 10에 따라 생성된 아텔로콜라겐의 농도를 하기와 같은 2 가지 방법에 의해 검정하였다:
SIRCOLTM 검정법: SIRCOLTM 콜라겐 검정법 키트를 Biocolor Ltd.(카탈로그 번호 85000)로부터 구매하였다. 이 검정법은 시리우스 레드 염료와 콜라겐 삼중 나선의 상호작용에 기초한다. 분석을 공급업체의 설명서 매뉴얼, 4판, 2002에 따라 수행하였다. 소 콜라겐 표준을 사용하여, 보정 곡선(0 내지 50 μg 콜라겐)을 제조하였다. 10 mM HCl 중 10 μl 내지 50 μl의 콜라겐 용액의 3개 시료를 1.5 ml 에펜도르프 튜브 내로 배치하고, 0.5 M 아세트산을 이용하여 부피를 100 μl로 만들었다. 1 ml의 SIRCOLTM 염료 시약을 각각의 튜브에 첨가하고, 상기 튜브를 실온에서 30분 동안 진탕시켰다. 튜브를 실온에서 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하며, 상층액을 흡인하고, 상기 튜브를 흡수지 위로 역전시켜, 잔여 상층액을 제거하였다. 면봉을 사용하여, 튜브의 벽으로부터 임의의 과량의 액적을 제거하였다. 1 ml의 알칼리 시약을 각각의 튜브에 첨가하며, 잘 혼합하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 분광광도계를 사용하여 540 nm에서의 흡광을 측정하고, 10 mM HCl을 블랭크 시료로서 사용하여 보정 곡선과 비교하여 콜라겐의 농도를 계산하였다.
SDS-PAGE 인스턴트 블루 검정법: SDS PAGE, 8% 아크릴아미드 상에 로딩하기 전에, 시료를 SAB 완충제(환원 조건) 내에서 5분 동안 가열하고, 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 겔을 Mini Protean 3 유닛(BioRad #165-3301, 165-3302)에서 진행시켰다. 단백질이 겔 상에서 청색 밴드로서 시각화될 때까지 인스턴트 블루 시약(Novexin #ISB01L)을 겔에 적용하였다. 상기 겔을 물로 헹구고, 건조하였다. 동일한 겔 상에 로딩된 인간 표준과 비교하여 밀도측정법에 의해 콜라겐 밴드의 농도를 계산하였다.
쿠마시 분석: 콜라겐(10 mM HCl 중)의 시료를 1 M Tris를 사용하여 pH 7.5로 적정하였다. 10% 베타-머캅토에탄올 및 8% SDS를 함유하는 시료 적용 완충제를 30 μl의 pH 적정된 시료에서 4배 희석시킴으로써 이를 첨가하였다. 시료를 7분 동안 가열하였다. 30 μl의 상층액을 10% 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하고, 100 볼트에서 2시간 동안 분리하였다. 겔을 쿠마시계 용액에 1시간 동안 진탕하면서 이전시켰다. 표준 탈색 용액을 사용하여 쿠마시 염료를 제거하였다.
알파-1 및 알파-2 콜라겐 사슬의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석: 시료를 환원성 시료 적용 완충제(2.5% 베타-머캅토에탄올 및 2% SDS를 함유함)에서 7분 동안 가열하고, 13,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 30 μl의 상층액을 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하였다. 분리 후, 표준 웨스턴 블롯 프로토콜을 이용하여, 시료를 니트로셀룰로스 막 상으로 블로팅하였다. 이전 후, 알파-1 및 알파-2 콜라겐 사슬의 면역검출을 위해 막을 항-콜라겐 I 항체(Chemicon Inc. 카탈로그 #AB745)와 함께 인큐베이션하였다. 분자량 마커를 Fermentas Inc.(카탈로그 #SM0671)로부터 구매하였다.
대조군: Calbiochem(#234138)으로부터 구매한 인간 피부 콜라겐 I형의 양성 대조군을 웨스턴 블롯 분석용 마커로서 이용하였다. 분쇄 대조군 시료는 추출 완충제에서의 재현탁 직전 담배 잎으로부터 유래된 펠렛을 반영한다. "D" 대조군 시료는 추출 완충제에서의 재현탁 후 동일한 펠렛을 반영한다. "K" 대조군 시료는 10 mM HCl 중 피신-분해된 프로콜라겐을 포함한다. 배경 피신-독립적 프로테아제 활성을 모니터링하기 위해, 피신-무함유 절단 시료를 항상 모든 피신 분해 시험과 병행하여 제조하였다.
유전자이식 식물로부터의 콜라겐의 정제: 30 mg/L 트립신 또는 5 mg/L(50 μl/L) 서브틸리신(Sigma #P5459) 또는 5 mg/L 피신(Sigma #F4125)의 첨가에 의해 콜라겐-함유 추출물에서의 프로펩타이드의 분해를 개시하였다. 단백질분해를 15℃에서 4시간 동안 수행하였다. 22,000 g, 15℃에서 30분 동안 원심분리에 의해 비-가용성 오염물의 제거를 수행하였다. 상층액을 회수하고, R.T.에서 20분 동안 일정하게 교반하면서 결정질 NaCl을 3.13 M의 최종 농도까지 서서히 첨가함으로써 콜라겐을 침전시켰다. 용액을 저온실에서 교반 없이 O.N. 인큐베이션하였다. 5℃에서 25,000 g에서 2시간 동안 원심분리함으로써 콜라겐의 수집을 수행하였다.
거즈 패드의 4개 층을 통해 상층액을 조심스럽게 부었다. 펠렛을 200 ml의 250 mM 아세트산 및 2 M NaCl에서 자기 교반기를 사용하여 5분 동안 재현탁시켰다. 현탁액을 5℃에서 25,000 g에서 40분 동안 원심분리하였다. 미량의 상층액을 유리 바이얼로부터 제거하였다. 펠렛을 실온에서 1시간 동안 200 ml의 0.5 M 아세트산에서 재용해시켰다. 15℃에서 16,000 g에서 30분 동안 원심분리에 의해 비-가용성 물질의 제거를 수행하였다. 거즈 패드의 12개 층을 통해 상층액을 부었다. R.T.에서 20분 동안 일정하게 교반하면서 NaCl을 3 M의 최종 농도까지 서서히 첨가함으로써 콜라겐을 침전시켰다. 용액을 4℃에서 8시간 내지 O.N. 이하 동안 인큐베이션하였다. 5℃에서 25,000 g에서 2시간 동안 원심분리함으로써 콜라겐의 수집을 수행하였다. 상층액의 흡인 후, 펠렛을 R.T.에서 1시간 동안 자기 교반기를 사용하여 200 ml의 0.5 M 아세트산에서 재용해시켰다. 15℃에서 16,000 g에서 30분 동안 원심분리에 의해 비-가용성 물질의 제거를 수행하였다. 거즈 패드의 12개 층을 통해 상층액을 부었다. R.T.에서 20분 동안 일정하게 교반하면서 NaCl을 3 M의 최종 농도까지 서서히 첨가함으로써 콜라겐을 침전시켰다. 용액을 4℃에서 8시간 동안 인큐베이션하였다. 5℃에서 2,000 g에서 2시간 동안 원심분리함으로써 콜라겐을 수집하였다. 상층액을 흡인하였다. 펠렛을 40 ml의 10 mM HCl에 피펫팅에 의해 재용해시키고, R.T에서 5분 동안 보텍스시켰다. 용액을 투석 백(MWCO 14,000 Da)으로 이전시키고, 4℃에서 4 L의 10 mM HCl에 대해 4시간 동안 투석시켰다. 이러한 투석을 O.N. 반복하였다.
용액을 30 ml 주시기를 사용하여 우선 0.45 μm 필터를 통해 여과한 다음, 0.2 μM 필터를 통해 여과함으로써 콜라겐의 멸균을 수행하였다. Vivaspin PES 20 ml 여과 튜브(Vivascience, #VS2041, MWCO 100'000)를 사용한 한외여과를 통해 콜라겐을 추가로 농축시켰다. 부피가 0.75 ml로 감소될 때까지 원심분리를 5℃에서 5,000 g에서 45분 동안 수행하였다.
분해 동역학 및 식품-등급 피신에 의한 프로콜라겐 절단의 조건의 최적화: 25% 암모늄 설페이트(AMS)에서 포화될 때까지의 펠렛(실시예 10에 기재된 바와 같이 수집됨)을 완충제(완충제 A: 0.1 M 소듐 포스페이트 완충제에 용해되고 10 M NaOH 또는 6 N HCl로 pH 7.5로 적정된 4.5 mM 포타슘 메타디설파이트, 12.5 mM L-시스테인, 7.5 mM EDTA)에 4.36 g 펠렛: 200 mL 빙냉 완충제의 비에서 재현탁시켰다. 그 후에, 시료를 15℃에서 20분 동안 교반하였다. 그 후에, 15 mL 시험 튜브 당 10 mL의 분취물을 제조하고, 뒤이어 증가하는 농도(5 mg/L 내지 15 mg/L)의 피신(피그 트리 라텍스, Biochem Europe 식품 등급 피신)을 투여하였다. 시료를 15℃에서 1시간 내지 3시간 동안 인큐베이션하고, SDS-PAGE에 의해 분리한 다음, 프로콜라겐보다 더 낮은 분자량에서 이동하는 콜라겐의 존재에 대해 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
다양한 pH 값(5.5, 7.5, 또는 8.5)의 포스페이트 완충제 A(27.2 g:800 mL 완충제)에 재현탁된 담배 잎-유래 펠렛을 0 M 내지 3 M NaCl의 존재 하에 15℃에서 1시간 동안 10 mg/L 피신으로 처리하였다. 각각의 반응 혼합물로부터 1 mL 시료를 원심분리(10 min, 15,000 g, 4℃)함으로써 반응을 종료시켰다. 펠렛을 1 mL 완충제 A(pH 7.5)에 재현탁시키며, SDS-PAGE에 의해 분리하고, 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
분해 동역학 및 약제학적-등급의 피신: 담배 잎 펠렛에 의한 프로콜라겐 절단의 조건을 증가하는 NaCl 농도(0 M 내지 3 M)와 함께 다양한 pH 값(7.5, 8.5, 9.5)의 약제학적-등급(Biochem-Europe Pharm 등급) 피신-함유 추출 완충제(10 mg/L)에 5분 내지 45분 동안 재현탁시켰다. 추가의 실험은 추출 완충제에의 첨가제로서 EDTA 및 L-시스테인의 필요하고 최적의 조건 및 농도를 연구하였다. 시료를 15℃, pH 7.5에서 NaCl 없이 1시간 내지 3시간 동안 0 mM 내지 80 mM L-시스테인과 함께 0 mM 내지 100 mM EDTA의 존재 하에 분해 혼합물에서 인큐베이션하였다.
원섬유형성: 원섬유형성은 콜라겐 작용성 시험으로서 간주된다. 따라서, 피신에 의해 분해된 정제된 콜라겐이 원섬유를 형성하는 능력은 수득된 생성물의 필수적인 특성이다. 시험 방법: 콜라겐-함유 용액(2벌 중복 시료)의 pH를 소듐 포스페이트, pH 11.2로 pH 6.7로 중화시킨 다음, 27+/-2 μC에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 시료를 원심분리하여, 형성된 하이드로겔을 침강시켰다. 중화-전과 중화-후(상층액) 시료의 단백질 농도를 로리(Lowry) 방법을 통해 결정하였다. PURECOLTM(NUTACON, Cat No. 5409)을 양성 대조군으로서 그리고 젤라틴을 음성 대조군으로서 이용하였다.
실시예 7. 트립신 및 펩신의 존재 하에 유전자이식 식물로부터 콜라겐의 추출 및 정제.
진화적인 근접부가 상대적으로 가까우므로 인간 미용 또는 의학적 적용에서 포유류 단백질의 사용이 인간 건강에 위험할 수 있기 때문에 포유류 공급원으로부터의 콜라겐의 사용을 피하기 위해 식물 내 인간 콜라겐의 생성을 개시하였다. 기지의 질환이 크로이펠츠-야콥 질환(CJD)은, 인간에 의한 감염된 포유류 단백질의 소모에 의해 유발되는 질환 중 하나이다.
초기에, 유전자이식 식물로부터의 콜라겐의 정제를 소 췌장 트립신 및 소화 프로테아제 펩신을 사용하여 수행하였으며, 이 두 효소 모두 동물 소화계에서 단백질의 가수분해를 촉매화한다. 하기 실시예는 콜라겐 정제 공정에 사용하기에 적합한 비-동물 공급원으로부터 프로테아제의 식별을 예시한다.
결과
콜라겐의 정제 동안 프로펩타이드 분해는 우선, 췌장 효소 트립신에 의해 수행되었다. 트립신은 300 mg/L에서 콜라겐 프로펩타이드를 분해시켰으나, 콜라겐 수율은 정제 과정의 종료 시 매우 낮았다(도10). 트립신의 농도가 20 mg/L 또는 30 mg/L까지 낮춰지는 경우, 수율은 더 높았으나, 프로콜라겐 분해는 단지 부분적이었으며 동일한 시료 사이에서 일관되지 않았다(도11).
이러한 문제점을 극복하기 위해, 다양한 인큐베이션 온도 및 시간을 시도하였으나, 그 결과는 수율의 변화를 야기하지 않았다(데이터는 제시되지 않음). 정제 과정에서 이후에 펩신 효소의 첨가는 부분적인 분해 문제점을 해결하였고(도12), 알파-1 및 알파-2 콜라겐을 산출하였으며, 이러한 콜라겐은 돼지-유래 콜라겐 대조군 시료와 함께 공동-이동하였다.
실시예 8. 콜라겐 추출 및 이의 효소적으로-유도된 분해.
그러나, 트립신-펩신 용액은, 이것이 2개의 상이한 효소를 필요로 하여 정제 과정을 연장시키기 때문에 최적이지 않았다. 더욱이, 두 효소 모두 동물 공급원으로부터 유래된다. 이들 문제를 극복하기 위해, 비-동물 기원의 상이한 프로테아제 효소의 스크린을 수행하였다. 스크리닝된 다양한 효소에 의해 다양한 분해 패턴을 수득하였다. 콜라겐을 사비나제(도 15) 및 에스퍼라제(도 17) 효소와 함께 인큐베이션한 경우, 프로펩타이드의 관찰 가능한 분해는 거의 없거나 전혀 없었다. 파파인(도 14), 브로멜라인(도 13), 알칼라제 2.4 L 및 에스퍼라제 8.0 L(도 18)와의 인큐베이션은 프로펩타이드의 과다분해 또는 과소분해를 야기하였다. 알칼라제 및 프로타멕스 효소(도 16)는 요망되는 분해 패턴 및 수준(25 mg/L, 6시간)을 야기하였고, 이때 알파 1 및 알파 2 사슬은 돼지-유래 콜라겐 시료와 유사하게 이동하였다. 그러나, 모든 분자가 완전히 분해되지는 않았으며, 더 긴 인큐베이션 기간을 필요로 할 수 있다. 프로콜라겐과 피신(5 mg/L 및 25 mg/L)(도 15)의 인큐베이션 시 최적의 결과가 수득되었으며, 이때, 알파 1 및 알파 2 사슬의 밴드는 돼지-유래 콜라겐 대조군 시료와 함께 공동이동하였고, 이때 가시적인 과다분해는 없었다. 유사한 결과는 3시간 동안의 서브틸리신 5 mg/L(도 13) 및 6시간 동안의 뉴트라제 25 mg/L(도 17)에서 실증되었다.
실시예 9. 서브틸리신 또는 피신에 의한 분해 후 유전자이식 식물로부터 콜라겐의 추출 및 정제.
450 gr의 유전자이식 식물의 잎(13-361 또는 13-6-52)으로부터의 콜라겐 정제를 수행하였으며, 뒤이어 피신(도 19) 또는 서브틸리신(도 20)에 의한 프로콜라겐 분해를 수행하였다. 정제 과정 중 다양한 단계에서 콜라겐의 시료를 웨스턴 분석에 의해 분석하였다. 피신 및 서브틸리신에 의한 프로펩타이드 분해는 콜라겐 1 및 콜라겐 2의 요망되는 가공도를 야기하였다. 더 낮은 분자량의 밴드가 정제 과정 전체에 걸쳐 웨스턴 블롯 상에서 관찰되었으나, 이들 밴드는 효소(레인 3 내지 4)와의 인큐베이션 전에 식물 추출물에서 그리고 또한 돼지-유래 콜라겐 대조군 시료(양성 대조군)에서 나타났다(도 19).
실시예 10. 피신에 의한 분해 후 유전자이식 식물로부터 콜라겐의 스케일업 추출 및 정제.
4 L 반응기(ESCO 모델 EL-3)에서 1 kg의 유전자이식 담배 잎을 예비-냉각된 2 L 추출 완충제(100 mM 소듐 포스페이트 완충제 pH 7.5, 4.5 mM 포타슘 메타디설파이트, 12.23 mM L-시스테인 및 7.5 mM EDTA)로 20분 동안(5℃, 50% 스크레이퍼 속도 및 100% 균질기 블레이드 rpm) 분쇄하였다. 6.68 g 챠콜 및 16.67 g의 PVPP를 추출물에 첨가하고, 20분 동안(5℃ 및 50% 스크레이퍼 속도) 계속 교반하였다. 추출물을 원심분리하고(11,000 rpm, 5℃, 0.5 H), 상층액을 15% 암모늄 설페이트로 포화시켰다(1시간 교반, 5℃). 6880 rpm, 5℃, 30분 후, 상층액을 25% 암모늄 설페이트까지 포화시키고, 1시간 동안(5℃) 교반하였다. 재원심분리 후, 제1 원심분리 단계 후 수집된 부피의 15%에서 펠렛(6880 rpm, 5℃, 30분)을 재현탁시켰다(추출 완충제에서). 프로펩타이드의 제거는 5 mg/L 피신(Biochem Europe)과 함께 3시간 분해, 15℃에 의해 가능해졌다. 시료를 원심분리하고(11,000 rpm, 15℃, 30분), 성숙 콜라겐을 3 M NaCl(교반하면서 NaCl을 서서히 첨가하고 4℃에서 O.N. 놔두었음)을 사용하여 침전시켰다. 침전(13,000 rpm, 5℃, 2시간) 후, 상층액을 폐기하고, 펠렛을 0.5 M 아세트산에 재현탁시켰다. 다른 라운드의 3 M 염석(O.N) 및 원심분리를 수행하였고, 뒤이어 펠렛을 40 ml의 10 mM HCl에 재현탁시켰다. 시료를 투석 백(12 kDa 내지 14 kDa)으로 이전시키고, 4℃에서 4 L의 10 mM HCl에 대해 4시간 동안 투석시켰다. 신선한 4 L 10 mM HCl, O.N.으로 투석을 반복하였다. 투석된 용액을 0.45 미크론 필터(이전에 10 mM HCl로 세척됨)를 통해 여과한 다음, 0.25 미크론 필터를 통해 여과하였다. 마지막으로, 시료를 Vivaspin(Vivascience) 여과 튜브(100 kDa)에서 농축시켰다.
실시예 11. 유전자이식 담배 식물에서 재조합 인간 프로콜라겐으로서 생성된 아텔로콜라겐의 용해도.
실시예 9 내지 10에 따라 생성된 아텔로콜라겐의 농도를 방법 섹션에 기재된 바와 같이 후속하는 2 가지 방법에 의해 검정하였다. 피신에 의해 분해된 몇몇 전형적인 조제물로부터 수득된 생셩된 농도는 본원 하기의 표 4에 열거되어 있다:
실시예 12. 담배 잎-유래 프로콜라겐의 피신-의존적 단백질분해.
식품-등급 피신에 의한 프로콜라겐의 분해 동역학: 최고 콜라겐 수율을 가능하게 하는 적절한 피신 농도 및 인큐베이션 시간을 보정하기 위해, 프로콜라겐-발현 담배 잎 펠렛을 증가하는 농도의 식품-등급 피신(5-15 mg/L)과 함께 15℃에서 1시간 내지 3시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 시료를 웨스턴 블롯 상에서의 알파-1 및 알파-2 콜라겐 사슬의 면역검출에 의해 분석하였다. 증가된 피신 농도는 1-시간의 인큐베이션 기간 후 콜라겐 사슬에서 향상을 제공하였다(도 22, 레인 5 대 레인 6). 그러나, 반응 시간의 연장 시, 증가된 피신 농도는 콜라겐의 과다분해를 야기하였다(도 22, 레인 11 대 레인 12 내지 14 및 레인 17 대 레인 18 내지 20). 그러므로, 프로콜라겐으로부터 콜라겐으로의 분해를 위한 최적 조건을 10 mg/L 식품-등급 피신의 첨가 시 15℃에서 1시간 동안 설정하였다.
약제학적-등급 피신에 의한 프로콜라겐의 분해 동역학: 프로콜라겐-발현 담배 잎 펠렛 상에서 유사한 실험을 수행하여, 약제학적-등급 피신에 의한 프로콜라겐 분해에 적절한 조건을 결정하였다. 펠렛을 재현탁시키고, 증가하는 농도의 약제-등급 피신(2.5 내지 10 mg/L)과 함께 15℃에서 0.5시간 내지 3시간 동안 인큐베이션하였다. 웨스턴 블롯 상에서의 콜라겐 사슬의 면역검출에 의해 분해 효율을 결정하였다. 도 23a 내지 도 23c에 도시된 바와 같이, 증가하는 피신 농도는 증가된 콜라겐 산출 및 저하된 프로콜라겐 수준을 야기하였다. 약제학적-등급의 피신에 의한 프로콜라겐의 가장 효과적인 분해는 1-시간 반응 시간 후 10 mg/L에서 관찰되었다.
피신-의존적 프로콜라겐 절단을 위한 pH 값 및 염 농도의 최적화: 그 후에, 분해 완충제 pH와 염 농도 둘 다의 기여도를 평가하였다. 유사한 담배 잎 포스트-AMS 펠렛을, 0.5 M 내지 3 M NaCl 범위의 염 함량으로 pH 5.5, 7.5, 8.5 또는 9.5로 적정된 추출 완충제에 재현탁시켰다. 그 후에, 웨스턴 블롯 상에서의 면역분석 전에 시료를 15℃에서 1시간 동안 10 mg/L 약제-등급 피신과 함께 인큐베이션하였다. 산성 검정법 조건(pH 5.5)은 불충분한 콜라겐 수율(도 24a, 레인 2 내지 레인 6)을 야기한 한편, pH 값의 증가는 피신-의존적 콜라겐 함량에서 상관관계적인 상승을 실증하였고, 이때 피크 값은 2 M NaCl의 존재 하에 pH 8.5에서 관찰되었다(도 24b, 레인 10). 이들 결과는 피신-유도 프로콜라겐 분해에 대해 풀링된 2개의 15 kg 펠렛 상에서 수행된 스케일업 추출 및 정제 실험에서 추가로 지지되었다. 면역블로팅에 의해 관찰된 바와 같은 증가된 콜라겐 사슬 수율과는 별도로, 2 M NaCl의 존재 하에 pH 8.5의 완충제에서 분해된 시료는 완충제 A(pH 7.5, 0 mM NaCl)에서 분해된 것처럼 효율적으로 원섬유화되었다(본원 하기의 표 5 참조--배치 YC1 및 YC2). 그러므로, 더 높은 pH 및 염 농도 둘 다, 프로콜라겐의 피신-유도 분해 후 향상된 콜라겐 수율을 제공하였다.
분해 반응 혼합물에서 EDTA 및 L-시스테인의 필수성(vitalness)의 결정: EDTA와 L-시스테인 둘 다 콜라겐 정제 과정의 초기 단계에서 추출 완충제에 존재하는 첨가제이다. 본원에서, 효과적인 피신-의존적 콜라겐 절단에 대한 이들 2개의 구성요소의 필수성(essentiality)을 결정하였다. 프로콜라겐 포스트-AMS 펠렛을, 증가하는 농도의 EDTA(8 mM 내지 80 mM) 및 L-시스테인 (10 mM 내지 100 mM)을 함유하는 추출 완충제에 재현탁시키고, 피신(10 mg/L)과 함께 pH 7.5, 15℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 확연한 증강 효과는 10 mM L-시스테인(도 25, 레인 7 내지 레인 10)의 존재 하에 분해 효율에서 관찰되었으며, 이때 피신-의존적 콜라겐 결과물에 대한 EDTA의 명백한 기여도는 없었다(도 25, 레인 7 대 레인 8 내지 레인 10).
피신-유도 프로콜라겐 분해를 위한 온도 조건의 최적화: 프로콜라겐-발현 담배 잎 펠렛을 피신과 함께 15℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션한 다음, 부가적인 1.5시간 동안의 30℃ 배쓰로 이전시켰다. 웨스턴 블롯 및 원섬유형성 검정법은 증가된 반응 온도와 관련하여 콜라겐 수율 또는 시료 순도에서 임의의 향상을 식별하지 않았다.
프로콜라겐의 피신-유도 절단으로부터 추출된 콜라겐의 원섬유형성: 피신-유도 분해 후, 원섬유형성 검정법을 수행하여, 생성된 콜라겐이 원섬유를 형성하는 능력, 콜라겐의 기능성을 결정하는 궁극적인 방법을 결정하였다. 본원 하기의 표 5는 2개의 변형 프로토콜을 사용하여 프로콜라겐의 피신 절단 후 결정된 바와 같은 원섬유형성 결과를 요약한 것이다. 반응 완충제 pH 및 염 함량이 상이한 프로토콜 A와 프로토콜 B 둘 다 유의한 백분율의 콜라겐 원섬유를 산출하였다. 그러므로, 본원에서 개발되고 최적화된 단백질분해 반응 매개변수는 기능적 콜라겐을 고수율로 야기하였다.
실시예 13. 프로콜라겐 절단에서 TRYPZEAN
TM
프로테아제 효능의 결정.
EDTA(7.5 mM) 및 L-시스테인(12.5 mM)으로 농화된 추출 완충제(pH 7.5)에서 재현탁된 프로콜라겐-발현 담배 잎 펠렛을 TRYPZEAN TM (30 내지 100 mg/L)과 함께 15℃에서 1시간 내지 3시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 후, 60 mg/L 및 100 mg/L 용량의 TRYPZEAN TM 은 프로콜라겐을 효율적으로 절단하여, 2개의 별개의 알파 콜라겐 사슬을 산출하였으며, 이때 검출 가능한 과다분해는 없었다(도 26). 그러므로, pH 7.5에서 TRYPZEAN TM 에 의한 프로콜라겐의 처리는 콜라겐 사슬 알파-1 및 알파-2로의 효과적인 분해를 야기하였다.
논의
상기 실시예 7 내지 13은 식물로부터 유래된 콜라겐의 정제 과정에 사용되기에 적합한 비-포유류 프로테아제의 식별을 기재하고 있다. 박테리아 및 식물 공급원으로부터의 프로테아제를 검사하였고, 3개의 효소, 즉, 뉴트라제, 서브틸리신, TRYPZEAN TM 및 피신은 콜라겐 프로펩타이드 분해에 적합한 것으로 밝혀졌다.
뉴트라제 및 서브틸리신 둘 다 박테리아 바실러스 종에 의해 분비된다. 서브틸리신은 주로(90% 초과) 세제 및 가정용 세정 제품에 사용된다. 서브틸리신 용도 중 대략 10%는 단백질 가수분해, 가죽 처리와 같은 기술 적용, 및 텍스타일 및 미용 산업에 향해 있다. 더 높은 농도에서 콜라겐 정제 과정에서 서브틸리신의 표준 사용은 콜라겐의 과다분해로 인해 문제가 된다. 뉴트라제는 음료 알코올 산업 및 치즈 숙성에 주로 사용된다. 본원 상기에 기재된 실시예 7 내지 13에서, 뉴트라제는 단지 고농도에서 프로펩타이드를 분해하는 데 효과적이었고, 바람직한 분해 결과를 위해서는 적어도 6시간이 필요하였다.
현재 기재된 실험 조건 하에, 재조합 트립신 및 피신은 높은 효소 농도에서 또는 연장된 인큐베이션 기간 후에 콜라겐의 과다분해가 없었기 때문에 4 가지 중에서 가장 안정한 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 이들 효소는 명백하게, SDS PAGE 분석에 의해 결정된 바와 같이 콜라겐의 나선 영역을 분해하지 않았다. 피그 라텍스 식물(피쿠스 카리카(Ficus carica))에 대해 추출된 천연 효소인 피신은 몇몇 공급원으로부터 약제학적 등급을 포함한 몇몇 등급에서 저비용으로 상업적으로 입수 가능하다. 이는 식품 산업: 알코올 및 맥주 산업, 단백질의 수화(hydrolisation), 육가공, 제과 산업, 및 애완동물 사료 및 건강 식품 제조에 사용된다. 이는 또한, 약제학적 산업, 콘택트렌즈 세정제, 암 치료, 항-관절염 치료, 및 소화 보조제, 뿐만 아니라 미용 및 텍스타일 산업에 적용된다.
실시예 14. rh콜라겐 특성의 추가 분석.
재료 및 방법
재료
유전자이식 담배 식물로부터 발현되고 단리된 인간 재조합 콜라겐(rh콜라겐) I형을 생성하고 CollPlant Ltd(이스라엘 소재)에 의해 공급받았다. I형 소 콜라겐(PureCol)을 미국 소재의 Advanced Biomatrix로부터 구매하였다. 메타크릴 무수물, 글리시딜 메타크릴레이트, 트리에틸아민, 테트라부틸암모늄 브로마이드, 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산(TNBS), 2-하이드록시-4'-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논(Irgacure 2959), 소듐 포스페이트 모노베이직 무수, HCl 1 N, HCl ≥37%, 소듐 비카르보네이트 및 NaOH를 이스라엘 소재의 Sigma Aldrich Ltd로부터 구매하였다. 포스페이트 완충 식염수(PBS), x10 PBS, 소 태아 혈청(FBS), DMEM 고 글루코스 및 페니실린/스트렙토마이신을 이스라엘 소재의 Biological Industries Ltd로부터 구매하였다. 소듐 포스페이트 디베이직 무수물을 인도 소재의 Canton으로부터 구매하였다. 절대 에탄올 및 아세톤을 이스라엘 소재의 Bio-Lab Ltd로부터 구매하였다. 히알루론산을 미국 소재의 Lifecore로부터 구매하였다.
완충제 및 광개시제 스탁 용액 제조
원섬유형성 완충제(FB): 소듐 포스페이트 디베이직을 이중 증류수(DDW)에서 162 mM의 최종 농도까지 용해시켰다. 10 N NaOH를 이용하여 용액을 pH 11.2로 적정하였다.
배지 제조: 50 ml의 태아 소 혈청 및 5 ml의 페니실린/스트렙토마이신(각각 10,000 단위/mL 및 10 mg/mL)을 무균 조건 하에 500 ml의 DMEM 고 글루코스 배지에 첨가하였다. 배지를 부드럽게 혼합하고, 냉동고에서 유지시켰다.
포스페이트 완충 식염수 제조: 39 ml의 0.1 M 소듐 포스페이트 모노베이직 용액을 61 ml의 0.1M 소듐 포스페이트 디베이직 용액과 혼합하고, 최종 부피를 DDW로 200 ml로 조정하였다. 필요하다면 진한 NaOH 또는 HCl을 이용하여 최종 pH를 7로 조정하였다. NaCl을 150 mM의 최종 농도까지 첨가하였다.
세척 완충제: HCl을 원섬유형성 완충제에 첨가하여, 16.2 mM 소듐 포스페이트 디베이직 및 10 mM HCl의 최종 농도에 도달하게 하였다. 10 N NaOH를 이용하여 pH를 7.2 내지 7.4로 조정하였다.
광개시제 10% (v/v) 스탁 용액: Irgacure 2959를 절대 에탄올/PBS 1:1 용액에서 100 mg/mL의 최종 농도까지 용해시켰다.
rh콜라겐의 메타크릴화
하기 기재된 바와 같이 수성 배지에서 라이신 및 하이드록시라이신 콜라겐 잔여물을 메타크릴 무수물과 반응시킴으로써 원섬유성 rh콜라겐-메타크릴아미드 및 단량체성 rh콜라겐-메타크릴아미드를 제조하고, 추가 사용 시까지 4℃에서 광 보호 하에 저장하였다.
원섬유성 rh콜라겐-메타크릴아미드
3 내지 10 mg/mL 원섬유성 rh콜라겐-메타크릴아미드를 세척 완충제, 원섬유형성 완충제 또는 DDW에서, 실온(R.T.) 또는 12℃에서 합성하였다. 예를 들어, 간략하게는, 원섬유성 콜라겐-MA를 하기와 같이 DDW에서 합성하였다: 10 Mm HCl(COLLAGETM) 중 단량체성 rh콜라겐 3-4 mg/mL 용액을 원섬유형성 완충제와 9:1 v/v 비로 혼합하고, R.T에서 1시간 동안 교반하여, 원섬유를 얻었다. 상기 용액을 4℃에서 7500 rpm에서 30분 동안 원심분리하여, 상층액을 폐기하였다. 펠렛을 동일한 부피의 세척 완충제에 재현탁시키고, 동일한 조건에서 원심분리하였다. 이후, 침강 원섬유를 DDW에서 10 mg/mL까지 재현탁시켰다. 농도를 고체 백분율 측정에 의해 확인하였다. 콜라겐 라이신에 대하여 10 내지 20 몰비에서 메타크릴 무수물(MA)을 실온에서 질소 유동 하에 적가하고, 반응 용액 pH를 시간 경과에 따라 모니터링하고 10 N NaOH를 이용하여 pH 7로 조정하였다. 24시간 반응 후, 적어도 6회의 투석물(이 경우 세척 완충제) 변화와 함께 4℃에서 3일 동안 10 kDa 컷오프 투석 튜빙(Spectrum Laboratories Inc, 미국 캘리포니아주 소재)을 사용하여 세척 완충제(pH 7)에 대하여 혼합물을 투석시켜, 반응 부산물을 제거하고 결국 3일 내지 4일 동안 동결건조시켰다.
단량체성 rh콜라겐-메타크릴아미드
150 mM NaCl의 첨가와 함께 200 mM MOPS, 포스페이트, 또는 Tris 완충제를 사용하였다. 예를 들어, 200 mM MOPS 및 150 mM NaCl을 3 내지 4 mg/mL COLLAGETM에 첨가하고, 투명한 용액이 수득될 때까지 RT에서 교반하였다. 이후, 10-배 내지 20-배 과량의 메타크릴 무수물을 12℃에서 질소 유동 하에 적가하고, 10 N NaOH를 이용하여 pH를 시간 경과에 따라 pH 7로 조정하였다. 24시간 반응 후, 적어도 6회의 투석물 변화와 함께 4℃에서 3일 동안 10 kDa 컷오프 투석 튜빙(tubing)으로 10 mM HCl 및 20 mM NaCl(pH 2)에 대하여 혼합물을 투석시키고, 뒤이어 3일 내지 4일 동안 동결건조하였다.
히알루론산(HA)의 메타크릴화
500 mg의 HA를 Leach 등 [Leach 등 2002, Biotechnology and Bioengineering, vol. 82, no. 5]에 의해 기재된 바와 같이 작용화시켰다. 간략하게는, 1.8 ml의 트리에틸아민, 1.8 ml의 글리시딜 메타크릴레이트, 및 1.8 g의 테트라부틸 암모늄 브로마이드를 DDW 중 10 mg/mL HA 용액 50 ml에 별도로 첨가하고, 다음 구성요소를 첨가하기 전에 완전히 혼합하였다. 반응을 실온에서 밤새 혼합하며, HAMA를 20-배 부피의 아세톤에 침전시키고 DDW에서 재용해시켰다. 침전 과정을 2회 반복하여, 모든 반응 잔여물을 제거하였다. 상기 물질을 결국 동결건조시켰다.
점도 측정을 위한 용액 제조
1 ml의 PBS X10을 첨가함으로써, PBS 중 PureCol 및 Collage™: 8 ml의 단량체성 콜라겐 용액(10 mM HCl 중 3 mg/mL), rh콜라겐(COLLAGETM) 또는 소 콜라겐(PureColl)을 중화시켰다. 그 후에, 상기 용액을 0.1 N NaOH를 이용한 적정에 의해 pH 7 내지 7.5로 만들었다. 결국 이중 증류수를 첨가하여 10 ml의 최종 부피에 도달시켰다. 시료를 37℃에서 적어도 90분 동안 인큐베이션한 후, 측정을 수행하였다(37℃ 또는 4℃에서).
1 ml의 원섬유형성 완충제를 첨가함으로써, 원섬유형성 완충제 중 COLLAGE™: 9 ml의 단량체성 rh콜라겐(COLLAGETM) 용액(10 mM HCl 중 3.79 mg/mL)을 중화시켰다. 시료를 37℃에서 적어도 90분 동안 인큐베이션한 후, 측정을 수행하였다(37℃ 또는 4℃에서).
PBS 중 원섬유성 rh콜라겐-메타크릴아미드: DDW에서 제조되고 세척 완충제에 대해 투석된 동결건조된 원섬유성 rh콜라겐-MA(상기 기재된 것에 따라 10-배 과량의 MA로)를 PBS에서 10 mg/mL의 농도까지 용해시켰다. 시료를 37℃에서 적어도 90분 동안 인큐베이션한 후, 측정을 수행하였다(37℃ 또는 4℃에서).
DMEM 중 rh콜라겐-메타크릴아미드: 동결건조된 원섬유성 rh콜라겐-메타크릴아미드(상기 설명에 따라 세척 완충제에서 제조되고 투석된 15-배 과량의 MA)를 DMEM 배지에서 20 mg/mL 및 26 mg/mL의 최종 농도까지 용해시켰다.
DMEM 중 rh콜라겐-메타크릴아미드/히알루론산: 히알루론산을 원섬유성 rh콜라겐-MA의 용액에 첨가하여, DMEM 배지에서 10 mg/mL HA 및 20 mg/mL rh콜라겐-MA의 최종 농도를 수득하였다.
DMEM 중 rh콜라겐-메타크릴아미드/히알루론산 메타크릴레이트(HA-MA): 히알루론산 메타크릴레이트(상기 참조)를 원섬유성 rh콜라겐-MA의 용액에 첨가하여, DMEM 배지에서 10 mg/mL HA-MA 및 20 mg/mL rh콜라겐-MA의 최종 농도를 수득하였다.
손실 계수 및 저장 계수 측정을 위한 rh콜라겐-MA 광가교
rh콜라겐-MA 가교 스캐폴드는 2개의 상이한 조제물에서 형성되었으며, 2개의 개별적인 실험에서 검사되는 것을 목표로 하였다. 제1 조제물에서, 10-배 과량의 메타크릴 시약으로 합성된 1 중량% 내지 2 중량%의 원섬유성 rh콜라겐-MA를 R.T.에서 PBS 0.1 M에 용해시킨 다음, Irgacure 2959 0.1%를 첨가하고, 1 mL 최종 부피의 용액을 원판(discoid) 몰드 내로 주사하였다. 이후, 수은 광원을 사용하여 670 mW/cm2의 평균화된 강도에서 7초 및 10초 동안 1.5 cm의 거리로부터 경화 과정을 수행하였으며, 가교된 스캐폴드에서 종료하였다. 제2 조제물은 15-배 및 20-배 과량의 메타크릴 시약으로 합성된, 원섬유성 rh콜라겐-MA의 2개의 상이한 배치를 포함하였다. 1 중량% 내지 2 중량%를 PBS 0.1 M에 용해시키고, Irgacure 2959 0.1%를 첨가하여 1.5 mL의 최종 부피를 달성하였다. 고도로 가교된 스캐폴드를 수득하기 위해, 420 mW/cm2의 평균화된 강도에서 60초 동안 2 cm의 거리로부터 경화 과정을 수행하였다.
TNBS 검정법
검정법 프로토콜은 Sashidhar 등에 의해 보고된 것과 유사하고 문헌[Sashidhar R.B., Capoor, A.K., Ramana, D, Journal of Immunological Methods.1994, 167, 121-127], 및 Habeeb[Habeeb A.F.S.A, Analytical Biochemistry. 1966, 14, 328-336]에 기초하였다. 간략하게는, 방금 제조된 0.4 mL의 0.01% (v/v) TNBS를 0.4 mL의, 소듐 비카르보네이트 4% 중 0.1-2 mg/mL 원섬유성 rh콜라겐-MA에 첨가하였다. 40℃에서 2시간 반응 후, 0.2 mL의 1 N HCl 및 0.4 mL의 10%(v/v) SDS를 첨가하였다. 흡광도를 1 mL 폴리스티렌 큐벳에서 분광광도계에서 335 nm에서 측정하였다. rh콜라겐-MA 용액 대신에 소듐 비카르보네이트 완충제를 첨가하는 점을 제외하고는, 동일한 절차를 이용하여 대조군(블랭크)을 제조하였다. 동일한 조건으로 제조된 1-2 mg/mL 네이티브 원섬유성 rh콜라겐의 흡광도를 보정에 대해 기록하였다.
유변학적 특징화
점도: 온도-제어된 세포 챔버가 장착된 HAAKE RHEOSTRESS600TM 레오미터(Thermo Electron Corporation) 상에서 C60/1°Ti 원추-플레이트 셋업을 사용하여 점도 측정을 수행하였다. 점도를 4℃, 25℃ 및 37℃에서 0.0001 내지 1000 초-1 범위의 전단율의 회전형 램프(ramp) 모드에서 1 mL 시료 상에서 측정하였다.
스캐폴드 저장 계수 및 손실 계수: PP20 톱니모양 스핀들 및 20 mm 톱니모양 플레이트 셋업을 이용하는 병행 플레이트 시스템을 사용하여 rh콜라겐 가교된 원반의 유변학적 거동을 조사하였다. 비-가교된 rh콜라겐-MA를 특징화하기 위해, C60/1°Ti 원추-플레이트 요소를 사용하였다. rh콜라겐-MA의 유변학적 거동을 평가하기 위해, 2개 세트의 실험을 개별적으로 수행하였다. 제1 실험에서, 1 mL 시료를 제어된 스트레스 모드에서 진동력(oscillation force)을 받게 하여, 1 Hz 주파수 및 37℃에서 5 Pa 전단 응력을 300초 동안 적용하면서 저장 계수 G' 및 손실 계수 G''를 기록하였다. 갭을 원래의 시료의 90%까지 조정하고, G' 및 G'' 값을 150초 내지 300초 범위에서 평균을 내었다. 제2 실험에서, 1.5 mL 가교된 원반을 37℃에서 주파수 스윕 진동에서 시험하였으며, 이때, G'를 0.01-100 Hz의 주파수 범위에서 1 Pa 전단 응력 하에 기록하였다. 측정을 개시하기 위해, 스핀들을 낮춰서 하이드로겔 표면과 접촉시켰으며, 그 후에, 기기의 축방향 힘이 0.4 N이 될 때까지 추가로 낮추었다. 모든 측정 전에, 시료를 습도 마개로 덮인 플레이트 상에서 1분 동안 유지시켜, 온도 평형에 도달하게 하였다.
결과
TNBS 검정법
TNBS 비색 검정법을 사용하여 rh콜라겐의 변형 정도를 정량화하였다. 이 검정법은 라이신 및 하이드록실 라이신으로부터 유래된 유리, 미-반응된 --아미노기의 몰 함량을 정량화하고, 후속적으로 작용화도를 정량화하였다. 원섬유성 rh콜라겐 10-배, 15-배 및 20-배 상이한 배치의 작용화도를 표 6에 제시된 바와 같이 TNBS 검정법에 의해 결정하였다.
그 결과는, 원섬유 rh콜라겐의 높은 변형 능력을 제시하고, 10의 몰비에서 메타크릴 시약을 첨가하는 것이 원섬유성 콜라겐의 최대 작용화를 받는 데 바람직할 수 있음을 의미한다.
유변학
1. 점도
rh콜라겐/소 콜라겐 점도의 온도 의존도
도 27은 T=4℃(각각 청색, 파선 및 실선) 및 T=37℃에서 전단율의 함수로서 표현된 PBS 중 rh콜라겐(COLLAGE™) 및 소 콜라겐(PureCol)의 점도를 보여준다(각각 적색, 파선 및 실선). 소 콜라겐(실선)은, 4℃(청색)에서의 값보다 한자리수 넘게 더 높은 37℃(적색) η0 값을 갖는 제로-전단율 점도(η0), 즉, 낮은 전단율 값에서 점도 평탄부의 명확한 온도 의존도를 보여준다. 대조적으로, rh콜라겐 (파선)은 4℃에서의 η0 값과 37℃에서의 η0 값 사이에 유의한 차이가 없음을 보여준다. FB(방법 참조)에서 중화된 rh콜라겐은 매우 유사한 거동을 보여주며(도 28), 즉, 4℃ 및 37℃에서의 점도는 거의 동일하다. 도 29는 4℃(청색 선) 및 37℃(적색 선)에서의 원섬유성 rh콜라겐-MA의 점도를 도시한다. 프로파일이 동일하지 않긴 하지만, 제로 전단율 값은 두 온도 모두에서 약 1000 cP이다.
rh콜라겐-메타크릴아미드의 점도
도 30은 25℃에서 DMEM에 용해된 rh콜라겐-MA의 점도를 도시한다. 도 27 및 도 28에 도시된 rh콜라겐의 전형적인 전단 담화 거동은 HA/HA-MA의 첨가와 함께 그리고 첨가 없이 rh콜라겐-MA에 대해서도 유지된다. rh콜라겐의 농도를 20 mg/mL로부터 26 mg/mL(각각 녹색 선 및 적색 선)까지 증가시키면, 제로-전단 점도는 증가할 뿐만 아니라 10 mg/mL HA 또는 HAMA의 숨은(ulterior) 첨가에 의해 30 mg/mL의 최종 중합체 농도를 야기한다.
당업자는, rh콜라겐-MA가 가교되지 않고, 가교를 달성하기 위해 당업자는 광개시제 및 광을 추가해야 함을 인식할 것이다.
2. 스캐폴드의 손실 계수 및 저장 계수
제1 실험에서 수행된 37℃에서 시간 경과에 따른 1 mL 원반의 유변학적 분석을 도 31에 제시한다. 상단 그래프는 UV 경화 전의 손실 계수와 저장 계수 및 tan(델타)를 보고하는 한편, 하단 그래프는 UV 경화 후의(광개시제의 첨가 시) 상기 값을 보고한다. 데이터는, rh콜라겐-MA의 저장 계수가 광개시제의 존재 하에 조명 시 2-배만큼 증가함을 실증한다. 더욱이, 그 결과는 rh콜라겐-MA 농도를 변화시킴으로써 스캐폴드 특성을 조절하는 능력을 나타낸다. 가교된 원반의 G' 값과 G'' 값 사이의 높은 차이, 및 제로-근접 tan(델타) 값은 이의 탄성-유사 거동을 나타낸다. (G' - 저장 계수; G'' - 손실 계수; G′, "저장/탄성 계수"는 변형 동안 겔에 의해 저장되고 이후에 원래의 형상을 회복하는 데 사용되는 G*의 에너지 분율을 나타낸다. G′는 겔의 탄성 거동, 또는 겔이 전단 변형 후에 이의 형상을 얼마나 많이 회복시킬 수 있는지를 측정한다. 예를 들어, 가황 고무는 이것이 응력 하에 즉시 변형되고 응력이 제거된 후 이의 형상을 완전히 회복하므로 순수하게 탄성인 물질이다(즉, G* G′). G″, "손실/점성 계수"는 내부 마찰을 통한 전단 변형 시 상실되는 G*의 에너지 분율을 나타낸다. HA 충전제가 순수하게 점성이 아니므로 G"는 점도와 직접적으로 관련이 있지 않다. 대신에, 이 용어는, 전단 응력이 제거된 후 겔이 이의 형상을 완전히 회복시키지 못하는 무능력을 반영한다.
제2 실험에서, 60초 동안 조사된 1.5 mL 원반은 도 32에 도시된 바와 같이 더 높은 G' 값을 제시한다. 데이터는, G'가 rh콜라겐-MA 농도 및 메타크릴화도에 따라 증가함을 보여주며, 스캐폴드 특성을 조절하는 능력을 나타낸다.
실시예 15. 담배 식물로부터 rh콜라겐의 수득 및 가공 절차.
상기 기재된 바와 같이 유전적으로 변형된 담배 식물이 성장되고, 잎은 초기 업스트림 추출 및 정제를 위해 수합되고 제조된다(도 33a 내지 도 33c). 도 33a에 도시된 바와 같이, 잎은 기계적 절단(mechanical shredding)(단계 A)을 받고, 펄프는 슬러리로부터 제거되는 한편, 프로콜라겐-함유 모이어티는 보유되고 효소적 분해를 받아 프로콜라겐을 콜라겐으로 전환시킨다(단계 B 내지 단계 C). 펄프는 다시 폐기되고, 콜라겐-함유 모이어티는 슬러러로부터 보유된다(단계 C). 산성화 단계 후, 시료는 제1 세정 단계 동안 제1 원심분리를 겪고, 그 후에 펠렛이 폐기된다(단계 D-F). AMS 침전 및 제2 원심분리 후, 단백질은 침전되고(H 펠렛), 상층액은 폐기된다(단계 G-H). 저장을 위해 H 펠렛을 -20℃에서 냉동시킬 수 있다.
도 33b에 도시된 바와 같이, H 펠렛을 재현탁시켜, 단백질 현탁액을 산출하고, 뒤이어 제3 원심분리를 수행하며, 그 후에 펠렛을 폐기한다(단계 I-J). 깊이 필터를 사용하여 현탁액을 세정하고, 상기 현탁액을 NaCl을 이용하여 염석시켜 콜라겐을 침전시킨다(단계 K-L). 제4 원심분리는 콜라겐 펠렛을 산출하고, 상층액을 폐기한다(단계 M).
도 33c에 도시된 바와 같이, 콜라겐 펠렛을 HCl에 재현탁시켜, 가용화된 콜라겐을 산출한다(단계 N). 0.2-0.8 미크론 여과 후, 한외여과(UF)(농축 및 희석여과)는 벌크 농축된 콜라겐을 초래한다(단계 O-P). 0.2 미크론 여과 및 충전 후, 정제된 콜라겐을 이의 최종 용기에 저장한다(단계 Z).
실시예 16. rh콜라겐 메타크릴레이트와 첨가제의 점도 및 중합.
5:1, 2:1 및 1:2의 콜라겐MA:첨가제의 비에서 상이한 첨가제(폴리비닐 알코올 메타크릴레이트(PVAMA) (도 34 및 37), 히알루론산 메타크릴레이트(HAMA) (도 35 및 37), 및 산화된 셀룰로스(OC) (도 36 및 37)로 농화된 5 mg/ml rh콜라겐 메타크릴레이트를 도 31 내지 37에 도시한다. 5 mg/ml rh콜라겐 메타크릴레이트의 점도는 비교를 위해 각각의 도면에 보고된다(검정색 곡선). 모든 시료를 0.1 M 포스페이트 완충제 pH 7.4 + 11.3 mM NaCl(생리학적 삼투몰 농도)에서 제조하고, T=22℃에서 측정을 수행하였다. 데이터를 비교하고, 도 37에 요약한다.
상이한 첨가제로 농화된 rh콜라겐 메타크릴레이트의 중합 또한, collMA:첨가제 2:1의 비에서 5 mg/ml 콜라겐MA+ 상이한 첨가제의 전형적인 스캐폴드에 관하여 도시된다(도 38). ColMA 단독은 폴리비닐 알코올 메타크릴레이트(PVMA), 히알루론산 메타크릴레이트(HAMA), 또는 산화된 셀룰로스(OC)와 조합된 ColMA와 비교되었다. 용액은 광개시제 2-하이드록시-4'-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논(0.1%)과 혼합되고, 자외선(uv) 광(365 nm)으로 20초 동안 조사되었다.
실시예 17. 주사성 rh콜라겐/혈소판 풍부 혈장 스캐폴드.
주사용 rh콜라겐/혈소판 풍부 혈장(PRP) 스캐폴드를 건병증에 대한 스캐폴드 및 치유 수단으로서 조사하였다. 성장 인자(GF)의 공급원, 예컨대 혈소판 풍부 혈장(PRP)과 조합된 느린-분해성 rh콜라겐 매트릭스를 상해를 입은 힘줄 부근에 주사하여, 상해를 입은 힘줄의 치유를 증강시키는 데 필요한 지지체를 제공하고자 하였다. 치료는 PRP와 혼합된 식물 유래 재조합 인간 I형 콜라겐(rh콜라겐)으로 제조된 매트릭스를 사용하였으며, 이는 상해를 입은 부위에서 성장 인자의 연장된 방출을 지지하고 치유를 촉진한다. 콜라게나제-유도 아킬레스건 건병증 래트 모델에서 섬유아세포의 증식, 혈전 분해, GF의 방출 및 힘줄 치유를 지지하는 데 있어서, rh콜라겐-PRP 매트릭스의 효과를 PRP와 시험관내에서 그리고 생체내에서 비교하였다. rh콜라겐-PRP는 시험관내에서 그리고 생체내에서 PRP 단독과 비교하여 우수한 성능을 실증하였다. 이들 결과는, 건병증 적응증에 대한 임상 시험에서 PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스의 용도에 관하여 고무적이다.
재료 및 방법
rh콜라겐 매트릭스
10 mM HCl 중 rh콜라겐의 단량체성 용액(CollPlant, 이스라엘 네스치오나 소재)을 포스페이트 용액에서 pH 중화에 의해 원섬유화시키고, 18 mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(Sigma Aldrich, 이스라엘 소재)에서 가교시켰다. 그 후에, 가교된 콜라겐을 이중 증류수에서 반복된 원심분리에 의해 세척하고, 칼슘 클로라이드(CaCl2)(Merck, 이스라엘 소재)를 첨가하고, 20 mM의 최종 농도로 계산하였다. rh콜라겐 슬러리가 충전된 주사기를 동결건조시키고, 에틸렌 옥사이드로 최종적으로 멸균시켰다.
혈소판 풍부 혈장(PRP) 제조
Tropocell PRP 키트(ESTAR, 이스라엘 소재)를 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 과립구-무함유 PRP를 제조하였다. 시험관내 세포 증식 검정법을 위해, 건강한 인간 지원자로부터 인간 혈액을 채혈하였다(헬싱키 허가 번호 2012068). 생체내 동물 연구를 위해, Hsd:Sprague DawleySD 래트(Harlan)로부터 혈액을 채혈하였다.
Rh콜라겐 매트릭스/PRP 및 대조군 제조
Rh콜라겐 매트릭스/PRP: 동결건조된 가교 rh콜라겐을 함유하는 주사기를 PRP 또는 식염수로 수화시켜서, 20 mg/ml rh콜라겐의 최종 농도를 수득하였다.
트롬빈 활성화된 PRP(대조군): 인간 PRP를 정제된 트롬빈(Sigma Aldrich, 이스라엘 소재)과 혼합하여, 100 IU/ml의 최종 농도를 수득하였다.
CaCl2 활성화된 PRP(대조군): 래트 PRP를 CaCl2(Merck, 이스라엘 소재)과 혼합하여, 20 Mm의 최종 농도를 수득하였다.
시험관내 세포 증식 검정법
이 연구에서, 정상적인 인간 진피 섬유아세포(nHDF) 생존력 및 증식에 미치는 GF의 효과를 평가하였다. PRP와 조합된 가교 rh콜라겐 매트릭스로 이루어진 매트릭스로부터 또는 트롬빈 활성화된 PRP로 이루어진 혈전으로부터의 GF 확산 시 세포 생존력 및 증식을 비교하였다. PRP 또는 트롬빈 활성화된 PRP(각각 200 μl)와 조합된 rh콜라겐 매트릭스를 24웰 플레이트(Thermo scientific, 이스라엘 소재)의 상부에 배치된 트랜스웰(Thincerts ™ 24웰 8.0 μm, Greiner bio-on, 이스라엘 소재)에 첨가하고, 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하여, 혈전을 형성시켰다. 정상적인 인간 진피 섬유아세포(nHDF)(0.5 ml 당 5,000개 세포)를 혈청 고갈 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM, 1% 소 태아 혈청, FBS, Biological Industries, 이스라엘 소재) 내 각각의 웰의 바닥에 접종하였다. 매트릭스(PRP 또는 트롬빈 활성화된 PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스)를 함유하는 트랜스웰을 접종된 웰의 상부 상에 배치하고, 부가적인 0.2 ml의 배지를 시료의 상부 상에 첨가하였다. 0.5 ml DMEM, 1% FBS 중 nHDF를 대조군으로서 접종하였다. 세포 증식 키트 WST-1(Roche, 이스라엘 소재)을 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 접종한 후 7일째 및 10일째에 시료를 3벌 중복으로 시험하였다.
생체내 연구
동물
체중이 230 g±20%인 Hsd:Sprague Dawley SD 래트를 동물 실험에 선택하였다. 동물에 독특한 동물 식별 귀 번호를 매기고, 특정 그룹으로 무작위로 배정하였다. 전용 열, 환기, 에어 컨디셔닝(HVAC) 동물 시설에서 개별적으로 환기되는(IVC) 케이지에서 동물을 사육하였다. 온도 및 습도를 계속 모니터링하였다. 동물은 상업적인 설치류 사료 (Harlan Teklad TRM Ra/마우스 사료)를 마음대로 제공받았고, 고압멸균된 물에 자유롭게 접근할 수 있었다. 시설을 외부광에 노출시키지 않았고, 12시간 명 및 12시간 암의 자동 교대 사이클에서 유지시킨다. 모든 동물을 실험 동물 처리 및 관리 가이드라인에 따라 처리하고, 모든 프로토콜은 지역 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다. 전체 연구 기간에 걸쳐 임의의 동물에서 어떠한 비정상도 탐지되지 않았다. 평균 그룹 체중 값 및 획득에서 통계학적으로 유의한 차이가 발견되지 않았다. 모든 획득은 종료 시 정상적으로 예상된 값의 범위 내에 있었다.
생체내 혈전 분해 및 성장 인자 방출
PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스, rh콜라겐 매트릭스 단독 또는 CaCl2 활성화된 PRP의 시간 경과에 따른 분해 시간 및 GF 함량을 피하(SC) 래트 모델(Science in Action Ltd., 이스라엘 네스치오나 소재)에서 비교하였다.
34 마리의 Sprague Dawley 래트(Harlan Laboratories, 이스라엘 네스치오나 소재)의 등 상의 주사 부위를 면도하고 마킹하였다. 각각의 래트에, 0.5 ml의 동일한 제제를 래트의 등의 4개의 이격된 위치, 등 평면 상에, 앞쪽 부분의 2개 부위, 및 뒤쪽 부분의 2개 부위에 주사하였다. 치료-후 시점 1일, 7일, 14일, 21일, 30일 및 45일에서 동물을 안락사시켰다(그룹 당 10 마리 또는 12 마리의 동물, 시점 당 2 마리의 동물). 각각의 시점에서, 주사 부위를 노출시키고, 거시적으로 평가하였다. 주사 부위에서의 피부를 시저를 사용하여 근육으로부터 부드럽게 분리하며, 상기 부위를 0.25 ml DMEM, 1% FBS(Biological Industries, 이스라엘 소재)로 세척하고, 혈전을 추출하고 칭량하였다. 세척 매질을 에펜도르프 튜브(1.5 ml 내지 2 ml)로 이전시키는 한편, 추출된 혈전을 6웰 또는 12웰 플레이트로 이전시켰다. 일단 칭량하면, 혈전을 각각의 세척 배지와 조합하며, 시저로 절단하고, 막자로 다져서, 혈전으로부터 주변 배지로의 GF의 방출을 촉진하였다. 그 후에, 에펜도르프 튜브를 적어도 5분 동안 원심분리하여, 혈전의 펠렛과 배지를 분리하였다. 상층액을 수집하고, 검정될 때까지 -80℃에서 저장하였다. 약 0.5 ml의 각각의 제제를 함유하는 대조군(T0)을 동물에게 주사하지 않으면서 상기 기재된 바와 같이 동일한 절차에 따라 시험관내에서 형성시켰다. 연구 종료 시, 보존된 상층액 내 PDGF 및 VEGF 함량을 ELISA(Quantikine ELISA 마우스/래트 PDGF 및 Quantikine ELISA 래트 VEGF, R&D Systems, 이스라엘 소재)에 의해 평가하였다.
래트에서 유도된 생체내 건병증
36 마리의 수컷 Sprague Dawley 래트(그룹 당 18 마리의 래트, 시점 당 6 마리의 동물)에서의 콜라게나제 유도 건병증 모델에서 PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스 및 PRP 단독의 치유 특성을 비교하였다. 실험을 Harlan Laboratories Israel Ltd.(이스라엘 네스치오나 소재)에서 수행하였다.
공통 발뒤꿈치 힘줄에 걸쳐 래트의 우측 뒷다리의 근접부에 걸쳐 피부 절개를 수행하였다. 적절한 배율 하에, 힘줄의 중앙 분지를 식별하며 단리하였고, 0.3 mg 콜라게나제(10 mg/ml, Sigma)를 0.5 ml 인슐린 주사기를 사용하여 공통 발뒤꿈치 힘줄집(tendon sheath) 아래에 주사함으로써 건병증을 유도하였다. 결국 4/0 비크릴(Vicryl)을 사용한 단속 피하 봉합(interrupted subcutaneous suture)으로 피부를 닫았다. 건병증 유도 후 1주째에, 안과학적 각막/공막 나이프를 사용하여 힘줄집에 찌름 절개(stab incision)를 생성시켰다. 그 후에, 캐뉼라를 사용하여 힘줄집 아래에 터널(tunnel)을 생성하고, 50 μl의 PRP와 조합된 rh콜라겐 또는 PRP 단독을 예비-생성된 커낼(canal) 내로 주사하였다. 치료-후 3일, 7일 및 14일째에 동물을 안락사시켰다. 치료된 힘줄을 절제하고, 조직병리학적 평가를 위해 보존하였다.
조직학
조직을 파라핀에 포매하고, 4 내지 5 미크론 두께의 시료로 연속적으로 절단하였다. 조직병리학적 검사를 위해 슬라이드를 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하고, 병리학자가 맹검 평가하였다.
결과
시험관내 세포 증식 검정법
이 연구에서, PRP와 조합된 rh콜라겐으로 이루어진 매트릭스 및 트롬빈 활성화된 PRP로 이루어진 혈전 주변에 접종된 세포의 생존력 및 증식을 비교하였다. 비처리된 웰에 접종된 세포를 대조군으로서 사용하였다. 매트릭스(PRP와 조합된 rh콜라겐 또는 트롬빈 활성화된 PRP로 이루어짐)를 트랜스웰에서 접종된 웰의 상부 상에 배치시켜, 세포층과의 직접적인 접촉 없이 매트릭스로부터 웰로의 GF의 확산을 가능하게 하였다. 제7일 및 제10일에 살아 있는 세포의 수를, PRP를 2명의 상이한 혈액 공여자로부터 추출한 2개의 상이한 실험(실험 당 3회 반복)의 평균으로서 보고한다(도 39 상단). 도 39에 도시된 바와 같이, PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스로부터 방출되는 GF의 존재 하에서의 세포 생존력(제7일 및 제10일)은 트롬빈 활성화된 PRP 혈전에서보다 또는 대조군에서보다 유의하게 더 높다. 더욱이, PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스의 존재 하에 세포수가 제7일로부터 제10일까지 증가한 한편, 트롬빈 활성화된 PRP의 존재 하에 그리고 대조군에서 세포수는 저하되었으며, 이는 세포 생존력과 증식 둘 다 rh콜라겐 매트릭스의 존재 하에 상당히 우수함을 보여준다. 데이터를 현미경 분석에 의해 확인하였다(도 39 하단). PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스의 존재 하에 배양된 세포(도 39, 하단, 패널 A)는 접종 후 7일째에 신장된 모양을 보여주고 완전 존재비(confluence)에 이미 도달한 한편, 트롬빈 활성화된 PRP의 존재 하에 배양된 세포는 거의 살아 있지 않았으며, 이는 이 실험 셋업에서 트롬빈의 독성 효과를 나타낼 수 있다. (도 39 하단, 패널 B). 단지 배지의 존재 하에 배양된 세포는 매우 제한된 생존력을 보여주었다(도 39 하단, 패널 C).
생체내 매트릭스 분해 프로파일 및 성장 인자 방출
매트릭스 분해 프로파일
래트 내로의 피하 주사 후 상이한 시점에서 매트릭스를 칭량함으로써, 주사된 제제의 분해 프로파일을 결정하였다.
활성화된 PRP의 주사 시, 물질은 제1일에 이미 사라졌으며(도 40), 이는 처음 24시간 동안 피브린 혈전의 완전한 분해를 시사한다. 한편, rh콜라겐 매트릭스 단독 또는 PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스는 2-상 분해 프로파일을 가졌으며(도 40), 상기 프로파일은 제1일 동안 가파른 체중 저하로 시작하고 뒤이어 상대적으로 더 느린 분해율을 가져서 30일 내지 45일 후에 완전한 제거를 야기하였다(최종 중량은 초기 중량의 0.5% 미만임).
성장 인자 함량
시간의 함수로서 주사 부위에서의 GF 함량을 PDGF 및 VEGF에 대한 ELISA에 의해 평가하였다(도 41a 내지 도 41b). 0시간에서의 PDGF 함량은 PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스에서 그리고 활성화된 PRP 치료(도 41a)에서 유사하였으며, 이는 제0일의 PDGF 함량이 PRP에 의해 만들어진 GF 풍부 혈소판의 단독 기여도임을 시사한다. 그러나, PRP 단독의 주사 시, 주사 부위에서 PDGF 함량은 주사 후 1일째에 이미 검출 한계보다 더 낮았으며, 신속한 혈전 분해와 일치하게 전체 연구에 따라 검출 불가능하게 남았다(도 40). PRP가 rh콜라겐 매트릭스 (도 41a)에 혼입된 경우 상이한 사진이 도시된다. PDGF 함량은 제1일부터 제14일까지 점차 증가하였고, 스캐폴드 분해와 일관되게 제45일로 완전히 제거될 때까지 다시 저하되었다(도 40). 흥미롭게는, rh콜라겐 매트릭스 단독 그룹 내 PDGF 함량은 제7일부터 시작하여 증가하였고, 뒤이어 PRP와 조합된 매트릭스 그룹에 의해 제시된 패턴이 이어졌다. 제0일에서 VEGF 함량은 모든 제제에 대해 검출 한계보다 더 낮았고, 활성화된 PRP 그룹에서 기준선 수준에 머물러 있었다(도 41a 내지 도 41b 및 도 42). PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스의 VEGF 프로파일은 제7일 즈음에 VEGF 함량의 빠른 증가를 보여주며, 뒤이어 제14일까지 가파른 저하 및 제30일까지 평탄부를 보여주고, VEGF는 결국 스캐폴드 분해와 일관되게 제45일에 저하된다(도 41b).
PDGF 분석에서 제1일부터 제14일까지 그리고 VEGF 분석에서 제0일부터 제7일까지 나타난 GF 증가는 GF 축적을 가능하게 하는 rh콜라겐 스캐폴드의 능력을 입증하여, 스캐폴드에서 이동하고 증식하는 세포를 반영하는 경향이 있다. 각각의 제제에 대한 전체 연구에 걸쳐 PDGF 및 VEGF의 공칭 함량의 적분은 도 42에 요약되어 있다. 주사 부위에서의 GF 함량은, 활성화된 PRP 단독과 비교하여 rh콜라겐 매트릭스 단독의 주사 또는 PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스의 주사 시 훨씬 더 높은 것이 명확하다.
래트에서 유도된 생체내 건병증
PRP 단독과 비교하여 PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스의 치유 특성을 건병증에 대한 래트 모델에서 평가하고, 상이한 시점에서 조직병리학적 분석에 의해 평가하였다. 성숙한 섬유증의 수준, 단핵 염증 세포의 존재 및 미성숙 과립화 조직의 존재를 채점함으로써(표 7에서 기재된 바와 같이 저수 0 내지 5) 힘줄 치유 및 염증을 정량화하였다.
각각의 치료와 관련된 조직병리학적 점수의 누적값을 도 43a 내지 도 43c에 도시한다. PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스로 치료된 그룹은 PRP 치료군과 비교하여 구체적으로 제3일 및 제14일에 약간 더 성숙한 섬유증을 나타내었다. 이는, 제14일에 PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스로 치료된 그룹에 의해 나타난 더 낮은 수준의 미성숙 과립화와 일관되고 상관관계가 있었다(도 43c). 더욱이, 도 43b에서, PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스로 치료된 그룹은 모든 시점에서, 특히 제3일 및 제14일에 단핵 염증 세포의 낮은 존재로 제시된 바와 같이 염증 저하를 나타낸다. 전반적으로, 데이터는, 상해를 입은 힘줄을 PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스로 치료하는 것이 표준 PRP 주사 치료와 비교한 경우 염증 단핵 세포의 주요 저하에 의해 동반된 더 높은 수준의 성숙 섬유증 및 더 낮은 수준의 미성숙 과립화에 의해 제시된 바와 같이 더 신속한 치유를 촉진한다.
논의
힘줄 및 인대에서의 상해를 포함하여 연조직에의 손상은 매우 흔하고, 유의한 임상 부담을 유발한다. 몇몇 치료가 이용 가능하긴 하지만, 이들의 임상 이익은 여전히 제한되어 있다. 이는 치유를 향상시키고 회복 시간을 단축시키는 의도로 새로운 대안을 모색하는 것을 고무시켰다. 일단 PRP와 혼합되면 서서히 분해하고 콜라겐 스캐폴드 내로의 세포 이동 및 증식을 유도하고 상해를 입은 부위에서 GF의 연장된 방출을 가능하게 하여 치유 과정을 더 양호하게 지지하는 콜라겐-피브린-PRP 복합물을 형성하는, 인간 재조합 I형 콜라겐으로 이루어진 주사 가능한 매트릭스를 개발하였다. 시험관내 실험(도 39)은 트롬빈 활성화된 PRP와 비교하여 PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스의 주변에서 상당히 우수한 nHDF 생존력 및 증식을 보여주었다. 그 결과는, 콜라겐 매트릭스로부터 방출된 지속된 성장 인자는 세포 증식을 촉진하고 증강시킴을 실증하였다. I형 rh콜라겐은 PRP와 조합된 경우, 세포층과 직접 접촉하지 않는 경우에도 세포 증식을 촉진하고 증강시키는 지지적 환경을 여전히 제공한다. 래트에서 SC 주사는 처음에, PRP 주사 시 인 시추에서 형성된 GF-함유 피브린-혈전이 24시간 이내에 이미 분해하고, 결과적으로 주사 부위에서 GF 함량은 ELISA 검출 한계보다 더 낮음을 보여주었다(도 41a 내지 도 41b). 일단 혈소판이 rh콜라겐 매트릭스와 복합체화되면, GF는 45일에 걸쳐 방출되고, 이 시간은 스캐폴드 분해 시간과 일치한다(도 40 및 도 41a 내지 도 41b). GF 함량 프로파일은 표준 방출 프로파일에 의해 예상되었을 것이므로 단조(monotonic)가 아님을 주지하는 것이 흥미롭다. PRP 처리된 rh콜라겐 매트릭스에서의 PDGF 프로파일(도 41a 내지 도 41b)은 PRP 단독의 경우와 매우 유사하게 제1일에 제1 가파른 저하를 실증하였으나, 뒤이어 제21일까지 점차적인 증가, 및 스캐폴드 분해와 일치하여 비검출 가능한 수준에 도달하는 최종 저하를 실증하였다. 흥미롭게는, rh콜라겐 단독은 처음 2주 동안 PDGF 함량의 유사한 패턴의 점차적인 증가, 및 스캐폴드의 완전한 분해를 향한 저하를 보여주었다. 따라서, PRP 스캐폴드와 함께 rh콜라겐은 혼입된(trapped) PRP에 의해 제공되는 이익(초기 GF 방출)을, 세포 동원 및 증식을 고도로 촉진하고 증강시키는 rh콜라겐 스캐폴드 그 자체에 의해 제공되는 이익과 조합한다. VEGF 함량 프로파일에 관하여, PRP 주사 시 VEGF 수준은 전체 연구 동안 매우 낮게 유지된 한편, PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스의 주사는 첫주 이내에 VEGF 수준의 증가를 초래하였으며, 결국 스캐폴드 분해와 일치하여 저하를 초래하였다. 흥미롭게는, PDGF와는 대조적으로, rh콜라겐 매트릭스 단독으로 치료된 그룹에서 VEGF 수준은 PRP 단독 그룹보다 여전히 더 높았으나, 특히 제7일에, PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스와 상이한 프로파일을 보여주었다. 이러한 관찰은, 일단 콜라겐 스캐폴드와 조합되면 GF 수준에 대한 PRP의 기여도를 강조한다. rh콜라겐 및 PRP의 치유 특성을 결국 공통 발꿈치 힘줄(Common Calcaneal tendon)(아킬레스건) 건병증에 대한 래트 모델에서 PRP와 비교하였다. 조직학적 평가는, PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스가 성숙 섬유증 조직을 더 신속하게 확립하는 능력을 확인해 주었으며, 이는 이전의 실험에서 예상된 바와 같이 세포 동원 및 증식을 촉진하는 스캐폴드 능력과 일관된다. 더욱이, 조직학적 분석은 또한, 일단 상해를 입은 부위가 PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스로 치료되면, 염증이 PRP 단독에 의한 표준 치료와 비교하여 실질적으로 저하됨을 실증한다.
이 연구는, 가교된 인간 재조합 I형 콜라겐으로 이루어진 주사 가능한 스캐폴드의 시험관내에서의 그리고 생체내에서의 생물학적 효과를 실증한다. 일단 PRP와 같은 GF의 자가 공급원과 조합되면, 형성된 스캐폴드는 염증 반응을 조절하고 새로운 치유 조직의 더 신속한 형성을 촉진함으로써 연조직 상해의 치유를 가속화시킨다. 그 결과는, 증강된 치유 특성이 rh콜라겐과 자가 PRP의 독특한 조합에 있으며 이는 GF의 방출을 연장시킴을 시사한다. 데이터는, 건병증 적응증에 대한 임상 시험에서 PRP와 조합된 rh콜라겐 매트릭스의 용도를 지지한다.
실시예 18. 진피 충전제로서 식물-유래 인간 재조합 콜라겐의 용도.
조직-유래 인간 및 소 콜라겐과 비교하여 면역원성을 감소시키며 조직 재생을 촉진하고 향상된 유변학적 특성과 함께 더욱 균질하며 잠재적으로 더 오래 지속되는 진피 충전제를 제공하기 위해, 인간 유전자이식 콜라겐(rh콜라겐)을 식물(예를 들어, 유전적으로 조작된 담배 식물)로부터 생성하고 단리한 후, 진피 충전제로서 사용한다. 전형적으로, 유전적으로 변형된 식물은 COL1, COL2, P4H-알파, P4H-베타, 및 LH3로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 데옥시리보핵산(DNA)의 적어도 하나의 유전자 서열의 발현성 서열을 포함한다. 전형적으로, 식물-유래 인간 콜라겐은 SEQ ID NO: 3에 제시된 바와 같고 유전적으로 변형된 식물에서 발현되는 바와 같은 적어도 변형된 하나의 인간 콜라겐 알파-1 사슬; 및 SEQ ID NO: 6에 제시된 바와 같고 유전적으로 변형된 식물에서 발현되는 바와 같은 적어도 하나의 변형된 인간 콜라겐 알파-2 사슬을 포함하고; 상기 유전적으로 변형된 식물은 외인성 프롤릴-4-하이드록실라제(P4H)(예를 들어, 인간 또는 다른 포유류 P4H)를 추가로 발현한다. 선택적으로, 유전적으로 변형된 식물은 라이실 하이드록실라제(LH), 프로테아제 N, 및 프로테아제 C로 이루어진 군으로부터 선택되는 외인성 폴리펩타이드를 발현한다. 예를 들어, 인간 콜라겐 알파-1 사슬은 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같은 서열에 의해 인코딩되고/되거나 인간 콜라겐 알파-2 사슬은 SEQ ID NO: 2에 제시된 바와 같은 서열에 의해 인코딩된다. 선택적으로, 인간 콜라겐 알파-1 및/또는 알파-2 사슬을 식물 또는 유전적으로 변형된 식물의 액포로 표적화시키고, 이를 피신으로 분해시켜, 인간 아텔로콜라겐을 초래한다.
선택적으로, rh콜라겐은 진피 충전제에 대해 당업계에 알려진 것을 포함하여 다른 성분에 의해 변형되거나 이와 함께 제제화된다. 변형의 예는 메타크릴화 및/또는 티올화를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 다른 성분의 예는 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 유도체, 산화된 셀룰로스(OC) 또는 이의 변형된 유도체, 또는 이들 중 임의의 조합을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 다른 성분의 예는 히알루론산(HA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 산화된 셀룰로스(OC), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체, 트리칼슘 포스페이트(TCP), 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA), 카르복시메틸셀룰로스, 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 이들의 조합을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. HA, PVA, PEG, 또는 OC의 변형된 유도체는 광중합성 유도체를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. HA, PVA, PEG, 또는 OC의 변형은 메타크릴화 및/또는 티올화를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 다른 성분의 예는 중합제 또는 광개시제(예를 들어, 가시광, 자외선(uv) 또는 적외선 광에 민감함)와 같은 개시제를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 가시광 광개시제의 예는 에오신 Y+ 트리에탄올아민 또는 리보플라빈을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 자외선 광개시제의 예는 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP) 또는 1-[4 2-하이드록시-1-[4-(2-하이드록시에톡시)페닐]-2-메틸프로판-1-온(IRGACURE® 2959)을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
조직-추출 콜라겐의 고유한 특성은 실온에서의 겔화이다. 생리학적 완충제 내 상대적으로 저농도(예를 들어, 5 mg/ml 내지 15 mg/ml)에서, 조직-추출 콜라겐은 저온(대략 4℃) 내지 실온에서 형질전환 시 겔을 형성한다.
대조적으로, rh콜라겐은 상대적으로 낮은 점도(동일한 농도 및 제제에서)를 가져서, 상대적으로 저하된 발현력을 사용하여 좁은 게이지의 바늘 또는 캐뉼라(27-게이지 내지 33-게이지)를 통한 주사, 뿐만 아니라 더 작은 공간 내로의 더 양호한 투과, 및 주사-후 조정(형상화) 시 더 큰 가요성을 가능하게 한다.
rh콜라겐을 미세-게이지 바늘 또는 캐뉼라(27-게이지 내지 33-게이지)를 갖는 주사기에 배치하고, 진피 아래의 공극 또는 공간 내로 주사한다. 그 후에, 주사된 rh콜라겐을 요망되는 위치로 (예를 들어, 수동 마사지를 통해 또는 성형 또는 형상화 기구, 예컨대 수술용 압저기를 이용하여) 성형하거나, 형상화하거나 그렇지 않으면 조작한다. 이러한 과정 전에, 동안 또는 후에, 주사된 제제를 덮는 진피 상에 또는 진피 위에 위치한 광원(예를 들어, 발광다이오드(LED), 레이저, 또는 제논 램프)에의 노출에 의해 중합을 개시할 수 있다.
실시예 19. 광개시제 및 첨가제로 제제화된 변형된 식물-유래 인간 재조합 콜라겐의 용도.
rh콜라겐을 실시예 18에 기재된 바와 같이 메타크릴화에 의해 변형시킨다. 변형된 rh콜라겐을 광개시제(예를 들어, 에오신 Y+ 트리에탄올아민 또는 리보플라빈)와 함께 중합성 용액 제제로서 제조한다. 히알루론산(HA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 산화된 셀룰로스(OC), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체, 트리칼슘 포스페이트(TCP), 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA), 카르복시메틸셀룰로스, 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 이들의 일부 조합을 포함시킨다.
제제를 미세-게이지 바늘 또는 캐뉼라(27-게이지 내지 33-게이지)를 갖는 주사기에 배치하고, 진피 아래의 공극 또는 공간 내로 주사한다. 그 후에, 실시예 18에 기재된 바와 같이, 주사된 제제를 광원(예를 들어, 가시광원)에의 노출 동안 또는 후에, 수동으로 또는 적절한 수술용 기구를 이용하여 요망되는 위치로 성형하거나, 형상화하거나 그렇지 않다면 조작한다.
실시예 20. 광개시제 및 변형된 첨가제로 제제화된 변형된 식물-유래 인간 재조합 콜라겐의 용도.
rh콜라겐을 실시예 19에서와 같이 메타크릴화 또는 티올화에 의해 변형시킨다. 변형된 rh콜라겐을 실시예 18에 기재된 바와 같이 광개시제(예를 들어, 에오신 Y+ 트리에탄올아민 또는 리보플라빈)와 함께 중합성 용액 제제로서 제조한다. 히알루론산(HA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 산화된 셀룰로스(OC), 또는 이들의 일부 조합의 변형된 유도체를 포함시키고, 메타크릴화 또는 티올화에 의해 변형시킨다.
제제를 미세-게이지 바늘 또는 캐뉼라(27-게이지 내지 33-게이지)를 갖는 주사기에 배치하고, 진피 아래의 공극 또는 공간 내로 주사한다. 그 후에, 실시예 18에 기재된 바와 같이, 주사된 제제를 광원(예를 들어, 가시광원)에의 노출 동안 또는 후에, 수동으로 또는 적절한 수술용 기구를 이용하여 요망되는 위치로 성형하거나, 형상화하거나 그렇지 않다면 조작한다.
실시예 21. 가교 히알루론산과 콜라겐의 비교적인 주사성 및 점도.
도 44에 도시된 바와 같이, 가교 히알루론산(HA)(검정색 □ 곡선) 발현력(뉴튼, N)을 주사하는 데 필요한 발현력을, 단량체성 콜라겐(▼곡선) 또는 원섬유화된 콜라겐(▲ 곡선)을 갖는 가교 히알루론산(HA)을 주사하는 데 필요한 발현력과 비교하였다. (가교 HA 20 ml/ml; 가교 HA 20 mg/ml, 단량체성 rhCol 7.5 mg/ml; 가교 HA 20 mg/ml, 원섬유화된 콜라겐 10 mg/ml)
도 45에 도시된 바와 같이, 가교 HA를 주사하는 데 필요한 발현력(뉴튼, N)을, 이중 가교된 HA - 콜라겐(회색 곡선)의 제제를 주사하는 데 필요한 힘과 비교하였다. 2개의 곡선은 대체로 유사하였다.
도 46에 도시된 바와 같이, 가교 히알루론산(HA)(검정색 □ 곡선)의 점도를, 단량체성 콜라겐(▼곡선) 또는 원섬유화된 콜라겐(▲ 곡선)을 갖는 가교 히알루론산(HA)의 점도와 비교하였다. 원섬유화된 콜라겐을 갖는 가교 HA에 대한 점도는 단량체성 콜라겐을 갖는 가교 HA의 점도보다 더 느렸으나, 가교 HA 단독의 점도보다는 더 컸다. 농도는 도 44에서와 같았다.
도 47에 도시된 바와 같이, 가교 히알루론산(HA)의 점도를, 이중 가교된 히알루론산(HA)-콜라겐(회색 곡선)의 제제의 점도와 비교하였다. 이중 가교된 HA-콜라겐에 대한 점도는 가교 HA 단독의 점도보다는 더 컸다.
단량체성 또는 원섬유화된, 가교된 또는 가교되지 않은 rh콜라겐을 가교 HA 진피 충전제에 첨가하는 것은 발현력을 유의하게 증가시키지 않아 의사에게 유사한 성능을 가능하게 하였지만, 다른 한편으로는 물질의 점도를 유의하게 증가시켜, 주사 시 더 양호한 피부 리프팅을 가능하게 하였다.
실시예 22. 재조합 인간 콜라겐 메타크릴레이트(rh콜라겐MA)의 경피 중합.
도 48a 내지 도 48b에 도시된 바와 같이, 피부를 백색 LED 토치로부터의 LED 백색광으로 6분 동안 투광시킴으로써, 마우스 피부 패치(도 48a) 아래에 주사된, 광개시제로서의 에오신 Y/TEA와 함께 재조합 인간 콜라겐 메타크릴레이트(rh콜라겐MA)의 액체 용액을 경피 중합시켰다. rh콜라겐MA가 중합되었고 피부 조직 내로 통합되었다(도 48b).
광개시제로서 에오신Y/TEA의 존재 하에 작은 LED 토치로 6분 동안 투과 시, rh콜라겐MA는 피부 아래에서 중합된다.
실시예 23. 이중 가교된 진피 충전제의 제조: 2-단계 합성
목적: 미적 목적 또는 임상 목적을 위해 피부 표면의 외양을 향상시키는 데 사용하기 위한 주사용 진피 충전제를 개발하는 것이다. 진피 충전제는 I형 재조합 인간 콜라겐(rh콜라겐) 또는 이의 변형된 형태, 메타크릴레이트화된 rh콜라겐(MA-rhCol) 및 가교 히알루론산(HA)으로 이루어진다.
가교-HA가 rh콜라겐에 추가로 가교되는 이중 가교된 생성물(도 49)은, 히알루론산이 구조적 지지 및 보이드 충전을 제공하는 스캐폴드가 되도록 디자인되는 한편, rh콜라겐은 세포 증식을 증강시키고 조직 재생을 촉진한다. 스캐폴드는 결국 분해되어 새로 형성된 조직을 남길 것이다. 또 다른 목적은 I형 rh콜라겐에 의해 촉진되는 조직 재생과 함께, 가교-HA에 의해 제공되는 리프팅 효과(조직 강화)를 검사하여 이중 가교된 진피 충전제를 분석하는 것이다.
방법:
이중 가교
- HA 가교 -
고분자량 히알루론산(범위 700 KDa 내지 3 MDa, 바람직하게는 1.5 MDa)을 알칼리성 조건 (예를 들어, 0.3 N Na(OH) 중 pH 12 내지 13) 하에 50 mg/ml 내지 200 mg/ml(바람직하게는 100 mg/ml) 범위의 농도에서 용해시켰다. HA를 용해시키기 전에, 가교제 1, 4-부탄디올 디글리시딜 에테르(BDDE)를 HA 이당류 양의 1% 내지 50%(바람직하게는 6%, 8%, 10%) 범위의 비로 용매에 첨가하였다. 이러한 제제의 일부 구현예에서, HA는 메타크릴레이트화된-HA(MA-HA)를 포함한다.
HA 가교를 실온에서 24시간 동안 수행하였다.
더 낮은 MW HA의 첨가 및 중화
총 HA 양의 1% 내지 30%(바람직하게는 5% 내지 10%) 범위의 더 낮은 분자량의 HA(50 KDa 내지 1,000 KDa, 바람직하게는 300 kDa 내지 700 KDa)를 10 mg/ml 내지 100 mg/ml(바람직하게는 30 mg/ml) 범위의 농도로 물에 용해시켰다. 이러한 제제의 일부 구현예에서, HA는 메타크릴레이트화된-HA(MA-HA)를 포함한다.
비-가교 HA를 가교 HA와 혼합하기 전에, HCl을 가교 HA의 pH를 중화시키는 데 필요한 양으로 비-가교 HA에 첨가한다. 포스페이트 완충제(PB) 및 NaCl을 0.1 M PB 및 0.2 M NaCl의 최종 농도로 첨가한다.
rh콜라겐의 중화
rh콜라겐을 HA와 혼합하기 전에, rh콜라겐을 PB+0.2M NaCl에서 0.1 M로 만든다.
HA+rh콜라겐의 혼합
HA(가교 HA + 비-가교 HA)를 (6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1,1:2, 1:3,1:4,1:5, 1:6) 사이의 범위의 HA:rh콜라겐의 비에서 rh콜라겐과 혼합하고, 2℃ 내지 8℃에서 유지시킨다. HA의 최종 농도는 약 5 내지 50 mg/ml이다. rh콜라겐 또는 MA-rh콜라겐의 최종 농도는 약 1 mg/ml 내지 50 mg/ml이다.
제2 가교
HA 및 rh콜라겐이 잘 혼합된 경우, 제2 가교를 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카르보디이미드 메트요오다이드(EDC)로 수행하였다: 10배 내지 100배(바람직하게는 50배)와 동일한 양의 EDC 및 rh콜라겐 중 자유 아민의 양을 (0.1 M PB+0.2 M NaCl)에 용해시키고, 가교 HA-rh콜라겐 혼합물에 첨가하고 혼합하였다. 제2 가교를 암실에서 2℃ 내지 8℃에서 2시간 내지 3시간 동안 수행한다.
투석
그 후에, 이중 가교된 물질을, PBS, 1 mM HCl 또는 저농도 포스페이트 완충제(저농도 포스페이트 완충제 조제물: (a) 스탁 용액: 10 N Na(OH)로 pH 11.2로 만들어진 162 mM 소듐 포스페이트 디베이직(dibasic); (b) 0.1 mM HCL 중 희석된 스탁 용액 1:1000에 대해 투석하였다.
유변학적 및 기계적 평가
예를 들어, 원추(1-도) 대 플레이트 배치(C35/1)를 사용하는 HAAKE-RHEO STRESS 600TM 기기(THERMO SCIENTIFICTM)를 사용하여 저장 계수 및 손실 계수를 측정하였다. 주파수 스윕 측정을 일정한 변형(예를 들어, 0.8%) 및 주파수 범위(예를 들어, 0.02 Hz 내지 100 Hz)에서 수행하였다. 선택적으로, 하나 또는 둘 모두의 구성요소의 다양한 비 또는 가교비를 시험하였다. 제1 가교 및 제2 가교를 조율하여, 최종 생성물의 저장 계수 및 손실 계수를 조절할 수 있다.
예를 들어, MULTITEST 1-/i MECMESINTM 머신을 사용하여 주사성 측정을 플런저 치환(mm)의 함수로서 수행하여, 발현력을 관찰하였다.
주사성
상기 기재된 바와 같이, MULTITEST 1-/i MECMESINTM 머신을 사용하여 주사성 측정을 수행하였다. 1 ml LUER-LOKTM 주사기(BECTON-DICKINSONTM) 및 30 G 바늘을 제제 2, 2A 및 3(표 8)에 사용하였다. 대표적인 이중 가교된 제제 2, 2A 및 3(표 8)의 플런저 치환의 함수로서의 발현력을 마찬가지로 30 G 바늘을 사용하여 상업적으로 입수 가능한 진피 충전제와 비교하였다.
동물 연구
200 마이크로리터의 제제 2 또는 2A, 또는 대조군을 Sprague dawley 래트의 등 내로 피하 주사하였다. 1주 후에 조직학을 수행하였다.
결과:
당업자는, 본원에서의 2-단계 이중 가교가 2-유형의 가교제를 사용함을 이해할 것이다. 제1 단계는 HA 및 BDDE를 가교제로서 포함한다. 제2 단계에서, 콜라겐 및 비-가교 HA를 첨가하고, EDC를 사용하여 가교를 달성한다. 모든 다른 진피 충전제 제조 방법과 비교하여, 가교 화학 및 작용 순서의 차이는 기계적 특성, 조직 상호작용, 및 분해율을 포함하는 상이한 특성을 갖는 진피 충전제 조성물을 초래해야 하는 것으로 예상된다.
표 8에 제시된 대표적인 제제와 함께 상기 방법을 사용하여 HA:rh콜라겐의 제제를 제조하였다.
유변학적 및 기계적 평가
도 50에 제시된 바와 같이, 대표적인 이중 가교된 제제(표 8)의 저장 계수(실선) 및 손실 계수(파선)는 상업적으로 입수 가능한 진피 충전제와 유사하였다. f=1 Hz에서 이들 제제 및 이러한 상업적인 충전제의 저장 계수 및 탄성 계수의 비교는 도 51에 도시되어 있다.
제1 가교 및 제2 가교를 조율하여, 최종 생성물의 저장 계수 및 손실 계수를 조정할 수 있다. 도 52에 제시된 바와 같이, 이중 가교된 제제를 30G 바늘을 통해 주사하는 데 필요한 발현력은 상업적으로 입수 가능한 진피 충전제를 주사하는 데 필요한 발현력보다 유의하게 더 낮았다.
조직학 및 동물 연구
동물 연구를 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 제제 2 및 2A(표 8 및 9 참조)를 피하 주사 후, 상업적으로 입수 가능한 진피 충전제 생성물과 비교하였다. 염증은 이것이 너무 중증이지 않는 한, 재생 과정에서의 제1 단계이다.
피하 주사 후 제7일에 평균 조직학 점수를 표 9에서 상업적으로 입수 가능한 진피 충전제와 비교한다.
표 9에 제시된 바와 같이, 이중 가교된 제제는 상업적으로 입수 가능한 진피 충전제보다 더 높은 섬유증 점수 및 더 높은 염증 수준을 가지며, 이는 조직 재생의 더욱 진전된 과정을 나타낸다.
도 56은 제제 2, 2A 및 대조군의 피하 주사한 후 제7일의 대표적인 조직학 이미지를 도시한다. 화살표는 제제 2 및 2A(그러나 여전히 중증이 아님)에서 증강된 면역 반응을 나타내며, 이는 조직 재생의 개시를 나타낸다. "물집"은 주사된 물질에 의해 형성되는 수포(bullae)를 지칭한다.
도 56에 도시된 시료에 대한 조직학 점수는 도 57에서 막대 그래프로서 제시되며, 여기서, 이중 가교된 제제 2 및 2A에 대한 더 높은 염증 점수 및 섬유증 점수는 이들 제제가 대조군과 비교하여 향상된 조직 재생을 보여주었음을 나타낸다.
요약/결론
이중 가교된 제제는 27 G 내지 32 G 바늘을 통한 용이한 주사 및 광범위한 범위의 강성 G'-G"를 갖도록 개발되었다. 1-주 주사 후 조직학 결과는 조직 재생 과정의 증강된 개시를 보여준다.
실시예 24. 광경화성 진피 충전제
목적: 광경화성 진피 충전제의 특성을 분석하기 위한 것이다. 광경화성 제제는 경화 전의 반 IPN이고 경화 후에 IPN(상호투과된 네트워크)으로 종료된다. 2개의 얽혀진 네트워크를 의미하여, 각각의 하나는 그 자체에 가교되고 다른 것에는 가교되지 않는다.
방법:
rh콜라겐과 메타크릴레이트화된 rh콜라겐의 혼합물을 실시예 23에서와 같이 가교된 이미 가교된 HA에 1 mg/ml 내지 10 mg/ml의 최종 농도로 첨가하였으며, 여기서, 메타크릴화된 rh콜라겐 : 비-메타크릴레이트화된 rh콜라겐의 비는 1:0, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 0:1, 2:1, 3:1, 또는 4:1이다. MA-rh콜라겐의 최종 농도 범위는 약 0 mg/ml 내지 12 mg/ml이고, 비-변형된 rh콜라겐의 최종 농도 범위는 약 0 mg/ml 내지 12 mg/ml이다. 가교 HA : MA-rh콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1이다. HA의 최종 농도는 12 mg/ml 내지 25 mg/ml이고, rh콜라겐(MA + 비-변형된)의 최종 농도는 1 mg/ml 내지 24 mg/ml이다.
가시광 광개시제를 혼합물(예를 들어, 에오신 Y, 트리에탄올아민 및 N-비닐피롤리돈의 조성물)에 첨가하였다.
유변학적 연구
각각의 대표적인 제제 4, 5 및 6과 대조군(하기 표 10 참조)의 1.6 ml 시료를 원통형 몰드 및 2 cm 직경과 0.5 mm 높이의 원통에 붓고, 6분 동안의 백색 LED 플래쉬라이트를 사용한 일정한 양의 가시광 투광에 의해 경화시켰다.
표 10에 제시된 바와 같이 상기 방법을 사용하여 일정한 양의 가시광 광개시제와 함께 3개의 상이한 대표적인 비율의 rh콜라겐 및/또는 rH 콜라겐 메타크릴레이트의 조합과 고도로 가교된 히알루론산(HA)의 제제를 혼합하였다. 고도로 BDDE 가교 HA(그러나 임의의 다른 가교제가 마찬가지로 있을 수 있거나, 심지어 가교 HA로만 제조된 표준 상업적 충전제가 있을 수 있음)를 상이한 비로 rhCol 및 rhColMA와 혼합하였다. 그 결과는 경화 후, HA의 가교 및 얽혀진 rhColMA의 가교이다. 이러한 형태는, HA가 그 자체에 가교되고 콜라겐이 HA 네트워크 내에서 그 자체에 가교되는 상호투과된 네트워크를 형성한다.
저장 계수 및 손실 계수를 하기 기재된 바와 같이 투광 전과 후에 측정하였다.
a. 경화 전
저장 계수 및 손실 계수는 원추(1°) 대 플레이트 배치(C35/1)를 사용하는 HAAKE-RHEO STRESS 600TM 기기(THERMO SCIENTIFICTM)를 사용하여 측정되었다. 주파수 스윕 측정을 0.8%의 일정한 변형 및 0.02 Hz 내지 100 Hz 범위의 주파수에서 수행하였다.
b. 경화 후
광경화된 실린더의 저장 계수 및 손실 계수는 톱니모양 플레이트 대 플레이트 배치(PP20)를 사용하는 HAAKE-RHEO STRESS 600TM 기기(THERMO SCIENTIFICTM)를 사용하여 측정되었다. 주파수 스윕 측정은 3 Pa의 일정한 전단율, 0.02 Hz 내지 100 Hz 범위의 주파수에서 0.3 N의 일정한 정상적인 하중 하에 수행되었다.
주사성
상기 기재된 바와 같이, 제제 4, 5 및 6에 대해 그리고 대조군으로서 고도로 가교된 HA에 대해 MULTITEST 1-/i MECMESINTM 머신을 사용하여 주사성 측정을 수행하였다. 1 ml LUER-LOKTM 주사기(BECTON-DICKINSONTM) 및 30 G 바늘을 모든 시료(표 10)에 사용하였다. 대표적인 제제 4, 5 및 6(표 10)의 플런저 치환(12 mm/분)의 함수로서의 발현력이 고도로 가교된 HA와 비교되었다.
동물 연구
동물 연구를 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 래트의 등 내로 피하 주사 후, 제제 4(표 10 및 표 11 참조)를 고도로 가교된 HA와 비교하였다.
결과:
유변학적 및 기계적 평가
도 53은 제제 4, 5 및 6을 고도로 가교된 HA(표 10 참조)로 광경화시키기 전과 후에 저장 계수 및 손실 계수의 비교를 도시한다. f=1 Hz의 주파수에서, 광경화 전과 후 둘 다에서, 이들 제제 및 고도로 가교된 HA(경화 가능하지 않음)의 저장 계수 및 탄성 계수의 비교는 도 54에 도시되어 있다. 화살표는 "트렌드"를 나타내며: rhColMA의 양이 증가함에 따라 강성이 증가한다.
주사성
도 55에 도시된 바와 같이, 30 G 바늘을 통한 제제 4, 5 및 6의 주사에 필요한 발현력은 가교 HA 단독에 필요한 발현력보다 더 낮았으며, 이는 의사에 대해 더 용이한 사용성 및 환자의 잔주름 및 연약한 영역에서 더 용이한 주사를 가능하게 하였다. 그러나, 인 시추 광경화(주사 후) 후에, 물질 강성을 가교 HA 단독보다 유의하게 더 높도록 조정할 수 있다(도 53 및 도 54).
조직학 및 동물 연구
제7일의 피하 주사 시 제제 4의 평균 조직학 점수를 표 11에서 고도로 가교된 HA와 비교하였다.
표 11에 제시된 바와 같이, 제제 4는 고도로 가교된 HA보다 더 높은 섬유증 점수 및 더 높은 염증 수준을 가지며, 이는 조직 재생의 더욱 진전된 과정을 나타낸다.
도 58 및 도 59는, 제제 4가 대조군 진피 충전제보다 더 높은 염증 점수 및 섬유증 점수를 가지며, 이는 제제 4의 진피 충전제를 이용하는 경우 조직 재생 과정의 향상된 개시를 나타낸다.
결론/요약
주사 전에 상대적으로 낮은 강성을 가지며 27 G 내지 32 G 바늘을 통한 용이한 주사를 가능하게 하지만 광경화 후 강성(조율 가능함)의 유의한 향상을 가능하게 하는 광경화성 충전제를 개발하였다. rhCol과 rhColMA 사이의 최종 비를 조절함으로써 강성을 조율할 수 있다. 이 기술은, 의사가 충전제를 광경화성 투광으로 고정시키기 전에 요망되는 모양으로 형상화시킬 수 있게 한다. 주사된 물질은 주변 조직에 강하게 접착한다. 예비 생체내 결과는 재생 과정의 개시를 나타낸다.
실시예 25.
생체내
동물 연구: 진피 충전제 구성요소의 독립적인 주사
목적: HA 또는 이의 메타크릴레이트화된 유도체, 및 메타크릴레이트화된 rh콜라겐을 반액체상에서 별도로 피하 주사하고, 주사 후 이들을 피부를 통한 백색광 투광에 의해인 시추에서 가교시키기 위한 것이다(가교는 rhColMA에의 rhColMA임). 이러한 접근법은 물질을 광 중합에 의해 고정시키기 직전에, 상기 물질의 더 용이한 주사 및 이의 형상의 인 시추 형상화를 가능하게 한다. 피하 래트 모델을 사용하여, 시간 경과에 따른 세포 증식, 조직 강화, 및 매트릭스 분해의 특징을 평가할 것이다.
방법: 이 모델에서, 평가용 시료 제제 구성요소(HA 또는 이의 메타크릴레이트화된 유도체, 및 메타크릴레이트화된 rh콜라겐 및 광개시제)를 Sprague Dawley 래트의 등에 피하 주사하고, 주사 부위를 20일 이하 동안 추적조사할 것이다. 주사는 대략 동일한 시기(다른 주사 후 즉시)에, 동일한 장소에서 수행될 것이다. 구성요소 용액은 가교 전에 또는 동시에 또는 후에 인 시추에서 마사지될 수 있다. 피하 래트 모델은, 이것이 생체적합성, 리프팅 효과 및 지속성을 추정하기 위한 가장 간단한 모델이므로 선택된다. 더욱이, Hillel 등은 이 특정 모델을 위한 확증 연구를 공개하였다(문헌[Dermatol Surg 2012; 38:471-478]).
각각의 치료 전에 동물을 케타민/자일라신(Xylasine)으로 진정시킬 것이다. 동물의 등을 면도할 것이고, 면도된 피부 상에서 주사 부위를 마킹할 것이다. 각각의 래트에게, 래트 당 총 6회의 주사를 등 평면 상의 이격된 장소에서 27.5 G 내지 32 G 바늘을 사용하여 0.2 ml의 제제를 주사할 것이다.
주사 후, 백색광 LED 토치로 주사 부위를 2분 동안 경피 투광시켜 제제를 가교시킬 것이다.
전체 연구 기간에 걸쳐 이환율(morbidity) 및 사망률에 대해 매일 2회 동물을 관찰할 것이다. 3일마다(주사 후 0, 1, 4, 7, 11, 14, 18 및 21일째 시점), 각각의 물집의 높이, 폭 및 길이를 캘리퍼로 측정할 것이고, 각각의 물집의 타원형 부피 [( 4/3)(π)(1/2 높이)(1/2길이)(1/2 폭)]를 계산할 것이다.
예를 들어 비제한적으로 치료-후 7, 14 및 21일째 시점에서 동물을 안락사시킬 것이다.
각각의 안락사 시점에서, 주사 부위를 노출시키고 거시적으로 평가할 것이며, 조직학적 평가를 위해 물집을 수집할 것이다. 주사 부위(물집을 포함함)를 위에 덮인 피부와 함께 절개하며, 4% 포르말린에서 고정시키고, 파라핀에 포매시킬 것이다.
조직학
슬라이드 제조
파라핀 블록을 대략 3 미크론 내지 5 미크론 두께로 박절하며, 유리 슬라이드 상에 놓고, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 및 마손(Masson) 3색으로 염색하며, 자동화된 머신에 의해 피복시킬 것이다. 광현미경(Olympus BX60, 시리얼 번호 7D04032)을 사용하여 모든 슬라이드의 조직학 평가를 수행할 것이다.
이미지를 X4의 배율에서 촬영할 것이다. 이미지 획득을 병리학적 변화 시에만 그리고 대표적인 동물에서만 수행할 것이다.
결과:
실시예 24에서 수득된 것과 유사한 결과가 예상되며, 여기서, 광경화성 진피 충전제의 구성요소의 별개의 독립적인 주사는 예를 들어, 제제 믹스와 비교하여 구성요소의 저하된 점도로 인해 증가된 주사 용이성을 제공할 수 있다.
세포성 성장 촉진 스캐폴드를 포함하는 진피 충전제, 및 이의 용도가 이의 구체적인 구현예와 함께 기재되긴 하였지만, 다수의 대안, 변형 및 변화가 당업자에게 명백할 것임은 자명하다. 이에, 첨부된 청구범위의 사상 및 넓은 범주에 속하는 모든 이러한 대안, 변형 및 변화를 포괄하도록 의도된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원 및 GenBank 기탁 번호는 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원 또는 GenBank 기탁 번호가 본 명세서에 참조에 의해 구체적으로 그리고 개별적으로 포함되는 것과 동일한 정도로 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. 게다가, 본 출원에서 임의의 참조문헌의 인용 또는 식별은 이러한 참조문헌이 선행 기술로서 이용 가능함을 인정하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
SEQUENCE LISTING
<110> SHOSEYOV, Oded
ORR, Nadav
SEROR MAKNOUZ, Jasmine
ZARKA, Revital
<120> DERMAL FILLERS AND METHODS OF USE THEREOF
<130> P-578412-PC
<160> 42
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4662
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence containing the coding regions of the vacuolar
signal sequence of barley gene for Thiol protease aleurain
precursor fused to the human Collagen alpha 1(I) chain and
flanking regions
<400> 1
gcgatgcatg taatgtcatg agccacatga tccaatggcc acaggaacgt aagaatgtag 60
atagatttga ttttgtccgt tagatagcaa acaacattat aaaaggtgtg tatcaatacg 120
aactaattca ctcattggat tcatagaagt ccattcctcc taagtatcta aaccatggct 180
cacgctcgtg ttctcctcct cgctctcgct gttttggcaa cagctgctgt ggctgtggct 240
tctagttctt cttttgctga ttcaaaccct attagacctg ttactgatag agcagcttcc 300
actttggctc aattgcaaga ggagggccag gttgagggcc aagatgagga tatccctcca 360
attacatgcg tgcaaaatgg cttgcgttac cacgataggg atgtgtggaa acctgaacct 420
tgtcgtatct gtgtgtgtga taacggcaag gtgctctgcg atgatgttat ctgcgatgag 480
acaaaaaatt gccctggcgc tgaagttcct gagggcgagt gttgccctgt gtgccctgat 540
ggttccgagt ccccaactga tcaggaaact actggcgtgg agggcccaaa aggagatact 600
ggtccacgtg gtcctagggg tccagcaggt cctccaggta gagatggtat tccaggccag 660
cctggattgc caggaccacc aggcccacct ggcccaccag gacctcctgg tcttggtgga 720
aatttcgctc cacaactctc ttatggctat gatgagaagt caacaggtgg tatttccgtt 780
ccaggtccta tgggaccatc cggaccaaga ggtctcccag gtcctccagg tgctcctgga 840
cctcaaggct ttcaaggacc tccaggcgaa ccaggagaac caggcgcttc tggaccaatg 900
ggcccaaggg gaccacctgg cccaccagga aaaaatggcg atgatggcga agctggaaag 960
cctggtcgtc ctggagagag aggtcctcct ggcccacagg gtgcaagagg cttgccagga 1020
actgctggct tgcctggaat gaagggacat aggggcttct ccggcctcga tggcgctaag 1080
ggtgatgctg gccctgctgg accaaagggc gagccaggtt cccctggaga aaacggtgct 1140
cctggacaaa tgggtcctcg tggacttcca ggagaaaggg gtcgtccagg cgctccagga 1200
ccagcaggtg ctaggggaaa cgatggtgca acaggcgctg ctggccctcc tggcccaact 1260
ggtcctgctg gccctccagg attcccaggc gcagttggag ctaaaggaga agcaggacca 1320
cagggcccta ggggttctga aggacctcag ggtgttagag gtgaaccagg tcctccaggc 1380
ccagctggag cagctggtcc agcaggaaat ccaggtgctg atggtcaacc tggagctaag 1440
ggcgctaatg gcgcaccagg tatcgcaggc gcaccaggtt ttcctggcgc tagaggccca 1500
agtggtcctc aaggaccagg tggaccacca ggtccaaaag gcaattctgg cgaacctggc 1560
gctccaggtt ctaaaggaga tactggtgct aaaggcgaac caggacctgt tggtgttcag 1620
ggtcctcctg gtcctgctgg agaagaagga aaaagaggtg ctcgtggaga accaggacca 1680
actggacttc ctggacctcc tggtgaacgt ggcggacctg gctcaagggg tttccctgga 1740
gctgatggag tggcaggtcc aaaaggccct gctggagaga gaggttcacc aggtccagct 1800
ggtcctaagg gctcccctgg tgaagcaggt agaccaggcg aagcaggatt gccaggcgca 1860
aagggattga caggctctcc tggtagtcct ggcccagatg gaaaaacagg cccaccaggt 1920
ccagcaggac aagatggacg tccaggccca ccaggtcctc ctggagcaag gggacaagct 1980
ggcgttatgg gttttccagg acctaaaggt gctgctggag agccaggaaa ggcaggtgaa 2040
agaggagttc ctggtccacc aggagcagtg ggtcctgctg gcaaagatgg tgaagctgga 2100
gcacagggcc ctccaggccc tgctggccca gctggcgaac gtggagaaca aggcccagct 2160
ggtagtccag gatttcaagg attgcctggc cctgctggcc ctccaggaga agcaggaaaa 2220
cctggagaac aaggagttcc tggtgatttg ggagcacctg gaccttcagg agcacgtggt 2280
gaaagaggct tccctggcga gaggggtgtt caaggtccac caggtccagc aggacctaga 2340
ggtgctaatg gcgctcctgg caacgatgga gcaaaaggtg atgctggtgc tcctggcgca 2400
cctggaagtc agggtgctcc tggattgcaa ggaatgcctg gagagagggg tgctgctggc 2460
ttgccaggcc caaagggcga taggggtgat gctggaccaa aaggtgctga tggatcccca 2520
ggaaaagatg gagttcgtgg tcttactggc ccaatcggac ctccaggccc tgctggcgct 2580
ccaggtgata agggcgaaag tggcccaagt ggacctgctg gacctactgg tgctagaggt 2640
gcacctggtg ataggggtga acctggacca cctggtccag ctggttttgc tggtcctcct 2700
ggagctgatg gacaacctgg cgcaaagggt gaaccaggtg atgctggcgc aaagggagat 2760
gctggtccac ctggacctgc tggtccagca ggcccccctg ggccaatcgg taatgttgga 2820
gcaccaggtg ctaagggagc taggggttcc gctggtccac ctggagcaac aggatttcca 2880
ggcgctgctg gtagagttgg cccaccaggc ccatccggaa acgcaggccc tcctggtcct 2940
ccaggtcctg ctggcaagga gggtggcaaa ggaccaaggg gcgaaactgg ccctgctggt 3000
agacctggcg aagttggccc tcctggacca ccaggtccag caggagaaaa aggttcccca 3060
ggagctgatg gcccagctgg tgctccagga actccaggcc ctcaaggtat tgctggacag 3120
agaggcgttg tgggactccc tggtcaaagg ggagagagag gatttccagg cttgccagga 3180
cctagtggag aacctggaaa acaaggccca tcaggcgcta gtggagagcg tggacctcct 3240
ggccctatgg gacctcctgg attggctggc ccacctggcg aatcaggtcg tgaaggcgca 3300
ccaggcgcag aaggatcacc tggaagagat ggatcccctg gtgctaaagg cgatcgtgga 3360
gaaactggtc cagcaggccc accaggcgca ccaggtgcac ctggcgctcc aggacctgtg 3420
ggaccagctg gaaaatccgg agataggggc gagacaggcc cagcaggacc agctggacct 3480
gttggccctg ctggcgctcg tggaccagca ggacctcaag gaccaagggg agataaggga 3540
gaaacaggcg aacaaggcga taggggcatt aagggtcata ggggttttag tggcctccag 3600
ggtcctcctg gcccacctgg atcaccagga gaacagggac catctggtgc ttccggccca 3660
gctggtccaa gaggacctcc aggatcagct ggtgcacctg gaaaagatgg tcttaacggt 3720
ctcccaggac caatcggccc tccaggacct agaggaagaa caggagatgc tggccctgtt 3780
ggccctccag gacctcctgg tccaccaggt ccacctggtc ctccatcagc tggattcgat 3840
ttttcatttc ttccacagcc accacaagag aaagctcacg atggcggcag atattaccgt 3900
gctgatgatg ctaacgttgt tagggataga gatttggaag tggatacaac tttgaaatcc 3960
ctctcccagc aaattgaaaa cattagatct ccagaaggtt cacgtaaaaa cccagctaga 4020
acatgtcgtg atttgaaaat gtgtcactcc gattggaaaa gtggtgaata ctggattgat 4080
ccaaatcagg gctgtaatct cgatgctatc aaagttttct gtaacatgga aacaggcgaa 4140
acatgcgttt atcctactca accttccgtg gctcagaaaa attggtacat ctcaaaaaat 4200
cctaaagata agaggcacgt ttggttcggt gaaagtatga ctgatggatt tcaatttgag 4260
tacggcggtc aaggtagtga tccagctgat gtggctattc aactcacatt tttgcgtctt 4320
atgtccacag aggcatcaca aaacatcact taccactgca aaaacagtgt ggcttatatg 4380
gatcaacaaa caggaaacct taagaaggct cttcttttga agggctcaaa cgagattgag 4440
attagagcag agggcaactc aaggtttact tattcagtta ctgttgatgg ctgcacttca 4500
catactggcg cttggggtaa aacagttatc gagtataaga ctacaaaaac atcaagactc 4560
ccaatcattg atgttgctcc tctcgatgtt ggcgctcctg atcaagagtt cggttttgat 4620
gtgggcccag tttgtttcct ctaatgagct cgcggccgca tc 4662
<210> 2
<211> 4662
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence of the vacuolar signal sequence of barley gene
for Thiol protease aleurain precursor fused to the human Collagen
alpha 1(I) chain and flanking regions
<220>
<221> CDS
<222> (175)..(4644)
<400> 2
gcgatgcatg taatgtcatg agccacatga tccaatggcc acaggaacgt aagaatgtag 60
atagatttga ttttgtccgt tagatagcaa acaacattat aaaaggtgtg tatcaatacg 120
aactaattca ctcattggat tcatagaagt ccattcctcc taagtatcta aacc atg 177
Met
1
gct cac gct cgt gtt ctc ctc ctc gct ctc gct gtt ttg gca aca gct 225
Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr Ala
5 10 15
gct gtg gct gtg gct tct agt tct tct ttt gct gat tca aac cct att 273
Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro Ile
20 25 30
aga cct gtt act gat aga gca gct tcc act ttg gct caa ttg caa gag 321
Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Gln Glu
35 40 45
gag ggc cag gtt gag ggc caa gat gag gat atc cct cca att aca tgc 369
Glu Gly Gln Val Glu Gly Gln Asp Glu Asp Ile Pro Pro Ile Thr Cys
50 55 60 65
gtg caa aat ggc ttg cgt tac cac gat agg gat gtg tgg aaa cct gaa 417
Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Glu
70 75 80
cct tgt cgt atc tgt gtg tgt gat aac ggc aag gtg ctc tgc gat gat 465
Pro Cys Arg Ile Cys Val Cys Asp Asn Gly Lys Val Leu Cys Asp Asp
85 90 95
gtt atc tgc gat gag aca aaa aat tgc cct ggc gct gaa gtt cct gag 513
Val Ile Cys Asp Glu Thr Lys Asn Cys Pro Gly Ala Glu Val Pro Glu
100 105 110
ggc gag tgt tgc cct gtg tgc cct gat ggt tcc gag tcc cca act gat 561
Gly Glu Cys Cys Pro Val Cys Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Thr Asp
115 120 125
cag gaa act act ggc gtg gag ggc cca aaa gga gat act ggt cca cgt 609
Gln Glu Thr Thr Gly Val Glu Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro Arg
130 135 140 145
ggt cct agg ggt cca gca ggt cct cca ggt aga gat ggt att cca ggc 657
Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Ile Pro Gly
150 155 160
cag cct gga ttg cca gga cca cca ggc cca cct ggc cca cca gga cct 705
Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro
165 170 175
cct ggt ctt ggt gga aat ttc gct cca caa ctc tct tat ggc tat gat 753
Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala Pro Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr Asp
180 185 190
gag aag tca aca ggt ggt att tcc gtt cca ggt cct atg gga cca tcc 801
Glu Lys Ser Thr Gly Gly Ile Ser Val Pro Gly Pro Met Gly Pro Ser
195 200 205
gga cca aga ggt ctc cca ggt cct cca ggt gct cct gga cct caa ggc 849
Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly
210 215 220 225
ttt caa gga cct cca ggc gaa cca gga gaa cca ggc gct tct gga cca 897
Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Glu Pro Gly Ala Ser Gly Pro
230 235 240
atg ggc cca agg gga cca cct ggc cca cca gga aaa aat ggc gat gat 945
Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asn Gly Asp Asp
245 250 255
ggc gaa gct gga aag cct ggt cgt cct gga gag aga ggt cct cct ggc 993
Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Arg Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly
260 265 270
cca cag ggt gca aga ggc ttg cca gga act gct ggc ttg cct gga atg 1041
Pro Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Thr Ala Gly Leu Pro Gly Met
275 280 285
aag gga cat agg ggc ttc tcc ggc ctc gat ggc gct aag ggt gat gct 1089
Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala
290 295 300 305
ggc cct gct gga cca aag ggc gag cca ggt tcc cct gga gaa aac ggt 1137
Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Glu Asn Gly
310 315 320
gct cct gga caa atg ggt cct cgt gga ctt cca gga gaa agg ggt cgt 1185
Ala Pro Gly Gln Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg
325 330 335
cca ggc gct cca gga cca gca ggt gct agg gga aac gat ggt gca aca 1233
Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Asn Asp Gly Ala Thr
340 345 350
ggc gct gct ggc cct cct ggc cca act ggt cct gct ggc cct cca gga 1281
Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly
355 360 365
ttc cca ggc gca gtt gga gct aaa gga gaa gca gga cca cag ggc cct 1329
Phe Pro Gly Ala Val Gly Ala Lys Gly Glu Ala Gly Pro Gln Gly Pro
370 375 380 385
agg ggt tct gaa gga cct cag ggt gtt aga ggt gaa cca ggt cct cca 1377
Arg Gly Ser Glu Gly Pro Gln Gly Val Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro
390 395 400
ggc cca gct gga gca gct ggt cca gca gga aat cca ggt gct gat ggt 1425
Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Asn Pro Gly Ala Asp Gly
405 410 415
caa cct gga gct aag ggc gct aat ggc gca cca ggt atc gca ggc gca 1473
Gln Pro Gly Ala Lys Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Ile Ala Gly Ala
420 425 430
cca ggt ttt cct ggc gct aga ggc cca agt ggt cct caa gga cca ggt 1521
Pro Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Pro Gly
435 440 445
gga cca cca ggt cca aaa ggc aat tct ggc gaa cct ggc gct cca ggt 1569
Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly
450 455 460 465
tct aaa gga gat act ggt gct aaa ggc gaa cca gga cct gtt ggt gtt 1617
Ser Lys Gly Asp Thr Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Pro Val Gly Val
470 475 480
cag ggt cct cct ggt cct gct gga gaa gaa gga aaa aga ggt gct cgt 1665
Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Glu Gly Lys Arg Gly Ala Arg
485 490 495
gga gaa cca gga cca act gga ctt cct gga cct cct ggt gaa cgt ggc 1713
Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly
500 505 510
gga cct ggc tca agg ggt ttc cct gga gct gat gga gtg gca ggt cca 1761
Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro Gly Ala Asp Gly Val Ala Gly Pro
515 520 525
aaa ggc cct gct gga gag aga ggt tca cca ggt cca gct ggt cct aag 1809
Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro Lys
530 535 540 545
ggc tcc cct ggt gaa gca ggt aga cca ggc gaa gca gga ttg cca ggc 1857
Gly Ser Pro Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly Glu Ala Gly Leu Pro Gly
550 555 560
gca aag gga ttg aca ggc tct cct ggt agt cct ggc cca gat gga aaa 1905
Ala Lys Gly Leu Thr Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Pro Asp Gly Lys
565 570 575
aca ggc cca cca ggt cca gca gga caa gat gga cgt cca ggc cca cca 1953
Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln Asp Gly Arg Pro Gly Pro Pro
580 585 590
ggt cct cct gga gca agg gga caa gct ggc gtt atg ggt ttt cca gga 2001
Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln Ala Gly Val Met Gly Phe Pro Gly
595 600 605
cct aaa ggt gct gct gga gag cca gga aag gca ggt gaa aga gga gtt 2049
Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Lys Ala Gly Glu Arg Gly Val
610 615 620 625
cct ggt cca cca gga gca gtg ggt cct gct ggc aaa gat ggt gaa gct 2097
Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ala
630 635 640
gga gca cag ggc cct cca ggc cct gct ggc cca gct ggc gaa cgt gga 2145
Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly
645 650 655
gaa caa ggc cca gct ggt agt cca gga ttt caa gga ttg cct ggc cct 2193
Glu Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro
660 665 670
gct ggc cct cca gga gaa gca gga aaa cct gga gaa caa gga gtt cct 2241
Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Glu Gln Gly Val Pro
675 680 685
ggt gat ttg gga gca cct gga cct tca gga gca cgt ggt gaa aga ggc 2289
Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Arg Gly Glu Arg Gly
690 695 700 705
ttc cct ggc gag agg ggt gtt caa ggt cca cca ggt cca gca gga cct 2337
Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro
710 715 720
aga ggt gct aat ggc gct cct ggc aac gat gga gca aaa ggt gat gct 2385
Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Asn Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala
725 730 735
ggt gct cct ggc gca cct gga agt cag ggt gct cct gga ttg caa gga 2433
Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly
740 745 750
atg cct gga gag agg ggt gct gct ggc ttg cca ggc cca aag ggc gat 2481
Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Asp
755 760 765
agg ggt gat gct gga cca aaa ggt gct gat gga tcc cca gga aaa gat 2529
Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Lys Asp
770 775 780 785
gga gtt cgt ggt ctt act ggc cca atc gga cct cca ggc cct gct ggc 2577
Gly Val Arg Gly Leu Thr Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly
790 795 800
gct cca ggt gat aag ggc gaa agt ggc cca agt gga cct gct gga cct 2625
Ala Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ser Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Pro
805 810 815
act ggt gct aga ggt gca cct ggt gat agg ggt gaa cct gga cca cct 2673
Thr Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Asp Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro
820 825 830
ggt cca gct ggt ttt gct ggt cct cct gga gct gat gga caa cct ggc 2721
Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro Gly
835 840 845
gca aag ggt gaa cca ggt gat gct ggc gca aag gga gat gct ggt cca 2769
Ala Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro
850 855 860 865
cct gga cct gct ggt cca gca ggc ccc cct ggg cca atc ggt aat gtt 2817
Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ile Gly Asn Val
870 875 880
gga gca cca ggt gct aag gga gct agg ggt tcc gct ggt cca cct gga 2865
Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Ala Arg Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly
885 890 895
gca aca gga ttt cca ggc gct gct ggt aga gtt ggc cca cca ggc cca 2913
Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly Arg Val Gly Pro Pro Gly Pro
900 905 910
tcc gga aac gca ggc cct cct ggt cct cca ggt cct gct ggc aag gag 2961
Ser Gly Asn Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu
915 920 925
ggt ggc aaa gga cca agg ggc gaa act ggc cct gct ggt aga cct ggc 3009
Gly Gly Lys Gly Pro Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Arg Pro Gly
930 935 940 945
gaa gtt ggc cct cct gga cca cca ggt cca gca gga gaa aaa ggt tcc 3057
Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly Ser
950 955 960
cca gga gct gat ggc cca gct ggt gct cca gga act cca ggc cct caa 3105
Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln
965 970 975
ggt att gct gga cag aga ggc gtt gtg gga ctc cct ggt caa agg gga 3153
Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly
980 985 990
gag aga gga ttt cca ggc ttg cca gga cct agt gga gaa cct gga aaa 3201
Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys
995 1000 1005
caa ggc cca tca ggc gct agt gga gag cgt gga cct cct ggc cct 3246
Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro
1010 1015 1020
atg gga cct cct gga ttg gct ggc cca cct ggc gaa tca ggt cgt 3291
Met Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gly Arg
1025 1030 1035
gaa ggc gca cca ggc gca gaa gga tca cct gga aga gat gga tcc 3336
Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro Gly Arg Asp Gly Ser
1040 1045 1050
cct ggt gct aaa ggc gat cgt gga gaa act ggt cca gca ggc cca 3381
Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Pro
1055 1060 1065
cca ggc gca cca ggt gca cct ggc gct cca gga cct gtg gga cca 3426
Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val Gly Pro
1070 1075 1080
gct gga aaa tcc gga gat agg ggc gag aca ggc cca gca gga cca 3471
Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Pro
1085 1090 1095
gct gga cct gtt ggc cct gct ggc gct cgt gga cca gca gga cct 3516
Ala Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly Pro
1100 1105 1110
caa gga cca agg gga gat aag gga gaa aca ggc gaa caa ggc gat 3561
Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly Asp
1115 1120 1125
agg ggc att aag ggt cat agg ggt ttt agt ggc ctc cag ggt cct 3606
Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly Pro
1130 1135 1140
cct ggc cca cct gga tca cca gga gaa cag gga cca tct ggt gct 3651
Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Ala
1145 1150 1155
tcc ggc cca gct ggt cca aga gga cct cca gga tca gct ggt gca 3696
Ser Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala
1160 1165 1170
cct gga aaa gat ggt ctt aac ggt ctc cca gga cca atc ggc cct 3741
Pro Gly Lys Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro
1175 1180 1185
cca gga cct aga gga aga aca gga gat gct ggc cct gtt ggc cct 3786
Pro Gly Pro Arg Gly Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro
1190 1195 1200
cca gga cct cct ggt cca cca ggt cca cct ggt cct cca tca gct 3831
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala
1205 1210 1215
gga ttc gat ttt tca ttt ctt cca cag cca cca caa gag aaa gct 3876
Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu Pro Gln Pro Pro Gln Glu Lys Ala
1220 1225 1230
cac gat ggc ggc aga tat tac cgt gct gat gat gct aac gtt gtt 3921
His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr Arg Ala Asp Asp Ala Asn Val Val
1235 1240 1245
agg gat aga gat ttg gaa gtg gat aca act ttg aaa tcc ctc tcc 3966
Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr Leu Lys Ser Leu Ser
1250 1255 1260
cag caa att gaa aac att aga tct cca gaa ggt tca cgt aaa aac 4011
Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu Gly Ser Arg Lys Asn
1265 1270 1275
cca gct aga aca tgt cgt gat ttg aaa atg tgt cac tcc gat tgg 4056
Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met Cys His Ser Asp Trp
1280 1285 1290
aaa agt ggt gaa tac tgg att gat cca aat cag ggc tgt aat ctc 4101
Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Asn Leu
1295 1300 1305
gat gct atc aaa gtt ttc tgt aac atg gaa aca ggc gaa aca tgc 4146
Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr Cys
1310 1315 1320
gtt tat cct act caa cct tcc gtg gct cag aaa aat tgg tac atc 4191
Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp Tyr Ile
1325 1330 1335
tca aaa aat cct aaa gat aag agg cac gtt tgg ttc ggt gaa agt 4236
Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu Ser
1340 1345 1350
atg act gat gga ttt caa ttt gag tac ggc ggt caa ggt agt gat 4281
Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp
1355 1360 1365
cca gct gat gtg gct att caa ctc aca ttt ttg cgt ctt atg tcc 4326
Pro Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser
1370 1375 1380
aca gag gca tca caa aac atc act tac cac tgc aaa aac agt gtg 4371
Thr Glu Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val
1385 1390 1395
gct tat atg gat caa caa aca gga aac ctt aag aag gct ctt ctt 4416
Ala Tyr Met Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu
1400 1405 1410
ttg aag ggc tca aac gag att gag att aga gca gag ggc aac tca 4461
Leu Lys Gly Ser Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser
1415 1420 1425
agg ttt act tat tca gtt act gtt gat ggc tgc act tca cat act 4506
Arg Phe Thr Tyr Ser Val Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr
1430 1435 1440
ggc gct tgg ggt aaa aca gtt atc gag tat aag act aca aaa aca 4551
Gly Ala Trp Gly Lys Thr Val Ile Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Thr
1445 1450 1455
tca aga ctc cca atc att gat gtt gct cct ctc gat gtt ggc gct 4596
Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala Pro Leu Asp Val Gly Ala
1460 1465 1470
cct gat caa gag ttc ggt ttt gat gtg ggc cca gtt tgt ttc ctc 4641
Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val Gly Pro Val Cys Phe Leu
1475 1480 1485
taa tgagctcgcg gccgcatc 4662
<210> 3
<211> 1489
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 3
Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro
20 25 30
Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Gln
35 40 45
Glu Glu Gly Gln Val Glu Gly Gln Asp Glu Asp Ile Pro Pro Ile Thr
50 55 60
Cys Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro
65 70 75 80
Glu Pro Cys Arg Ile Cys Val Cys Asp Asn Gly Lys Val Leu Cys Asp
85 90 95
Asp Val Ile Cys Asp Glu Thr Lys Asn Cys Pro Gly Ala Glu Val Pro
100 105 110
Glu Gly Glu Cys Cys Pro Val Cys Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Thr
115 120 125
Asp Gln Glu Thr Thr Gly Val Glu Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro
130 135 140
Arg Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Ile Pro
145 150 155 160
Gly Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
165 170 175
Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala Pro Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr
180 185 190
Asp Glu Lys Ser Thr Gly Gly Ile Ser Val Pro Gly Pro Met Gly Pro
195 200 205
Ser Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gln
210 215 220
Gly Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Glu Pro Gly Ala Ser Gly
225 230 235 240
Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asn Gly Asp
245 250 255
Asp Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Arg Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro
260 265 270
Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Thr Ala Gly Leu Pro Gly
275 280 285
Met Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Asp Gly Ala Lys Gly Asp
290 295 300
Ala Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Glu Asn
305 310 315 320
Gly Ala Pro Gly Gln Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly
325 330 335
Arg Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Asn Asp Gly Ala
340 345 350
Thr Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro
355 360 365
Gly Phe Pro Gly Ala Val Gly Ala Lys Gly Glu Ala Gly Pro Gln Gly
370 375 380
Pro Arg Gly Ser Glu Gly Pro Gln Gly Val Arg Gly Glu Pro Gly Pro
385 390 395 400
Pro Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Asn Pro Gly Ala Asp
405 410 415
Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Ile Ala Gly
420 425 430
Ala Pro Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Pro
435 440 445
Gly Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Glu Pro Gly Ala Pro
450 455 460
Gly Ser Lys Gly Asp Thr Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Pro Val Gly
465 470 475 480
Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Glu Gly Lys Arg Gly Ala
485 490 495
Arg Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Glu Arg
500 505 510
Gly Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro Gly Ala Asp Gly Val Ala Gly
515 520 525
Pro Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro
530 535 540
Lys Gly Ser Pro Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly Glu Ala Gly Leu Pro
545 550 555 560
Gly Ala Lys Gly Leu Thr Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Pro Asp Gly
565 570 575
Lys Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln Asp Gly Arg Pro Gly Pro
580 585 590
Pro Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln Ala Gly Val Met Gly Phe Pro
595 600 605
Gly Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Lys Ala Gly Glu Arg Gly
610 615 620
Val Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu
625 630 635 640
Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Glu Arg
645 650 655
Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly
660 665 670
Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Glu Gln Gly Val
675 680 685
Pro Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Arg Gly Glu Arg
690 695 700
Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly
705 710 715 720
Pro Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Asn Asp Gly Ala Lys Gly Asp
725 730 735
Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln
740 745 750
Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly
755 760 765
Asp Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Lys
770 775 780
Asp Gly Val Arg Gly Leu Thr Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala
785 790 795 800
Gly Ala Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ser Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly
805 810 815
Pro Thr Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Asp Arg Gly Glu Pro Gly Pro
820 825 830
Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro
835 840 845
Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly
850 855 860
Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ile Gly Asn
865 870 875 880
Val Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Ala Arg Gly Ser Ala Gly Pro Pro
885 890 895
Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly Arg Val Gly Pro Pro Gly
900 905 910
Pro Ser Gly Asn Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys
915 920 925
Glu Gly Gly Lys Gly Pro Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Arg Pro
930 935 940
Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly
945 950 955 960
Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro
965 970 975
Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg
980 985 990
Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly
995 1000 1005
Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly
1010 1015 1020
Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gly
1025 1030 1035
Arg Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro Gly Arg Asp Gly
1040 1045 1050
Ser Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly
1055 1060 1065
Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val Gly
1070 1075 1080
Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly
1085 1090 1095
Pro Ala Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly
1100 1105 1110
Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly
1115 1120 1125
Asp Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly
1130 1135 1140
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly
1145 1150 1155
Ala Ser Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly
1160 1165 1170
Ala Pro Gly Lys Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly
1175 1180 1185
Pro Pro Gly Pro Arg Gly Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly
1190 1195 1200
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser
1205 1210 1215
Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu Pro Gln Pro Pro Gln Glu Lys
1220 1225 1230
Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr Arg Ala Asp Asp Ala Asn Val
1235 1240 1245
Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr Leu Lys Ser Leu
1250 1255 1260
Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu Gly Ser Arg Lys
1265 1270 1275
Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met Cys His Ser Asp
1280 1285 1290
Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Asn
1295 1300 1305
Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr
1310 1315 1320
Cys Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp Tyr
1325 1330 1335
Ile Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu
1340 1345 1350
Ser Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser
1355 1360 1365
Asp Pro Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met
1370 1375 1380
Ser Thr Glu Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser
1385 1390 1395
Val Ala Tyr Met Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu
1400 1405 1410
Leu Leu Lys Gly Ser Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn
1415 1420 1425
Ser Arg Phe Thr Tyr Ser Val Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser His
1430 1435 1440
Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr Val Ile Glu Tyr Lys Thr Thr Lys
1445 1450 1455
Thr Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala Pro Leu Asp Val Gly
1460 1465 1470
Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val Gly Pro Val Cys Phe
1475 1480 1485
Leu
<210> 4
<211> 4362
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence containing the coding regions of the vacuolar
signal sequence of barley gene for Thiol protease aleurain
precursor fused to the human Collagen alpha 2(I) chain and
flanking regions
<400> 4
gcgatgcatg taatgtcatg agccacatga tccaatggcc acaggaacgt aagaatgtag 60
atagatttga ttttgtccgt tagatagcaa acaacattat aaaaggtgtg tatcaatacg 120
aactaattca ctcattggat tcatagaagt ccattcctcc taagtatcta aaccatggct 180
cacgctcgtg ttctcctcct cgctctcgct gttttggcaa cagctgctgt ggctgtggct 240
tcaagttcta gttttgctga ttccaaccca attcgtccag ttactgatag agcagcttcc 300
actttggctc aattgcttca agaagaaact gtgaggaagg gccctgctgg cgataggggc 360
cctaggggcg aaaggggtcc accaggacct ccaggcaggg atggcgaaga tggtccaact 420
ggccctcctg gacctcctgg ccctccaggg ccacccggct tgggcggaaa cttcgcagct 480
caatacgatg gcaagggtgt tggtcttggt cctggtccta tgggcttgat gggacctaga 540
ggcccacctg gtgctgctgg tgctcctgga ccacagggtt ttcagggacc agctggcgag 600
ccaggagagc caggccaaac aggaccagct ggtgcaaggg gacctgctgg acctcctgga 660
aaagctggtg aagatggtca cccaggcaaa ccaggacgtc ctggcgaaag aggtgttgtt 720
ggaccacaag gcgctagggg atttccaggt acacctggat tgccaggttt taagggcatt 780
cgtggtcata acggcctcga tggattgaag ggacagcctg gcgcacctgg cgttaagggt 840
gaacctggag caccaggtga aaacggtact cctggccaga ctggtgcaag aggactccca 900
ggtgaaaggg gtagagttgg tgctcctgga cctgctggag ctaggggtag tgatggtagt 960
gttggtcctg tgggccctgc tggtccaatc ggttccgctg gcccacctgg attcccaggc 1020
gctccaggac ctaaaggaga aatcggtgct gtgggtaacg caggtcctac tggtccagca 1080
ggtcctcgtg gagaagtggg attgccagga ctttctggtc cagtgggccc tccaggcaac 1140
cctggagcta acggcttgac aggagctaaa ggcgcagcag gactccctgg agtggctggc 1200
gcaccaggat tgcctggtcc aaggggtatc ccaggccctg ttggcgcagc tggagctact 1260
ggtgcacgtg gacttgttgg cgaaccaggc cctgctggat caaaaggcga gtctggaaat 1320
aagggagaac ctggttctgc tggacctcaa ggtcctcctg gaccttctgg agaagaagga 1380
aaaaggggac caaatggcga ggctggatca gcaggtccac caggaccacc tggacttcgt 1440
ggatcccctg gtagtagagg acttccaggc gctgatggta gagcaggcgt tatgggacca 1500
ccaggaagta gaggagcatc cggtccagca ggagttaggg gtcctaacgg agatgctggt 1560
agaccaggtg aaccaggtct tatgggccca aggggcctcc caggtagtcc aggaaatatc 1620
ggccctgctg gaaaagaagg ccctgttgga cttccaggta ttgatggacg tcctggccct 1680
attggcccag caggtgcaag aggagaacct ggcaatattg gatttccagg accaaagggt 1740
ccaacaggcg atcctggaaa aaatggagat aagggtcatg ctggattggc aggcgcaagg 1800
ggcgctcctg gtccagatgg aaacaacggc gcacagggtc cacctggccc tcagggtgtt 1860
caaggcggaa aaggcgaaca aggcccagct ggaccaccag gctttcaagg cttgccagga 1920
ccaagtggtc cagcaggtga agttggcaag ccaggcgagc gtggacttca tggcgagttt 1980
ggactccctg gaccagcagg accaaggggt gaaagaggcc ctcctggaga gagtggcgct 2040
gctggaccaa caggcccaat cggtagtaga ggtcctagtg gacctccagg cccagatgga 2100
aataagggtg aaccaggagt tgtgggcgct gttggaacag ctggtccttc aggaccatca 2160
ggactcccag gcgagagagg cgctgctggc attcctggag gaaaaggtga aaaaggcgaa 2220
cctggcctcc gtggcgaaat cggaaatcct ggacgtgatg gtgctcgtgg tgcacacggc 2280
gctgtgggcg ctccaggccc tgctggtgct actggtgata gaggagaggc tggcgcagct 2340
ggcccagcag gtcctgctgg cccaaggggt agtcctggtg aaagaggcga agttggacct 2400
gctggcccta acggctttgc tggccctgct ggagcagcag gtcaacctgg cgctaaaggt 2460
gaaaggggcg gaaagggccc aaaaggtgaa aatggcgttg tgggaccaac tggtccagtg 2520
ggcgcagctg gacctgctgg tccaaatgga ccaccaggac cagcaggtag tagaggagat 2580
ggtggacctc caggaatgac aggttttcca ggtgctgctg gtagaacagg acctcctggt 2640
cctagtggta tttctggtcc accaggacca ccaggtcctg ctggaaaaga aggattgagg 2700
ggtccacgtg gtgatcaagg accagtgggc agaactggtg aagttggcgc agtgggacca 2760
cctggttttg ctggagaaaa gggcccttct ggagaggcag gaacagctgg tcctcctggt 2820
acacctggac ctcaaggact tttgggtgca cctggtattc tcggattgcc aggaagtagg 2880
ggcgaacgtg gacttcctgg cgtggcagga gcagttggag aacctggccc tctcggaatc 2940
gcaggcccac caggcgcaag aggaccacca ggagctgttg gatcaccagg cgtgaatggt 3000
gcacctggcg aggctggtcg tgatggaaac ccaggaaatg atggcccacc aggaagagat 3060
ggtcaacctg gacacaaagg cgagaggggc tacccaggaa atattggccc agttggtgct 3120
gctggcgcac caggcccaca cggtccagtt ggaccagcag gaaaacacgg taatcgtggc 3180
gaaacaggcc cttcaggccc agtgggacct gctggtgctg ttggcccaag aggaccatct 3240
ggacctcaag gcattagagg cgataaggga gagcctggcg aaaaaggacc tagaggcttg 3300
cctggtttta aaggacacaa cggtctccaa ggacttccag gtatcgctgg tcatcatgga 3360
gatcagggtg ctcctggatc agtgggtcca gcaggtccta gaggcccagc aggcccttcc 3420
ggtccagcag gaaaggatgg acgtactggc caccctggaa ctgtgggccc tgctggaatt 3480
agaggtcctc aaggtcatca gggccctgct ggccctccag gtccaccagg tcctccaggc 3540
ccaccaggag tttcaggtgg tggttacgat tttggttacg atggtgattt ttaccgtgct 3600
gatcaaccta gaagtgctcc ttctctccgt cctaaagatt atgaagttga tgctactttg 3660
aaatcactta acaaccagat tgagactctt ctcacacctg agggatcaag aaagaatcca 3720
gcacgtacat gccgtgatct cagacttagt cacccagagt ggtcaagtgg ctattattgg 3780
attgatccta atcagggttg tacaatggag gctatcaaag tttactgtga ttttccaact 3840
ggagagacat gtattagggc acaacctgag aacattccag ctaaaaattg gtatcgttcc 3900
tctaaagata agaaacatgt ttggctcgga gagactatta acgctggttc tcagttcgag 3960
tataatgttg agggcgttac ttctaaagag atggcaactc agctcgcttt tatgagattg 4020
ctcgctaact acgcatccca aaacatcact tatcactgca aaaattccat tgcatatatg 4080
gatgaggaga caggaaattt gaagaaagca gttattctcc aaggtagtaa cgatgttgag 4140
cttgtggctg agggaaatag tagattcact tacacagttt tggtggatgg atgctcaaag 4200
aaaactaatg agtggggcaa gacaatcatt gagtacaaga caaataagcc ttctaggctc 4260
ccatttctcg atattgcacc tcttgatatc ggaggagctg atcacgagtt ttttgttgat 4320
atcggacctg tttgttttaa gtaatgagct cgcggccgca tc 4362
<210> 5
<211> 4362
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence of the vacuolar signal sequence of barley gene
for Thiol protease aleurain precursor fused to the human Collagen
alpha 2(I) chain and flanking regions
<220>
<221> CDS
<222> (175)..(4344)
<400> 5
gcgatgcatg taatgtcatg agccacatga tccaatggcc acaggaacgt aagaatgtag 60
atagatttga ttttgtccgt tagatagcaa acaacattat aaaaggtgtg tatcaatacg 120
aactaattca ctcattggat tcatagaagt ccattcctcc taagtatcta aacc atg 177
Met
1
gct cac gct cgt gtt ctc ctc ctc gct ctc gct gtt ttg gca aca gct 225
Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr Ala
5 10 15
gct gtg gct gtg gct tca agt tct agt ttt gct gat tcc aac cca att 273
Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro Ile
20 25 30
cgt cca gtt act gat aga gca gct tcc act ttg gct caa ttg ctt caa 321
Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Leu Gln
35 40 45
gaa gaa act gtg agg aag ggc cct gct ggc gat agg ggc cct agg ggc 369
Glu Glu Thr Val Arg Lys Gly Pro Ala Gly Asp Arg Gly Pro Arg Gly
50 55 60 65
gaa agg ggt cca cca gga cct cca ggc agg gat ggc gaa gat ggt cca 417
Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Glu Asp Gly Pro
70 75 80
act ggc cct cct gga cct cct ggc cct cca ggg cca ccc ggc ttg ggc 465
Thr Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly
85 90 95
gga aac ttc gca gct caa tac gat ggc aag ggt gtt ggt ctt ggt cct 513
Gly Asn Phe Ala Ala Gln Tyr Asp Gly Lys Gly Val Gly Leu Gly Pro
100 105 110
ggt cct atg ggc ttg atg gga cct aga ggc cca cct ggt gct gct ggt 561
Gly Pro Met Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ala Ala Gly
115 120 125
gct cct gga cca cag ggt ttt cag gga cca gct ggc gag cca gga gag 609
Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Glu
130 135 140 145
cca ggc caa aca gga cca gct ggt gca agg gga cct gct gga cct cct 657
Pro Gly Gln Thr Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly Pro Pro
150 155 160
gga aaa gct ggt gaa gat ggt cac cca ggc aaa cca gga cgt cct ggc 705
Gly Lys Ala Gly Glu Asp Gly His Pro Gly Lys Pro Gly Arg Pro Gly
165 170 175
gaa aga ggt gtt gtt gga cca caa ggc gct agg gga ttt cca ggt aca 753
Glu Arg Gly Val Val Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Phe Pro Gly Thr
180 185 190
cct gga ttg cca ggt ttt aag ggc att cgt ggt cat aac ggc ctc gat 801
Pro Gly Leu Pro Gly Phe Lys Gly Ile Arg Gly His Asn Gly Leu Asp
195 200 205
gga ttg aag gga cag cct ggc gca cct ggc gtt aag ggt gaa cct gga 849
Gly Leu Lys Gly Gln Pro Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly Glu Pro Gly
210 215 220 225
gca cca ggt gaa aac ggt act cct ggc cag act ggt gca aga gga ctc 897
Ala Pro Gly Glu Asn Gly Thr Pro Gly Gln Thr Gly Ala Arg Gly Leu
230 235 240
cca ggt gaa agg ggt aga gtt ggt gct cct gga cct gct gga gct agg 945
Pro Gly Glu Arg Gly Arg Val Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg
245 250 255
ggt agt gat ggt agt gtt ggt cct gtg ggc cct gct ggt cca atc ggt 993
Gly Ser Asp Gly Ser Val Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Pro Ile Gly
260 265 270
tcc gct ggc cca cct gga ttc cca ggc gct cca gga cct aaa gga gaa 1041
Ser Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly Glu
275 280 285
atc ggt gct gtg ggt aac gca ggt cct act ggt cca gca ggt cct cgt 1089
Ile Gly Ala Val Gly Asn Ala Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Pro Arg
290 295 300 305
gga gaa gtg gga ttg cca gga ctt tct ggt cca gtg ggc cct cca ggc 1137
Gly Glu Val Gly Leu Pro Gly Leu Ser Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly
310 315 320
aac cct gga gct aac ggc ttg aca gga gct aaa ggc gca gca gga ctc 1185
Asn Pro Gly Ala Asn Gly Leu Thr Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Leu
325 330 335
cct gga gtg gct ggc gca cca gga ttg cct ggt cca agg ggt atc cca 1233
Pro Gly Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Pro Gly Pro Arg Gly Ile Pro
340 345 350
ggc cct gtt ggc gca gct gga gct act ggt gca cgt gga ctt gtt ggc 1281
Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Arg Gly Leu Val Gly
355 360 365
gaa cca ggc cct gct gga tca aaa ggc gag tct gga aat aag gga gaa 1329
Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ser Lys Gly Glu Ser Gly Asn Lys Gly Glu
370 375 380 385
cct ggt tct gct gga cct caa ggt cct cct gga cct tct gga gaa gaa 1377
Pro Gly Ser Ala Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Glu Glu
390 395 400
gga aaa agg gga cca aat ggc gag gct gga tca gca ggt cca cca gga 1425
Gly Lys Arg Gly Pro Asn Gly Glu Ala Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly
405 410 415
cca cct gga ctt cgt gga tcc cct ggt agt aga gga ctt cca ggc gct 1473
Pro Pro Gly Leu Arg Gly Ser Pro Gly Ser Arg Gly Leu Pro Gly Ala
420 425 430
gat ggt aga gca ggc gtt atg gga cca cca gga agt aga gga gca tcc 1521
Asp Gly Arg Ala Gly Val Met Gly Pro Pro Gly Ser Arg Gly Ala Ser
435 440 445
ggt cca gca gga gtt agg ggt cct aac gga gat gct ggt aga cca ggt 1569
Gly Pro Ala Gly Val Arg Gly Pro Asn Gly Asp Ala Gly Arg Pro Gly
450 455 460 465
gaa cca ggt ctt atg ggc cca agg ggc ctc cca ggt agt cca gga aat 1617
Glu Pro Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Ser Pro Gly Asn
470 475 480
atc ggc cct gct gga aaa gaa ggc cct gtt gga ctt cca ggt att gat 1665
Ile Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Pro Val Gly Leu Pro Gly Ile Asp
485 490 495
gga cgt cct ggc cct att ggc cca gca ggt gca aga gga gaa cct ggc 1713
Gly Arg Pro Gly Pro Ile Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly
500 505 510
aat att gga ttt cca gga cca aag ggt cca aca ggc gat cct gga aaa 1761
Asn Ile Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Thr Gly Asp Pro Gly Lys
515 520 525
aat gga gat aag ggt cat gct gga ttg gca ggc gca agg ggc gct cct 1809
Asn Gly Asp Lys Gly His Ala Gly Leu Ala Gly Ala Arg Gly Ala Pro
530 535 540 545
ggt cca gat gga aac aac ggc gca cag ggt cca cct ggc cct cag ggt 1857
Gly Pro Asp Gly Asn Asn Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly
550 555 560
gtt caa ggc gga aaa ggc gaa caa ggc cca gct gga cca cca ggc ttt 1905
Val Gln Gly Gly Lys Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe
565 570 575
caa ggc ttg cca gga cca agt ggt cca gca ggt gaa gtt ggc aag cca 1953
Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Glu Val Gly Lys Pro
580 585 590
ggc gag cgt gga ctt cat ggc gag ttt gga ctc cct gga cca gca gga 2001
Gly Glu Arg Gly Leu His Gly Glu Phe Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly
595 600 605
cca agg ggt gaa aga ggc cct cct gga gag agt ggc gct gct gga cca 2049
Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gly Ala Ala Gly Pro
610 615 620 625
aca ggc cca atc ggt agt aga ggt cct agt gga cct cca ggc cca gat 2097
Thr Gly Pro Ile Gly Ser Arg Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro Asp
630 635 640
gga aat aag ggt gaa cca gga gtt gtg ggc gct gtt gga aca gct ggt 2145
Gly Asn Lys Gly Glu Pro Gly Val Val Gly Ala Val Gly Thr Ala Gly
645 650 655
cct tca gga cca tca gga ctc cca ggc gag aga ggc gct gct ggc att 2193
Pro Ser Gly Pro Ser Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile
660 665 670
cct gga gga aaa ggt gaa aaa ggc gaa cct ggc ctc cgt ggc gaa atc 2241
Pro Gly Gly Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Leu Arg Gly Glu Ile
675 680 685
gga aat cct gga cgt gat ggt gct cgt ggt gca cac ggc gct gtg ggc 2289
Gly Asn Pro Gly Arg Asp Gly Ala Arg Gly Ala His Gly Ala Val Gly
690 695 700 705
gct cca ggc cct gct ggt gct act ggt gat aga gga gag gct ggc gca 2337
Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Asp Arg Gly Glu Ala Gly Ala
710 715 720
gct ggc cca gca ggt cct gct ggc cca agg ggt agt cct ggt gaa aga 2385
Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Glu Arg
725 730 735
ggc gaa gtt gga cct gct ggc cct aac ggc ttt gct ggc cct gct gga 2433
Gly Glu Val Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Phe Ala Gly Pro Ala Gly
740 745 750
gca gca ggt caa cct ggc gct aaa ggt gaa agg ggc gga aag ggc cca 2481
Ala Ala Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Arg Gly Gly Lys Gly Pro
755 760 765
aaa ggt gaa aat ggc gtt gtg gga cca act ggt cca gtg ggc gca gct 2529
Lys Gly Glu Asn Gly Val Val Gly Pro Thr Gly Pro Val Gly Ala Ala
770 775 780 785
gga cct gct ggt cca aat gga cca cca gga cca gca ggt agt aga gga 2577
Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg Gly
790 795 800
gat ggt gga cct cca gga atg aca ggt ttt cca ggt gct gct ggt aga 2625
Asp Gly Gly Pro Pro Gly Met Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly Arg
805 810 815
aca gga cct cct ggt cct agt ggt att tct ggt cca cca gga cca cca 2673
Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ile Ser Gly Pro Pro Gly Pro Pro
820 825 830
ggt cct gct gga aaa gaa gga ttg agg ggt cca cgt ggt gat caa gga 2721
Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Leu Arg Gly Pro Arg Gly Asp Gln Gly
835 840 845
cca gtg ggc aga act ggt gaa gtt ggc gca gtg gga cca cct ggt ttt 2769
Pro Val Gly Arg Thr Gly Glu Val Gly Ala Val Gly Pro Pro Gly Phe
850 855 860 865
gct gga gaa aag ggc cct tct gga gag gca gga aca gct ggt cct cct 2817
Ala Gly Glu Lys Gly Pro Ser Gly Glu Ala Gly Thr Ala Gly Pro Pro
870 875 880
ggt aca cct gga cct caa gga ctt ttg ggt gca cct ggt att ctc gga 2865
Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly
885 890 895
ttg cca gga agt agg ggc gaa cgt gga ctt cct ggc gtg gca gga gca 2913
Leu Pro Gly Ser Arg Gly Glu Arg Gly Leu Pro Gly Val Ala Gly Ala
900 905 910
gtt gga gaa cct ggc cct ctc gga atc gca ggc cca cca ggc gca aga 2961
Val Gly Glu Pro Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Pro Pro Gly Ala Arg
915 920 925
gga cca cca gga gct gtt gga tca cca ggc gtg aat ggt gca cct ggc 3009
Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Ser Pro Gly Val Asn Gly Ala Pro Gly
930 935 940 945
gag gct ggt cgt gat gga aac cca gga aat gat ggc cca cca gga aga 3057
Glu Ala Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Asn Asp Gly Pro Pro Gly Arg
950 955 960
gat ggt caa cct gga cac aaa ggc gag agg ggc tac cca gga aat att 3105
Asp Gly Gln Pro Gly His Lys Gly Glu Arg Gly Tyr Pro Gly Asn Ile
965 970 975
ggc cca gtt ggt gct gct ggc gca cca ggc cca cac ggt cca gtt gga 3153
Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Pro Gly Pro His Gly Pro Val Gly
980 985 990
cca gca gga aaa cac ggt aat cgt ggc gaa aca ggc cct tca ggc cca 3201
Pro Ala Gly Lys His Gly Asn Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ser Gly Pro
995 1000 1005
gtg gga cct gct ggt gct gtt ggc cca aga gga cca tct gga cct 3246
Val Gly Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Arg Gly Pro Ser Gly Pro
1010 1015 1020
caa ggc att aga ggc gat aag gga gag cct ggc gaa aaa gga cct 3291
Gln Gly Ile Arg Gly Asp Lys Gly Glu Pro Gly Glu Lys Gly Pro
1025 1030 1035
aga ggc ttg cct ggt ttt aaa gga cac aac ggt ctc caa gga ctt 3336
Arg Gly Leu Pro Gly Phe Lys Gly His Asn Gly Leu Gln Gly Leu
1040 1045 1050
cca ggt atc gct ggt cat cat gga gat cag ggt gct cct gga tca 3381
Pro Gly Ile Ala Gly His His Gly Asp Gln Gly Ala Pro Gly Ser
1055 1060 1065
gtg ggt cca gca ggt cct aga ggc cca gca ggc cct tcc ggt cca 3426
Val Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro Ser Gly Pro
1070 1075 1080
gca gga aag gat gga cgt act ggc cac cct gga act gtg ggc cct 3471
Ala Gly Lys Asp Gly Arg Thr Gly His Pro Gly Thr Val Gly Pro
1085 1090 1095
gct gga att aga ggt cct caa ggt cat cag ggc cct gct ggc cct 3516
Ala Gly Ile Arg Gly Pro Gln Gly His Gln Gly Pro Ala Gly Pro
1100 1105 1110
cca ggt cca cca ggt cct cca ggc cca cca gga gtt tca ggt ggt 3561
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Val Ser Gly Gly
1115 1120 1125
ggt tac gat ttt ggt tac gat ggt gat ttt tac cgt gct gat caa 3606
Gly Tyr Asp Phe Gly Tyr Asp Gly Asp Phe Tyr Arg Ala Asp Gln
1130 1135 1140
cct aga agt gct cct tct ctc cgt cct aaa gat tat gaa gtt gat 3651
Pro Arg Ser Ala Pro Ser Leu Arg Pro Lys Asp Tyr Glu Val Asp
1145 1150 1155
gct act ttg aaa tca ctt aac aac cag att gag act ctt ctc aca 3696
Ala Thr Leu Lys Ser Leu Asn Asn Gln Ile Glu Thr Leu Leu Thr
1160 1165 1170
cct gag gga tca aga aag aat cca gca cgt aca tgc cgt gat ctc 3741
Pro Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu
1175 1180 1185
aga ctt agt cac cca gag tgg tca agt ggc tat tat tgg att gat 3786
Arg Leu Ser His Pro Glu Trp Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Ile Asp
1190 1195 1200
cct aat cag ggt tgt aca atg gag gct atc aaa gtt tac tgt gat 3831
Pro Asn Gln Gly Cys Thr Met Glu Ala Ile Lys Val Tyr Cys Asp
1205 1210 1215
ttt cca act gga gag aca tgt att agg gca caa cct gag aac att 3876
Phe Pro Thr Gly Glu Thr Cys Ile Arg Ala Gln Pro Glu Asn Ile
1220 1225 1230
cca gct aaa aat tgg tat cgt tcc tct aaa gat aag aaa cat gtt 3921
Pro Ala Lys Asn Trp Tyr Arg Ser Ser Lys Asp Lys Lys His Val
1235 1240 1245
tgg ctc gga gag act att aac gct ggt tct cag ttc gag tat aat 3966
Trp Leu Gly Glu Thr Ile Asn Ala Gly Ser Gln Phe Glu Tyr Asn
1250 1255 1260
gtt gag ggc gtt act tct aaa gag atg gca act cag ctc gct ttt 4011
Val Glu Gly Val Thr Ser Lys Glu Met Ala Thr Gln Leu Ala Phe
1265 1270 1275
atg aga ttg ctc gct aac tac gca tcc caa aac atc act tat cac 4056
Met Arg Leu Leu Ala Asn Tyr Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His
1280 1285 1290
tgc aaa aat tcc att gca tat atg gat gag gag aca gga aat ttg 4101
Cys Lys Asn Ser Ile Ala Tyr Met Asp Glu Glu Thr Gly Asn Leu
1295 1300 1305
aag aaa gca gtt att ctc caa ggt agt aac gat gtt gag ctt gtg 4146
Lys Lys Ala Val Ile Leu Gln Gly Ser Asn Asp Val Glu Leu Val
1310 1315 1320
gct gag gga aat agt aga ttc act tac aca gtt ttg gtg gat gga 4191
Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Thr Val Leu Val Asp Gly
1325 1330 1335
tgc tca aag aaa act aat gag tgg ggc aag aca atc att gag tac 4236
Cys Ser Lys Lys Thr Asn Glu Trp Gly Lys Thr Ile Ile Glu Tyr
1340 1345 1350
aag aca aat aag cct tct agg ctc cca ttt ctc gat att gca cct 4281
Lys Thr Asn Lys Pro Ser Arg Leu Pro Phe Leu Asp Ile Ala Pro
1355 1360 1365
ctt gat atc gga gga gct gat cac gag ttt ttt gtt gat atc gga 4326
Leu Asp Ile Gly Gly Ala Asp His Glu Phe Phe Val Asp Ile Gly
1370 1375 1380
cct gtt tgt ttt aag taa tgagctcgcg gccgcatc 4362
Pro Val Cys Phe Lys
1385
<210> 6
<211> 1389
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 6
Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro
20 25 30
Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Leu
35 40 45
Gln Glu Glu Thr Val Arg Lys Gly Pro Ala Gly Asp Arg Gly Pro Arg
50 55 60
Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Glu Asp Gly
65 70 75 80
Pro Thr Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu
85 90 95
Gly Gly Asn Phe Ala Ala Gln Tyr Asp Gly Lys Gly Val Gly Leu Gly
100 105 110
Pro Gly Pro Met Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ala Ala
115 120 125
Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly
130 135 140
Glu Pro Gly Gln Thr Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly Pro
145 150 155 160
Pro Gly Lys Ala Gly Glu Asp Gly His Pro Gly Lys Pro Gly Arg Pro
165 170 175
Gly Glu Arg Gly Val Val Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Phe Pro Gly
180 185 190
Thr Pro Gly Leu Pro Gly Phe Lys Gly Ile Arg Gly His Asn Gly Leu
195 200 205
Asp Gly Leu Lys Gly Gln Pro Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly Glu Pro
210 215 220
Gly Ala Pro Gly Glu Asn Gly Thr Pro Gly Gln Thr Gly Ala Arg Gly
225 230 235 240
Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg Val Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala
245 250 255
Arg Gly Ser Asp Gly Ser Val Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Pro Ile
260 265 270
Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly
275 280 285
Glu Ile Gly Ala Val Gly Asn Ala Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Pro
290 295 300
Arg Gly Glu Val Gly Leu Pro Gly Leu Ser Gly Pro Val Gly Pro Pro
305 310 315 320
Gly Asn Pro Gly Ala Asn Gly Leu Thr Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly
325 330 335
Leu Pro Gly Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Pro Gly Pro Arg Gly Ile
340 345 350
Pro Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Arg Gly Leu Val
355 360 365
Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ser Lys Gly Glu Ser Gly Asn Lys Gly
370 375 380
Glu Pro Gly Ser Ala Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Glu
385 390 395 400
Glu Gly Lys Arg Gly Pro Asn Gly Glu Ala Gly Ser Ala Gly Pro Pro
405 410 415
Gly Pro Pro Gly Leu Arg Gly Ser Pro Gly Ser Arg Gly Leu Pro Gly
420 425 430
Ala Asp Gly Arg Ala Gly Val Met Gly Pro Pro Gly Ser Arg Gly Ala
435 440 445
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450 455 460
Gly Glu Pro Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Ser Pro Gly
465 470 475 480
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Gly Val Gln Gly Gly Lys Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly
565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Asp Gly Asn Lys Gly Glu Pro Gly Val Val Gly Ala Val Gly Thr Ala
645 650 655
Gly Pro Ser Gly Pro Ser Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly
660 665 670
Ile Pro Gly Gly Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Leu Arg Gly Glu
675 680 685
Ile Gly Asn Pro Gly Arg Asp Gly Ala Arg Gly Ala His Gly Ala Val
690 695 700
Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Asp Arg Gly Glu Ala Gly
705 710 715 720
Ala Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Glu
725 730 735
Arg Gly Glu Val Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Phe Ala Gly Pro Ala
740 745 750
Gly Ala Ala Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Arg Gly Gly Lys Gly
755 760 765
Pro Lys Gly Glu Asn Gly Val Val Gly Pro Thr Gly Pro Val Gly Ala
770 775 780
Ala Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg
785 790 795 800
Gly Asp Gly Gly Pro Pro Gly Met Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly
805 810 815
Arg Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ile Ser Gly Pro Pro Gly Pro
820 825 830
Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Leu Arg Gly Pro Arg Gly Asp Gln
835 840 845
Gly Pro Val Gly Arg Thr Gly Glu Val Gly Ala Val Gly Pro Pro Gly
850 855 860
Phe Ala Gly Glu Lys Gly Pro Ser Gly Glu Ala Gly Thr Ala Gly Pro
865 870 875 880
Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala Pro Gly Ile Leu
885 890 895
Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Glu Arg Gly Leu Pro Gly Val Ala Gly
900 905 910
Ala Val Gly Glu Pro Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Pro Pro Gly Ala
915 920 925
Arg Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Ser Pro Gly Val Asn Gly Ala Pro
930 935 940
Gly Glu Ala Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Asn Asp Gly Pro Pro Gly
945 950 955 960
Arg Asp Gly Gln Pro Gly His Lys Gly Glu Arg Gly Tyr Pro Gly Asn
965 970 975
Ile Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Pro Gly Pro His Gly Pro Val
980 985 990
Gly Pro Ala Gly Lys His Gly Asn Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ser Gly
995 1000 1005
Pro Val Gly Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Arg Gly Pro Ser Gly
1010 1015 1020
Pro Gln Gly Ile Arg Gly Asp Lys Gly Glu Pro Gly Glu Lys Gly
1025 1030 1035
Pro Arg Gly Leu Pro Gly Phe Lys Gly His Asn Gly Leu Gln Gly
1040 1045 1050
Leu Pro Gly Ile Ala Gly His His Gly Asp Gln Gly Ala Pro Gly
1055 1060 1065
Ser Val Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro Ser Gly
1070 1075 1080
Pro Ala Gly Lys Asp Gly Arg Thr Gly His Pro Gly Thr Val Gly
1085 1090 1095
Pro Ala Gly Ile Arg Gly Pro Gln Gly His Gln Gly Pro Ala Gly
1100 1105 1110
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Val Ser Gly
1115 1120 1125
Gly Gly Tyr Asp Phe Gly Tyr Asp Gly Asp Phe Tyr Arg Ala Asp
1130 1135 1140
Gln Pro Arg Ser Ala Pro Ser Leu Arg Pro Lys Asp Tyr Glu Val
1145 1150 1155
Asp Ala Thr Leu Lys Ser Leu Asn Asn Gln Ile Glu Thr Leu Leu
1160 1165 1170
Thr Pro Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp
1175 1180 1185
Leu Arg Leu Ser His Pro Glu Trp Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Ile
1190 1195 1200
Asp Pro Asn Gln Gly Cys Thr Met Glu Ala Ile Lys Val Tyr Cys
1205 1210 1215
Asp Phe Pro Thr Gly Glu Thr Cys Ile Arg Ala Gln Pro Glu Asn
1220 1225 1230
Ile Pro Ala Lys Asn Trp Tyr Arg Ser Ser Lys Asp Lys Lys His
1235 1240 1245
Val Trp Leu Gly Glu Thr Ile Asn Ala Gly Ser Gln Phe Glu Tyr
1250 1255 1260
Asn Val Glu Gly Val Thr Ser Lys Glu Met Ala Thr Gln Leu Ala
1265 1270 1275
Phe Met Arg Leu Leu Ala Asn Tyr Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr
1280 1285 1290
His Cys Lys Asn Ser Ile Ala Tyr Met Asp Glu Glu Thr Gly Asn
1295 1300 1305
Leu Lys Lys Ala Val Ile Leu Gln Gly Ser Asn Asp Val Glu Leu
1310 1315 1320
Val Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Thr Val Leu Val Asp
1325 1330 1335
Gly Cys Ser Lys Lys Thr Asn Glu Trp Gly Lys Thr Ile Ile Glu
1340 1345 1350
Tyr Lys Thr Asn Lys Pro Ser Arg Leu Pro Phe Leu Asp Ile Ala
1355 1360 1365
Pro Leu Asp Ile Gly Gly Ala Asp His Glu Phe Phe Val Asp Ile
1370 1375 1380
Gly Pro Val Cys Phe Lys
1385
<210> 7
<211> 127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence containing the coding region of the appoplast
signal of Arabidopsis thaliana endo-1,4-beta-glucanase and
flanking regions
<400> 7
gccatggcta ggaagtcttt gattttccca gtgattcttc ttgctgtgct tcttttctct 60
ccacctattt actctgctgg acacgattat agggatgctc ttaggaagtc atctatggct 120
caattgc 127
<210> 8
<211> 127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence of the appoplast signal of Arabidopsis
thaliana endo-1,4-beta-glucanase and flanking regions
<220>
<221> CDS
<222> (10)..(120)
<400> 8
gccatggct agg aag tct ttg att ttc cca gtg att ctt ctt gct gtg ctt 51
Arg Lys Ser Leu Ile Phe Pro Val Ile Leu Leu Ala Val Leu
1 5 10
ctt ttc tct cca cct att tac tct gct gga cac gat tat agg gat gct 99
Leu Phe Ser Pro Pro Ile Tyr Ser Ala Gly His Asp Tyr Arg Asp Ala
15 20 25 30
ctt agg aag tca tct atg gct caattgc 127
Leu Arg Lys Ser Ser Met Ala
35
<210> 9
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 9
Arg Lys Ser Leu Ile Phe Pro Val Ile Leu Leu Ala Val Leu Leu Phe
1 5 10 15
Ser Pro Pro Ile Tyr Ser Ala Gly His Asp Tyr Arg Asp Ala Leu Arg
20 25 30
Lys Ser Ser Met Ala
35
<210> 10
<211> 1037
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chrysanthemum rbcS1 promoter and 5' UTR
<400> 10
aaatggcgcg ccaagcttag acaaacaccc cttgttatac aaagaatttc gctttacaaa 60
atcaaattcg agaaaataat atatgcacta aataagatca ttcggatcca atctaaccaa 120
ttacgatacg ctttgggtac acttgatttt tgtttcagta gttacatata tcttgtttta 180
tatgctatct ttaaggatct tcactcaaag actatttgtt gatgttcttg atggggctcg 240
gaagatttga tatgatacac tctaatcttt aggagatacc agccaggatt atattcagta 300
agacaatcaa attttacgtg ttcaaactcg ttatcttttc atttaatgga tgagccagaa 360
tctctataga atgattgcaa tcgagaatat gttcggccga tatccctttg ttggcttcaa 420
tattctacat atcacacaag aatcgaccgt attgtaccct ctttccataa aggaacacac 480
agtatgcaga tgcttttttc ccacatgcag taacataggt attcaaaaat ggctaaaaga 540
agttggataa caaattgaca actatttcca tttctgttat ataaatttca caacacacaa 600
aagcccgtaa tcaagagtct gcccatgtac gaaataactt ctattatttg gtattgggcc 660
taagcccagc tcagagtacg tgggggtacc acatatagga aggtaacaaa atactgcaag 720
atagccccat aacgtaccag cctctcctta ccacgaagag ataagatata agacccaccc 780
tgccacgtgt cacatcgtca tggtggttaa tgataaggga ttacatcctt ctatgtttgt 840
ggacatgatg catgtaatgt catgagccac atgatccaat ggccacagga acgtaagaat 900
gtagatagat ttgattttgt ccgttagata gcaaacaaca ttataaaagg tgtgtatcaa 960
tacgaactaa ttcactcatt ggattcatag aagtccattc ctcctaagta tctaaacata 1020
tgcaattgtc gactaaa 1037
<210> 11
<211> 975
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chrysanthemum rbcS1 3'UTR and terminator
<400> 11
aaaaggatcc gcggccgcat aagttttact atttaccaag acttttgaat attaaccttc 60
ttgtaacgag tcggttaaat ttgattgttt agggttttgt attatttttt tttggtcttt 120
taattcatca ctttaattcc ctaattgtct gttcatttcg ttgtttgttt ccggatcgat 180
aatgaaatgt aagagatatc atatataaat aataaattgt cgtttcatat ttgcaatctt 240
tttttacaaa cctttaatta attgtatgta tgacattttc ttcttgttat attaggggga 300
aataatgtta aataaaagta caaaataaac tacagtacat cgtactgaat aaattaccta 360
gccaaaaagt acacctttcc atatacttcc tacatgaagg cattttcaac attttcaaat 420
aaggaatgct acaaccgcat aataacatcc acaaattttt ttataaaata acatgtcaga 480
cagtgattga aagattttat tatagtttcg ttatcttctt ttctcattaa gcgaatcact 540
acctaacacg tcattttgtg aaatattttt tgaatgtttt tatatagttg tagcattcct 600
cttttcaaat tagggtttgt ttgagatagc atttcagccg gttcatacaa cttaaaagca 660
tactctaatg ctggaaaaaa gactaaaaaa tcttgtaagt tagcgcagaa tattgaccca 720
aattatatac acacatgacc ccatatagag actaattaca cttttaacca ctaataatta 780
ttactgtatt ataacatcta ctaattaaac ttgtgagttt ttgctagaat tattatcata 840
tatactaaaa ggcaggaacg caaacattgc cccggtactg tagcaactac ggtagacgca 900
ttaattgtct atagtggacg cattaattaa ccaaaaccgc ctctttcccc ttcttcttga 960
agcttgagct ctttt 975
<210> 12
<211> 1633
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence containing the coding regions of the vacuolar
signal sequence of barley gene for Thiol protease aleurain
precursor fused to the human Prolyl 4-hydroxylase beta subunit
and flanking regions
<400> 12
ctcgagtaaa ccatggctca tgctagggtt ttgcttttgg ctcttgctgt tcttgctact 60
gctgctgttg ctgtggcttc ttcttcatct ttcgctgatt ctaacccaat taggccagtg 120
actgatagag ctgcttctac tcttgctcaa ttggtcgaca tggatgctcc agaagaggag 180
gatcacgttc ttgtgcttag gaagtctaac ttcgctgaag ctcttgctgc tcacaagtac 240
cttcttgtgg agttttatgc tccttggtgc ggacattgca aagctcttgc tccagagtat 300
gctaaggctg ctggaaagtt gaaggctgag ggatctgaaa ttaggcttgc taaagtggat 360
gctactgagg agtctgatct tgctcaacag tacggagtta ggggataccc aactattaag 420
ttcttcagga acggagatac tgcttctcca aaggagtata ctgctggaag ggaggctgat 480
gatattgtga actggcttaa gaagagaact ggaccagctg ctactactct tccagatgga 540
gctgctgctg aatctcttgt ggagtcatct gaggtggcag tgattggatt cttcaaggat 600
gtggagtctg attctgctaa gcagttcctt caagctgctg aggctattga tgatattcca 660
ttcggaatta cttctaactc tgatgtgttc tctaagtacc agcttgataa ggatggagtg 720
gtgcttttca agaaattcga tgagggaagg aacaatttcg agggagaggt gacaaaggag 780
aaccttcttg atttcattaa gcacaaccag cttccacttg tgattgagtt cactgagcag 840
actgctccaa agattttcgg aggagagatt aagactcaca ttcttctttt ccttccaaag 900
tctgtgtctg attacgatgg aaagttgtct aacttcaaga ctgctgctga gtctttcaag 960
ggaaagattc ttttcatttt cattgattct gatcacactg ataaccagag gattcttgag 1020
ttcttcggac ttaagaagga agagtgccca gctgttaggc ttattactct tgaggaggag 1080
atgactaagt acaagccaga gtctgaagaa cttactgctg agaggattac tgagttctgc 1140
cacagattcc ttgagggaaa gattaagcca caccttatgt ctcaagagct tccagaggat 1200
tgggataagc agccagttaa ggtgttggtg ggtaaaaact tcgaggatgt ggctttcgat 1260
gagaagaaga acgtgttcgt ggagttctac gcaccttggt gtggtcactg taagcagctt 1320
gctccaattt gggataagtt gggagagact tacaaggatc acgagaacat tgtgattgct 1380
aagatggatt ctactgctaa cgaggtggag gctgttaagg ttcactcttt cccaactttg 1440
aagttcttcc cagcttctgc tgataggact gtgattgatt acaacggaga aaggactctt 1500
gatggattca agaagttcct tgagtctgga ggacaagatg gagctggaga tgatgatgat 1560
cttgaggatt tggaagaagc tgaggagcca gatatggagg aggatgatga tcagaaggct 1620
gtgtgatgag ctc 1633
<210> 13
<211> 537
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence containing the vacuolar signal sequence of
barley gene for Thiol protease aleurain precursor fused to the
human Prolyl 4-hydroxylase beta subunit and flanking regions
<400> 13
Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro
20 25 30
Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Val
35 40 45
Asp Met Asp Ala Pro Glu Glu Glu Asp His Val Leu Val Leu Arg Lys
50 55 60
Ser Asn Phe Ala Glu Ala Leu Ala Ala His Lys Tyr Leu Leu Val Glu
65 70 75 80
Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Glu Tyr
85 90 95
Ala Lys Ala Ala Gly Lys Leu Lys Ala Glu Gly Ser Glu Ile Arg Leu
100 105 110
Ala Lys Val Asp Ala Thr Glu Glu Ser Asp Leu Ala Gln Gln Tyr Gly
115 120 125
Val Arg Gly Tyr Pro Thr Ile Lys Phe Phe Arg Asn Gly Asp Thr Ala
130 135 140
Ser Pro Lys Glu Tyr Thr Ala Gly Arg Glu Ala Asp Asp Ile Val Asn
145 150 155 160
Trp Leu Lys Lys Arg Thr Gly Pro Ala Ala Thr Thr Leu Pro Asp Gly
165 170 175
Ala Ala Ala Glu Ser Leu Val Glu Ser Ser Glu Val Ala Val Ile Gly
180 185 190
Phe Phe Lys Asp Val Glu Ser Asp Ser Ala Lys Gln Phe Leu Gln Ala
195 200 205
Ala Glu Ala Ile Asp Asp Ile Pro Phe Gly Ile Thr Ser Asn Ser Asp
210 215 220
Val Phe Ser Lys Tyr Gln Leu Asp Lys Asp Gly Val Val Leu Phe Lys
225 230 235 240
Lys Phe Asp Glu Gly Arg Asn Asn Phe Glu Gly Glu Val Thr Lys Glu
245 250 255
Asn Leu Leu Asp Phe Ile Lys His Asn Gln Leu Pro Leu Val Ile Glu
260 265 270
Phe Thr Glu Gln Thr Ala Pro Lys Ile Phe Gly Gly Glu Ile Lys Thr
275 280 285
His Ile Leu Leu Phe Leu Pro Lys Ser Val Ser Asp Tyr Asp Gly Lys
290 295 300
Leu Ser Asn Phe Lys Thr Ala Ala Glu Ser Phe Lys Gly Lys Ile Leu
305 310 315 320
Phe Ile Phe Ile Asp Ser Asp His Thr Asp Asn Gln Arg Ile Leu Glu
325 330 335
Phe Phe Gly Leu Lys Lys Glu Glu Cys Pro Ala Val Arg Leu Ile Thr
340 345 350
Leu Glu Glu Glu Met Thr Lys Tyr Lys Pro Glu Ser Glu Glu Leu Thr
355 360 365
Ala Glu Arg Ile Thr Glu Phe Cys His Arg Phe Leu Glu Gly Lys Ile
370 375 380
Lys Pro His Leu Met Ser Gln Glu Leu Pro Glu Asp Trp Asp Lys Gln
385 390 395 400
Pro Val Lys Val Leu Val Gly Lys Asn Phe Glu Asp Val Ala Phe Asp
405 410 415
Glu Lys Lys Asn Val Phe Val Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His
420 425 430
Cys Lys Gln Leu Ala Pro Ile Trp Asp Lys Leu Gly Glu Thr Tyr Lys
435 440 445
Asp His Glu Asn Ile Val Ile Ala Lys Met Asp Ser Thr Ala Asn Glu
450 455 460
Val Glu Ala Val Lys Val His Ser Phe Pro Thr Leu Lys Phe Phe Pro
465 470 475 480
Ala Ser Ala Asp Arg Thr Val Ile Asp Tyr Asn Gly Glu Arg Thr Leu
485 490 495
Asp Gly Phe Lys Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gln Asp Gly Ala Gly
500 505 510
Asp Asp Asp Asp Leu Glu Asp Leu Glu Glu Ala Glu Glu Pro Asp Met
515 520 525
Glu Glu Asp Asp Asp Gln Lys Ala Val
530 535
<210> 14
<211> 1723
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence containing the coding regions of the vacuolar
signal sequence of barley gene for Thiol protease aleurain
precursor fused to the human Prolyl 4-hydroxylase alpha-1 subunit
and flanking regions
<400> 14
ctcgagtaaa ccatggctca tgctagggtt ttgcttttgg ctcttgctgt tcttgctact 60
gctgctgttg ctgtggcttc ttcttcatct ttcgctgatt ctaacccaat taggccagtg 120
actgatagag ctgcttctac tcttgctcaa ttggtcgaca tgcacccagg attcttcact 180
tctattggac agatgactga tcttattcac actgagaagg atcttgtgac ttctcttaag 240
gattacatta aggctgagga ggataagttg gagcagatta agaagtgggc tgagaagttg 300
gataggctta cttctactgc tacaaaagat ccagagggat tcgttggtca tccagtgaac 360
gctttcaagt tgatgaagag gcttaacact gagtggagtg agcttgagaa ccttgtgctt 420
aaggatatgt ctgatggatt catttctaac cttactattc agaggcagta cttcccaaat 480
gatgaggatc aagtgggagc tgctaaggct cttcttaggc ttcaggatac ttacaacctt 540
gatactgata caatttctaa gggaaacctt ccaggagtta agcacaagtc tttccttact 600
gctgaggatt gcttcgagct tggaaaggtt gcatacactg aggctgatta ctaccacact 660
gagctttgga tggaacaagc tcttaggcaa cttgatgagg gagagatttc tactattgat 720
aaggtgtcag tgcttgatta cctttcttac gctgtgtacc agcagggtga tcttgataag 780
gctcttttgc ttactaagaa gttgcttgag cttgatccag aacatcagag ggctaacgga 840
aaccttaagt acttcgagta cattatggct aaggaaaagg atgtgaacaa gtctgcttct 900
gatgatcagt ctgatcaaaa gactactcca aagaagaagg gagtggctgt tgattatctt 960
cctgagaggc agaagtatga gatgttgtgt aggggagagg gtattaagat gactccaagg 1020
aggcagaaga agttgttctg caggtatcac gatggaaaca ggaacccaaa gttcattctt 1080
gctccagcta agcaagaaga tgagtgggat aagccaagga ttattaggtt ccacgatatt 1140
atttctgatg ctgagattga gattgtgaag gatcttgcta agccaagact taggagggct 1200
actatttcta accctattac tggtgatctt gagactgtgc actacaggat ttctaagtct 1260
gcttggcttt ctggatacga gaacccagtg gtgtctagga ttaacatgag gattcaggat 1320
cttactggac ttgatgtgtc tactgctgag gagcttcaag ttgctaacta cggagttgga 1380
ggacaatatg agccacactt cgatttcgct aggaaggatg agccagatgc ttttaaggag 1440
cttggaactg gaaacaggat tgctacttgg cttttctaca tgtctgatgt ttctgctgga 1500
ggagctactg ttttcccaga agtgggagct tctgtttggc caaagaaggg aactgctgtg 1560
ttctggtaca accttttcgc ttctggagag ggagattact ctactaggca tgctgcttgc 1620
ccagttcttg ttggaaacaa gtgggtgtca aacaagtggc ttcatgagag gggacaagag 1680
tttagaaggc catgcactct ttctgagctt gagtgatgag ctc 1723
<210> 15
<211> 567
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence containing the vacuolar signal sequence of
barley gene for Thiol protease aleurain precursor fused to the
human Prolyl 4-hydroxylase alpha-1 subunit and flanking regions
<400> 15
Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro
20 25 30
Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Val
35 40 45
Asp Met His Pro Gly Phe Phe Thr Ser Ile Gly Gln Met Thr Asp Leu
50 55 60
Ile His Thr Glu Lys Asp Leu Val Thr Ser Leu Lys Asp Tyr Ile Lys
65 70 75 80
Ala Glu Glu Asp Lys Leu Glu Gln Ile Lys Lys Trp Ala Glu Lys Leu
85 90 95
Asp Arg Leu Thr Ser Thr Ala Thr Lys Asp Pro Glu Gly Phe Val Gly
100 105 110
His Pro Val Asn Ala Phe Lys Leu Met Lys Arg Leu Asn Thr Glu Trp
115 120 125
Ser Glu Leu Glu Asn Leu Val Leu Lys Asp Met Ser Asp Gly Phe Ile
130 135 140
Ser Asn Leu Thr Ile Gln Arg Gln Tyr Phe Pro Asn Asp Glu Asp Gln
145 150 155 160
Val Gly Ala Ala Lys Ala Leu Leu Arg Leu Gln Asp Thr Tyr Asn Leu
165 170 175
Asp Thr Asp Thr Ile Ser Lys Gly Asn Leu Pro Gly Val Lys His Lys
180 185 190
Ser Phe Leu Thr Ala Glu Asp Cys Phe Glu Leu Gly Lys Val Ala Tyr
195 200 205
Thr Glu Ala Asp Tyr Tyr His Thr Glu Leu Trp Met Glu Gln Ala Leu
210 215 220
Arg Gln Leu Asp Glu Gly Glu Ile Ser Thr Ile Asp Lys Val Ser Val
225 230 235 240
Leu Asp Tyr Leu Ser Tyr Ala Val Tyr Gln Gln Gly Asp Leu Asp Lys
245 250 255
Ala Leu Leu Leu Thr Lys Lys Leu Leu Glu Leu Asp Pro Glu His Gln
260 265 270
Arg Ala Asn Gly Asn Leu Lys Tyr Phe Glu Tyr Ile Met Ala Lys Glu
275 280 285
Lys Asp Val Asn Lys Ser Ala Ser Asp Asp Gln Ser Asp Gln Lys Thr
290 295 300
Thr Pro Lys Lys Lys Gly Val Ala Val Asp Tyr Leu Pro Glu Arg Gln
305 310 315 320
Lys Tyr Glu Met Leu Cys Arg Gly Glu Gly Ile Lys Met Thr Pro Arg
325 330 335
Arg Gln Lys Lys Leu Phe Cys Arg Tyr His Asp Gly Asn Arg Asn Pro
340 345 350
Lys Phe Ile Leu Ala Pro Ala Lys Gln Glu Asp Glu Trp Asp Lys Pro
355 360 365
Arg Ile Ile Arg Phe His Asp Ile Ile Ser Asp Ala Glu Ile Glu Ile
370 375 380
Val Lys Asp Leu Ala Lys Pro Arg Leu Arg Arg Ala Thr Ile Ser Asn
385 390 395 400
Pro Ile Thr Gly Asp Leu Glu Thr Val His Tyr Arg Ile Ser Lys Ser
405 410 415
Ala Trp Leu Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Val Val Ser Arg Ile Asn Met
420 425 430
Arg Ile Gln Asp Leu Thr Gly Leu Asp Val Ser Thr Ala Glu Glu Leu
435 440 445
Gln Val Ala Asn Tyr Gly Val Gly Gly Gln Tyr Glu Pro His Phe Asp
450 455 460
Phe Ala Arg Lys Asp Glu Pro Asp Ala Phe Lys Glu Leu Gly Thr Gly
465 470 475 480
Asn Arg Ile Ala Thr Trp Leu Phe Tyr Met Ser Asp Val Ser Ala Gly
485 490 495
Gly Ala Thr Val Phe Pro Glu Val Gly Ala Ser Val Trp Pro Lys Lys
500 505 510
Gly Thr Ala Val Phe Trp Tyr Asn Leu Phe Ala Ser Gly Glu Gly Asp
515 520 525
Tyr Ser Thr Arg His Ala Ala Cys Pro Val Leu Val Gly Asn Lys Trp
530 535 540
Val Ser Asn Lys Trp Leu His Glu Arg Gly Gln Glu Phe Arg Arg Pro
545 550 555 560
Cys Thr Leu Ser Glu Leu Glu
565
<210> 16
<211> 928
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence containing the coding regions of the vacuolar
signal sequence of barley gene for Thiol protease aleurain
precursor fused to the plant Prolyl 4-hydroxylase Plant and
flanking regions
<400> 16
ctcgagtaaa ccatggctca tgctagggtt ttgcttttgg ctcttgctgt tcttgctact 60
gctgctgttg ctgtggcttc ttcttcatct ttcgctgatt ctaacccaat taggccagtg 120
actgatagag ctgcttctac tcttgctcaa ttggtcgaca tgcttggtat tctttctctt 180
ccaaacgcta acaggaactc ttctaagact aacgatctta ctaacattgt gaggaagtct 240
gagacttctt ctggagatga ggagggaaat ggagaaagat gggtggaagt gatttcttgg 300
gagccaaggg ctgttgttta ccacaacttc cttactaatg aggagtgcga gcaccttatt 360
tctcttgcta agccatctat ggtgaagtct actgtggtgg atgagaaaac tggaggatct 420
aaggattcaa gagtgaggac ttcatctggt actttcctta ggaggggaca tgatgaagtt 480
gtggaagtta ttgagaagag gatttctgat ttcactttca ttccagtgga gaacggagaa 540
ggacttcaag ttcttcacta ccaagtggga caaaagtacg agccacacta cgattacttc 600
cttgatgagt tcaacactaa gaacggagga cagaggattg ctactgtgct tatgtacctt 660
tctgatgtgg atgatggagg agagactgtt tttccagctg ctaggggaaa catttctgct 720
gttccttggt ggaacgagct ttctaagtgt ggaaaggagg gactttctgt gcttccaaag 780
aaaagggatg ctcttctttt ctggaacatg aggccagatg cttctcttga tccatcttct 840
cttcatggag gatgcccagt tgttaaggga aacaagtggt catctactaa gtggttccac 900
gtgcacgagt tcaaggtgta atgagctc 928
<210> 17
<211> 302
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence containing the vacuolar signal sequence of
barley gene for Thiol protease aleurain precursor fused to the
plant Prolyl 4-hydroxylase Plant and flanking regions
<400> 17
Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro
20 25 30
Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Val
35 40 45
Asp Met Leu Gly Ile Leu Ser Leu Pro Asn Ala Asn Arg Asn Ser Ser
50 55 60
Lys Thr Asn Asp Leu Thr Asn Ile Val Arg Lys Ser Glu Thr Ser Ser
65 70 75 80
Gly Asp Glu Glu Gly Asn Gly Glu Arg Trp Val Glu Val Ile Ser Trp
85 90 95
Glu Pro Arg Ala Val Val Tyr His Asn Phe Leu Thr Asn Glu Glu Cys
100 105 110
Glu His Leu Ile Ser Leu Ala Lys Pro Ser Met Val Lys Ser Thr Val
115 120 125
Val Asp Glu Lys Thr Gly Gly Ser Lys Asp Ser Arg Val Arg Thr Ser
130 135 140
Ser Gly Thr Phe Leu Arg Arg Gly His Asp Glu Val Val Glu Val Ile
145 150 155 160
Glu Lys Arg Ile Ser Asp Phe Thr Phe Ile Pro Val Glu Asn Gly Glu
165 170 175
Gly Leu Gln Val Leu His Tyr Gln Val Gly Gln Lys Tyr Glu Pro His
180 185 190
Tyr Asp Tyr Phe Leu Asp Glu Phe Asn Thr Lys Asn Gly Gly Gln Arg
195 200 205
Ile Ala Thr Val Leu Met Tyr Leu Ser Asp Val Asp Asp Gly Gly Glu
210 215 220
Thr Val Phe Pro Ala Ala Arg Gly Asn Ile Ser Ala Val Pro Trp Trp
225 230 235 240
Asn Glu Leu Ser Lys Cys Gly Lys Glu Gly Leu Ser Val Leu Pro Lys
245 250 255
Lys Arg Asp Ala Leu Leu Phe Trp Asn Met Arg Pro Asp Ala Ser Leu
260 265 270
Asp Pro Ser Ser Leu His Gly Gly Cys Pro Val Val Lys Gly Asn Lys
275 280 285
Trp Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Val His Glu Phe Lys Val
290 295 300
<210> 18
<211> 2689
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence containing the coding regions of the human
Procollagen C-proteinase and flanking regions
<400> 18
agatctatcg atgcatgcca tggtaccgcg ccatggctca attggctgca acatcaaggc 60
ctgaaagagt ttggccagat ggtgttattc ctttcgttat tggtggaaac tttactggat 120
ctcagagagc agtttttaga caagctatga gacattggga aaagcacact tgtgtgacat 180
tccttgaaag gactgatgaa gattcttata ttgtgttcac ataccgtcca tgtggatgct 240
gctcatatgt tggtagaagg ggaggaggtc cacaagcaat ttctattgga aaaaactgcg 300
ataagttcgg aattgtggtg catgaattgg gacatgttgt tggtttctgg cacgaacaca 360
caaggccaga tagggatagg cacgtgtcta ttgtgaggga aaacattcag ccaggtcaag 420
agtacaattt tcttaagatg gaacctcaag aggtggaatc tctcggagag acttacgact 480
tcgactccat catgcactac gcaaggaata ctttcagcag gggcatcttc ttggatacca 540
ttgtgcctaa gtacgaggtg aacggcgtta agccacctat tggtcaaagg actaggctct 600
ctaagggtga tattgcacag gctaggaagc tctacaaatg tccagcatgc ggagaaactc 660
ttcaggattc cactggcaac ttctcatctc cagagtaccc aaacggatac tctgctcata 720
tgcactgtgt ttggaggatc tcagtgactc ctggagagaa gatcatcctc aacttcactt 780
ccctcgatct ctatcgttct aggctctgtt ggtacgacta tgtggaagtg agagatggct 840
tctggagaaa ggctccactt agaggaaggt tctgcggatc taaacttcct gagccaatcg 900
tgtctactga ttccagattg tgggtggagt tcaggtcctc ttctaattgg gttggcaagg 960
gcttttttgc tgtgtacgag gctatttgtg gcggcgacgt gaaaaaggac tacggacata 1020
ttcaaagtcc aaattaccca gatgattacc gtccttcaaa agtgtgtatt tggaggattc 1080
aagtgagtga gggtttccat gttggattga cattccaatc tttcgaaatt gagagacacg 1140
attcatgcgc atacgattat ttggaagtga gagatggaca ctctgaatct tctacactta 1200
ttggaaggta ctgcggttat gagaaacctg atgatattaa gtctacttct agtaggttgt 1260
ggcttaaatt tgtgtcagat ggttctatta acaaggctgg tttcgcagtg aacttcttca 1320
aggaagtgga tgaatgctca agacctaaca gaggaggatg tgagcaaaga tgccttaaca 1380
ctttgggaag ttacaagtgt tcttgcgatc ctggatacga gttggctcct gataagagaa 1440
gatgcgaagc tgcttgcggt ggttttttga caaaattgaa cggatctatt acttctcctg 1500
gatggccaaa agagtaccca cctaataaga attgcatttg gcagcttgtt gcacctactc 1560
agtaccgtat ttcattgcaa ttcgattttt tcgagactga gggtaatgat gtgtgcaagt 1620
acgatttcgt ggaagtgaga tcaggtctta ctgctgatag taaattgcac ggaaagttct 1680
gcggatctga aaaaccagaa gtgattacat cacagtacaa caatatgagg gtggagttca 1740
aatctgataa tactgtttct aaaaaaggtt ttaaggcaca tttcttttct gataaggacg 1800
agtgctctaa agataatggt ggttgccagc aggattgcgt gaacacattc ggttcatatg 1860
agtgccaatg ccgtagtgga tttgttcttc acgataacaa acatgattgc aaagaggcag 1920
gttgcgatca caaggtgaca tctacttcag gtactatcac atctccaaac tggcctgata 1980
agtatccttc aaaaaaagaa tgtacatggg caatttcttc tacaccaggt catagggtta 2040
agttgacatt catggagatg gatattgaga gtcaaccaga gtgcgcttat gatcatcttg 2100
aggtgttcga tggaagggat gctaaggctc ctgttcttgg tagattctgt ggtagtaaaa 2160
agccagaacc agtgcttgca acaggatcta ggatgttcct tagattctac tctgataact 2220
cagttcagag gaaaggattc caagctagtc acgcaactga atgcggtgga caagttagag 2280
cagatgttaa gactaaggat ctttactcac acgcacagtt cggagataac aactaccctg 2340
gaggagttga ttgcgagtgg gttattgtgg ctgaagaggg atacggagtt gagcttgttt 2400
tccagacatt cgaggtggag gaggaaactg attgcggtta cgattatatg gaactttttg 2460
atggatacga tagtactgct ccaagacttg gaaggtattg tggtagtggt ccaccagaag 2520
aggtgtactc agctggagat agtgttcttg ttaagttcca cagtgatgat acaattacta 2580
agaagggatt ccatcttaga tatacttcaa ctaagtttca ggatactctt cattctagga 2640
agtaatgagc tcgcggccgc atccaagctt ctgcagacgc gtcgacgtc 2689
<210> 19
<211> 870
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence containing the human Procollagen C-proteinase
and flanking regions
<400> 19
Met Ala Gln Leu Ala Ala Thr Ser Arg Pro Glu Arg Val Trp Pro Asp
1 5 10 15
Gly Val Ile Pro Phe Val Ile Gly Gly Asn Phe Thr Gly Ser Gln Arg
20 25 30
Ala Val Phe Arg Gln Ala Met Arg His Trp Glu Lys His Thr Cys Val
35 40 45
Thr Phe Leu Glu Arg Thr Asp Glu Asp Ser Tyr Ile Val Phe Thr Tyr
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Cys Cys Ser Tyr Val Gly Arg Arg Gly Gly Gly Pro
65 70 75 80
Gln Ala Ile Ser Ile Gly Lys Asn Cys Asp Lys Phe Gly Ile Val Val
85 90 95
His Glu Leu Gly His Val Val Gly Phe Trp His Glu His Thr Arg Pro
100 105 110
Asp Arg Asp Arg His Val Ser Ile Val Arg Glu Asn Ile Gln Pro Gly
115 120 125
Gln Glu Tyr Asn Phe Leu Lys Met Glu Pro Gln Glu Val Glu Ser Leu
130 135 140
Gly Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ser Ile Met His Tyr Ala Arg Asn Thr
145 150 155 160
Phe Ser Arg Gly Ile Phe Leu Asp Thr Ile Val Pro Lys Tyr Glu Val
165 170 175
Asn Gly Val Lys Pro Pro Ile Gly Gln Arg Thr Arg Leu Ser Lys Gly
180 185 190
Asp Ile Ala Gln Ala Arg Lys Leu Tyr Lys Cys Pro Ala Cys Gly Glu
195 200 205
Thr Leu Gln Asp Ser Thr Gly Asn Phe Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Asn
210 215 220
Gly Tyr Ser Ala His Met His Cys Val Trp Arg Ile Ser Val Thr Pro
225 230 235 240
Gly Glu Lys Ile Ile Leu Asn Phe Thr Ser Leu Asp Leu Tyr Arg Ser
245 250 255
Arg Leu Cys Trp Tyr Asp Tyr Val Glu Val Arg Asp Gly Phe Trp Arg
260 265 270
Lys Ala Pro Leu Arg Gly Arg Phe Cys Gly Ser Lys Leu Pro Glu Pro
275 280 285
Ile Val Ser Thr Asp Ser Arg Leu Trp Val Glu Phe Arg Ser Ser Ser
290 295 300
Asn Trp Val Gly Lys Gly Phe Phe Ala Val Tyr Glu Ala Ile Cys Gly
305 310 315 320
Gly Asp Val Lys Lys Asp Tyr Gly His Ile Gln Ser Pro Asn Tyr Pro
325 330 335
Asp Asp Tyr Arg Pro Ser Lys Val Cys Ile Trp Arg Ile Gln Val Ser
340 345 350
Glu Gly Phe His Val Gly Leu Thr Phe Gln Ser Phe Glu Ile Glu Arg
355 360 365
His Asp Ser Cys Ala Tyr Asp Tyr Leu Glu Val Arg Asp Gly His Ser
370 375 380
Glu Ser Ser Thr Leu Ile Gly Arg Tyr Cys Gly Tyr Glu Lys Pro Asp
385 390 395 400
Asp Ile Lys Ser Thr Ser Ser Arg Leu Trp Leu Lys Phe Val Ser Asp
405 410 415
Gly Ser Ile Asn Lys Ala Gly Phe Ala Val Asn Phe Phe Lys Glu Val
420 425 430
Asp Glu Cys Ser Arg Pro Asn Arg Gly Gly Cys Glu Gln Arg Cys Leu
435 440 445
Asn Thr Leu Gly Ser Tyr Lys Cys Ser Cys Asp Pro Gly Tyr Glu Leu
450 455 460
Ala Pro Asp Lys Arg Arg Cys Glu Ala Ala Cys Gly Gly Phe Leu Thr
465 470 475 480
Lys Leu Asn Gly Ser Ile Thr Ser Pro Gly Trp Pro Lys Glu Tyr Pro
485 490 495
Pro Asn Lys Asn Cys Ile Trp Gln Leu Val Ala Pro Thr Gln Tyr Arg
500 505 510
Ile Ser Leu Gln Phe Asp Phe Phe Glu Thr Glu Gly Asn Asp Val Cys
515 520 525
Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Arg Ser Gly Leu Thr Ala Asp Ser Lys
530 535 540
Leu His Gly Lys Phe Cys Gly Ser Glu Lys Pro Glu Val Ile Thr Ser
545 550 555 560
Gln Tyr Asn Asn Met Arg Val Glu Phe Lys Ser Asp Asn Thr Val Ser
565 570 575
Lys Lys Gly Phe Lys Ala His Phe Phe Ser Asp Lys Asp Glu Cys Ser
580 585 590
Lys Asp Asn Gly Gly Cys Gln Gln Asp Cys Val Asn Thr Phe Gly Ser
595 600 605
Tyr Glu Cys Gln Cys Arg Ser Gly Phe Val Leu His Asp Asn Lys His
610 615 620
Asp Cys Lys Glu Ala Gly Cys Asp His Lys Val Thr Ser Thr Ser Gly
625 630 635 640
Thr Ile Thr Ser Pro Asn Trp Pro Asp Lys Tyr Pro Ser Lys Lys Glu
645 650 655
Cys Thr Trp Ala Ile Ser Ser Thr Pro Gly His Arg Val Lys Leu Thr
660 665 670
Phe Met Glu Met Asp Ile Glu Ser Gln Pro Glu Cys Ala Tyr Asp His
675 680 685
Leu Glu Val Phe Asp Gly Arg Asp Ala Lys Ala Pro Val Leu Gly Arg
690 695 700
Phe Cys Gly Ser Lys Lys Pro Glu Pro Val Leu Ala Thr Gly Ser Arg
705 710 715 720
Met Phe Leu Arg Phe Tyr Ser Asp Asn Ser Val Gln Arg Lys Gly Phe
725 730 735
Gln Ala Ser His Ala Thr Glu Cys Gly Gly Gln Val Arg Ala Asp Val
740 745 750
Lys Thr Lys Asp Leu Tyr Ser His Ala Gln Phe Gly Asp Asn Asn Tyr
755 760 765
Pro Gly Gly Val Asp Cys Glu Trp Val Ile Val Ala Glu Glu Gly Tyr
770 775 780
Gly Val Glu Leu Val Phe Gln Thr Phe Glu Val Glu Glu Glu Thr Asp
785 790 795 800
Cys Gly Tyr Asp Tyr Met Glu Leu Phe Asp Gly Tyr Asp Ser Thr Ala
805 810 815
Pro Arg Leu Gly Arg Tyr Cys Gly Ser Gly Pro Pro Glu Glu Val Tyr
820 825 830
Ser Ala Gly Asp Ser Val Leu Val Lys Phe His Ser Asp Asp Thr Ile
835 840 845
Thr Lys Lys Gly Phe His Leu Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Phe Gln Asp
850 855 860
Thr Leu His Ser Arg Lys
865 870
<210> 20
<211> 2912
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence containing the coding regions of the human
Procollagen I N-proteinase and flanking regions
<400> 20
gcgccatggc tcaattgagg agaagggcta ggagacacgc agctgatgat gattacaaca 60
ttgaagtttt gcttggtgtt gatgatagtg tggtgcaatt ccacggaaaa gagcatgttc 120
agaaatatct tttgacactt atgaatattg tgaacgaaat ctaccatgat gagtctttgg 180
gagcacacat taacgtggtt cttgtgagga ttattcttct ttcatacggt aaatctatgt 240
cacttattga gattggaaac ccttctcagt ctcttgagaa tgtgtgcaga tgggcatacc 300
ttcaacagaa gcctgatact ggacacgatg agtatcacga tcacgctatt ttccttacaa 360
ggcaggattt cggtccaagt ggaatgcaag gatatgctcc tgttactggt atgtgccacc 420
ctgttaggtc ttgtacactt aaccacgagg atggtttttc atctgctttc gtggtggctc 480
atgagacagg tcatgttttg ggaatggaac atgatggaca gggtaataga tgtggagatg 540
aagtgagact tggttcaatt atggctcctc ttgttcaagc tgcttttcat aggttccact 600
ggagtaggtg ttcacagcaa gagttgagta gataccttca ttcttacgat tgcttgcttg 660
atgatccatt tgctcatgat tggccagctt tgcctcaact tcctggattg cactactcta 720
tgaacgagca gtgcagattt gatttcggtc ttggttacat gatgtgcaca gctttcagga 780
ctttcgatcc atgcaaacag ttgtggtgtt cacacccaga taacccatat ttctgtaaaa 840
caaaaaaagg tccaccactt gatggtacta tgtgcgcacc tggaaagcac tgcttcaagg 900
gacactgcat ttggcttact cctgatattc ttaaaaggga tggatcatgg ggagcttggt 960
ctccattcgg aagttgctca agaacttgcg gaacaggtgt taagtttaga actaggcagt 1020
gcgataatcc acaccctgct aatggtggta gaacttgctc tggacttgct tacgattttc 1080
agttgtgttc taggcaagat tgccctgata gtcttgctga ttttagagaa gagcaatgta 1140
gacagtggga tctttacttt gagcacggcg acgctcagca ccactggctt ccacacgagc 1200
atagagatgc aaaagaaagg tgtcaccttt attgcgagag tagagagact ggagaggtgg 1260
tgtcaatgaa gagaatggtg cacgatggta caaggtgttc ttataaggat gcattctctt 1320
tgtgtgtgag gggagattgc aggaaagtgg gttgtgatgg agtgattgga tctagtaagc 1380
aagaagataa gtgcggagtg tgcggaggag ataactctca ttgcaaggtt gtgaaaggaa 1440
cttttacaag atcaccaaaa aaacacggtt acattaagat gttcgaaatt cctgctggag 1500
caaggcattt gcttattcag gaagtggatg caacatctca ccacttggca gtgaaaaacc 1560
ttgagactgg aaaattcatt ttgaacgagg agaacgatgt tgatgcatct agtaagactt 1620
tcattgcaat gggtgttgaa tgggagtata gggatgagga tggaagggaa acacttcaaa 1680
caatgggtcc tcttcatgga acaattactg tgttggtgat tccagtggga gatacaaggg 1740
tgtcattgac atacaagtat atgattcacg aggatagtct taacgttgat gataacaacg 1800
ttttggaaga agattctgtg gtttacgagt gggctcttaa gaaatggtca ccttgctcta 1860
agccatgtgg tggaggaagt cagttcacta agtatggttg taggaggagg cttgatcata 1920
agatggttca taggggattt tgcgcagcac ttagtaagcc aaaggcaatt aggagggctt 1980
gtaaccctca agaatgctca caaccagttt gggtgacagg agagtgggag ccatgttcac 2040
aaacatgcgg aagaactgga atgcaagtta gatcagttag atgcattcaa cctcttcatg 2100
ataacactac aagaagtgtg cacgcaaaac actgtaacga tgctaggcca gagagtagaa 2160
gagcttgctc tagggaactt tgccctggta gatggagggc aggaccttgg agtcagtgct 2220
ctgtgacatg tggaaacggt actcaggaaa gacctgttcc atgtagaact gctgatgata 2280
gtttcggaat ttgtcaggag gaaaggccag aaacagctag gacttgtaga cttggacctt 2340
gtcctaggaa tatttctgat cctagtaaaa aatcatacgt ggtgcaatgg ttgagtaggc 2400
cagatccaga ttcaccaatt aggaagattt cttcaaaagg acactgccag ggtgataaga 2460
gtattttctg cagaatggaa gttcttagta ggtactgttc tattccaggt tataacaaac 2520
tttcttgtaa gagttgcaac ttgtataaca atcttactaa cgtggagggt agaattgaac 2580
ctccaccagg aaagcacaac gatattgatg tgtttatgcc tactcttcct gtgccaacag 2640
ttgcaatgga agttagacct tctccatcta ctccacttga ggtgccactt aatgcatcaa 2700
gtactaacgc tactgaggat cacccagaga ctaacgcagt tgatgagcct tataagattc 2760
acggacttga ggatgaggtt cagccaccaa accttattcc taggaggcca agtccttacg 2820
aaaaaactag aaatcagagg attcaggagc ttattgatga gatgaggaaa aaggagatgc 2880
ttggaaagtt ctaatgagct cgcggccgca tc 2912
<210> 21
<211> 962
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence containing the human Procollagen I
N-proteinase and flanking regions
<400> 21
Met Ala Gln Leu Arg Arg Arg Ala Arg Arg His Ala Ala Asp Asp Asp
1 5 10 15
Tyr Asn Ile Glu Val Leu Leu Gly Val Asp Asp Ser Val Val Gln Phe
20 25 30
His Gly Lys Glu His Val Gln Lys Tyr Leu Leu Thr Leu Met Asn Ile
35 40 45
Val Asn Glu Ile Tyr His Asp Glu Ser Leu Gly Ala His Ile Asn Val
50 55 60
Val Leu Val Arg Ile Ile Leu Leu Ser Tyr Gly Lys Ser Met Ser Leu
65 70 75 80
Ile Glu Ile Gly Asn Pro Ser Gln Ser Leu Glu Asn Val Cys Arg Trp
85 90 95
Ala Tyr Leu Gln Gln Lys Pro Asp Thr Gly His Asp Glu Tyr His Asp
100 105 110
His Ala Ile Phe Leu Thr Arg Gln Asp Phe Gly Pro Ser Gly Met Gln
115 120 125
Gly Tyr Ala Pro Val Thr Gly Met Cys His Pro Val Arg Ser Cys Thr
130 135 140
Leu Asn His Glu Asp Gly Phe Ser Ser Ala Phe Val Val Ala His Glu
145 150 155 160
Thr Gly His Val Leu Gly Met Glu His Asp Gly Gln Gly Asn Arg Cys
165 170 175
Gly Asp Glu Val Arg Leu Gly Ser Ile Met Ala Pro Leu Val Gln Ala
180 185 190
Ala Phe His Arg Phe His Trp Ser Arg Cys Ser Gln Gln Glu Leu Ser
195 200 205
Arg Tyr Leu His Ser Tyr Asp Cys Leu Leu Asp Asp Pro Phe Ala His
210 215 220
Asp Trp Pro Ala Leu Pro Gln Leu Pro Gly Leu His Tyr Ser Met Asn
225 230 235 240
Glu Gln Cys Arg Phe Asp Phe Gly Leu Gly Tyr Met Met Cys Thr Ala
245 250 255
Phe Arg Thr Phe Asp Pro Cys Lys Gln Leu Trp Cys Ser His Pro Asp
260 265 270
Asn Pro Tyr Phe Cys Lys Thr Lys Lys Gly Pro Pro Leu Asp Gly Thr
275 280 285
Met Cys Ala Pro Gly Lys His Cys Phe Lys Gly His Cys Ile Trp Leu
290 295 300
Thr Pro Asp Ile Leu Lys Arg Asp Gly Ser Trp Gly Ala Trp Ser Pro
305 310 315 320
Phe Gly Ser Cys Ser Arg Thr Cys Gly Thr Gly Val Lys Phe Arg Thr
325 330 335
Arg Gln Cys Asp Asn Pro His Pro Ala Asn Gly Gly Arg Thr Cys Ser
340 345 350
Gly Leu Ala Tyr Asp Phe Gln Leu Cys Ser Arg Gln Asp Cys Pro Asp
355 360 365
Ser Leu Ala Asp Phe Arg Glu Glu Gln Cys Arg Gln Trp Asp Leu Tyr
370 375 380
Phe Glu His Gly Asp Ala Gln His His Trp Leu Pro His Glu His Arg
385 390 395 400
Asp Ala Lys Glu Arg Cys His Leu Tyr Cys Glu Ser Arg Glu Thr Gly
405 410 415
Glu Val Val Ser Met Lys Arg Met Val His Asp Gly Thr Arg Cys Ser
420 425 430
Tyr Lys Asp Ala Phe Ser Leu Cys Val Arg Gly Asp Cys Arg Lys Val
435 440 445
Gly Cys Asp Gly Val Ile Gly Ser Ser Lys Gln Glu Asp Lys Cys Gly
450 455 460
Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser His Cys Lys Val Val Lys Gly Thr Phe
465 470 475 480
Thr Arg Ser Pro Lys Lys His Gly Tyr Ile Lys Met Phe Glu Ile Pro
485 490 495
Ala Gly Ala Arg His Leu Leu Ile Gln Glu Val Asp Ala Thr Ser His
500 505 510
His Leu Ala Val Lys Asn Leu Glu Thr Gly Lys Phe Ile Leu Asn Glu
515 520 525
Glu Asn Asp Val Asp Ala Ser Ser Lys Thr Phe Ile Ala Met Gly Val
530 535 540
Glu Trp Glu Tyr Arg Asp Glu Asp Gly Arg Glu Thr Leu Gln Thr Met
545 550 555 560
Gly Pro Leu His Gly Thr Ile Thr Val Leu Val Ile Pro Val Gly Asp
565 570 575
Thr Arg Val Ser Leu Thr Tyr Lys Tyr Met Ile His Glu Asp Ser Leu
580 585 590
Asn Val Asp Asp Asn Asn Val Leu Glu Glu Asp Ser Val Val Tyr Glu
595 600 605
Trp Ala Leu Lys Lys Trp Ser Pro Cys Ser Lys Pro Cys Gly Gly Gly
610 615 620
Ser Gln Phe Thr Lys Tyr Gly Cys Arg Arg Arg Leu Asp His Lys Met
625 630 635 640
Val His Arg Gly Phe Cys Ala Ala Leu Ser Lys Pro Lys Ala Ile Arg
645 650 655
Arg Ala Cys Asn Pro Gln Glu Cys Ser Gln Pro Val Trp Val Thr Gly
660 665 670
Glu Trp Glu Pro Cys Ser Gln Thr Cys Gly Arg Thr Gly Met Gln Val
675 680 685
Arg Ser Val Arg Cys Ile Gln Pro Leu His Asp Asn Thr Thr Arg Ser
690 695 700
Val His Ala Lys His Cys Asn Asp Ala Arg Pro Glu Ser Arg Arg Ala
705 710 715 720
Cys Ser Arg Glu Leu Cys Pro Gly Arg Trp Arg Ala Gly Pro Trp Ser
725 730 735
Gln Cys Ser Val Thr Cys Gly Asn Gly Thr Gln Glu Arg Pro Val Pro
740 745 750
Cys Arg Thr Ala Asp Asp Ser Phe Gly Ile Cys Gln Glu Glu Arg Pro
755 760 765
Glu Thr Ala Arg Thr Cys Arg Leu Gly Pro Cys Pro Arg Asn Ile Ser
770 775 780
Asp Pro Ser Lys Lys Ser Tyr Val Val Gln Trp Leu Ser Arg Pro Asp
785 790 795 800
Pro Asp Ser Pro Ile Arg Lys Ile Ser Ser Lys Gly His Cys Gln Gly
805 810 815
Asp Lys Ser Ile Phe Cys Arg Met Glu Val Leu Ser Arg Tyr Cys Ser
820 825 830
Ile Pro Gly Tyr Asn Lys Leu Ser Cys Lys Ser Cys Asn Leu Tyr Asn
835 840 845
Asn Leu Thr Asn Val Glu Gly Arg Ile Glu Pro Pro Pro Gly Lys His
850 855 860
Asn Asp Ile Asp Val Phe Met Pro Thr Leu Pro Val Pro Thr Val Ala
865 870 875 880
Met Glu Val Arg Pro Ser Pro Ser Thr Pro Leu Glu Val Pro Leu Asn
885 890 895
Ala Ser Ser Thr Asn Ala Thr Glu Asp His Pro Glu Thr Asn Ala Val
900 905 910
Asp Glu Pro Tyr Lys Ile His Gly Leu Glu Asp Glu Val Gln Pro Pro
915 920 925
Asn Leu Ile Pro Arg Arg Pro Ser Pro Tyr Glu Lys Thr Arg Asn Gln
930 935 940
Arg Ile Gln Glu Leu Ile Asp Glu Met Arg Lys Lys Glu Met Leu Gly
945 950 955 960
Lys Phe
<210> 22
<211> 2888
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence containing the coding regions of the vacuolar
signal sequence of barley gene for Thiol protease aleurain
precursor fused to the human Lysyl hydroxylase 3 and flanking
regions
<400> 22
gcgaattcgc tagctatcac tgaaaagaca gcaagacaat ggtgtctcga tgcaccagaa 60
ccacatcttt gcagcagatg tgaagcagcc agagtggtcc acaagacgca ctcagaaaag 120
gcatcttcta ccgacacaga aaaagacaac cacagctcat catccaacat gtagactgtc 180
gttatgcgtc ggctgaagat aagactgacc ccaggccagc actaaagaag aaataatgca 240
agtggtccta gctccacttt agctttaata attatgtttc attattattc tctgcttttg 300
ctctctatat aaagagcttg tattttcatt tgaaggcaga ggcgaacaca cacacagaac 360
ctccctgctt acaaaccaga tcttaaacca tggctcacgc tagggttttg cttcttgctc 420
ttgctgttct tgctactgct gctgttgctg tggcttcttc aagttctttc gctgattcta 480
acccaattag gccagtgact gatagagctg cttctactct tgctcaattg agatctatgt 540
ctgatagacc aaggggaagg gatccagtta atccagagaa gttgcttgtg attactgtgg 600
ctactgctga gactgaagga taccttagat tccttaggag tgctgagttc ttcaactaca 660
ctgtgaggac tcttggactt ggagaagaat ggaggggagg agatgttgct agaactgttg 720
gaggaggaca gaaagtgaga tggcttaaga aagagatgga gaagtacgct gatagggagg 780
atatgattat tatgttcgtg gattcttacg atgtgattct tgctggatct ccaactgagc 840
ttttgaagaa attcgttcag tctggatcta ggcttctttt ctctgctgag tctttttgtt 900
ggccagaatg gggacttgct gagcaatatc cagaagtggg aactggaaag agattcctta 960
actctggagg attcattgga ttcgctacta ctattcacca gattgtgagg cagtggaagt 1020
acaaggatga cgatgatgat cagcttttct acactaggct ttaccttgat ccaggactta 1080
gggagaagtt gtctcttaac cttgatcaca agtctaggat tttccagaac cttaacggtg 1140
ctcttgatga ggttgtgctt aagttcgata ggaacagagt gaggattagg aacgtggctt 1200
acgatactct tcctattgtg gtgcatggaa acggaccaac aaaactccag cttaactacc 1260
ttggaaacta cgttccaaac ggatggactc cagaaggagg atgtggattc tgcaatcagg 1320
ataggagaac tcttccagga ggacaaccac caccaagagt tttccttgct gtgttcgttg 1380
aacagccaac tccattcctt ccaagattcc ttcagaggct tcttcttttg gattacccac 1440
cagatagggt gacacttttc cttcacaaca acgaggtttt ccacgagcca cacattgctg 1500
attcttggcc acagcttcag gatcatttct ctgctgtgaa gttggttggt ccagaagaag 1560
ctctttctcc aggagaagct agggatatgg ctatggattt gtgcaggcag gatccagagt 1620
gcgagttcta cttctctctt gatgctgatg ctgtgcttac taaccttcag actcttagga 1680
ttcttattga ggagaacagg aaagtgattg ctccaatgct ttctaggcac ggaaagttgt 1740
ggtctaattt ctggggtgct ctttctcctg atgagtacta cgctagatca gaggactacg 1800
tggagcttgt tcagagaaag agagtgggag tttggaacgt tccttatatt tctcaggctt 1860
acgtgattag gggagatact cttaggatgg agcttccaca gagggatgtt ttctctggat 1920
ctgatactga tccagatatg gctttctgca agtctttcag ggataaggga attttccttc 1980
acctttctaa ccagcatgag ttcggaagat tgcttgctac ttcaagatac gatactgagc 2040
accttcatcc tgatctttgg cagattttcg ataacccagt ggattggaag gagcagtaca 2100
ttcacgagaa ctactctagg gctcttgaag gagaaggaat tgtggagcaa ccatgcccag 2160
atgtttactg gttcccactt ctttctgagc aaatgtgcga tgagcttgtt gctgagatgg 2220
agcattacgg acaatggagt ggaggtagac atgaggattc taggcttgct ggaggatacg 2280
agaacgttcc aactgtggat attcacatga agcaagtggg atacgaggat caatggcttc 2340
agcttcttag gacttatgtg ggaccaatga ctgagtctct tttcccagga taccacacta 2400
aggctagggc tgttatgaac ttcgttgtga ggtatcgtcc agatgagcaa ccatctctta 2460
ggccacacca cgattcttct actttcactc ttaacgtggc tcttaaccac aagggacttg 2520
attatgaggg aggaggatgc cgtttcctta gatacgattg cgtgatttct tcaccaagaa 2580
agggatgggc tcttcttcat ccaggaaggc ttactcatta ccacgaggga cttccaacta 2640
cttggggaac tagatatatt atggtgtctt tcgtggatcc atgactgctt taatgagata 2700
tgcgagacgc ctatgatcgc atgatatttg ctttcaattc tgttgtgcac gttgtaaaaa 2760
acctgagcat gtgtagctca gatccttacc gccggtttcg gttcattcta atgaatatat 2820
cacccgttac tatcgtattt ttatgaataa tattctccgt tcaatttact gattgtccag 2880
aattcgcg 2888
<210> 23
<211> 764
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence containing the vacuolar signal sequence of
barley gene for Thiol protease aleurain precursor fused to the
human Lysyl hydroxylase 3 and flanking regions
<400> 23
Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro
20 25 30
Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Arg
35 40 45
Ser Met Ser Asp Arg Pro Arg Gly Arg Asp Pro Val Asn Pro Glu Lys
50 55 60
Leu Leu Val Ile Thr Val Ala Thr Ala Glu Thr Glu Gly Tyr Leu Arg
65 70 75 80
Phe Leu Arg Ser Ala Glu Phe Phe Asn Tyr Thr Val Arg Thr Leu Gly
85 90 95
Leu Gly Glu Glu Trp Arg Gly Gly Asp Val Ala Arg Thr Val Gly Gly
100 105 110
Gly Gln Lys Val Arg Trp Leu Lys Lys Glu Met Glu Lys Tyr Ala Asp
115 120 125
Arg Glu Asp Met Ile Ile Met Phe Val Asp Ser Tyr Asp Val Ile Leu
130 135 140
Ala Gly Ser Pro Thr Glu Leu Leu Lys Lys Phe Val Gln Ser Gly Ser
145 150 155 160
Arg Leu Leu Phe Ser Ala Glu Ser Phe Cys Trp Pro Glu Trp Gly Leu
165 170 175
Ala Glu Gln Tyr Pro Glu Val Gly Thr Gly Lys Arg Phe Leu Asn Ser
180 185 190
Gly Gly Phe Ile Gly Phe Ala Thr Thr Ile His Gln Ile Val Arg Gln
195 200 205
Trp Lys Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Asp Gln Leu Phe Tyr Thr Arg Leu
210 215 220
Tyr Leu Asp Pro Gly Leu Arg Glu Lys Leu Ser Leu Asn Leu Asp His
225 230 235 240
Lys Ser Arg Ile Phe Gln Asn Leu Asn Gly Ala Leu Asp Glu Val Val
245 250 255
Leu Lys Phe Asp Arg Asn Arg Val Arg Ile Arg Asn Val Ala Tyr Asp
260 265 270
Thr Leu Pro Ile Val Val His Gly Asn Gly Pro Thr Lys Leu Gln Leu
275 280 285
Asn Tyr Leu Gly Asn Tyr Val Pro Asn Gly Trp Thr Pro Glu Gly Gly
290 295 300
Cys Gly Phe Cys Asn Gln Asp Arg Arg Thr Leu Pro Gly Gly Gln Pro
305 310 315 320
Pro Pro Arg Val Phe Leu Ala Val Phe Val Glu Gln Pro Thr Pro Phe
325 330 335
Leu Pro Arg Phe Leu Gln Arg Leu Leu Leu Leu Asp Tyr Pro Pro Asp
340 345 350
Arg Val Thr Leu Phe Leu His Asn Asn Glu Val Phe His Glu Pro His
355 360 365
Ile Ala Asp Ser Trp Pro Gln Leu Gln Asp His Phe Ser Ala Val Lys
370 375 380
Leu Val Gly Pro Glu Glu Ala Leu Ser Pro Gly Glu Ala Arg Asp Met
385 390 395 400
Ala Met Asp Leu Cys Arg Gln Asp Pro Glu Cys Glu Phe Tyr Phe Ser
405 410 415
Leu Asp Ala Asp Ala Val Leu Thr Asn Leu Gln Thr Leu Arg Ile Leu
420 425 430
Ile Glu Glu Asn Arg Lys Val Ile Ala Pro Met Leu Ser Arg His Gly
435 440 445
Lys Leu Trp Ser Asn Phe Trp Gly Ala Leu Ser Pro Asp Glu Tyr Tyr
450 455 460
Ala Arg Ser Glu Asp Tyr Val Glu Leu Val Gln Arg Lys Arg Val Gly
465 470 475 480
Val Trp Asn Val Pro Tyr Ile Ser Gln Ala Tyr Val Ile Arg Gly Asp
485 490 495
Thr Leu Arg Met Glu Leu Pro Gln Arg Asp Val Phe Ser Gly Ser Asp
500 505 510
Thr Asp Pro Asp Met Ala Phe Cys Lys Ser Phe Arg Asp Lys Gly Ile
515 520 525
Phe Leu His Leu Ser Asn Gln His Glu Phe Gly Arg Leu Leu Ala Thr
530 535 540
Ser Arg Tyr Asp Thr Glu His Leu His Pro Asp Leu Trp Gln Ile Phe
545 550 555 560
Asp Asn Pro Val Asp Trp Lys Glu Gln Tyr Ile His Glu Asn Tyr Ser
565 570 575
Arg Ala Leu Glu Gly Glu Gly Ile Val Glu Gln Pro Cys Pro Asp Val
580 585 590
Tyr Trp Phe Pro Leu Leu Ser Glu Gln Met Cys Asp Glu Leu Val Ala
595 600 605
Glu Met Glu His Tyr Gly Gln Trp Ser Gly Gly Arg His Glu Asp Ser
610 615 620
Arg Leu Ala Gly Gly Tyr Glu Asn Val Pro Thr Val Asp Ile His Met
625 630 635 640
Lys Gln Val Gly Tyr Glu Asp Gln Trp Leu Gln Leu Leu Arg Thr Tyr
645 650 655
Val Gly Pro Met Thr Glu Ser Leu Phe Pro Gly Tyr His Thr Lys Ala
660 665 670
Arg Ala Val Met Asn Phe Val Val Arg Tyr Arg Pro Asp Glu Gln Pro
675 680 685
Ser Leu Arg Pro His His Asp Ser Ser Thr Phe Thr Leu Asn Val Ala
690 695 700
Leu Asn His Lys Gly Leu Asp Tyr Glu Gly Gly Gly Cys Arg Phe Leu
705 710 715 720
Arg Tyr Asp Cys Val Ile Ser Ser Pro Arg Lys Gly Trp Ala Leu Leu
725 730 735
His Pro Gly Arg Leu Thr His Tyr His Glu Gly Leu Pro Thr Thr Trp
740 745 750
Gly Thr Arg Tyr Ile Met Val Ser Phe Val Asp Pro
755 760
<210> 24
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vacuole signal sequence of barley gene for Thiol protease
aleurain precursor
<400> 24
Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro
20 25 30
Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala
35 40 45
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Single strand DNA oligonucleotide
<400> 25
atcaccagga gaacagggac catc 24
<210> 26
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Single strand DNA oligonucleotide
<400> 26
tccacttcca aatctctatc cctaacaac 29
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Single strand DNA oligonucleotide
<400> 27
aggcattaga ggcgataagg gag 23
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Single strand DNA oligonucleotide
<400> 28
tcaatccaat aatagccact tgaccac 27
<210> 29
<211> 102
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pBINPLUS multiple cloning site
<400> 29
atgaccatga ttacgccaag ctggcgcgcc aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga 60
ggatccccgg gtaccgagct cgaattctta attaacaatt ca 102
<210> 30
<211> 1464
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Met Phe Ser Phe Val Asp Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Thr
1 5 10 15
Ala Leu Leu Thr His Gly Gln Glu Glu Gly Gln Val Glu Gly Gln Asp
20 25 30
Glu Asp Ile Pro Pro Ile Thr Cys Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His
35 40 45
Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Glu Pro Cys Arg Ile Cys Val Cys Asp
50 55 60
Asn Gly Lys Val Leu Cys Asp Asp Val Ile Cys Asp Glu Thr Lys Asn
65 70 75 80
Cys Pro Gly Ala Glu Val Pro Glu Gly Glu Cys Cys Pro Val Cys Pro
85 90 95
Asp Gly Ser Glu Ser Pro Thr Asp Gln Glu Thr Thr Gly Val Glu Gly
100 105 110
Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro Arg Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro
115 120 125
Pro Gly Arg Asp Gly Ile Pro Gly Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro
130 135 140
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala
145 150 155 160
Pro Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr Asp Glu Lys Ser Thr Gly Gly Ile Ser
165 170 175
Val Pro Gly Pro Met Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro
180 185 190
Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro
195 200 205
Gly Glu Pro Gly Ala Ser Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly
210 215 220
Pro Pro Gly Lys Asn Gly Asp Asp Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Arg
225 230 235 240
Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro
245 250 255
Gly Thr Ala Gly Leu Pro Gly Met Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly
260 265 270
Leu Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Glu
275 280 285
Pro Gly Ser Pro Gly Glu Asn Gly Ala Pro Gly Gln Met Gly Pro Arg
290 295 300
Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly
305 310 315 320
Ala Arg Gly Asn Asp Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro
325 330 335
Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Ala Val Gly Ala Lys
340 345 350
Gly Glu Ala Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Ser Glu Gly Pro Gln Gly
355 360 365
Val Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Pro
370 375 380
Ala Gly Asn Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Ala Asn
385 390 395 400
Gly Ala Pro Gly Ile Ala Gly Ala Pro Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly
405 410 415
Pro Ser Gly Pro Gln Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn
420 425 430
Ser Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly Ser Lys Gly Asp Thr Gly Ala Lys
435 440 445
Gly Glu Pro Gly Pro Val Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly
450 455 460
Glu Glu Gly Lys Arg Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Leu
465 470 475 480
Pro Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro
485 490 495
Gly Ala Asp Gly Val Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly
500 505 510
Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Ser Pro Gly Glu Ala Gly Arg
515 520 525
Pro Gly Glu Ala Gly Leu Pro Gly Ala Lys Gly Leu Thr Gly Ser Pro
530 535 540
Gly Ser Pro Gly Pro Asp Gly Lys Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly
545 550 555 560
Gln Asp Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln
565 570 575
Ala Gly Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro
580 585 590
Gly Lys Ala Gly Glu Arg Gly Val Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly
595 600 605
Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro
610 615 620
Ala Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro
625 630 635 640
Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly
645 650 655
Lys Pro Gly Glu Gln Gly Val Pro Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro
660 665 670
Ser Gly Ala Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln
675 680 685
Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly
690 695 700
Asn Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser
705 710 715 720
Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala
725 730 735
Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly
740 745 750
Ala Asp Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Thr Gly Pro
755 760 765
Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ser
770 775 780
Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly
785 790 795 800
Asp Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro
805 810 815
Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala
820 825 830
Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly
835 840 845
Pro Pro Gly Pro Ile Gly Asn Val Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Ala
850 855 860
Arg Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala
865 870 875 880
Gly Arg Val Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Asn Ala Gly Pro Pro Gly
885 890 895
Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Gly Lys Gly Pro Arg Gly Glu
900 905 910
Thr Gly Pro Ala Gly Arg Pro Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro
915 920 925
Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly
930 935 940
Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val
945 950 955 960
Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro
965 970 975
Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly
980 985 990
Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro
995 1000 1005
Pro Gly Glu Ser Gly Arg Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser
1010 1015 1020
Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu
1025 1030 1035
Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala
1040 1045 1050
Pro Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu
1055 1060 1065
Thr Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Val Gly Pro Val Gly Ala
1070 1075 1080
Arg Gly Pro Ala Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu
1085 1090 1095
Thr Gly Glu Gln Gly Asp Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe
1100 1105 1110
Ser Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu
1115 1120 1125
Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro
1130 1135 1140
Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Leu Asn Gly Leu
1145 1150 1155
Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Arg Thr Gly Asp
1160 1165 1170
Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro
1175 1180 1185
Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu Pro Gln
1190 1195 1200
Pro Pro Gln Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr Arg Ala
1205 1210 1215
Asp Asp Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr
1220 1225 1230
Thr Leu Lys Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro
1235 1240 1245
Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys
1250 1255 1260
Met Cys His Ser Asp Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro
1265 1270 1275
Asn Gln Gly Cys Asn Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met
1280 1285 1290
Glu Thr Gly Glu Thr Cys Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala
1295 1300 1305
Gln Lys Asn Trp Tyr Ile Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His
1310 1315 1320
Val Trp Phe Gly Glu Ser Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr
1325 1330 1335
Gly Gly Gln Gly Ser Asp Pro Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr
1340 1345 1350
Phe Leu Arg Leu Met Ser Thr Glu Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr
1355 1360 1365
His Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr Met Asp Gln Gln Thr Gly Asn
1370 1375 1380
Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Gln Gly Ser Asn Glu Ile Glu Ile
1385 1390 1395
Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Ser Val Thr Val Asp
1400 1405 1410
Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr Val Ile Glu
1415 1420 1425
Tyr Lys Thr Thr Lys Thr Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala
1430 1435 1440
Pro Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val
1445 1450 1455
Gly Pro Val Cys Phe Leu
1460
<210> 31
<211> 1366
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Met Leu Ser Phe Val Asp Thr Arg Thr Leu Leu Leu Leu Ala Val Thr
1 5 10 15
Leu Cys Leu Ala Thr Cys Gln Ser Leu Gln Glu Glu Thr Val Arg Lys
20 25 30
Gly Pro Ala Gly Asp Arg Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly
35 40 45
Pro Pro Gly Arg Asp Gly Glu Asp Gly Pro Thr Gly Pro Pro Gly Pro
50 55 60
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala Ala Gln
65 70 75 80
Tyr Asp Gly Lys Gly Val Gly Leu Gly Pro Gly Pro Met Gly Leu Met
85 90 95
Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ala Ala Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly
100 105 110
Phe Gln Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Glu Pro Gly Gln Thr Gly Pro
115 120 125
Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Lys Ala Gly Glu Asp
130 135 140
Gly His Pro Gly Lys Pro Gly Arg Pro Gly Glu Arg Gly Val Val Gly
145 150 155 160
Pro Gln Gly Ala Arg Gly Phe Pro Gly Thr Pro Gly Leu Pro Gly Phe
165 170 175
Lys Gly Ile Arg Gly His Asn Gly Leu Asp Gly Leu Lys Gly Gln Pro
180 185 190
Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly Glu Asn Gly
195 200 205
Thr Pro Gly Gln Thr Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg
210 215 220
Val Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Ser Asp Gly Ser Val
225 230 235 240
Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Pro Ile Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly
245 250 255
Phe Pro Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly Glu Ile Gly Ala Val Gly Asn
260 265 270
Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Glu Val Gly Leu Pro
275 280 285
Gly Leu Ser Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly Ala Asn Gly
290 295 300
Leu Thr Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Val Ala Gly Ala
305 310 315 320
Pro Gly Leu Pro Gly Pro Arg Gly Ile Pro Gly Pro Val Gly Ala Ala
325 330 335
Gly Ala Thr Gly Ala Arg Gly Leu Val Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly
340 345 350
Ser Lys Gly Glu Ser Gly Asn Lys Gly Glu Pro Gly Ser Ala Gly Pro
355 360 365
Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Glu Glu Gly Lys Arg Gly Pro Asn
370 375 380
Gly Glu Ala Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Arg Gly
385 390 395 400
Ser Pro Gly Ser Arg Gly Leu Pro Gly Ala Asp Gly Arg Ala Gly Val
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Met Gly Pro Pro Gly Ser Arg Gly Ala Ser Gly Pro Ala Gly Val Arg
420 425 430
Gly Pro Asn Gly Asp Ala Gly Arg Pro Gly Glu Pro Gly Leu Met Gly
435 440 445
Pro Arg Gly Leu Pro Gly Ser Pro Gly Asn Ile Gly Pro Ala Gly Lys
450 455 460
Glu Gly Pro Val Gly Leu Pro Gly Ile Asp Gly Arg Pro Gly Pro Ile
465 470 475 480
Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly Asn Ile Gly Phe Pro Gly
485 490 495
Pro Lys Gly Pro Thr Gly Asp Pro Gly Lys Asn Gly Asp Lys Gly His
500 505 510
Ala Gly Leu Ala Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Pro Asp Gly Asn Asn
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Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Gly Lys Gly
530 535 540
Glu Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro
545 550 555 560
Ser Gly Pro Ala Gly Glu Val Gly Lys Pro Gly Glu Arg Gly Leu His
565 570 575
Gly Glu Phe Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly
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Pro Pro Gly Glu Ser Gly Ala Ala Gly Pro Thr Gly Pro Ile Gly Ser
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Gly Val Val Gly Ala Val Gly Thr Ala Gly Pro Ser Gly Pro Ser Gly
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Leu Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile Pro Gly Gly Lys Gly Glu
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Lys Gly Glu Pro Gly Leu Arg Gly Glu Ile Gly Asn Pro Gly Arg Asp
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Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Ala Val Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly
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Gly Pro Asn Gly Phe Ala Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Gln Pro Gly
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Ala Lys Gly Glu Arg Gly Ala Lys Gly Pro Lys Gly Glu Asn Gly Val
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Met Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly Arg Thr Gly Pro Pro Gly Pro
785 790 795 800
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Gly Leu Arg Gly Pro Arg Gly Asp Gln Gly Pro Val Gly Arg Thr Gly
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Ala Gly Ser Gln Phe Glu Tyr Asn Val Glu Gly Val Thr Ser Lys
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Leu Pro Phe Leu Asp Ile Ala Pro Leu Asp Ile Gly Gly Ala Asp
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<210> 32
<211> 5927
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 32
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cggatctgcg tctgcgacaa cggcaaggtg ttgtgcgatg acgtgatctg tgacgagacc 360
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tcagagtcac ccaccgacca agaaaccacc ggcgtcgagg gacccaaggg agacactggc 480
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<210> 33
<211> 5411
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 33
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ggcaacagca ggttcactta cactgttctt gtagatggct gctctaaaaa gacaaatgaa 4440
tggggaaaga caatcattga atacaaaaca aataagccat cacgcctgcc cttccttgat 4500
attgcacctt tggacatcgg tggtgctgac caggaattct ttgtggacat tggcccagtc 4560
tgtttcaaat aaatgaactc aatctaaatt aaaaaagaaa gaaatttgaa aaaactttct 4620
ctttgccatt tcttcttctt cttttttaac tgaaagctga atccttccat ttcttctgca 4680
catctacttg cttaaattgt gggcaaaaga gaaaaagaag gattgatcag agcattgtgc 4740
aatacagttt cattaactcc ttcccccgct cccccaaaaa tttgaatttt tttttcaaca 4800
ctcttacacc tgttatggaa aatgtcaacc tttgtaagaa aaccaaaata aaaattgaaa 4860
aataaaaacc ataaacattt gcaccacttg tggcttttga atatcttcca cagagggaag 4920
tttaaaaccc aaacttccaa aggtttaaac tacctcaaaa cactttccca tgagtgtgat 4980
ccacattgtt aggtgctgac ctagacagag atgaactgag gtccttgttt tgttttgttc 5040
ataatacaaa ggtgctaatt aatagtattt cagatacttg aagaatgttg atggtgctag 5100
aagaatttga gaagaaatac tcctgtattg agttgtatcg tgtggtgtat tttttaaaaa 5160
atttgattta gcattcatat tttccatctt attcccaatt aaaagtatgc agattatttg 5220
cccaaatctt cttcagattc agcatttgtt ctttgccagt ctcattttca tcttcttcca 5280
tggttccaca gaagctttgt ttcttgggca agcagaaaaa ttaaattgta cctattttgt 5340
atatgtgaga tgtttaaata aattgtgaaa aaaatgaaat aaagcatgtt tggttttcca 5400
aaagaacata t 5411
<210> 34
<211> 1633
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence containing the coding regions of the vascular
signal sequence of barley gene for Thiol protease aleurain
precursor fused to the human Prolyl 4-hydroxylase beta subunit
and flanking regions
<400> 34
ctcgagtaaa ccatggctca tgctagggtt ttgcttttgg ctcttgctgt tcttgctact 60
gctgctgttg ctgtggcttc ttcttcatct ttcgctgatt ctaacccaat taggccagtg 120
actgatagag ctgcttctac tcttgctcaa ttggtcgaca tggatgctcc agaagaggag 180
gatcacgttc ttgtgcttag gaagtctaac ttcgctgaag ctcttgctgc tcacaagtac 240
cttcttgtgg agttttatgc tccttggtgc ggacattgca aagctcttgc tccagagtat 300
gctaaggctg ctggaaagtt gaaggctgag ggatctgaaa ttaggcttgc taaagtggat 360
gctactgagg agtctgatct tgctcaacag tacggagtta ggggataccc aactattaag 420
ttcttcagga acggagatac tgcttctcca aaggagtata ctgctggaag ggaggctgat 480
gatattgtga actggcttaa gaagagaact ggaccagctg ctactactct tccagatgga 540
gctgctgctg aatctcttgt ggagtcatct gaggtggcag tgattggatt cttcaaggat 600
gtggagtctg attctgctaa gcagttcctt caagctgctg aggctattga tgatattcca 660
ttcggaatta cttctaactc tgatgtgttc tctaagtacc agcttgataa ggatggagtg 720
gtgcttttca agaaattcga tgagggaagg aacaatttcg agggagaggt gacaaaggag 780
aaccttcttg atttcattaa gcacaaccag cttccacttg tgattgagtt cactgagcag 840
actgctccaa agattttcgg aggagagatt aagactcaca ttcttctttt ccttccaaag 900
tctgtgtctg attacgatgg aaagttgtct aacttcaaga ctgctgctga gtctttcaag 960
ggaaagattc ttttcatttt cattgattct gatcacactg ataaccagag gattcttgag 1020
ttcttcggac ttaagaagga agagtgccca gctgttaggc ttattactct tgaggaggag 1080
atgactaagt acaagccaga gtctgaagaa cttactgctg agaggattac tgagttctgc 1140
cacagattcc ttgagggaaa gattaagcca caccttatgt ctcaagagct tccagaggat 1200
tgggataagc agccagttaa ggtgttggtg ggtaaaaact tcgaggatgt ggctttcgat 1260
gagaagaaga acgtgttcgt ggagttctac gcaccttggt gtggtcactg taagcagctt 1320
gctccaattt gggataagtt gggagagact tacaaggatc acgagaacat tgtgattgct 1380
aagatggatt ctactgctaa cgaggtggag gctgttaagg ttcactcttt cccaactttg 1440
aagttcttcc cagcttctgc tgataggact gtgattgatt acaacggaga aaggactctt 1500
gatggattca agaagttcct tgagtctgga ggacaagatg gagctggaga tgatgatgat 1560
cttgaggatt tggaagaagc tgaggagcca gatatggagg aggatgatga tcagaaggct 1620
gtgtgatgag ctc 1633
<210> 35
<211> 1723
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence containing the coding regions of the vascular
signal sequence of barley gene for Thiol protease aleurain
precursor fused to the human Prolyl 4-hydroxylase alpha-1 subunit
and flanking regions
<400> 35
ctcgagtaaa ccatggctca tgctagggtt ttgcttttgg ctcttgctgt tcttgctact 60
gctgctgttg ctgtggcttc ttcttcatct ttcgctgatt ctaacccaat taggccagtg 120
actgatagag ctgcttctac tcttgctcaa ttggtcgaca tgcacccagg attcttcact 180
tctattggac agatgactga tcttattcac actgagaagg atcttgtgac ttctcttaag 240
gattacatta aggctgagga ggataagttg gagcagatta agaagtgggc tgagaagttg 300
gataggctta cttctactgc tacaaaagat ccagagggat tcgttggtca tccagtgaac 360
gctttcaagt tgatgaagag gcttaacact gagtggagtg agcttgagaa ccttgtgctt 420
aaggatatgt ctgatggatt catttctaac cttactattc agaggcagta cttcccaaat 480
gatgaggatc aagtgggagc tgctaaggct cttcttaggc ttcaggatac ttacaacctt 540
gatactgata caatttctaa gggaaacctt ccaggagtta agcacaagtc tttccttact 600
gctgaggatt gcttcgagct tggaaaggtt gcatacactg aggctgatta ctaccacact 660
gagctttgga tggaacaagc tcttaggcaa cttgatgagg gagagatttc tactattgat 720
aaggtgtcag tgcttgatta cctttcttac gctgtgtacc agcagggtga tcttgataag 780
gctcttttgc ttactaagaa gttgcttgag cttgatccag aacatcagag ggctaacgga 840
aaccttaagt acttcgagta cattatggct aaggaaaagg atgtgaacaa gtctgcttct 900
gatgatcagt ctgatcaaaa gactactcca aagaagaagg gagtggctgt tgattatctt 960
cctgagaggc agaagtatga gatgttgtgt aggggagagg gtattaagat gactccaagg 1020
aggcagaaga agttgttctg caggtatcac gatggaaaca ggaacccaaa gttcattctt 1080
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atttctgatg ctgagattga gattgtgaag gatcttgcta agccaagact taggagggct 1200
actatttcta accctattac tggtgatctt gagactgtgc actacaggat ttctaagtct 1260
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ggacaatatg agccacactt cgatttcgct aggaaggatg agccagatgc ttttaaggag 1440
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tttagaaggc catgcactct ttctgagctt gagtgatgag ctc 1723
<210> 36
<211> 1489
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro
20 25 30
Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Gln
35 40 45
Glu Glu Gly Gln Val Glu Gly Gln Asp Glu Asp Ile Pro Pro Ile Thr
50 55 60
Cys Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro
65 70 75 80
Glu Pro Cys Arg Ile Cys Val Cys Asp Asn Gly Lys Val Leu Cys Asp
85 90 95
Asp Val Ile Cys Asp Glu Thr Lys Asn Cys Pro Gly Ala Glu Val Pro
100 105 110
Glu Gly Glu Cys Cys Pro Val Cys Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Thr
115 120 125
Asp Gln Glu Thr Thr Gly Val Glu Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro
130 135 140
Arg Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Ile Pro
145 150 155 160
Gly Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
165 170 175
Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala Pro Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr
180 185 190
Asp Glu Lys Ser Thr Gly Gly Ile Ser Val Pro Gly Pro Met Gly Pro
195 200 205
Ser Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gln
210 215 220
Gly Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Glu Pro Gly Ala Ser Gly
225 230 235 240
Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asn Gly Asp
245 250 255
Asp Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Arg Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro
260 265 270
Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Thr Ala Gly Leu Pro Gly
275 280 285
Met Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Asp Gly Ala Lys Gly Asp
290 295 300
Ala Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Glu Asn
305 310 315 320
Gly Ala Pro Gly Gln Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly
325 330 335
Arg Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Asn Asp Gly Ala
340 345 350
Thr Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro
355 360 365
Gly Phe Pro Gly Ala Val Gly Ala Lys Gly Glu Ala Gly Pro Gln Gly
370 375 380
Pro Arg Gly Ser Glu Gly Pro Gln Gly Val Arg Gly Glu Pro Gly Pro
385 390 395 400
Pro Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Asn Pro Gly Ala Asp
405 410 415
Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Ile Ala Gly
420 425 430
Ala Pro Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Pro
435 440 445
Gly Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Glu Pro Gly Ala Pro
450 455 460
Gly Ser Lys Gly Asp Thr Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Pro Val Gly
465 470 475 480
Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Glu Gly Lys Arg Gly Ala
485 490 495
Arg Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Glu Arg
500 505 510
Gly Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro Gly Ala Asp Gly Val Ala Gly
515 520 525
Pro Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro
530 535 540
Lys Gly Ser Pro Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly Glu Ala Gly Leu Pro
545 550 555 560
Gly Ala Lys Gly Leu Thr Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Pro Asp Gly
565 570 575
Lys Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln Asp Gly Arg Pro Gly Pro
580 585 590
Pro Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln Ala Gly Val Met Gly Phe Pro
595 600 605
Gly Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Lys Ala Gly Glu Arg Gly
610 615 620
Val Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu
625 630 635 640
Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Glu Arg
645 650 655
Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly
660 665 670
Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Glu Gln Gly Val
675 680 685
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690 695 700
Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly
705 710 715 720
Pro Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Asn Asp Gly Ala Lys Gly Asp
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Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly
755 760 765
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770 775 780
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Gly Ala Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ser Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly
805 810 815
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820 825 830
Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro
835 840 845
Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly
850 855 860
Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ile Gly Asn
865 870 875 880
Val Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Ala Arg Gly Ser Ala Gly Pro Pro
885 890 895
Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly Arg Val Gly Pro Pro Gly
900 905 910
Pro Ser Gly Asn Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys
915 920 925
Glu Gly Gly Lys Gly Pro Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Arg Pro
930 935 940
Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly
945 950 955 960
Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro
965 970 975
Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg
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Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly
995 1000 1005
Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly
1010 1015 1020
Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gly
1025 1030 1035
Arg Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro Gly Arg Asp Gly
1040 1045 1050
Ser Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly
1055 1060 1065
Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val Gly
1070 1075 1080
Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly
1085 1090 1095
Pro Ala Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly
1100 1105 1110
Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly
1115 1120 1125
Asp Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly
1130 1135 1140
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly
1145 1150 1155
Ala Ser Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly
1160 1165 1170
Ala Pro Gly Lys Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly
1175 1180 1185
Pro Pro Gly Pro Arg Gly Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly
1190 1195 1200
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser
1205 1210 1215
Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu Pro Gln Pro Pro Gln Glu Lys
1220 1225 1230
Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr Arg Ala Asp Asp Ala Asn Val
1235 1240 1245
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1250 1255 1260
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1310 1315 1320
Cys Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp Tyr
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Ile Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu
1340 1345 1350
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Ser Thr Glu Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser
1385 1390 1395
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Leu
<210> 37
<211> 1389
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
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1 5 10 15
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100 105 110
Pro Gly Pro Met Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ala Ala
115 120 125
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130 135 140
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260 265 270
Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly
275 280 285
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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565 570 575
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580 585 590
Pro Gly Glu Arg Gly Leu His Gly Glu Phe Gly Leu Pro Gly Pro Ala
595 600 605
Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gly Ala Ala Gly
610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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740 745 750
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755 760 765
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915 920 925
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930 935 940
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945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
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1085 1090 1095
Pro Ala Gly Ile Arg Gly Pro Gln Gly His Gln Gly Pro Ala Gly
1100 1105 1110
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Val Ser Gly
1115 1120 1125
Gly Gly Tyr Asp Phe Gly Tyr Asp Gly Asp Phe Tyr Arg Ala Asp
1130 1135 1140
Gln Pro Arg Ser Ala Pro Ser Leu Arg Pro Lys Asp Tyr Glu Val
1145 1150 1155
Asp Ala Thr Leu Lys Ser Leu Asn Asn Gln Ile Glu Thr Leu Leu
1160 1165 1170
Thr Pro Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp
1175 1180 1185
Leu Arg Leu Ser His Pro Glu Trp Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Ile
1190 1195 1200
Asp Pro Asn Gln Gly Cys Thr Met Glu Ala Ile Lys Val Tyr Cys
1205 1210 1215
Asp Phe Pro Thr Gly Glu Thr Cys Ile Arg Ala Gln Pro Glu Asn
1220 1225 1230
Ile Pro Ala Lys Asn Trp Tyr Arg Ser Ser Lys Asp Lys Lys His
1235 1240 1245
Val Trp Leu Gly Glu Thr Ile Asn Ala Gly Ser Gln Phe Glu Tyr
1250 1255 1260
Asn Val Glu Gly Val Thr Ser Lys Glu Met Ala Thr Gln Leu Ala
1265 1270 1275
Phe Met Arg Leu Leu Ala Asn Tyr Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr
1280 1285 1290
His Cys Lys Asn Ser Ile Ala Tyr Met Asp Glu Glu Thr Gly Asn
1295 1300 1305
Leu Lys Lys Ala Val Ile Leu Gln Gly Ser Asn Asp Val Glu Leu
1310 1315 1320
Val Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Thr Val Leu Val Asp
1325 1330 1335
Gly Cys Ser Lys Lys Thr Asn Glu Trp Gly Lys Thr Ile Ile Glu
1340 1345 1350
Tyr Lys Thr Asn Lys Pro Ser Arg Leu Pro Phe Leu Asp Ile Ala
1355 1360 1365
Pro Leu Asp Ile Gly Gly Ala Asp His Glu Phe Phe Val Asp Ile
1370 1375 1380
Gly Pro Val Cys Phe Lys
1385
<210> 38
<211> 2888
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence containing the coding regions of the vascular
signal sequence of barley gene for Thiol protease aleurain
precursor fused to the human Lysyl hydroxylase 3 and flanking
regions
<400> 38
gcgaattcgc tagctatcac tgaaaagaca gcaagacaat ggtgtctcga tgcaccagaa 60
ccacatcttt gcagcagatg tgaagcagcc agagtggtcc acaagacgca ctcagaaaag 120
gcatcttcta ccgacacaga aaaagacaac cacagctcat catccaacat gtagactgtc 180
gttatgcgtc ggctgaagat aagactgacc ccaggccagc actaaagaag aaataatgca 240
agtggtccta gctccacttt agctttaata attatgtttc attattattc tctgcttttg 300
ctctctatat aaagagcttg tattttcatt tgaaggcaga ggcgaacaca cacacagaac 360
ctccctgctt acaaaccaga tcttaaacca tggctcacgc tagggttttg cttcttgctc 420
ttgctgttct tgctactgct gctgttgctg tggcttcttc aagttctttc gctgattcta 480
acccaattag gccagtgact gatagagctg cttctactct tgctcaattg agatctatgt 540
ctgatagacc aaggggaagg gatccagtta atccagagaa gttgcttgtg attactgtgg 600
ctactgctga gactgaagga taccttagat tccttaggag tgctgagttc ttcaactaca 660
ctgtgaggac tcttggactt ggagaagaat ggaggggagg agatgttgct agaactgttg 720
gaggaggaca gaaagtgaga tggcttaaga aagagatgga gaagtacgct gatagggagg 780
atatgattat tatgttcgtg gattcttacg atgtgattct tgctggatct ccaactgagc 840
ttttgaagaa attcgttcag tctggatcta ggcttctttt ctctgctgag tctttttgtt 900
ggccagaatg gggacttgct gagcaatatc cagaagtggg aactggaaag agattcctta 960
actctggagg attcattgga ttcgctacta ctattcacca gattgtgagg cagtggaagt 1020
acaaggatga cgatgatgat cagcttttct acactaggct ttaccttgat ccaggactta 1080
gggagaagtt gtctcttaac cttgatcaca agtctaggat tttccagaac cttaacggtg 1140
ctcttgatga ggttgtgctt aagttcgata ggaacagagt gaggattagg aacgtggctt 1200
acgatactct tcctattgtg gtgcatggaa acggaccaac aaaactccag cttaactacc 1260
ttggaaacta cgttccaaac ggatggactc cagaaggagg atgtggattc tgcaatcagg 1320
ataggagaac tcttccagga ggacaaccac caccaagagt tttccttgct gtgttcgttg 1380
aacagccaac tccattcctt ccaagattcc ttcagaggct tcttcttttg gattacccac 1440
cagatagggt gacacttttc cttcacaaca acgaggtttt ccacgagcca cacattgctg 1500
attcttggcc acagcttcag gatcatttct ctgctgtgaa gttggttggt ccagaagaag 1560
ctctttctcc aggagaagct agggatatgg ctatggattt gtgcaggcag gatccagagt 1620
gcgagttcta cttctctctt gatgctgatg ctgtgcttac taaccttcag actcttagga 1680
ttcttattga ggagaacagg aaagtgattg ctccaatgct ttctaggcac ggaaagttgt 1740
ggtctaattt ctggggtgct ctttctcctg atgagtacta cgctagatca gaggactacg 1800
tggagcttgt tcagagaaag agagtgggag tttggaacgt tccttatatt tctcaggctt 1860
acgtgattag gggagatact cttaggatgg agcttccaca gagggatgtt ttctctggat 1920
ctgatactga tccagatatg gctttctgca agtctttcag ggataaggga attttccttc 1980
acctttctaa ccagcatgag ttcggaagat tgcttgctac ttcaagatac gatactgagc 2040
accttcatcc tgatctttgg cagattttcg ataacccagt ggattggaag gagcagtaca 2100
ttcacgagaa ctactctagg gctcttgaag gagaaggaat tgtggagcaa ccatgcccag 2160
atgtttactg gttcccactt ctttctgagc aaatgtgcga tgagcttgtt gctgagatgg 2220
agcattacgg acaatggagt ggaggtagac atgaggattc taggcttgct ggaggatacg 2280
agaacgttcc aactgtggat attcacatga agcaagtggg atacgaggat caatggcttc 2340
agcttcttag gacttatgtg ggaccaatga ctgagtctct tttcccagga taccacacta 2400
aggctagggc tgttatgaac ttcgttgtga ggtatcgtcc agatgagcaa ccatctctta 2460
ggccacacca cgattcttct actttcactc ttaacgtggc tcttaaccac aagggacttg 2520
attatgaggg aggaggatgc cgtttcctta gatacgattg cgtgatttct tcaccaagaa 2580
agggatgggc tcttcttcat ccaggaaggc ttactcatta ccacgaggga cttccaacta 2640
cttggggaac tagatatatt atggtgtctt tcgtggatcc atgactgctt taatgagata 2700
tgcgagacgc ctatgatcgc atgatatttg ctttcaattc tgttgtgcac gttgtaaaaa 2760
acctgagcat gtgtagctca gatccttacc gccggtttcg gttcattcta atgaatatat 2820
cacccgttac tatcgtattt ttatgaataa tattctccgt tcaatttact gattgtccag 2880
aattcgcg 2888
<210> 39
<211> 2689
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence containing the coding regions of the human
Procollagen C-proteinase and flanking regions
<400> 39
agatctatcg atgcatgcca tggtaccgcg ccatggctca attggctgca acatcaaggc 60
ctgaaagagt ttggccagat ggtgttattc ctttcgttat tggtggaaac tttactggat 120
ctcagagagc agtttttaga caagctatga gacattggga aaagcacact tgtgtgacat 180
tccttgaaag gactgatgaa gattcttata ttgtgttcac ataccgtcca tgtggatgct 240
gctcatatgt tggtagaagg ggaggaggtc cacaagcaat ttctattgga aaaaactgcg 300
ataagttcgg aattgtggtg catgaattgg gacatgttgt tggtttctgg cacgaacaca 360
caaggccaga tagggatagg cacgtgtcta ttgtgaggga aaacattcag ccaggtcaag 420
agtacaattt tcttaagatg gaacctcaag aggtggaatc tctcggagag acttacgact 480
tcgactccat catgcactac gcaaggaata ctttcagcag gggcatcttc ttggatacca 540
ttgtgcctaa gtacgaggtg aacggcgtta agccacctat tggtcaaagg actaggctct 600
ctaagggtga tattgcacag gctaggaagc tctacaaatg tccagcatgc ggagaaactc 660
ttcaggattc cactggcaac ttctcatctc cagagtaccc aaacggatac tctgctcata 720
tgcactgtgt ttggaggatc tcagtgactc ctggagagaa gatcatcctc aacttcactt 780
ccctcgatct ctatcgttct aggctctgtt ggtacgacta tgtggaagtg agagatggct 840
tctggagaaa ggctccactt agaggaaggt tctgcggatc taaacttcct gagccaatcg 900
tgtctactga ttccagattg tgggtggagt tcaggtcctc ttctaattgg gttggcaagg 960
gcttttttgc tgtgtacgag gctatttgtg gcggcgacgt gaaaaaggac tacggacata 1020
ttcaaagtcc aaattaccca gatgattacc gtccttcaaa agtgtgtatt tggaggattc 1080
aagtgagtga gggtttccat gttggattga cattccaatc tttcgaaatt gagagacacg 1140
attcatgcgc atacgattat ttggaagtga gagatggaca ctctgaatct tctacactta 1200
ttggaaggta ctgcggttat gagaaacctg atgatattaa gtctacttct agtaggttgt 1260
ggcttaaatt tgtgtcagat ggttctatta acaaggctgg tttcgcagtg aacttcttca 1320
aggaagtgga tgaatgctca agacctaaca gaggaggatg tgagcaaaga tgccttaaca 1380
ctttgggaag ttacaagtgt tcttgcgatc ctggatacga gttggctcct gataagagaa 1440
gatgcgaagc tgcttgcggt ggttttttga caaaattgaa cggatctatt acttctcctg 1500
gatggccaaa agagtaccca cctaataaga attgcatttg gcagcttgtt gcacctactc 1560
agtaccgtat ttcattgcaa ttcgattttt tcgagactga gggtaatgat gtgtgcaagt 1620
acgatttcgt ggaagtgaga tcaggtctta ctgctgatag taaattgcac ggaaagttct 1680
gcggatctga aaaaccagaa gtgattacat cacagtacaa caatatgagg gtggagttca 1740
aatctgataa tactgtttct aaaaaaggtt ttaaggcaca tttcttttct gataaggacg 1800
agtgctctaa agataatggt ggttgccagc aggattgcgt gaacacattc ggttcatatg 1860
agtgccaatg ccgtagtgga tttgttcttc acgataacaa acatgattgc aaagaggcag 1920
gttgcgatca caaggtgaca tctacttcag gtactatcac atctccaaac tggcctgata 1980
agtatccttc aaaaaaagaa tgtacatggg caatttcttc tacaccaggt catagggtta 2040
agttgacatt catggagatg gatattgaga gtcaaccaga gtgcgcttat gatcatcttg 2100
aggtgttcga tggaagggat gctaaggctc ctgttcttgg tagattctgt ggtagtaaaa 2160
agccagaacc agtgcttgca acaggatcta ggatgttcct tagattctac tctgataact 2220
cagttcagag gaaaggattc caagctagtc acgcaactga atgcggtgga caagttagag 2280
cagatgttaa gactaaggat ctttactcac acgcacagtt cggagataac aactaccctg 2340
gaggagttga ttgcgagtgg gttattgtgg ctgaagaggg atacggagtt gagcttgttt 2400
tccagacatt cgaggtggag gaggaaactg attgcggtta cgattatatg gaactttttg 2460
atggatacga tagtactgct ccaagacttg gaaggtattg tggtagtggt ccaccagaag 2520
aggtgtactc agctggagat agtgttcttg ttaagttcca cagtgatgat acaattacta 2580
agaagggatt ccatcttaga tatacttcaa ctaagtttca ggatactctt cattctagga 2640
agtaatgagc tcgcggccgc atccaagctt ctgcagacgc gtcgacgtc 2689
<210> 40
<211> 2912
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence containing the coding regions of the human
Procollagen I N-proteinase and flanking regions
<400> 40
gcgccatggc tcaattgagg agaagggcta ggagacacgc agctgatgat gattacaaca 60
ttgaagtttt gcttggtgtt gatgatagtg tggtgcaatt ccacggaaaa gagcatgttc 120
agaaatatct tttgacactt atgaatattg tgaacgaaat ctaccatgat gagtctttgg 180
gagcacacat taacgtggtt cttgtgagga ttattcttct ttcatacggt aaatctatgt 240
cacttattga gattggaaac ccttctcagt ctcttgagaa tgtgtgcaga tgggcatacc 300
ttcaacagaa gcctgatact ggacacgatg agtatcacga tcacgctatt ttccttacaa 360
ggcaggattt cggtccaagt ggaatgcaag gatatgctcc tgttactggt atgtgccacc 420
ctgttaggtc ttgtacactt aaccacgagg atggtttttc atctgctttc gtggtggctc 480
atgagacagg tcatgttttg ggaatggaac atgatggaca gggtaataga tgtggagatg 540
aagtgagact tggttcaatt atggctcctc ttgttcaagc tgcttttcat aggttccact 600
ggagtaggtg ttcacagcaa gagttgagta gataccttca ttcttacgat tgcttgcttg 660
atgatccatt tgctcatgat tggccagctt tgcctcaact tcctggattg cactactcta 720
tgaacgagca gtgcagattt gatttcggtc ttggttacat gatgtgcaca gctttcagga 780
ctttcgatcc atgcaaacag ttgtggtgtt cacacccaga taacccatat ttctgtaaaa 840
caaaaaaagg tccaccactt gatggtacta tgtgcgcacc tggaaagcac tgcttcaagg 900
gacactgcat ttggcttact cctgatattc ttaaaaggga tggatcatgg ggagcttggt 960
ctccattcgg aagttgctca agaacttgcg gaacaggtgt taagtttaga actaggcagt 1020
gcgataatcc acaccctgct aatggtggta gaacttgctc tggacttgct tacgattttc 1080
agttgtgttc taggcaagat tgccctgata gtcttgctga ttttagagaa gagcaatgta 1140
gacagtggga tctttacttt gagcacggcg acgctcagca ccactggctt ccacacgagc 1200
atagagatgc aaaagaaagg tgtcaccttt attgcgagag tagagagact ggagaggtgg 1260
tgtcaatgaa gagaatggtg cacgatggta caaggtgttc ttataaggat gcattctctt 1320
tgtgtgtgag gggagattgc aggaaagtgg gttgtgatgg agtgattgga tctagtaagc 1380
aagaagataa gtgcggagtg tgcggaggag ataactctca ttgcaaggtt gtgaaaggaa 1440
cttttacaag atcaccaaaa aaacacggtt acattaagat gttcgaaatt cctgctggag 1500
caaggcattt gcttattcag gaagtggatg caacatctca ccacttggca gtgaaaaacc 1560
ttgagactgg aaaattcatt ttgaacgagg agaacgatgt tgatgcatct agtaagactt 1620
tcattgcaat gggtgttgaa tgggagtata gggatgagga tggaagggaa acacttcaaa 1680
caatgggtcc tcttcatgga acaattactg tgttggtgat tccagtggga gatacaaggg 1740
tgtcattgac atacaagtat atgattcacg aggatagtct taacgttgat gataacaacg 1800
ttttggaaga agattctgtg gtttacgagt gggctcttaa gaaatggtca ccttgctcta 1860
agccatgtgg tggaggaagt cagttcacta agtatggttg taggaggagg cttgatcata 1920
agatggttca taggggattt tgcgcagcac ttagtaagcc aaaggcaatt aggagggctt 1980
gtaaccctca agaatgctca caaccagttt gggtgacagg agagtgggag ccatgttcac 2040
aaacatgcgg aagaactgga atgcaagtta gatcagttag atgcattcaa cctcttcatg 2100
ataacactac aagaagtgtg cacgcaaaac actgtaacga tgctaggcca gagagtagaa 2160
gagcttgctc tagggaactt tgccctggta gatggagggc aggaccttgg agtcagtgct 2220
ctgtgacatg tggaaacggt actcaggaaa gacctgttcc atgtagaact gctgatgata 2280
gtttcggaat ttgtcaggag gaaaggccag aaacagctag gacttgtaga cttggacctt 2340
gtcctaggaa tatttctgat cctagtaaaa aatcatacgt ggtgcaatgg ttgagtaggc 2400
cagatccaga ttcaccaatt aggaagattt cttcaaaagg acactgccag ggtgataaga 2460
gtattttctg cagaatggaa gttcttagta ggtactgttc tattccaggt tataacaaac 2520
tttcttgtaa gagttgcaac ttgtataaca atcttactaa cgtggagggt agaattgaac 2580
ctccaccagg aaagcacaac gatattgatg tgtttatgcc tactcttcct gtgccaacag 2640
ttgcaatgga agttagacct tctccatcta ctccacttga ggtgccactt aatgcatcaa 2700
gtactaacgc tactgaggat cacccagaga ctaacgcagt tgatgagcct tataagattc 2760
acggacttga ggatgaggtt cagccaccaa accttattcc taggaggcca agtccttacg 2820
aaaaaactag aaatcagagg attcaggagc ttattgatga gatgaggaaa aaggagatgc 2880
ttggaaagtt ctaatgagct cgcggccgca tc 2912
<210> 41
<211> 4467
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 41
atggctcacg ctcgtgttct cctcctcgct ctcgctgttt tggcaacagc tgctgtggct 60
gtggcttcta gttcttcttt tgctgattca aaccctatta gacctgttac tgatagagca 120
gcttccactt tggctcaatt gcaagaggag ggccaggttg agggccaaga tgaggatatc 180
cctccaatta catgcgtgca aaatggcttg cgttaccacg atagggatgt gtggaaacct 240
gaaccttgtc gtatctgtgt gtgtgataac ggcaaggtgc tctgcgatga tgttatctgc 300
gatgagacaa aaaattgccc tggcgctgaa gttcctgagg gcgagtgttg ccctgtgtgc 360
cctgatggtt ccgagtcccc aactgatcag gaaactactg gcgtggaggg cccaaaagga 420
gatactggtc cacgtggtcc taggggtcca gcaggtcctc caggtagaga tggtattcca 480
ggccagcctg gattgccagg accaccaggc ccacctggcc caccaggacc tcctggtctt 540
ggtggaaatt tcgctccaca actctcttat ggctatgatg agaagtcaac aggtggtatt 600
tccgttccag gtcctatggg accatccgga ccaagaggtc tcccaggtcc tccaggtgct 660
cctggacctc aaggctttca aggacctcca ggcgaaccag gagaaccagg cgcttctgga 720
ccaatgggcc caaggggacc acctggccca ccaggaaaaa atggcgatga tggcgaagct 780
ggaaagcctg gtcgtcctgg agagagaggt cctcctggcc cacagggtgc aagaggcttg 840
ccaggaactg ctggcttgcc tggaatgaag ggacataggg gcttctccgg cctcgatggc 900
gctaagggtg atgctggccc tgctggacca aagggcgagc caggttcccc tggagaaaac 960
ggtgctcctg gacaaatggg tcctcgtgga cttccaggag aaaggggtcg tccaggcgct 1020
ccaggaccag caggtgctag gggaaacgat ggtgcaacag gcgctgctgg ccctcctggc 1080
ccaactggtc ctgctggccc tccaggattc ccaggcgcag ttggagctaa aggagaagca 1140
ggaccacagg gccctagggg ttctgaagga cctcagggtg ttagaggtga accaggtcct 1200
ccaggcccag ctggagcagc tggtccagca ggaaatccag gtgctgatgg tcaacctgga 1260
gctaagggcg ctaatggcgc accaggtatc gcaggcgcac caggttttcc tggcgctaga 1320
ggcccaagtg gtcctcaagg accaggtgga ccaccaggtc caaaaggcaa ttctggcgaa 1380
cctggcgctc caggttctaa aggagatact ggtgctaaag gcgaaccagg acctgttggt 1440
gttcagggtc ctcctggtcc tgctggagaa gaaggaaaaa gaggtgctcg tggagaacca 1500
ggaccaactg gacttcctgg acctcctggt gaacgtggcg gacctggctc aaggggtttc 1560
cctggagctg atggagtggc aggtccaaaa ggccctgctg gagagagagg ttcaccaggt 1620
ccagctggtc ctaagggctc ccctggtgaa gcaggtagac caggcgaagc aggattgcca 1680
ggcgcaaagg gattgacagg ctctcctggt agtcctggcc cagatggaaa aacaggccca 1740
ccaggtccag caggacaaga tggacgtcca ggcccaccag gtcctcctgg agcaagggga 1800
caagctggcg ttatgggttt tccaggacct aaaggtgctg ctggagagcc aggaaaggca 1860
ggtgaaagag gagttcctgg tccaccagga gcagtgggtc ctgctggcaa agatggtgaa 1920
gctggagcac agggccctcc aggccctgct ggcccagctg gcgaacgtgg agaacaaggc 1980
ccagctggta gtccaggatt tcaaggattg cctggccctg ctggccctcc aggagaagca 2040
ggaaaacctg gagaacaagg agttcctggt gatttgggag cacctggacc ttcaggagca 2100
cgtggtgaaa gaggcttccc tggcgagagg ggtgttcaag gtccaccagg tccagcagga 2160
cctagaggtg ctaatggcgc tcctggcaac gatggagcaa aaggtgatgc tggtgctcct 2220
ggcgcacctg gaagtcaggg tgctcctgga ttgcaaggaa tgcctggaga gaggggtgct 2280
gctggcttgc caggcccaaa gggcgatagg ggtgatgctg gaccaaaagg tgctgatgga 2340
tccccaggaa aagatggagt tcgtggtctt actggcccaa tcggacctcc aggccctgct 2400
ggcgctccag gtgataaggg cgaaagtggc ccaagtggac ctgctggacc tactggtgct 2460
agaggtgcac ctggtgatag gggtgaacct ggaccacctg gtccagctgg ttttgctggt 2520
cctcctggag ctgatggaca acctggcgca aagggtgaac caggtgatgc tggcgcaaag 2580
ggagatgctg gtccacctgg acctgctggt ccagcaggcc cccctgggcc aatcggtaat 2640
gttggagcac caggtgctaa gggagctagg ggttccgctg gtccacctgg agcaacagga 2700
tttccaggcg ctgctggtag agttggccca ccaggcccat ccggaaacgc aggccctcct 2760
ggtcctccag gtcctgctgg caaggagggt ggcaaaggac caaggggcga aactggccct 2820
gctggtagac ctggcgaagt tggccctcct ggaccaccag gtccagcagg agaaaaaggt 2880
tccccaggag ctgatggccc agctggtgct ccaggaactc caggccctca aggtattgct 2940
ggacagagag gcgttgtggg actccctggt caaaggggag agagaggatt tccaggcttg 3000
ccaggaccta gtggagaacc tggaaaacaa ggcccatcag gcgctagtgg agagcgtgga 3060
cctcctggcc ctatgggacc tcctggattg gctggcccac ctggcgaatc aggtcgtgaa 3120
ggcgcaccag gcgcagaagg atcacctgga agagatggat cccctggtgc taaaggcgat 3180
cgtggagaaa ctggtccagc aggcccacca ggcgcaccag gtgcacctgg cgctccagga 3240
cctgtgggac cagctggaaa atccggagat aggggcgaga caggcccagc aggaccagct 3300
ggacctgttg gccctgctgg cgctcgtgga ccagcaggac ctcaaggacc aaggggagat 3360
aagggagaaa caggcgaaca aggcgatagg ggcattaagg gtcatagggg ttttagtggc 3420
ctccagggtc ctcctggccc acctggatca ccaggagaac agggaccatc tggtgcttcc 3480
ggcccagctg gtccaagagg acctccagga tcagctggtg cacctggaaa agatggtctt 3540
aacggtctcc caggaccaat cggccctcca ggacctagag gaagaacagg agatgctggc 3600
cctgttggcc ctccaggacc tcctggtcca ccaggtccac ctggtcctcc atcagctgga 3660
ttcgattttt catttcttcc acagccacca caagagaaag ctcacgatgg cggcagatat 3720
taccgtgctg atgatgctaa cgttgttagg gatagagatt tggaagtgga tacaactttg 3780
aaatccctct cccagcaaat tgaaaacatt agatctccag aaggttcacg taaaaaccca 3840
gctagaacat gtcgtgattt gaaaatgtgt cactccgatt ggaaaagtgg tgaatactgg 3900
attgatccaa atcagggctg taatctcgat gctatcaaag ttttctgtaa catggaaaca 3960
ggcgaaacat gcgtttatcc tactcaacct tccgtggctc agaaaaattg gtacatctca 4020
aaaaatccta aagataagag gcacgtttgg ttcggtgaaa gtatgactga tggatttcaa 4080
tttgagtacg gcggtcaagg tagtgatcca gctgatgtgg ctattcaact cacatttttg 4140
cgtcttatgt ccacagaggc atcacaaaac atcacttacc actgcaaaaa cagtgtggct 4200
tatatggatc aacaaacagg aaaccttaag aaggctcttc ttttgaaggg ctcaaacgag 4260
attgagatta gagcagaggg caactcaagg tttacttatt cagttactgt tgatggctgc 4320
acttcacata ctggcgcttg gggtaaaaca gttatcgagt ataagactac aaaaacatca 4380
agactcccaa tcattgatgt tgctcctctc gatgttggcg ctcctgatca agagttcggt 4440
tttgatgtgg gcccagtttg tttcctc 4467
<210> 42
<211> 4167
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 42
atggctcacg ctcgtgttct cctcctcgct ctcgctgttt tggcaacagc tgctgtggct 60
gtggcttcaa gttctagttt tgctgattcc aacccaattc gtccagttac tgatagagca 120
gcttccactt tggctcaatt gcttcaagaa gaaactgtga ggaagggccc tgctggcgat 180
aggggcccta ggggcgaaag gggtccacca ggacctccag gcagggatgg cgaagatggt 240
ccaactggcc ctcctggacc tcctggccct ccagggccac ccggcttggg cggaaacttc 300
gcagctcaat acgatggcaa gggtgttggt cttggtcctg gtcctatggg cttgatggga 360
cctagaggcc cacctggtgc tgctggtgct cctggaccac agggttttca gggaccagct 420
ggcgagccag gagagccagg ccaaacagga ccagctggtg caaggggacc tgctggacct 480
cctggaaaag ctggtgaaga tggtcaccca ggcaaaccag gacgtcctgg cgaaagaggt 540
gttgttggac cacaaggcgc taggggattt ccaggtacac ctggattgcc aggttttaag 600
ggcattcgtg gtcataacgg cctcgatgga ttgaagggac agcctggcgc acctggcgtt 660
aagggtgaac ctggagcacc aggtgaaaac ggtactcctg gccagactgg tgcaagagga 720
ctcccaggtg aaaggggtag agttggtgct cctggacctg ctggagctag gggtagtgat 780
ggtagtgttg gtcctgtggg ccctgctggt ccaatcggtt ccgctggccc acctggattc 840
ccaggcgctc caggacctaa aggagaaatc ggtgctgtgg gtaacgcagg tcctactggt 900
ccagcaggtc ctcgtggaga agtgggattg ccaggacttt ctggtccagt gggccctcca 960
ggcaaccctg gagctaacgg cttgacagga gctaaaggcg cagcaggact ccctggagtg 1020
gctggcgcac caggattgcc tggtccaagg ggtatcccag gccctgttgg cgcagctgga 1080
gctactggtg cacgtggact tgttggcgaa ccaggccctg ctggatcaaa aggcgagtct 1140
ggaaataagg gagaacctgg ttctgctgga cctcaaggtc ctcctggacc ttctggagaa 1200
gaaggaaaaa ggggaccaaa tggcgaggct ggatcagcag gtccaccagg accacctgga 1260
cttcgtggat cccctggtag tagaggactt ccaggcgctg atggtagagc aggcgttatg 1320
ggaccaccag gaagtagagg agcatccggt ccagcaggag ttaggggtcc taacggagat 1380
gctggtagac caggtgaacc aggtcttatg ggcccaaggg gcctcccagg tagtccagga 1440
aatatcggcc ctgctggaaa agaaggccct gttggacttc caggtattga tggacgtcct 1500
ggccctattg gcccagcagg tgcaagagga gaacctggca atattggatt tccaggacca 1560
aagggtccaa caggcgatcc tggaaaaaat ggagataagg gtcatgctgg attggcaggc 1620
gcaaggggcg ctcctggtcc agatggaaac aacggcgcac agggtccacc tggccctcag 1680
ggtgttcaag gcggaaaagg cgaacaaggc ccagctggac caccaggctt tcaaggcttg 1740
ccaggaccaa gtggtccagc aggtgaagtt ggcaagccag gcgagcgtgg acttcatggc 1800
gagtttggac tccctggacc agcaggacca aggggtgaaa gaggccctcc tggagagagt 1860
ggcgctgctg gaccaacagg cccaatcggt agtagaggtc ctagtggacc tccaggccca 1920
gatggaaata agggtgaacc aggagttgtg ggcgctgttg gaacagctgg tccttcagga 1980
ccatcaggac tcccaggcga gagaggcgct gctggcattc ctggaggaaa aggtgaaaaa 2040
ggcgaacctg gcctccgtgg cgaaatcgga aatcctggac gtgatggtgc tcgtggtgca 2100
cacggcgctg tgggcgctcc aggccctgct ggtgctactg gtgatagagg agaggctggc 2160
gcagctggcc cagcaggtcc tgctggccca aggggtagtc ctggtgaaag aggcgaagtt 2220
ggacctgctg gccctaacgg ctttgctggc cctgctggag cagcaggtca acctggcgct 2280
aaaggtgaaa ggggcggaaa gggcccaaaa ggtgaaaatg gcgttgtggg accaactggt 2340
ccagtgggcg cagctggacc tgctggtcca aatggaccac caggaccagc aggtagtaga 2400
ggagatggtg gacctccagg aatgacaggt tttccaggtg ctgctggtag aacaggacct 2460
cctggtccta gtggtatttc tggtccacca ggaccaccag gtcctgctgg aaaagaagga 2520
ttgaggggtc cacgtggtga tcaaggacca gtgggcagaa ctggtgaagt tggcgcagtg 2580
ggaccacctg gttttgctgg agaaaagggc ccttctggag aggcaggaac agctggtcct 2640
cctggtacac ctggacctca aggacttttg ggtgcacctg gtattctcgg attgccagga 2700
agtaggggcg aacgtggact tcctggcgtg gcaggagcag ttggagaacc tggccctctc 2760
ggaatcgcag gcccaccagg cgcaagagga ccaccaggag ctgttggatc accaggcgtg 2820
aatggtgcac ctggcgaggc tggtcgtgat ggaaacccag gaaatgatgg cccaccagga 2880
agagatggtc aacctggaca caaaggcgag aggggctacc caggaaatat tggcccagtt 2940
ggtgctgctg gcgcaccagg cccacacggt ccagttggac cagcaggaaa acacggtaat 3000
cgtggcgaaa caggcccttc aggcccagtg ggacctgctg gtgctgttgg cccaagagga 3060
ccatctggac ctcaaggcat tagaggcgat aagggagagc ctggcgaaaa aggacctaga 3120
ggcttgcctg gttttaaagg acacaacggt ctccaaggac ttccaggtat cgctggtcat 3180
catggagatc agggtgctcc tggatcagtg ggtccagcag gtcctagagg cccagcaggc 3240
ccttccggtc cagcaggaaa ggatggacgt actggccacc ctggaactgt gggccctgct 3300
ggaattagag gtcctcaagg tcatcagggc cctgctggcc ctccaggtcc accaggtcct 3360
ccaggcccac caggagtttc aggtggtggt tacgattttg gttacgatgg tgatttttac 3420
cgtgctgatc aacctagaag tgctccttct ctccgtccta aagattatga agttgatgct 3480
actttgaaat cacttaacaa ccagattgag actcttctca cacctgaggg atcaagaaag 3540
aatccagcac gtacatgccg tgatctcaga cttagtcacc cagagtggtc aagtggctat 3600
tattggattg atcctaatca gggttgtaca atggaggcta tcaaagttta ctgtgatttt 3660
ccaactggag agacatgtat tagggcacaa cctgagaaca ttccagctaa aaattggtat 3720
cgttcctcta aagataagaa acatgtttgg ctcggagaga ctattaacgc tggttctcag 3780
ttcgagtata atgttgaggg cgttacttct aaagagatgg caactcagct cgcttttatg 3840
agattgctcg ctaactacgc atcccaaaac atcacttatc actgcaaaaa ttccattgca 3900
tatatggatg aggagacagg aaatttgaag aaagcagtta ttctccaagg tagtaacgat 3960
gttgagcttg tggctgaggg aaatagtaga ttcacttaca cagttttggt ggatggatgc 4020
tcaaagaaaa ctaatgagtg gggcaagaca atcattgagt acaagacaaa taagccttct 4080
aggctcccat ttctcgatat tgcacctctt gatatcggag gagctgatca cgagtttttt 4140
gttgatatcg gacctgtttg ttttaag 4167
Claims (33)
- 이중 가교된 진피 충전제로서,
(a) 식물-유래 인간 콜라겐; 및
(b) 가교(crosslinked) 히알루론산
을 포함하고, 여기서, 상기 식물-유래 인간 콜라겐은 가교 히알루론산에 가교되는, 이중 가교된 진피 충전제. - 제1항에 있어서,
(a) 상기 식물-유래 인간 콜라겐은 1형 재조합 인간 콜라겐(rh콜라겐)을 포함하거나;
(b) 상기 가교 히알루론산은 가교 히알루론산 및 비-가교 히알루론산을 포함하거나;
(c) 이들의 조합인, 이중 가교된 진피 충전제. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
(a) 상기 가교 히알루론산을 연결시키는 가교제는 상기 식물-유래 인간 콜라겐을 가교 히알루론산과 연결시키는 가교제와 상이하거나;
(b) 상기 가교 히알루론산 : 상기 식물-유래 인간 콜라겐의 비는 6:1 내지 1:6 범위를 포함하거나;
(c) 상기 가교 히알루론산의 농도는 5 mg/ml 내지 50 mg/ml 범위이거나;
(d) 이들의 조합인, 이중 가교된 진피 충전제. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루론산을 가교시키는 가교제 및 식물-유래 인간 콜라겐을 가교시키는 가교제는 독립적으로, 1, 4-부탄디올 디글리시딜 에테르(BDDE), 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카르보디이미드 메트요오다이드(EDC), Ν,Ν'-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC), Ν,Ν'-디이소프로필카르보디이미드(DIC), 디비닐 설폰(DVS) 또는 글루타르알데하이드로부터 선택되는, 이중 가교된 진피 충전제.
- 가교 히알루론산에 가교된 식물-유래 인간 콜라겐을 포함하는 이중 가교된 진피 충전제를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은,
(a) 히알루론산을 가교시키는 단계;
(b) 가교 히알루론산을 중화시키는 단계;
(c) 식물-유래 인간 콜라겐을 중화시키는 단계;
(d) 중화된 가교 히알루론산을 중화된 식물-유래 인간 콜라겐과 혼합하는 단계;
(e) 더 낮은 분자량의 히알루론산(MW HA)을 첨가하는 단계;
(f) 가교 히알루론산과 식물-유래 인간 콜라겐의 믹스를 가교시키는 단계; 및
(g) 이중 가교된 가교 히알루론산-식물-유래 인간 콜라겐 진피 충전제를 투석시키는 단계를 포함하는, 방법. - 제5항에 있어서,
(a) 상기 식물-유래 인간 콜라겐은 1형 재조합 인간 콜라겐(rh콜라겐)을 포함하거나;
(b) 상기 단계 (a)의 가교 히알루론산을 연결시키는 가교제는 상기 단계 (f)의 식물-유래 인간 콜라겐을 가교 히알루론산과 연결시키는 가교제와 상이하거나;
(c) 이들의 조합인, 방법. - 제5항 또는 제6항에 있어서,
(a) 상기 가교 히알루론산 : 상기 식물-유래 인간 콜라겐의 비는 6:1 내지 1:6 범위를 포함하거나;
(b) 히알루론산을 가교시키는 가교제 및 식물-유래 인간 콜라겐을 가교시키는 가교제는 독립적으로, 1, 4-부탄디올 디글리시딜 에테르(BDDE), 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카르보디이미드 메트요오다이드(EDC), Ν,Ν'-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC), Ν,Ν'-디이소프로필카르보디이미드(DIC), 디비닐 설폰(DVS) 또는 글루타르알데하이드로부터 선택되거나;
(c) 이들의 조합인, 방법. - 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 상기 방법은,
(a) 중합성 용액을 상기 조직 공간 내로 도입하는 단계로서, 상기 중합성 용액이,
(i) 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐;
(ii) 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 유도체, 산화된 셀룰로스(OC) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체 또는 이의 변형된 유도체, 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 이의 변형된 유도체, 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA) 또는 이의 변형된 유도체, 카르복시메틸셀룰로스 또는 이의 변형된 유도체, 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 이의 변형된 유도체, 또는 이들의 조합; 및
(iii) 광개시제를 포함하는, 단계; 및
(b) 상기 공간에 대해 피상적인 표피의 표면에 광을 적용하여, 중합을 유도하는 단계를 포함하는, 방법. - 제8항에 있어서, 상기 중합성 용액 구성요소는 대략 동일한 장소 및 대략 동일한 시기에 혼합물로서 함께 또는 독립적으로 상기 조직 공간 내로 도입되며, 상기 조직 공간 내로 독립적으로 도입되는 경우,
(a) 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐 및 광개시제는 함께 그리고 독립적으로 도입되고,
(b) 상기 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 유도체, 상기 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 유도체, 상기 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 유도체, 산화된 셀룰로스(OC) 또는 상기 이의 변형된 유도체, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체 또는 상기 이의 변형된 유도체, 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 상기 이의 변형된 유도체, 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA) 또는 상기 이의 변형된 유도체, 카르복시메틸셀룰로스 또는 상기 이의 변형된 유도체, 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 상기 이의 변형된 유도체, 또는 상기 이들의 조합은 대략 동일한 시기에 독립적으로 상기 조직 공간 내로 도입되는, 방법. - 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 중합성 용액 또는 상기 중합성 용액의 구성요소를 상기 조직 공간 내의 요망되는 배치(configuration) 내로 성형하거나(molding) 형상화하는(sculpting) 단계를 추가로 포함하며, 상기 단계는 광을 적용하는 단계와 동시적이거나 이에 후속적인, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 방법은 비-치료적이고, 상기 성형하거나 형상화하는 단계는 주름(line), 접힘(fold), 잔주름, 주름살(wrinkle) 또는 흉터, 또는 이들의 조합을 감소시키는, 방법.
- 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 상기 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐은 메타크릴레이트화된 또는 티올화된 1형 인간 재조합 콜라겐(rh콜라겐)이거나;
(b) 상기 히알루론산(HA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 산화된 셀룰로스(OC), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체, 트리칼슘 포스페이트(TCP), 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA), 카르복시메틸셀룰로스, 또는 결정질 나노셀룰로스(CNC)의 변형된 유도체는 메타크릴레이트화된 유도체 또는 티올화된 유도체를 포함하거나;
(c) 상기 히알루론산(HA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 산화된 셀룰로스(OC), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체, 트리칼슘 포스페이트(TCP), 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA), 카르복시메틸셀룰로스, 또는 결정질 나노셀룰로스(CNC)는 가교 히알루론산(HA), 가교 폴리(비닐 알코올)(PVA), 가교 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 가교 산화된 셀룰로스(OC), 가교 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체, 가교 트리칼슘 포스페이트(TCP), 가교 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA), 가교 카르복시메틸셀룰로스, 또는 가교된 결정질 나노셀룰로스(CNC)를 포함하거나;
(d) (a)와 (b)의 조합, 또는 (a)와 (c)의 조합인, 방법. - 제12항에 있어서, MA-rh콜라겐이 선택되는 경우, 그리고 히알루론산이나 이의 유도체 또는 가교 히알루론산이나 히알루론산의 가교된 유도체가 선택되는 경우, HA나 이의 유도체 또는 가교 HA나 이의 가교 HA 유도체의 유도체 : MA-rh콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1인, 방법.
- 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 상기 방법은,
(a) 중합성 용액을 상기 조직 공간 내로 도입하는 단계로서, 상기 중합성 용액이,
(i) 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐; 및
(ii) 광개시제를 포함하는, 단계;
및
(b) 상기 공간에 대해 피상적인 표피의 표면에 광을 적용하여, 중합을 유도하는 단계를 포함하는, 방법. - 제14항에 있어서, 상기 중합성 용액을 상기 조직 공간 내의 요망되는 배치로 성형하거나 형상화하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 단계는 광을 적용하는 단계와 동시적이거나 이에 후속적인, 방법.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 방법은 비-치료적이고, 상기 성형하거나 형상화하는 단계는 주름, 접힘, 잔주름, 주름살 또는 흉터, 또는 이들의 조합을 감소시키는, 방법.
- 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐은 메타크릴레이트화된 또는 티올화된 1형 인간 재조합 콜라겐(rh콜라겐)인, 방법.
- 표피 아래의 조직 공간을 충전시키는 방법으로서, 상기 방법은 이중 가교된 진피 충전제를 상기 조직 공간 내로 도입하는 단계를 포함하고, 상기 이중 가교된 진피 충전제는,
(a) 식물-유래 인간 콜라겐; 및
(b) 가교 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 산화된 셀룰로스(OC) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 카르복시메틸셀룰로스 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교된 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 또는 이들의 조합을 포함하며;
상기 식물-유래 인간 콜라겐은 가교된 가교 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 산화된 셀룰로스(OC) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA) 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교 카르복시메틸셀룰로스 또는 이의 변형된 가교 유도체, 가교된 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 이의 변형된 가교 유도체에 가교되는, 방법. - 제18항에 있어서,
(a) 상기 식물-유래 인간 콜라겐은 1형 인간 재조합 콜라겐(rh콜라겐), 또는 이의 MA 또는 티올화된 유도체이거나;
(b) 상기 히알루론산(HA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 산화된 셀룰로스(OC), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체, 트리칼슘 포스페이트(TCP), 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA), 카르복시메틸셀룰로스, 또는 결정질 나노셀룰로스(CNC)의 변형된 유도체는 메타크릴레이트화된 유도체 또는 티올화된 유도체를 포함하거나;
(c) 이들의 조합인, 방법. - 제18항 또는 제19항에 있어서, 가교 HA가 선택되는 경우, 상기 가교 HA : 상기 식물-유래 인간 콜라겐의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 또는 0:1인, 방법.
- 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 비-치료적이고, 상기 방법은 주름, 접힘, 잔주름, 주름살 또는 흉터, 또는 이들의 조합을 감소시키는, 방법.
- 조직 강화에 사용하기 위한 중합성 용액 또는 비-중합성 용액으로서,
(a) 상기 중합성 용액은,
(i) 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐,
(ii) 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 유도체, 산화된 셀룰로스(OC) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체 또는 이의 변형된 유도체, 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 이의 변형된 유도체, 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA) 또는 이의 변형된 유도체, 카르복시메틸셀룰로스 또는 이의 변형된 유도체, 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 이의 변형된 유도체, 또는 이들의 조합, 및
(iii) 가시광의 적용 전에 또는 이와 동시에 중합을 유도하기 위한 광개시제를 포함하거나,
(b) 상기 비-중합성 용액은 식물-유래 인간 콜라겐, 및 가교 히알루론산, 가교 PVA, 가교 PGE 또는 가교 OC를 포함하는 이중 가교된 진피 충전제를 포함하며, 상기 식물-유래 인간 콜라겐은 상기 가교 히알루론산, 상기 가교 PVA, 상기 가교 PGE 또는 상기 가교 OC에 가교되고;
상기 사용은 상기 중합성 용액 또는 비-중합성 용액을 표피 아래의 조직 공간 내로 주사하고, 뒤이어 상기 중합성 용액 또는 비-중합성 용액을 요망되는 배치로 성형하거나 형상화하여, 주름, 접힘, 잔주름, 주름살 또는 흉터를 감소시키는 단계를 포함하는, 중합성 용액 또는 비-중합성 용액. - 제22항에 있어서,
(a) 상기 가교성, 식물-유래 인간 콜라겐은 메타크릴레이트화되거나 티올레이트화되거나;
(b) 상기 HA, PVA, PEG, PMMA, TCP, CaHA, 또는 CNC의 유도체는 메타크릴레이트화된 유도체 또는 티올화된 유도체를 포함하거나;
(c) 상기 HA, PVA, PEG, PMMA, TCP, CaHA, 또는 CNC의 유도체는 가교된 유도체를 포함하거나;
(d) 이들의 조합인, 중합성 용액 또는 비-중합성 용액. - 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 조직 강화는 임의의 의학적 또는 치과적 상태의 결과로서 요구되며, 상기 치과적 상태는 잇몸 질환 또는 잇몸 교체를 포함하는, 중합성 용액 또는 비-중합성 용액.
- 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 강화는 주름, 접힘, 잔주름, 주름살 또는 흉터, 또는 이들의 조합을 감소시키는, 중합성 용액 또는 비-중합성 용액.
- 표피 아래의 조직 공간에서 세포성 성장 촉진 스캐폴드를 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 용액을 상기 조직 공간 내로 도입하는 단계를 포함하며, 상기 용액은,
(a) 식물-유래 인간 콜라겐; 및
(b) 적어도 하나의 성장 인자 또는 이의 공급원을 포함하며,
상기 방법은 콜라겐-포함 조직의 치유 또는 교체를 촉진하는, 방법. - 제26항에 있어서,
(a) 상기 식물-유래 콜라겐은 1형 재조합 인간 콜라겐(rh콜라겐)을 포함하거나;
(b) 상기 적어도 하나의 성장 인자의 공급원은 혈장 또는 혈소판-풍부 혈장을 포함하거나;
(c) 상기 콜라겐-포함 조직은 피부를 포함하거나;
(d) 이들의 임의의 조합인, 방법. - 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 rh콜라겐은 이의 메타크릴레이트 또는 티올 유도체를 포함하는, 방법.
- 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은
(a) 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 유도체, 산화된 셀룰로스(OC) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체 또는 이의 변형된 유도체, 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 이의 변형된 유도체, 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA) 또는 이의 변형된 유도체, 카르복시메틸셀룰로스 또는 이의 변형된 유도체, 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 이의 변형된 유도체, 또는 이들의 조합, 및
가시광의 적용 전에 또는 이와 동시에 중합을 유도하기 위한 광개시제; 또는
(b) 가교 히알루론산, 가교 PVA, 가교 PGE 또는 가교 OC를 추가로 포함하며, 상기 식물-유래 인간 콜라겐은 상기 가교 히알루론산, 상기 가교 PVA, 상기 가교 PGE 또는 상기 가교 OC에 가교되는, 방법. - 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 비-치료적이고, 상기 세포성 성장 촉진 스캐폴드는 조직 공간에서 충전되어, 주름, 접힘, 잔주름, 주름살 또는 흉터, 또는 이들의 조합을 감소시키는, 방법.
- 세포성 성장 촉진 스캐폴드를 유도하는 데 사용하기 위한 용액으로서, 상기 용액은 식물-유래 인간 콜라겐 및 적어도 하나의 성장 인자 또는 이의 공급원을 포함하며, 상기 사용은 상기 용액을 피부 아래의 조직 공간 내로 주사하는 단계를 포함하고, 상기 사용은 콜라겐-포함 조직의 분해 또는 상해로 인한 치유 또는 교체를 촉진하기 위한 것인, 용액.
- 제31항에 있어서,
(a) 상기 적어도 하나의 성장 인자의 공급원은 혈장 또는 혈소판-풍부 혈장을 포함하거나;
(b) 상기 식물-유래 콜라겐은 1형 재조합 인간 콜라겐(rh콜라겐)을 포함하거나;
(c) 상기 콜라겐-포함 조직은 피부를 포함하거나;
(d) 이들의 조합인, 용액. - 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 사용을 위한 용액은
(a) 히알루론산(HA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 변형된 유도체, 산화된 셀룰로스(OC) 또는 이의 변형된 유도체, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 미소구체 또는 이의 변형된 유도체, 트리칼슘 포스페이트(TCP) 또는 이의 변형된 유도체, 칼슘 하이드록실아파타이트(CaHA) 또는 이의 변형된 유도체, 카르복시메틸셀룰로스 또는 이의 변형된 유도체, 결정질 나노셀룰로스(CNC) 또는 이의 변형된 유도체, 또는 이들의 조합, 및
가시광의 적용 전에 또는 이와 동시에 중합을 유도하기 위한 광개시제; 또는
(b) 가교 히알루론산, 가교 PVA, 가교 PGE 또는 가교 OC를 추가로 포함하며, 상기 식물-유래 인간 콜라겐은 상기 가교 히알루론산, 상기 가교 PVA, 상기 가교 PGE 또는 상기 가교 OC에 가교되는, 용도.
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