KR20210047891A - 상추 엽록체에서 무 항생제 생물약제의 생산을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
상추 엽록체에서 무 항생제 생물약제의 생산을 위한 조성물 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
식용 식물의 색소체에서 무 마커 생물약제 단백질을 생산하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 또한 질환의 치료를 위해 필요로 하는 대상체에게 이러한 단백질을 경구 투여하기 위한 방법이 제공된다.
Description
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출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2018년 8월 22일에 출원된 미국 가특허 번호 62/721,174에 대한 우선권을 주장하며, 전체 개시내용은 전부 제시된 바와 같이 참조로 포함된다.
전자 양식으로 제출된 자료의 참조에 의한 포함
출원인은 참조로 본원에 전자 양식으로 제출된 서열 목록 자료를 본원에 포함시킨다. 파일은 "6610WO00.txt"라고 라벨링되어 있으며, 2019년 8월 18일에 생성되었고, 5,881 바이트이다.
연방 정부에 의해
후원된
연구의 성명서
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 RO1 GM 63879, RO1 EY024564, RO1, HL 107904, R01 HL 109442, RO1 133191 하에서의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권한을 갖는다.
본 발명의 분야
본 발명은 고등 식물 엽록체에서의 생물 약제의 생산에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 선택 가능한 마커 유전자가 결여된 고등 식물의 색소체에서 치료 단백질의 생산을 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명이 속한 분야의 상태를 기재하기 위해 명세서 전반에 걸쳐 여러 간행물 및 특허 문서가 인용된다. 이들 인용문 각각은 전부 제시된 바와 같이 본원에 참조로 포함된다.
IGF-1 (인슐린-유사 성장 인자-1)은 IGF-1 수용체에 결합할 때 근육 형성, 근육량 및 강도, 손상 후 재생, 및 근육 건강의 유지에 있어서 중요한 역할을 한다. IGF1은 근섬유 형성에 관한 단백질 합성을 조절하는 것뿐만 아니라 근섬유 상에서 위성 세포의 증식을 증진시킴으로써 골격근의 성장 및 회복을 촉진한다. 위성 세포가 분화된 후, 그것들은 근섬유 상의 손상된 영역에 융합하여 회복시키거나 새로운 섬유 세포를 생성한다 (Bikle et al., 2015). 실제로, 설치류 근육 모델에서 IGF-1 수준을 증진시키는 것은 근육 강도의 기능적 개선을 입증하였고 섬유증(fibrosis)을 제한하였다 (Barton et al., 2002). 또한, 24주 동안 피하 주사를 통한 IGF-1/IGF-1 결합 단백질 복합체로의 1형 근긴장성 이영양증(myotonic dystrophy type 1) 환자의 치료는 체질량 및 대사를 증가시켰다 (Heatwole et al., 2011).
IGF-1는 근육의 형성에 대해 기능하는 것뿐만 아니라 골 재형성 및 생성을 활성화시킨다. IGF-1의 조건적 결실은 마우스에서 골아세포 수, 활성, 및 골 질량을 감소시켰다 (Givoni et al., 2007). 그에 반해, IGF-1의 과발현은 골 부피 및 재형성을 증가시켰다 (Jiang et al., 2006). 이것들 외에, IGF-1의 국소 전달은 래트 골절 치유 모델에서 골 형성을 가속화시킨다 (Schmidmaier et al., 2002). 더욱이, 환자에서 IGF-1 투여는 골 치유를 증가시켰으며, 고관절 또는 경골 골절을 빠르게 임상적으로 개선하였다 (Locatelli et al., 2014). 이에 더하여, IGF-1은 골 재흡수 용골 세포 및 골 형성 골아세포에서 생존, 증식, 분화를 촉진한다. 이전의 연구에서는 감소한 순환 IGF-1이 골 밀도를 감소시키는 것으로 나타났다 (Tahimic et al., 2013). IGF-1은 또한 치근 발달 및 치근 상아질 줄기 세포를 조절한다. 외인성 IGF-1은 단리된 인간 치근 줄기 세포의 증식 및 분화를 자극하였다 (Wang et al., 2012). 위성 세포의 증식/분화 및 근육 생성에 있어서의 IGF-1의 상기 언급된 역할은, 치근 발달을 포함한 골 성장/재형성과 함께, 다수의 근육 장애, 뿐만 아니라 골격 골 질환 및 치주 질환에 대한 치료제로서의 가능성을 향상시킬 수 있다. 세포외 매트릭스에서 세 가지 형태로 존재한다: e-펩타이드를 함유하는 전구체 IGF-1 (Pro-IGF-1), N-글리코실화를 갖는 Pro-IGF-1 (Gly-Pro-IGF-1), 및 성숙한 IGF-1 (Philippou et al., 2014). 그것의 체류로 인해, e-펩타이드 단독에 대해 또는 전구체에 대한 e-펩타이드의 잠재적인 생물학적 활성이 드러났다. 이전의 연구에서는 e-펩타이드를 가진 Pro-IGF-1이 근육 장애 치료에 대한 긍정적인 효과 및 성숙한 IGF-1보다 IGF-1R로의 결합의 증가를 입증하는 반면 Gly-Pro-IGF-1이 IGF-1R 활성화에서 더 작은 효율을 나타내는 것으로 나타났다 (Durzynska et al., 2013; Philippou and Barton, 2014). 근육 치료에 대한 임상 시험에서 현재의 IGF-1은 매일 피하 주사를 통해 전달되지만 기능적 효율에 필요한 e-펩타이드가 결여된다 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01207908, Philippou and Barton, 2014). 식물 세포에서 경구로 전달 가능한 IGF-1가 바람직한데 환자가 매일 주사를 방지하여 환자의 수용 상태, 특히 장기간 동안 투여되는 근육 장애에 필요한 치료 또는 골 치유를 증가시키기 때문이다. 색소체 전환(transplastomic) 식물에서 발현된 단백질 약물은 동결건조 이후 주위 온도에서 효험을 유지하면서 수년 동안 저장될 수 있다 (Su et al., 2015 and Herzog et al., 2017). 소화기 계통의 세포벽에 의해 부여된 보호는 이러한 약물의 경구 전달을 가능하게 한다. 그것들은 소화관 박테리아가 식물 세포벽을 용해시킬 때 표적 세포 또는 조직으로 전달될 수 있다 (Daniell et al., 2016 and Kwon et al., 2016). 이러한 천연의 과정은 엄청나게 비싼 발효, 정제, 및 냉장 보관/수송에 대한 필요성을 제거한다 (Daniell et al., 2016a; Daniell et al., 2016b). 귀중한 농경학적 특성, 효소의 발현, 생물약제, 또는 다른 고 부가 가치 제품을 도입하기 위해 엽록체 유전 공학이 지난 30년 동안 개발되고 발전되었다 (Clarke et al., 2017; Daniell et al., 2016a; Daniell et al., 2016b; Jin and Daniell, 2015).
상기 기재된 접근법에 대한 중요한 문제는 색소체 전환 라인(line)의 선택, 그리고 동형 세포질성(homoplasmy)을 달성하는데 필요한 색소체 전환 게놈 내의 항생제 저항성 유전자 (aadA)의 존재이다 (Daniell et al., 2016a; Jin and Daniell, 2015). 이들 항생제 저항성 유전자는 인간 임상 시험에서 이들 약물을 발전시키는데 중요한 장애물이 된다. 이것은 aadA 유전자의 수천 개의 카피가 각각의 세포 내에 존재할 때 도전이 될 수 있다. 지금까지 색소체 전환 담배 게놈으로부터 선택 가능한 마커 유전자를 제거하기 위해서 두 가지 상이한 접근법이 사용되었다. 엽록체 내에 존재하는 내인성 상동 재조합 시스템에 의해 aadA 유전자를 루프 아웃(loop out)시키기 위해 플랭킹(flanking) 서열의 직접 반복부의 사용이 사용되었다 (Day and Goldschmidt-Clermont, 2011). 대안으로, CRE (Corneille et al., 2001) 또는 Bxb1 재조합 효소 (Shao et al., 2014) 및 Lox 또는 attP/attB 부위가 담배 엽록체 게놈의 작은 단일 카피 영역 또는 역반복 영역으로부터 aadA 유전자를 제거하는데 사용되었다. 하지만, Lox 또는 attP/attB 및 재조합 효소의 사용은 핵 게놈에서의 비-상동 재조합, 외인성 재조합 효소의 통합 또는 사용 및 재조합 효소 발현을 위한 식물 병원체 또는 병원체 서열 (바이러스 프로모터)의 사용으로 인한 고유한 유전자의 의도하지 않은 절제 또는 변화 때문에 마커 유전자 절제 과정의 규제 승인을 복잡하게 만든다. 뚜렷하게 대조적으로, 엽록체 형질전환 과정은 식물 병원체 또는 식물 병원체 규제 시퀀스의 사용 부족으로 인해 USDA-APHIS 7CFR 파트 340 규제에서 면제되었다. 하지만, 엽록체 게놈을 통해 생물약제를 발현하는 식용 농작물에서 단일 단계 마커 유전자 제거는 아직 달성되지 않았다.
본 발명에 따르면, 색소체에서 구강 소비를 위한 무 항생제 생물약제를 생산하는 색소체 전환 식물을 생성하기 위한 방법이 제공된다. 예시의 방법은 색소체 형질전환 벡터를 식물 세포로 도입하는 단계를 포함하며, 벡터는 색소체 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 항생제를 암호화하는 선택 가능한 마커 유전자를 포함하고, 선택 가능한 마커 유전자 및 프로모터는 길이가 500-800개의 뉴클레오타이드인 직접 반복되는 DNA 서열에 의해 플랭킹되고, 상기 벡터는 생물약제 단백질 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 색소체 프로모터를 포함하는 이종성 핵산을 더 포함하며, 관심있는 단백질은 선택적으로 표적화 펩타이드를 포함하거나, 또는 단백질을 암호화하는 핵산은 상기 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 벡터를 포함하는 식물 세포는 순(shoot) 생산이 일어나기에 적합한 기간 동안 재생 배지 내에서 항생제의 존재 하에 배양된다. 선택 가능한 마커 유전자 절제를 확인하기 위해 순을 평가한 다음 뿌리 성장을 유도하기에 적합한 무 항생제 배지로 옮겼다. 그 다음에 선택 가능한 마커 유전자가 결여된 관심있는 단백질을 발현하는 색소체 전환 식물을 생성하고 후속 세대에서 관심있는 이종성 단백질을 발현하도록 뿌리가 배양된다. 특정 구체예에서, 단백질은 IGF1이고 글리코실화 부위는 단백질 암호화 서열로부터 제거된다. 다른 구체예에서, 관심있는 단백질은 상기 식물로부터 정제된다.
관심있는 이종성 단백질은, 제한되는 것이 아니라, PTD-IGF1, CTB-IGF1, CTB-프로인슐린, CTB-AMA, CTB-MSP, CTB-FIX, CTB-FIX-퓨린, CTB-엑센딘, CTB-ESAT6, CTB-Mtb72F, CTB-VP1, CTB-MBP, CTB-Ace 2, CTB-Ang1-7, CTB-GAA, CTB-FVIII-HC, CTB-FVIII-C2, 코돈 최적화된 CTB-FVIII-HC, 코돈 최적화된 CTB-FVIII-LC, 및 코돈 최적화된 CTB-FVIII-SC를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 단백질은 각각 e-펩타이드를 함유하는 CTB-proIGF1 또는 PTD-proIGF1로부터 선택된다.
식물은 소비에 적합하고 색소체 형질전환을 받아들일 수 있는 임의의 식물일 수 있다. 특정 구체예에서, 식물은 상추, 토마토, 당근, 저니코틴 담배, 또는 대두로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 식물은 상추이다.
또 다른 양태에서, 상기 요소들을 포함하는 식물 형질전환 벡터가 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
이러한 벡터를 포함하고 상기 기재된 방법을 사용하여 생성된 관심있는 생물약제 단백질을 생산하는 색소체 전환 식물이 또한 제공된다.
특정 양태에서, IGF-1 요법을 필요로 하는 대상체의 치료 방법이 또한 제공된다. 예시의 방법은 PTD 펩타이드 및 IGF1 기능을 향상시키는 e-펩타이드에 작동 가능하게 연결된 IGF-1 단백질을 포함하는 무 항생제 상추 식물 또는 상추 식물 제품의 유효량의 경구 투여를 수반하며, 상기 투여는 유전적 근질환, 급성 위축증, 손상 또는 골 손실의 증상을 완화하거나 개선하기에 효과적이다. IGF-1이 본원에서 예시되어 있지만, 상기 나열된 단백질 중 어느 것도 본원에서 기재된 무 마커 식물에서 발현될 수 있다. 이러한 식물 및 식물 제품은 당뇨병, 응고 장애, 선천성 대사 장애, 등의 치료를 위한 다양한 유용성을 가질 것이다.
도 1A - 1G. 고유한 CTB에 융합된 코돈 최적화된 합성 Pro-IGF-1을 발현하는 상추/담배 색소체 전환 라인의 생성. (도 1A) 상추 엽록체 형질전환을 위한 CTB-Pro-IGF-1 발현 카세트의 개략도. (도 1A 및 도 1E) 16s rRNA 및 23s rRNA, 16s 및 23s 리보솜 RNA; trnI, 아이소류실-tRNA; trnA, 알라닐-tRNA; Prrn, rRNA 오페론 프로모터; aadA, 아미노글리코사이드 3'-아데닐리트랜스퍼라제; TrbcL, 리불로스 비스포스페이트 카르복실라제 거대 서브유닛의 3' UTR; PpsbA, psbA의 프로모터; CTB-Pro-IGF-1(co), CTB (콜레라 비-독성 B 서브유닛) 융합체를 가진 인간 인슐린-유사 성장 인자-1의 코돈 최적화된 조숙한 형태; TpsbA, psbA의 3'-UTR; SB-P, 서던 블롯 프로브. PCR 스크리닝에 사용된 프라이머 세트는 화살표로 표시된다. CTB-Pro-IGF-1을 발현하는 상추 라인의 (도 1B) 게놈 DNA PCR 스크리닝 및 (도 1C) 서던 블롯 분석, 및 (도 1D) 단백질 발현. 예상되는 크기는 화살표로 표시된다 (24.3kDa). (도 1B - 도 1D) 레인 1 내지 4, 개개의 색소체 전환 라인; WT, 형질전환되지 않은 야생형; LS, 상추. (도 1E) 담배 엽록체 형질전환을 위한 CTB-Pro-IGF-1 발현 카세트의 개략도. (도 1F) CTB-Pro-IGF1 담배 색소체 전환 라인의 서던 블롯 분석. 레인 1 및 2, 개개의 야생형 식물 또는 색소체 전환 라인; WT, 형질전환되지 않은 야생형; PH, 담배 쁘띠 하바나(Petit Havana). (도 1G) 고유한 (N; 서열 번호: 12) 및 코돈 최적화된 (C; 서열 번호: 13) Pro-IGF-1의 서열 정렬. 최적화된 코돈은 노란색으로 표시된다. Nat: 고유한 서열; CH: 코돈 최적화된 서열. 글리코실화를 막기 위해, Lsy68 (AAG), Arg74 (CGT) 및 Arg77 (CGC)은 각각 Gly68 (GGT), Ala74 (GCA), 및 Ala77 (GCT)로 교체되며, 이것들은 빨간색으로 표시된다.
도 2A - 2J. 코돈 최적화된 PTD-Pro-IGF-1을 발현하는 상추 무 마커 색소체 전환 라인의 생성. (도 2A) PTD-Pro-IGF-1 발현 카세트를 함유하는 엽록체 형질전환 벡터 및 마커 절제 과정의 개략도가 도시된다. 16s rRNA 및 23s rRNA, 16s 및 23s 리보솜 RNA; trnI, 아이소류실-tRNA; atpB; 엽록체 암호화된 CF1 ATP 신타제 서브유닛 베타; Prrn, rRNA 오페론 프로모터; aadA, 아미노글리코사이드 3'-아데닐리트랜스퍼라제; TrbcL, 리불로스 비스포스페이트 카르복실라제 거대 서브유닛의 3' UTR; PpsbA, psbA의 프로모터; PTD-Pro-IGF-1(co), PTD (단백질 변환 도메인) 융합체를 가진 인간 인슐린-유사 성장 인자-1의 코돈 최적화된 조숙한 형태; TpsbA, psbA의 3'-UTR; trnA, 알라닐-tRNA; SB-P, 서던 블롯 프로브. (도 2B) 게놈 DNA PCR 스크리닝, (도 2C) 서던 블롯, 및 (도 2D) PTD-Pro-IGF-1 라인의 단백질 발현. 예상되는 크기는 화살표로 표시된다 (14.5kDa) (도 2B-2D) 레인 1 내지 4, 4개의 개개의 T0 색소체 전환 라인; WT, 형질전환되지 않은 야생형; MF, 상추 무 마커. 예상되는 크기는 화살표로 표시된다. 무 항생제 T1 세대에서 PTD-Pro-IGF-1의 (도 2E) PCR 스크리닝, (도 2F) 서던 블롯, 및 (도 2G) 단백질 발현. (도 2E 및 도 2F) 레인 1 내지 10; 10개의 개개의 T1 색소체 전환 식물, WT; 형질전환되지 않은 야생형 상추; PC, 마커를 가진 양성 대조군. 예상되는 크기는 화살표로 표시된다 (PCR 생성물의 3.3/2.4/2.4 kb 및 PTD-Pro-IGF-1의 14.5 kDa). 무 항생제 T2 세대에서 PTD-Pro-IGF-1의 (도 2H) 서던 블롯 및 (도 2I) 단백질 발현. (도 2H 및 도 2I) 레인 1 내지 4; 4개의 개개의 T2 색소체 전환 식물, WT; 형질전환되지 않은 야생형 상추. 예상되는 크기는 화살표로 표시된다 (14.5 kDa). (도 2J) 무 마커 상추 엽록체 형질전환 벡터 (pLsLF-MF)를 구성하기 위한 클로닝 과정의 개략도. 도표에서 나타난 바와 같이 2개의 반복되는 DNA 서열 (649 bp, atpB)이 aadA 발현 카세트에 플랭킹되었다. 엽록체에서 발현을 위해 PTD-Pro-IGF-1 DNA 서열이 PpsbA 및 TpsbA 사이에 삽입되었다. 16s rRNA 및 23s rRNA, 16s 및 23s 리보솜 RNA; trnI, 아이소류실-tRNA; atpB; 엽록체 암호화된 CF1 ATP 신타제 서브유닛 베타; Prrn, rRNA 오페론 프로모터; aadA, 아미노글리코사이드 3'-아데닐리트랜스퍼라제; TrbcL, 리불로스 비스포스페이트 카르복실라제 거대 서브유닛의 3' UTR; PpsbA, psbA의 프로모터; PTD-Pro-IGF-1(co), PTD (단백질 변환 도메인) 융합체를 가진 인간 인슐린-유사 성장 인자-1의 코돈 최적화된 조숙한 형태; TpsbA, psbA의 3'-UTR; trnA, 알라닐-tRNA.
도 3A - 3P. 동결건조 후 상추/담배 색소체 전환 라인에서 CTB/PTD-Pro-IGF-1의 특성. (도 3A- 도 3D) (도 3A 및 도 3C) 항-CTB 및 (도 3B 및 도 3D) 항-IGF-1 항체를 사용하여 동결건조된 (도 3A 및 도 3B) 상추 및 (도 3C 및 도 3D) 담배 세포에서 발현된 CTB-Pro-IGF-1의 면역블롯 검정. (도 3E) 동결건조된 무 마커 상추 세포에서 발현된 PTD-Pro-IGF-1의 정량화. (도 3F 및 도 3G) 같은 양 (1X)의 신선한 잎 재료와 동결건조된 잎 재료 사이에서 CTB/PTD-Pro-IGF-1 발현의 비교. (도 3F) 상추 CTB-Pro-IGF-1 및 (도 3G) 무 마커 상추 PTD-Pro-IGF-1 색소체 전환 라인. RbcL이 로딩 대조군으로 사용되었다. (도 3A-도 3G, 도 3K 및 도 3L) 각각 24.3 kDa 및 14.5 kDa에서의 CTB-Pro-IGF-1 및 PTD-Pro-IGF-1의 예상되는 크기는 화살표로 표시된다. PH, 담배 쁘띠 하바나; LS, 상추; MF, 무 마커 상추; WT, 형질전환되지 않은 야생형 담배 또는 상추. CTB 또는 IGF-1 펩타이드가 대조군으로 사용되었다. (도 3H 및 도 3I) (도 3H) 상추 및 (도 3I) 담배에서 CTB-GM1 수용체 결합에 대한 CTB-Pro-IGF-1 펜타머 형태의 ELISA. 데이터는 3배수로 실행된 2번의 생물학적 반복을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다 (ANOVA에 의해 야생형에 대하여 ***P-값 < 0.001). CTB가 양성 대조군으로 사용되었다. Lyo, 동결건조된 잎. (도 3J) 항-CTB 항체를 사용하여 CTB-Pro-IGF-1을 발현하는 담배의 비환원성 면역블롯 분석. (도 3K 및 도 3L) T0 및 T1 세대 사이에서 (도 3K) CTBPro-IGF-1 및 (도 3L) PTD-Pro-IGF-1 발현의 비교. RbcL이 로딩 대조군으로 사용되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다 (ANOVA에 의해 **P-값≤0.01). (도 3M-도 3N) 동결건조된 상추에서 저장 기간의 표시된 시점에 웨스턴 블롯 검정을 사용한 (도 3M) CTB-Pro-IGF-1 및 (도 3N) PTD-Pro-IGF-1의 발현 수준. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다 (군 사이에서 ANOVA에 의해 P-값 > 0.5). (도 3O) 마커 제거된 PTD-Pro-IGF-1 상추 라인의 발아. PTD-Pro-IGF-1의 5개의 시드(seed) 및 야생형 상추의 5개의 시드가 스펙티노마이신 함유 배지에서 발아되었다. 사진은 각각 발아 후 제6 일 (상단) 및 제15 일 (하단)에 촬영되었다. Spec25, 25 μg/mL의 스펙티노마이신; Spec50, 50 μg/mL의 스펙티노마이신. (도 3P) 동결건조된 식물 세포의 정제된 CTB-Pro-IGF-1. 전체 단백질, 정제 전에 CTB-Pro-IGF-1 발현된 동결건조된 식물 세포로부터 추출된 전체 가용성 단백질; Co, 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색; W, 항-CTB에 대한 웨스턴 블롯. 화살표는 대략 24.3 kDa의 모노머 CTB-Pro-IGF-1을 나타낸다.
도 4A - 4E. CTB-Pro-IGF-1은 각질 형성 세포(keratinocyte), GMSC 및 골아세포 증식 및 골아세포 분화를 촉진한다. (도 4A - 도 4D) 정제된 CTB-Pro-IGF-1과 함께 인큐베이션한 후 살아있는 (도 4A) HOK (인간 구강 각질 형성 세포), (도 4B) GMSC (인간 치은(Gingiva) 유래 중간엽 간질 세포), (도 4C) SCC (인간 두경부 편평세포암종 세포), 및 (도 4D) MC3T3 (마우스 골아세포)의 상대적 흡광도. IGF-1 펩타이드가 양성 대조군으로 이용되었다. 데이터는 3배수로 실행된 2번의 생물학적 반복을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다. *는 ANOVA에 의해 IGF-1에 대하여 P-값 < 0.05를 나타낸다. (도 4E) 골 형성 마커 유전자: 알칼리성 포스파타제 (ALP), 소모 관련 전사 인자 2 (RUNX2), 및 오스테릭스 (Osterix: Osx)의 qPCR 분석. 마우스 골아세포주 MC3T3 #4 세포는 골 형성 배지 (OS, DMEM, FBS 10%, 50 μg/ml 아스코르브산 및 10 mM β-글리세로포스페이트)로 유도되었고 5일 동안 각각 100ng/ml, 200ng/ml 및 300ng/ml로 CTB-Pro-IGF-1을 정제하였다. *, CON에 대한 P<0.05; #, OS에 대한 P<0.05.
도 5A - 5C. 경구 섭식 후 IGF-1의 전달. (도 5A) 경구 섭식 후 2시간에 혈청 내 IGF-1의 흡수. C57BL/6J 마우스 (군 당 n=14 내지 16마리의 마우스)는 동결건조된 세포에서 발현된 CTB/PTD-IGF-1의 5 μg 용량이 공급되었다. 데이터 포인트는 개개의 수컷 (파란색 점) 또는 암컷 (분홍색 점) 마우스를 나타낸다. **는 베이스라인과 비교하여 P-값≤0.01을 나타낸다. (도 5B) 비장근(gastrocnemius muscle)에서 CTB-Pro-IGF-1의 경구 투여 후 5시간에 증가된 IGF-1 (왼쪽) 및 내부 로딩 대조군으로 GAPDH를 이용한 웨스턴 블롯을 사용한 농도 계측 정량 (오른쪽). 데이터는 평균 ± SD로 표현된다. (도 5C) 가자미근(soleus muscle)에서 PTD-Pro-IGF-1의 경구 투여 후 5시간에 항-IGF-1에 대한 면역블롯에 의한 증가된 IGF-1 (왼쪽), 이후 β-액틴에 대한 표준화 (오른쪽). 데이터는 평균 ± SD로 표현된다. **는 ANOVA에 의해 공급되지 않은 것에 대하여 P-값 < 0.01을 나타낸다.
도 6A - 6B. 경구 섭식에 의한 CTB-Pro-IGF-1의 투여는 당뇨성 골절 치유시 골 재생을 촉진한다. (도 6A) 골절 후 6주에 골절 부위의 마이크로 CT 스캔의 섹션으로부터의 3-D 재구성의 대표적인 이미지 및 골절 갭(gap)에서 새롭게 형성된 골의 정량적 측정. (도 6B) 조직학적 분석 및 상대적인 골은 각각의 군에 대한 것이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다. 군 사이에서 * P< 0.05. 군 사이에서 ** P< 0.01. Non-Dia WT 군 (비당뇨병 마우스, 동결건조된 야생형 식물 세포로 경구 섭식), Non-Dia IGF 군 (비당뇨병 마우스, CTB-Pro-IGF-1을 함유하는 동결건조된 식물 세포로 경구 섭식), Dia WT 군 (당뇨병 마우스, 동결건조된 야생형 식물 세포로 경구 섭식), Dia IGF 군 (당뇨병 마우스, CTB-Pro-IGF-1을 함유하는 동결건조된 식물 세포로 경구 섭식).
도 7A - 7B. 무 항생제 생물약제의 발현을 위한 식물 엽록체 벡터의 구성을 위한 클로닝 전략. (도 7A) aadA 기반 형질전환이 atpB 프로모터 영역에 상응하는 색소체 DNA의 649 bp 영역을 복제하는데 사용되었다. 상동성-기반 절제는 기능성 aadA 유전자의 완전한 제거를 보장한다. (왼쪽에 서열 번호: 14 및 오른쪽에 서열 번호: 15) (도 7B)는 최종 벡터 구조체를 나타낸다. (도 7C)는 649 염기 쌍 반복부의 서열 (서열 번호: 16)을 제공한다. 고유한 atpB 반복 서열 (649 bp)은 반대 방향으로 rbcL 및 atpB 프로모터 영역을 함유하고 이것은 전이유전자(transgene) 카세트가 전사적으로 활성인 스페이서(spacer) 영역으로 도입될 때 안티센스(antisense) RNA를 제조함으로써 유전자 발현을 방해한다. 하지만, 이러한 스페이서 영역은 전이유전자 발현 수준이 전사적 침묵 스페이서 영역보다 더 높기 때문에 선호된다 (Jin & Daniell, Trends in Plant Science, 2015; Daniell et al, Genome Biology 2016). 그러므로, 상이한 버전의 무 마커 발현 카세트에서 하나 또는 두 개의 프로모터 영역이 결실되었다.
도 8은 psbA, 고유한 Pro-IGF-1, 및 코돈 최적화된 Pro-IGF-1의 코돈 사용 빈도를 나타내는 표이다.
도 2A - 2J. 코돈 최적화된 PTD-Pro-IGF-1을 발현하는 상추 무 마커 색소체 전환 라인의 생성. (도 2A) PTD-Pro-IGF-1 발현 카세트를 함유하는 엽록체 형질전환 벡터 및 마커 절제 과정의 개략도가 도시된다. 16s rRNA 및 23s rRNA, 16s 및 23s 리보솜 RNA; trnI, 아이소류실-tRNA; atpB; 엽록체 암호화된 CF1 ATP 신타제 서브유닛 베타; Prrn, rRNA 오페론 프로모터; aadA, 아미노글리코사이드 3'-아데닐리트랜스퍼라제; TrbcL, 리불로스 비스포스페이트 카르복실라제 거대 서브유닛의 3' UTR; PpsbA, psbA의 프로모터; PTD-Pro-IGF-1(co), PTD (단백질 변환 도메인) 융합체를 가진 인간 인슐린-유사 성장 인자-1의 코돈 최적화된 조숙한 형태; TpsbA, psbA의 3'-UTR; trnA, 알라닐-tRNA; SB-P, 서던 블롯 프로브. (도 2B) 게놈 DNA PCR 스크리닝, (도 2C) 서던 블롯, 및 (도 2D) PTD-Pro-IGF-1 라인의 단백질 발현. 예상되는 크기는 화살표로 표시된다 (14.5kDa) (도 2B-2D) 레인 1 내지 4, 4개의 개개의 T0 색소체 전환 라인; WT, 형질전환되지 않은 야생형; MF, 상추 무 마커. 예상되는 크기는 화살표로 표시된다. 무 항생제 T1 세대에서 PTD-Pro-IGF-1의 (도 2E) PCR 스크리닝, (도 2F) 서던 블롯, 및 (도 2G) 단백질 발현. (도 2E 및 도 2F) 레인 1 내지 10; 10개의 개개의 T1 색소체 전환 식물, WT; 형질전환되지 않은 야생형 상추; PC, 마커를 가진 양성 대조군. 예상되는 크기는 화살표로 표시된다 (PCR 생성물의 3.3/2.4/2.4 kb 및 PTD-Pro-IGF-1의 14.5 kDa). 무 항생제 T2 세대에서 PTD-Pro-IGF-1의 (도 2H) 서던 블롯 및 (도 2I) 단백질 발현. (도 2H 및 도 2I) 레인 1 내지 4; 4개의 개개의 T2 색소체 전환 식물, WT; 형질전환되지 않은 야생형 상추. 예상되는 크기는 화살표로 표시된다 (14.5 kDa). (도 2J) 무 마커 상추 엽록체 형질전환 벡터 (pLsLF-MF)를 구성하기 위한 클로닝 과정의 개략도. 도표에서 나타난 바와 같이 2개의 반복되는 DNA 서열 (649 bp, atpB)이 aadA 발현 카세트에 플랭킹되었다. 엽록체에서 발현을 위해 PTD-Pro-IGF-1 DNA 서열이 PpsbA 및 TpsbA 사이에 삽입되었다. 16s rRNA 및 23s rRNA, 16s 및 23s 리보솜 RNA; trnI, 아이소류실-tRNA; atpB; 엽록체 암호화된 CF1 ATP 신타제 서브유닛 베타; Prrn, rRNA 오페론 프로모터; aadA, 아미노글리코사이드 3'-아데닐리트랜스퍼라제; TrbcL, 리불로스 비스포스페이트 카르복실라제 거대 서브유닛의 3' UTR; PpsbA, psbA의 프로모터; PTD-Pro-IGF-1(co), PTD (단백질 변환 도메인) 융합체를 가진 인간 인슐린-유사 성장 인자-1의 코돈 최적화된 조숙한 형태; TpsbA, psbA의 3'-UTR; trnA, 알라닐-tRNA.
도 3A - 3P. 동결건조 후 상추/담배 색소체 전환 라인에서 CTB/PTD-Pro-IGF-1의 특성. (도 3A- 도 3D) (도 3A 및 도 3C) 항-CTB 및 (도 3B 및 도 3D) 항-IGF-1 항체를 사용하여 동결건조된 (도 3A 및 도 3B) 상추 및 (도 3C 및 도 3D) 담배 세포에서 발현된 CTB-Pro-IGF-1의 면역블롯 검정. (도 3E) 동결건조된 무 마커 상추 세포에서 발현된 PTD-Pro-IGF-1의 정량화. (도 3F 및 도 3G) 같은 양 (1X)의 신선한 잎 재료와 동결건조된 잎 재료 사이에서 CTB/PTD-Pro-IGF-1 발현의 비교. (도 3F) 상추 CTB-Pro-IGF-1 및 (도 3G) 무 마커 상추 PTD-Pro-IGF-1 색소체 전환 라인. RbcL이 로딩 대조군으로 사용되었다. (도 3A-도 3G, 도 3K 및 도 3L) 각각 24.3 kDa 및 14.5 kDa에서의 CTB-Pro-IGF-1 및 PTD-Pro-IGF-1의 예상되는 크기는 화살표로 표시된다. PH, 담배 쁘띠 하바나; LS, 상추; MF, 무 마커 상추; WT, 형질전환되지 않은 야생형 담배 또는 상추. CTB 또는 IGF-1 펩타이드가 대조군으로 사용되었다. (도 3H 및 도 3I) (도 3H) 상추 및 (도 3I) 담배에서 CTB-GM1 수용체 결합에 대한 CTB-Pro-IGF-1 펜타머 형태의 ELISA. 데이터는 3배수로 실행된 2번의 생물학적 반복을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다 (ANOVA에 의해 야생형에 대하여 ***P-값 < 0.001). CTB가 양성 대조군으로 사용되었다. Lyo, 동결건조된 잎. (도 3J) 항-CTB 항체를 사용하여 CTB-Pro-IGF-1을 발현하는 담배의 비환원성 면역블롯 분석. (도 3K 및 도 3L) T0 및 T1 세대 사이에서 (도 3K) CTBPro-IGF-1 및 (도 3L) PTD-Pro-IGF-1 발현의 비교. RbcL이 로딩 대조군으로 사용되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다 (ANOVA에 의해 **P-값≤0.01). (도 3M-도 3N) 동결건조된 상추에서 저장 기간의 표시된 시점에 웨스턴 블롯 검정을 사용한 (도 3M) CTB-Pro-IGF-1 및 (도 3N) PTD-Pro-IGF-1의 발현 수준. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다 (군 사이에서 ANOVA에 의해 P-값 > 0.5). (도 3O) 마커 제거된 PTD-Pro-IGF-1 상추 라인의 발아. PTD-Pro-IGF-1의 5개의 시드(seed) 및 야생형 상추의 5개의 시드가 스펙티노마이신 함유 배지에서 발아되었다. 사진은 각각 발아 후 제6 일 (상단) 및 제15 일 (하단)에 촬영되었다. Spec25, 25 μg/mL의 스펙티노마이신; Spec50, 50 μg/mL의 스펙티노마이신. (도 3P) 동결건조된 식물 세포의 정제된 CTB-Pro-IGF-1. 전체 단백질, 정제 전에 CTB-Pro-IGF-1 발현된 동결건조된 식물 세포로부터 추출된 전체 가용성 단백질; Co, 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색; W, 항-CTB에 대한 웨스턴 블롯. 화살표는 대략 24.3 kDa의 모노머 CTB-Pro-IGF-1을 나타낸다.
도 4A - 4E. CTB-Pro-IGF-1은 각질 형성 세포(keratinocyte), GMSC 및 골아세포 증식 및 골아세포 분화를 촉진한다. (도 4A - 도 4D) 정제된 CTB-Pro-IGF-1과 함께 인큐베이션한 후 살아있는 (도 4A) HOK (인간 구강 각질 형성 세포), (도 4B) GMSC (인간 치은(Gingiva) 유래 중간엽 간질 세포), (도 4C) SCC (인간 두경부 편평세포암종 세포), 및 (도 4D) MC3T3 (마우스 골아세포)의 상대적 흡광도. IGF-1 펩타이드가 양성 대조군으로 이용되었다. 데이터는 3배수로 실행된 2번의 생물학적 반복을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다. *는 ANOVA에 의해 IGF-1에 대하여 P-값 < 0.05를 나타낸다. (도 4E) 골 형성 마커 유전자: 알칼리성 포스파타제 (ALP), 소모 관련 전사 인자 2 (RUNX2), 및 오스테릭스 (Osterix: Osx)의 qPCR 분석. 마우스 골아세포주 MC3T3 #4 세포는 골 형성 배지 (OS, DMEM, FBS 10%, 50 μg/ml 아스코르브산 및 10 mM β-글리세로포스페이트)로 유도되었고 5일 동안 각각 100ng/ml, 200ng/ml 및 300ng/ml로 CTB-Pro-IGF-1을 정제하였다. *, CON에 대한 P<0.05; #, OS에 대한 P<0.05.
도 5A - 5C. 경구 섭식 후 IGF-1의 전달. (도 5A) 경구 섭식 후 2시간에 혈청 내 IGF-1의 흡수. C57BL/6J 마우스 (군 당 n=14 내지 16마리의 마우스)는 동결건조된 세포에서 발현된 CTB/PTD-IGF-1의 5 μg 용량이 공급되었다. 데이터 포인트는 개개의 수컷 (파란색 점) 또는 암컷 (분홍색 점) 마우스를 나타낸다. **는 베이스라인과 비교하여 P-값≤0.01을 나타낸다. (도 5B) 비장근(gastrocnemius muscle)에서 CTB-Pro-IGF-1의 경구 투여 후 5시간에 증가된 IGF-1 (왼쪽) 및 내부 로딩 대조군으로 GAPDH를 이용한 웨스턴 블롯을 사용한 농도 계측 정량 (오른쪽). 데이터는 평균 ± SD로 표현된다. (도 5C) 가자미근(soleus muscle)에서 PTD-Pro-IGF-1의 경구 투여 후 5시간에 항-IGF-1에 대한 면역블롯에 의한 증가된 IGF-1 (왼쪽), 이후 β-액틴에 대한 표준화 (오른쪽). 데이터는 평균 ± SD로 표현된다. **는 ANOVA에 의해 공급되지 않은 것에 대하여 P-값 < 0.01을 나타낸다.
도 6A - 6B. 경구 섭식에 의한 CTB-Pro-IGF-1의 투여는 당뇨성 골절 치유시 골 재생을 촉진한다. (도 6A) 골절 후 6주에 골절 부위의 마이크로 CT 스캔의 섹션으로부터의 3-D 재구성의 대표적인 이미지 및 골절 갭(gap)에서 새롭게 형성된 골의 정량적 측정. (도 6B) 조직학적 분석 및 상대적인 골은 각각의 군에 대한 것이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다. 군 사이에서 * P< 0.05. 군 사이에서 ** P< 0.01. Non-Dia WT 군 (비당뇨병 마우스, 동결건조된 야생형 식물 세포로 경구 섭식), Non-Dia IGF 군 (비당뇨병 마우스, CTB-Pro-IGF-1을 함유하는 동결건조된 식물 세포로 경구 섭식), Dia WT 군 (당뇨병 마우스, 동결건조된 야생형 식물 세포로 경구 섭식), Dia IGF 군 (당뇨병 마우스, CTB-Pro-IGF-1을 함유하는 동결건조된 식물 세포로 경구 섭식).
도 7A - 7B. 무 항생제 생물약제의 발현을 위한 식물 엽록체 벡터의 구성을 위한 클로닝 전략. (도 7A) aadA 기반 형질전환이 atpB 프로모터 영역에 상응하는 색소체 DNA의 649 bp 영역을 복제하는데 사용되었다. 상동성-기반 절제는 기능성 aadA 유전자의 완전한 제거를 보장한다. (왼쪽에 서열 번호: 14 및 오른쪽에 서열 번호: 15) (도 7B)는 최종 벡터 구조체를 나타낸다. (도 7C)는 649 염기 쌍 반복부의 서열 (서열 번호: 16)을 제공한다. 고유한 atpB 반복 서열 (649 bp)은 반대 방향으로 rbcL 및 atpB 프로모터 영역을 함유하고 이것은 전이유전자(transgene) 카세트가 전사적으로 활성인 스페이서(spacer) 영역으로 도입될 때 안티센스(antisense) RNA를 제조함으로써 유전자 발현을 방해한다. 하지만, 이러한 스페이서 영역은 전이유전자 발현 수준이 전사적 침묵 스페이서 영역보다 더 높기 때문에 선호된다 (Jin & Daniell, Trends in Plant Science, 2015; Daniell et al, Genome Biology 2016). 그러므로, 상이한 버전의 무 마커 발현 카세트에서 하나 또는 두 개의 프로모터 영역이 결실되었다.
도 8은 psbA, 고유한 Pro-IGF-1, 및 코돈 최적화된 Pro-IGF-1의 코돈 사용 빈도를 나타내는 표이다.
인간 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1)은 골격근 및 골의 발달 및 재생에서 중요한 역할을 하지만 치과 적용시 매일 주사 또는 수술에 의한 이식을 필요로 한다. 현재의 임상적 IGF-1은 e-펩타이드가 결여되고 글리코실화되어, 기능성 효험을 감소시킨다. 이전의 연구에서 시드, 비-식용 식물, 또는 세포 배양물에서 IGF-1 발현이 보고되었지만, e-펩타이드를 보유하는 Pro-IGF-1은 적합한 동물 모델에서 경구 전달 이후 발현되거나 기능적으로 평가된 적이 없었다.
본원에서 기재된 바와 같이, e-펩타이드를 가진 (세포 침투 펩타이드에 융합된) Pro-IGF-1은 코돈 최적화되었고 항생제 저항성 유전자 없이 상추 엽록체에서 발현되었다. 항생제 저항성 (aadA) 유전자는 직접 반복부의 상동 재조합을 통해 빠르게 절제되었고 무 마커 엽록체 게놈은 다음 세대의 상추 식물에서 유지되었으며, 높은 수준의 Pro-IGF-1 발현을 유지하였고; 수개월/수년 동안 주위 온도에서 동결건조된 식물 세포에서 폴딩(folding), 조립, 안정성 및 기능성이 유지되었다. CTB-Pro-IGF-1은 용량-의존적 방식으로 배양된 인간 구강 각질 형성 세포, 치은-유래 중간엽 간질 세포 및 마우스 골아세포의 성장을 자극하였고 ALP, OSX, 및 RUNX2를 포함한 골아세포 마커 유전자의 발현을 상향조절하였다. 냉동 건조된 식물 세포로 경구 섭식된 마우스는 수컷 및 암컷 마우스의 혈청 및 근육에서 IGF-1을 같은 효율로 크게 증가시켰고 당뇨성 골절 치유 모델에서 골 재생을 촉진하였다. 처음으로 항생제 저항성 유전자가 없는 식물 세포에서 생물약제 발현은 주위 온도에서 장기간 저장 및 반복적인 경구 전달의 편리함과 함께 매일 주사 또는 수술에 의한 이식을 제거함으로써 경제성(affordability) 및 환자의 수용 상태를 향상시켜야 한다.
정의:
상기 언급된 일반적인 설명 및 다음 상세한 설명은 모두 단지 예시적이고 설명하기 위한 것이며 현재의 고시내용의 범위를 제한하려는 것은 아니라는 것을 이해해야 한다. 본 출원에서, 단수형의 사용은 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 복수형을 포함한다. 예를 들어, "적어도 하나"는 하나 이상이 존재할 수 있다는 것을 의미한다. 또한, "포함하다", "함유하다", 및 "포함하다", 또는 상기 기초어의 변형, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, "포함하다", "함유하였다", 및 "포함하는"의 사용은 제한하려는 것은 아니며 "다음 요소들을 포함하지만 다른 것들을 배제하는 것은 아니라"는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "근본적으로 ~로 이루어지다", 또는 "근본적으로 ~로 이루어지는"은 다른 요소들을 조합에 대한 임의의 본질적인 의미를 갖는 것으로부터 배제한다. "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 용어 "및/또는"은 앞뒤의 용어가 함께 또는 별도로 취해질 수 있다는 것을 의미한다. 제한으로서가 아니라, 예시의 목적을 위해, "X 및/또는 Y"는 "X" 또는 "Y" 또는 "X 및 Y"를 의미할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 대상체에게 작용제, 약물, 또는 펩타이드를 "투여하는" 또는 그것들의 "투여"라는 용어는 의도된 기능을 수행하도록 대상체에게 화합물을 도입하거나 전달하는 임의의 경로를 포함한다. 투여하는 또는 투여는 경구로, 비강으로, 비경구로 (정맥내로, 근육내로, 복강내로, 또는 피하로), 직장으로, 또는 국부적으로를 포함한 임의의 적합한 경로에 의해 수행될 수 있다. 투여하는 또는 투여는 자가 투여 및 타인에 의한 투여를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "질환", "장애", 또는 "합병증"은 대상체의 정상 상태로부터의 임의의 편차를 나타낸다.
"무 항생제 생물약제"는 본원에서 사용된 바와 같이 항생제를 암호화하는 선택 가능한 마커 유전자가 결여된 고등 식물의 엽록체에서 생산된 생물약제를 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유효량", "유효한 양", 등은 원하는 결과를 달성하는데 필요한 투약시 및 일정 기간 동안에 유효한 양을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "억제하는" 또는 "치료하는"은 질환 상태에 노출되거나 질환 상태에 취약할 수 있지만, 아직 경험하지 않았거나 또는 질환 상태의 증상을 나타내는 대상체에서 질환 상태의 임상적 증상이 질환을 악화시키거나 발달시키지 않는 것, 예를 들어, 질환의 발병을 억제하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CTB"는 콜레라 독소 B 서브유닛을 나타낸다. 콜레라 독소는 하나의 A 서브유닛과 다섯 개의 B 서브유닛을 포함하는 단백질 복합체이다. B 서브유닛은 단백질 복합체에 대해 비독성이고 중요한데 그것이 단백질을 갱글리오사이드(ganglioside)의 오당류 사슬을 통해 세포 표면에 결합할 수 있게 하기 때문이다.
"레플리콘(replicon)"은 주로 자체 제어 하에 복제 가능한 임의의 유전적 요소, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드(cosmid), 바크미드(bacmid), 파지 또는 바이러스이다. 레플리콘은 RNA 또는 DNA일 수 있고 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
"벡터"는 부착되는 서열 또는 요소의 복제를 유발하기 위해 또 다른 유전적 서열 또는 요소 (DNA 또는 RNA)가 부착될 수 있는 임의의 비히클(vehicle)이다.
"발현 오페론"은 전사 및 번역 제어 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서(enhancer), 번역 시작 신호 (예를 들어, ATG 또는 AUG 코돈), 폴리아데닐화 신호, 종결자, 등을 소유할 수 있고, 숙주 세포 또는 유기체에서 폴리펩타이드 암호화 서열의 발현을 촉진하는 핵산 세그먼트를 나타낸다.
용어 "프로모터 영역"은 유전자의 5' 조절 영역 (예를 들어, 5'UTR 서열 (예를 들어, psbA 서열), 형질전환되는 식물에 대해 내인성인 프로모터 (예를 들어, 보편적인 Prnn 프로모터 또는 psbA 프로모터) 및 선택적인 인핸서 요소)을 말한다.
용어 "올리고뉴클레오타이드"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 서열, 프라이머 및 프로브를 나타내고, 2개 이상, 바람직하게는 3개 초과의 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드로 구성된 핵산 분자로 정의된다. 올리고뉴클레오타이드의 정확한 크기는 다양한 요인들 및 올리고뉴클레오타이드의 특정 적용 및 용도에 따라 다를 것이다.
구절 "특이적으로 혼성체화하다"는 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 사전 결정된 조건 하에서 이러한 혼성체화를 허용하기에 충분히 상보적인 서열 (때때로 "실질적으로 상보적인" 것으로 불림)의 2개의 단일 가닥 핵산 분자 사이에서의 회합을 나타낸다. 특히, 용어는 본 발명의 단일 가닥 DNA 또는 RNA 분자 내에 함유된 실질적으로 상보적인 서열과 올리고뉴클레오타이드의 혼성체화, 비-상보적 서열의 단일 가닥 핵산과 올리고뉴클레오타이드의 혼성체화의 실질적인 배제를 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "리포터", "리포터 시스템", "리포터 유전자", 또는 "리포터 유전자 생성물"은 핵산이, 발현될 때, 예를 들어, 생물학적 검정, 면역검정, 방사선면역검정에 의해, 또는 열량측정법, 형광측정법, 화학발광측정법 또는 다른 방법에 의해 쉽게 측정 가능한 리포터 신호를 생산하는 생성물을 암호화하는 유전자를 포함하는 작동 가능한 유전적 시스템을 의미해야 한다. 핵산은 RNA 또는 DNA, 선형 또는 원형, 단일 가닥 또는 이중 가닥, 안티센스 또는 센스 극성일 수 있고, 리포터 유전자 생성물의 발현에 필요한 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다. 필수적인 제어 요소는 리포터 시스템의 성질 및 리포터 유전자가 DNA 또는 RNA의 형태로 이루어져 있는지에 따라 다를 것이지만, 제한되는 것이 아니라, 프로모터, 인핸서, 번역 제어 서열, 폴리 A 추가 신호, 전사 종결 신호 등과 같은 요소를 포함할 수 있다.
용어 "형질전환", "트랜스펙션", "형질도입"은 핵산이 세포 또는 숙주 유기체로 도입되는 임의의 방법 또는 수단을 나타내어야 하고 동일한 의미를 전달하기 위해 교체 가능하게 사용될 수 있다. 이러한 방법은 트랜스펙션, 전기천공법, 미세주사, PEG-융합 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "선택 가능한 마커 유전자"는 발현될 때 형질전환된 세포 또는 식물에 선택 가능한 표현형, 예컨대 항생제 저항성을 부여하는 유전자를 말한다. 색소체 형질전환 벡터에 유용한 선택 가능한 마커는, 제한되는 것이 아니라, 스펙티노마이신 저항성, 글리포세이트 저항성, BADH 저항성, 및 카나마이신 저항성을 암호화하는 것들을 포함한다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 암호화 서열의 발현에 필요한 조절 서열이 암호화 서열의 발현에 영향을 미치도록 암호화 서열에 관하여 적절한 위치의 DNA 분자에 배치된다는 것을 의미한다. 이 동일한 정의는 때때로 발현 벡터에서 전사 유닛 및 다른 전사 제어 요소 (예를 들어, 인핸서)의 배열에 적용된다.
용어 "DNA 구조체"는 식물을 형질전환하고 자손 트랜스제닉(transgenic) 식물을 생성하는데 사용된 유전자 서열을 나타낸다. 이들 구조체는 바이러스 또는 플라스미드 벡터 내에서 식물에 투여될 수 있다. 하지만, 색소체 형질전환 벡터가 본 발명에서 사용하는데 가장 바람직하다. 다른 전달 방법, 예컨대 아그로박테리움(Agrobacterium) T-DNA 매개된 형질전환 및 유전자총(biolistic) 과정을 사용한 형질전환이 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 형질전환 DNA는 "Current Protocols in Molecular Biology", eds. Frederick M. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1995에 제시된 것들과 같은 표준 프로토콜에 따라 제조될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "엽록체"는 식물 세포 및 광합성을 실행하는 다른 진핵생물 유기체에서 발견되는 세포 기관 또는 색소체를 포함한다. 엽록체는 광 에너지를 캡쳐하여 ATP의 형태로 자유 에너지를 보존하고 광합성이라고 불리는 복잡한 일련의 과정을 통해 NADP를 NADPH로 환원시킨다. 엽록체는 엽록소를 함유한다. 엽록체는 더 많은 카피 수의 전이유전자를 가지며 전이 유전자의 더 높은 발현 수준을 나타낸다. 각각의 엽록체는 최대 100개의 게놈을 함유할 수 있는 한편, 각각의 식물 세포는 최대 100개의 엽록체를 함유할 수 있다. 그러므로, 각각의 식물 세포는 무려 100000개의 엽록체 게놈을 함유할 수 있으며 이것은 엽록체 게놈을 통해 발현되는 단백질의 높은 발현 수준을 초래한다. 엽록체는 엽록체 게놈이 핵 게놈 DNA와는 달리 화분을 통해 전달되지 않기 때문에 모계 유전을 통해 유전자 억제를 더 제공한다. 엽록체는 폴리시스트론성(polycistronic) RNA를 전사할 수 있는 능력을 가지며 번역 후 변형, 예컨대 이황화 결합, 멀티머의 조립 및 지질 변형을 수행할 수 있는 능력을 포함한 진핵생물 단백질의 정확한 처리를 수행할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "조성물", "약학적 조성물" 또는 "치료제"는 모두 본원에 기재된 바와 같이 구조체를 포함하는 IGF-1을 포함하는 조성물을 포함한다. 선택적으로, "조성물", "약학적 조성물" 또는 "치료제"는 약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체를 더 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현"은 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드의 맥락에서 RNA로의 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드의 전사를 수반한다. 용어는 또한 반드시 그러한 것은 아니지만, 폴리펩타이드 사슬로의 RNA의 후속 번역 및 단백질로의 조립을 수반한다.
식물 잔여물(remnant)은 관심있는 단백질이 발현되는 식물로부터 유래된 하나 이상의 분자 (제한되는 것은 아니지만, 예컨대 단백질 및 그것의 단편, 미네랄, 뉴클레오타이드 및 그것의 단편, 식물 구조적 구성요소, 등)를 포함할 수 있다. 따라서, 전체 식물 재료 (예를 들어, 식물 잎, 줄기, 과실, 등의 전체 또는 일부)와 관련된 조성물 또는 미가공(crude) 식물 추출물은 분명히 고농도의 식물 잔여물, 뿐만 아니라 하나 이상의 검출 가능한 식물 잔여물을 갖는 정제된 관심있는 단백질을 포함하는 조성물을 함유할 것이다. 특정 구체예에서, 식물 잔여물은 루비스코(rubisco)이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 식물 엽록체에서 생산된 치료적 융합 단백질의 투여를 통해 질환을 치료하거나 예방하기 위해 투여 가능한 조성물과 관련이 있다. 조성물은 식물 및 식물 잔여물에 의해 발현되는 융합 단백질의 치료적 유효량을 포함한다.
본원에 교시된 특정 구체예에 따라 발현되는 단백질은 다양한 방법으로 대상체, 인간 또는 동물에게 투여함으로써 생체 내에서(in vivo) 사용될 수 있다. 약학적 조성물은 경구로 또는 비경구로, 즉, 피하로, 근육내로 또는 정맥내로 투여될 수 있지만, 경구 투여가 바람직하다.
본 발명의 구체예에 의해 생산된 경구용 조성물은 색소체 유래된 치료적 융합 단백질을 생산하는 트랜스제닉 식물로 제조된 식료품(foodstuff)의 소비에 의해 투여될 수 있다. 식물, 또는 그 일부의 식용 부분은 식이 성분으로 사용된다. 치료적 조성물은 원하는 투여 방식에 적절한 고체 또는 액체 비히클, 희석제 및 첨가제를 사용하여 고전적인 방식으로 제제화될 수 있다. 경구로, 조성물은 적어도 하나의 비히클, 예를 들어, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스, 락토스, 젤라틴, 등이 들어있는 타블렛, 캡슐, 과립, 분말, 씹는 검, 등의 형태로 투여될 수 있다. 조제물은 또한 에멀젼화될 수 있다. 활성 면역원성 또는 치료 성분은 종종 약학적으로 허용 가능하고 활성 성분과 호환 가능한 부형제와 혼합된다. 적합한 부형제는, 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 이것들의 조합이다. 이에 더하여, 원하는 경우, 조성물은 소량의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 에멀젼화제, pH 완충제, 또는 보조제를 함유할 수 있다. 바람직한 구체예에서 약제 생산 트랜스제닉 식물의 식용 식물, 즙, 곡물, 잎, 덩이줄기, 줄기, 시드, 뿌리 또는 다른 식물 부분은 인간 또는 동물에 의해 섭취되며 따라서 질환의 치료 또는 질환에 대한 면역화의 매우 저렴한 수단을 제공한다.
특정 구체예에서, 치료적 융합 단백질을 발현할 수 있는 엽록체를 포함하는 식물 재료 (예를 들어 상추, 토마토, 당근, 대두, 저니코틴 담배 재료, 등)가 균질화되고 캡슐화된다. 하나의 특정 구체예에서, 상추 재료의 추출물이 캡슐화된다. 대안의 구체예에서, 상추 재료는 캡슐화되기 전에 분말화된다.
대안의 구체예에서, 조성물은 투여의 편의를 위해 트랜스제닉 식물의 즙과 함께 제공될 수 있다. 상기 목적을 위해, 형질전환되는 식물은 바람직하게는, 다른 것들 중에서도, 일반적으로 즙의 형태로 소비되는 토마토, 당근 및 사과로 이루어진 식용 식물로부터 선택된다.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명은 본원에 개시된 치료적 융합 단백질 또는 펩타이드를 발현하는 이종성 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 엽록체 게놈과 관련이 있다.
본원에서 단백질 서열에 대한 참조는 공지된 전장 아미노산 서열, 뿐만 아니라 이러한 아미노산 서열로부터 선택된 적어도 12, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250 또는 265개의 인접한 아미노산, 또는 이것들의 생물학적 활성 변이체와 관련이 있다. 전형적으로, 폴리펩타이드 서열은 공지된 인간 버전의 서열과 관련이 있다.
퍼센트 동일성의 변이는, 예를 들어, 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실 때문일 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산 대체에 대한 것으로 정의된다. 그것들은 치환된 아미노산이 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 가질 때 자연에서 보존적이다. 보존적 대체의 예는 아이소류신 또는 발린으로의 류신의 치환, 글루타메이트로의 아스파르테이트의 치환, 또는 세린으로의 트레오닌의 치환이다.
아미노산 삽입 또는 결실은 아미노산 서열로 또는 아미노산 서열 내에서 변화된다. 그것들은 전형적으로 약 1 내지 5개의 아미노산의 범위에 있다. 폴리펩타이드의 생물학적 또는 면역학적 활성을 폐지하지 않으면서 아미노산 잔기가 치환되거나, 삽입되거나, 또는 결실될 수 있는지를 결정하는데 있어서의 지침은 해당 분야에 널리 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대 DNASTAR 소프트웨어를 사용하여 발견될 수 있다. 아미노산 변화가 생물학적으로 활성인 치료적 융합 폴리펩타이드를 발생시키는지 여부는 하기, 예를 들어, 특정 실시예에서 기재된 바와 같이, 고유한 활성에 대해 분석함으로써 쉽게 결정될 수 있다.
본원에서 유전자 서열에 대한 참조는 단일 또는 이중 가닥 핵산 서열을 나타내고 관심있는 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열 또는 암호화 서열의 보체를 포함한다. 폴리펩타이드를 암호화하는 변성 핵산 서열, 뿐만 아니라 cDNA와 적어도 약 50, 55, 60, 65, 60, 바람직하게는 약 75, 90, 96, 또는 98% 동일한 상동성 뉴클레오타이드 서열은 본원에서 폴리뉴클레오타이드에 대한 교시내용에 따라 사용될 수 있다. 두 개의 폴리뉴클레오타이드의 서열 사이의 퍼센트 서열 동일성은 컴퓨터 프로그램, 예컨대 FASTA 알고리즘을 이용하는 ALIGN을 사용하여 결정되며, 갭 오픈 패널티(gap open penalty)가 -12이고 -2의 갭 확장 패널티(gap extension penalty)가 -2인 아핀 갭 검색(affine gap search)을 사용한다. 생물학적으로 활성인 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열의 상보적 DNA (cDNA) 분자, 종 상동체, 및 변이체가 또한 유용한 폴리뉴클레오타이드이다.
상기 기재된 핵산 서열의 변이체 및 상동체는 또한 유용한 핵산 서열이다. 전형적으로, 상동성 폴리뉴클레오타이드 서열은, 해당 분야에 공지된 바와 같이, 엄중 조건 하에서 공지된 폴리뉴클레오타이드로의 후보 폴리뉴클레오타이드의 혼성체화에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 다음 세척 조건을 사용하여, 최대 약 25-30% 염기 쌍 미스매치(mismatch)를 함유하는 상동성 서열이 확인될 수 있다: 2 X SSC (0.3 M NaCl, 0.03 M 나트륨 시트레이트, pH 7.0), 0.1% SDS, 실온 2회, 각각 30분; 2X SSC, 0.1% SDS, 50℃. 1회, 30분; 2X SSC, 실온 2회, 각각 10분. 더 바람직하게는, 상동성 핵산 가닥은 15-25% 염기 쌍 미스매치, 더 바람직하게는 5-15% 염기 쌍 미스매치를 함유한다.
본원에서 언급된 폴리뉴클레오타이드의 종 상동체는 또한 적합한 프로브 또는 프라이머 및 스크리닝 cDNA 발현 라이브러리를 제조함으로써 확인될 수 있다. 상동성이 1% 감소할 때마다 이중 가닥 DNA의 Tm이 1-1.5℃씩 감소한다는 것은 널리 공지되어 있다 (Bonner et al., J. Mol. Biol. 81, 123 (1973). 엄중 혼성체화 및/또는 세척 조건 이후 관심있는 폴리뉴클레오타이드, 또는 그것들의 보체에 혼성체화하는 뉴클레오타이드 서열이 또한 유용한 폴리뉴클레오타이드이다. 엄중 세척 조건은 널리 공지되어 있고 해당 분야에서 이해되고 있으며, 예를 들어, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed., 1989, 페이지 9.50-9.51에 개시되어 있다.
전형적으로, 엄중 혼성체화 조건에 대하여, 연구 중인 하이브리드(hybrid)의 계산된 Tm보다 낮은 대략 12-20℃인 온도와 염 농도의 조합이 선택되어야 한다. 관심있는 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체와 상기 뉴클레오타이드 서열 중 하나와 적어도 약 50, 바람직하게는 약 75, 90, 96, 또는 98% 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열 간의 하이브리드의 Tm은, 예를 들어, Bolton and McCarthy, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 48, 1390 (1962)의 방정식: Tm=81.5℃-16.6(log10 [Na+ ])+0.41(% G+C)-0.63(% 포름아미드)-600/l)를 사용하여 계산될 수 있으며, 상기 식에서 l=염기 쌍 내 하이브리드의 길이이다. 엄중 세척 조건은, 예를 들어, 65℃에서 4 X SSC, 또는 42℃에서 50% 포름아미드, 4 X SSC, 또는 65℃에서 0.5 X SSC, 0.1% SDS를 포함한다. 고도 엄중 세척 조건은, 예를 들어, 65℃에서 0.2 X SSC를 포함한다. 본 발명의 실시를 용이하게 하기 위해 다음 재료 및 방법이 제공된다.
코돈 최적화
엽록체에서 이종성 유전자의 발현을 최대화하기 위해서, 133개의 시드 식물 종에 걸친 psbA 유전자의 코돈 선호도에 기초한 엽록체 코돈 최적화기 프로그램이 개발되었다. 모든 서열은 미국 국립 생물 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information: NCBI, ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesGroup.cgi?taxid=2759&opt=plastid)로부터 다운로드되었다. 각각의 아미노산에 대한 동의 코돈 사이에서의 사용 선호도는 133개의 psbA 유전자로부터 총 46,500개의 코돈을 분석함으로써 결정되었다. 최적화 알고리즘 (엽록체 최적화기 v2.1)은 희귀 코돈에서 엽록체에서 자주 사용되는 코돈으로의 변화를 용이하게 하도록 JAVA를 사용하여 제조되었다.
무
마커
식용 식물
상기 기재된 바와 같이, 색소체에서 경구 소비를 위한 무 항생제 생물약제를 생산하는 식용 색소체 전환 식물을 생성하기 위한 방법이 제공된다. 이 목적을 위해 많은 예시의 색소체 형질전환 벡터가 도면에서 제공된다. 특정 구체예에서, 방법이 수행되면, 결과로 생성된 식물은 동형 세포질성에 대해 평가된다. 본원에서 예시된 바와 같이, 선택 가능한 마커 유전자는 aadA 유전자일 수 있고 항생제는 스펙티노마이신일 수 있다. 본원에서 aadA 및 스펙티노마이신 저항성이 예시되지만, 선택 가능한 마커 유전자 및 항생제를 암호화하는 다른 항생제가 또한 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
기재된 벡터에서 사용되는 고유한 atpB 반복 서열 (649 bp) 또는 그것의 변이체는 반대 방향으로 rbcL 및 atpB 프로모터 영역을 함유하고 이것은 전이유전자 카세트가 전사적으로 활성인 스페이서 영역으로 도입될 때 안티센스 RNA를 제조함으로써 유전자 발현을 방해한다. 하지만, 이러한 스페이서 영역이 바람직한데 전이유전자 발현 수준이 전사적 침묵 스페이서 영역보다 더 높기 때문이다 (Jin & Daniell, Trends in Plant Science, 2015; Daniell et al, Genome Biology 2016). 그러므로, 상이한 버전의 무 마커 발현 카세트 내의 반복 서열에서 적어도 하나 또는 두 개의 프로모터 영역이 결실되었다.
특정 구체예에서, 벡터에서 직접 반복 서열은 서열 번호: 16에 의해 암호화된다. 다른 구체예에서, 직접 반복부는 서열 번호: 16에 의해 암호화되며, 여기서 볼드체로 표시되거나, 밑줄 그어지거나 파란색 또는 빨간색으로 표시된 서열 중 1, 2, 3, 4개 또는 전부가 결실된다.
본 발명의 생물약제 단백질은 융합 단백질로서 암호화될 수 있다. 특정 양태에서, PTD 펩타이드는 관심있는 단백질에 작동 가능하게 연결될 것이다. 특정 다른 양태에서, CTB 펩타이드가 이용될 것이다.
무 마커 IGF-1 생산 식물의 성공적인 생산은, 제한되는 것이 아니라, CTB-프로인슐린, CTB-AMA, CTB-MSP, CTB-FIX, CTB-FIX-퓨린, CTB-엑센딘, CTB-ESAT6, CTB-Mtb72F, CTB-VP1, CTB-MBP, CTB-Ace 2, CTB-Ang1-7, CTB-GAA, CTB-FVIII-HC, CTB-FVIII-C2, 코돈 최적화된 CTB-FVIII-HC, 코돈 최적화된 CTB-FVIII-LC, 및 코돈 최적화된 CTB-FVIII-SC를 포함하는, 추가적인 치료적으로 유익한 단백질의 생산을 위한 기틀을 마련한다.
본 발명의 실시를 용이하게 하기 위한 다음의 재료 및 방법이 제공된다.
CTB
-Pro-
IGF
-1 발현 담배 및 상추 색소체 전환 라인의 생성
상기 기재된 코돈 최적화되고 합성된 Pro-IGF-1은 NdeI-CTB-F, 5'-TTCATATGACACCTCAAAATATTACTGATT (서열 번호: 1); CTB-IGF-1, 5'-TTGCCGCAATTAGTATGGCAAATGGTCCTGGACCACGTCGTAAACGCTCTGTTGGTCCTGAAACTCTATGTGGTGCT (서열 번호: 2); IGF-1-PshAI-R, 5'-CAATAAGACCAAAGTCTCTAGATTACATACGATAATTTTTGTTTCCAGC (서열 번호:3); 및 IGF-1-XbaI-R, 5'-CAATAATCTAGATTACATACGATAATTTTTGTTTCCAGC (서열 번호: 4)로 중첩 PCR 증폭되었다. 증폭된 CTB-Pro-IGF-1은 담배 엽록체 형질전환 벡터 (pLD-utr) 및 상추 벡터 (pLsLF)로 클로닝되었다 (Kwon et al., 2017; Verma et al., 2008). 클로닝된 CTB-Pro-IGF-1은 앞서 기재된 바와 같이 충격(bombardment)에 의해 담배 (쁘띠 하바나) 및 상추 (락투카 사티바(Lactuca sativa)) 품종 심슨 엘리트(cv. Simpson Elite)로 형질전환되었다 (Kwon et al., 2017; Verma et al., 2008). 충격 이후, 이전에 기재된 바와 같이 재생이 유도되었다 (Verma et al., 2008). 1차 순은 16s-F, 5'-CAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGATGCAAGC (서열 번호: 5); aadA-R, 5'-CCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACGGTCACC (서열 번호: 6); NdeI-CTB-F, 5'-TTCATATGACACCTCAAAATATTACTGATT (서열 번호: 1); IGF-1-PshAI-R, 5'-CAATAAGACCAAAGTCTCTAGATTACATACGATAATTTTTGTTTCCAGC (서열 번호:3); UTR-F, 5'-AGGAGCAATAACGCCCTCTTGATAAAAC (서열 번호: 7); 및 23s-R, 5'-TGCACCCCTACCTCCTTTATCACTGAGC (서열 번호: 8)로 스크리닝되었다. PCR 양성 잎이 스펙티노마이신 50 μg/mL를 함유한 재생 배지에서 제2 라운드 재생을 위해 유도되었다 (Verma et al., 2008). 2차 순은 제1 라운드 선택에 사용된 동일한 프라이머 세트를 이용한 제2 라운드 PCR에 의해 스크리닝되었다. 스크리닝된 양성 순은 뿌리를 형성하도록 유도되었다. 그것들이 동형 세포질성인 것이 확인되고 단백질 발현이 상기 기재된 바와 같이 각각 서던 블롯 및 웨스턴 블롯에 의해 확인된 후, 그것들은 이전에 기재된 바와 같이 수경 재배 시스템 및 온실로 옮겨졌다 (Kwon et al., 2017).
무
마커
PTD
-
IGF
-1 상추 엽록체 발현 벡터의 생성
Henry Daniell의 연구실에서 이전에 제조된 상추 엽록체 형질전환 벡터, pLsLF가 주형으로 사용되었으며 (Daniell et al., 2016a), 이것은 스펙티노마이신-저항성 유전자 (aadA, 아미노글리코사이드 3'-아데닐리트랜스퍼라제 유전자)를 함유한다. 마커 유전자를 절제하기 위해, 직접 반복되는 DNA 서열 (PatpB 및 5' UTR, 649 bp (Kode et al., 2006))이 주형으로서 담배 전체 게놈 DNA를 사용하여 PCR 증폭된 다음 aadA 발현 카세트를 플랭킹하도록 서열 확인된 직접 반복부가 클로닝된다. 엽록체의 형질전환 후 무 마커 벡터의 작동을 검증하기 위해서, 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri)로부터의 ptxD (포스파이트 옥시도리덕타제, GenBank: AAC71709.1) 유전자가 psbA 프로모터의 제어 하에 클로닝되었다. 포스파이트 배지에서 무 마커 형질전환체의 선택을 용이하게 하기 위해서, 코돈 최적화된 ptxD는 또한 ptxD의 고유한 서열과 함께 테스트되었다 (데이터 미도시). 벡터 백본으로의 단일 분해된 atpB 단편의 삽입을 위해, NEBuilder HiFi DNA (NEB, Ipswich, MA) 조립 키트가 역방향으로의 단편의 가능한 결찰을 방지하기 위해 사용되었다. 이전에 기재된 바와 같이 코돈-최적화 후 (Kwon et al., 2016), Pro-IGF-1이 GenScript (Piscataway, NJ)에서 합성되었다. Pro-IGF-1은 NdeI-PTD-F, 5'-ATTTTACATATGAGACACATCAAGATCTGGTTCCAAAACCGCCGCATGAAGTGGAAAAA (서열 번호: 9); PTD-IGF-1-F, 5'-CCGCCGCATGAAGTGGAAAAAGGGTCCTGGACCACGTCGTAAACGAT (서열 번호: 10); 및 IGF-1-PshAI-R, 5'-CAATAAGACCAAAGTCTCTAGATTACATACGATAATTTTTGTTTCCAGC (서열 번호: 3)으로 중첩 PCR 증폭되었다. PTD 융합된 Pro-IGF-1은 pLsLF-MF 벡터 내에서 엽록체 형질전환을 위해 NdeI 및 PshAI 부위 사이에서 ptxD로 대체되었다. 상추 (락투카 사티바) 품종 심슨 엘리트 잎은 이전에 기재된 바와 같이 형질전환을 위해 충격을 받았다 (Verma et al., 2008).
PTD
-Pro-
IGF
-1을 함유하는, 항생제 유전자 결실된 상추의 스크리닝
충격 이후, 상추 잎은 작은 조각 (1 cm2 미만)으로 잘라지고 스펙티노마이신 50 μg/mL를 함유하는 재생 배지 [MS 염 (Caisson, Smithfield, UT), Gamborg 비타민 (PhytoTechnology Laboratory, Lenexa KS), BAP 0.2 mg (Sigma, St Louis, MO), NAA 0.1 mg (Sigma, St Louis, MO), 미오이노시톨 100 mg (Sigma, St Louis, MO), PVP 500 mg (Sigma, St Louis, MO), 수크로스 30 g (Sigma, St Louis, MO), 피타블렌드(phytablend) 5 g (PhytoTechnology Laboratory, Lenexa, KS)]에서 키워졌다. 생성된 1차 순 (4-6주)은 특이적 PCR 프라이머 세트를 사용하여 스크리닝되었다:
16s-F, 5'-CAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGATGCAAGC (서열 번호: 5);
aadA-R, 5'-CCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACGGTCACC (서열 번호: 6);
atpB-R, 5'-GAATTAACCGATCGACGTGCTAGCGGACATT (서열 번호: 11);
UTR-F, 5'-A GGAGCAATAACGCCCTCTTGATAAAAC (서열 번호:7);
23s-R, 5'-TGCACCCCTACCTCCTTTATCACTGAGC (서열 번호: 8).
양성 순은 또 다른 라운드 동안에 50 μg/mL의 스펙티노마이신에서 재생되었다. 순이 탈색되기 시작하자마자, 그것들은 PCR에 의해 aadA 유전자 절제에 대해 평가되었고, 무 스펙티노마이신 배지로 옮겨 뿌리가 유도되었다. 뿌리가 생성되면, 전이유전자 발현 및 동형 세포질성이 각각 웨스턴 블롯 및 서던 블롯에 의해 확인되었다. 웨스턴 블롯에 대해, 신선한 잎이 액체 질소에서 그라인딩된 후, 100 mg의 그라인딩된 분말이 300 μL의 추출 버퍼 (100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 200 m Tris-Cl, pH 8, 0.05 % v/v Tween 20, 0.1 % v/v SDS, 400 mM 수크로스, 14 mM β-메르캅토에탄올, 100 mM DTT, 2 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 및 프로테이나제 억제자 칵테일)에 현탁되었다. 상세히 설명된 후속 단계들이 하기 기재된다. 서던 블롯은 DIG 고급 DNA 라벨링 및 검출 스타터 키트 II (Roche, Penzberg, Germany)의 제조사의 프로토콜에 기초하여 수행되었다. 색소체 전환 식물은 AerogarGarden 액체 비료 (Miracle-Gro, Marysville, OH)가 들어있는 수경재배 시스템에서 2주 동안 키워진 다음 수확을 위해 온실로 옮겨졌다. 온실에서, 흙은 1:1 비의 정원 흙 (Miracle-Gro, Marysville, OH) 및 화분용 흙 (Erthgro)과 혼합되었고, 22 ℃에서 16-h: 8-h 광 주기의 조건 하에 주 1회 또는 2회 Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food로 식물에 비료를 주었다. 수확된 잎은 이전에 기재된 바와 같이 동결건조되었다 (Kwon et al., 2016).
동결건조된 세포에서
CTB
/
PTD
-Pro-
IGF
-1의 정량 및 특성화
CTB/PTD-Pro-IGF-1 발현 수준을 확인하기 위해서, 10 mg의 동결건조된 잎 분말은 4℃에서 1시간 동안 500 μL의 추출 버퍼 (100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 200 m Tris-Cl, pH 8, 0.05% v/v Tween 20, 0.1% v/v SDS, 400 mM 수크로스, 14 mM β-메르캅토에탄올, 100 mM DTT, 2 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 및 프로테이나제 억제자 칵테일)에 재수화되었고 초음파 처리되었다 [Sonicator 3000 (Misonix, Farmingdale, NY)에 의해 5초 동안 켜짐/10초 동안 꺼짐 3회]. 추출된 단백질이 브래드포드 검정(Bradford assay) (Bio-rad Laboratories, Hercules, CA)에 의해 정량화된 후, 그것들은 1X Laemmli 버퍼에서 70℃에서 10 min 동안 가열되었고 SDS-PAGE 겔 (12%) 상에서 분리되었다. 토끼 항-CTB (1:10,000) (Gen Way Biotech, San Diego, CA), 토끼 항-IGF-1 (1:4,000) (Abcam, Cambridge, UK), 및 염소 항 토끼 IgG-HRP (1:4,000) (Southern Biotechnology, Birmingham, AL)에 대해 웨스턴 블롯 분석이 수행되었다. Precision 플러스 단백질 기준은 HRP (horseradish peroxidase)로 컨쥬게이션되고 라벨링된 Precision 단백질 Strep Tactin (1:5000) (Bio-rad Laboratories, Hercules, CA)을 사용하여 검출되었다. 화학발광 기반 키트는 X선 필름 상에 HRP 신호를 캡쳐하기 위해 사용되었고, 그 다음에 ImageJ 소프트웨어 (IJ 1.46; NIH)를 이용하여 정량화 분석이 수행되었다. 표준 곡선은 CTB 펩타이드 (Sigma, St Louis, MO) 또는 IGF-1 펩타이드 (Abcam, Cambridge, UK)를 기반으로 제조되었다.
비-환원성
겔에서
CTB
-Pro-
IGF
-1의
면역블롯
동결건조된 분말 10 mg은 4℃에서 1시간 동안 500 μL의 추출 버퍼 (100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 200 m Tris-Cl, pH 8, 0.05% v/v Tween 20, 0.2% v/v SDS, 400 mM 수크로스, 2 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 및 프로테이나제 억제자 칵테일)에서 재수화되었고, 초음파 처리되었고, 상기 기재된 바와 같이 정량화되었다. 추출된 단백질이 샘플 버퍼 (250 mM Tri-Cl, pH 6.5, 10% w/v SDS, 50% v/v 글리세롤, 0.2 mM 브로모페놀 블루)와 혼합된 후, 전기영동 및 웨스턴 블롯이 수해오디었다. 웨스턴 블롯의 상세한 후속 단계는 상기 기재되어 있다.
신선한 잎 및 동결건조된 잎에서 Pro-
IGF
-1의 정량화
동일한 양의 신선한 잎과 동결건조된 잎이 동일한 부피의 추출 버퍼에서 추출되었고, 그 다음에 그것들의 단계 희석액이 로딩되었고 상기 기재된 바와 같이 면역블롯이 실행되었다. 상추 CTB-Pro-IGF-1 및 무 마커 PTD-Pro-IGF-1에 대하여, 1X는 단백질 추출 버퍼 300 μL에 재현탁된 동결건조된 분말 10 mg으로부터의 10 μl 로딩을 나타낸다. 담배 CTB-Pro-IGF-1에 대하여, 1X는 단백질 추출 버퍼 300 μl에 재현탁된 동결건조된 분말 10 mg으로부터의 1 μl 로딩을 나타낸다. 로딩 대조군에 대하여, 막은 37℃에서 10분 동안 웨스턴 스트리핑 버퍼(Western Stripping Buffer) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에서 인큐베이션된 다음, 1시간 동안 1:40,000의 PTM 중의 토끼 항-RbcL (루비스코 거대 서브유닛) (Agrisera, Vannas, Sweden)로 면역라벨링되었다. 상기 기재된 바와 같이 후속 웨스턴 블롯 단계가 뒤따른다.
GM1-
갱글리오사이드
수용체 결합 검정
담배 및 상추에서 발현된 CTB-Pro-IGF-1은 동결건조 후 GM1-갱글리오사이드 수용체에 결합하는 CTB 펜타머 형태에 대해 평가되었다. 단백질은 상기 기재된 바와 같이 추출되었다. CTB-GM1 결합 검정은 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다 (Kwon et al., 2017).
CTB
-Pro-
IGF
-1의 정제 및 세포 증식 검정
CTB-Pro-IGF-1을 함유하는 동결건조된 및 그라인딩된 담배 색소체 전환 라인 400 밀리그램이 4℃에서 1시간 동안 식물 단백질 추출 버퍼 (50 mM NaP (pH 8.0), 300 mM NaCl, 1.4 mM 베타-메르캅토에탄올, 0.5 % v/v Tween 20, 및 프로테아제 억제자 칵테일 2 타블렛) 20 mL에 재수화되었다. 균질액은 초음파 처리 후 스핀 다운되었다 (spin down). 상층액은 Ni 수지 (Clontech, Fremont, CA) 2 mL와 함께 밤새도록 인큐베이션되었다. 그것이 컬럼에 계속해서 쌓이게 되면, 그것들은 10 mL의 결합 버퍼 (50 mM NaP (pH 8.0), 300 mM NaCl), 10 mL의 세척 버퍼 1 (50 mM NaP (pH 7.0), 300 mM NaCl), 및 10 mL의 세척 버퍼 2 (50 mM NaP (pH 6.0), 300 mM NaCl)의 순서로 세척되었다. 그 다음에, 그것들은 용출 버퍼 (50 mM (pH 6.0), 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸)로 용출되었다. 정제된 CTB-Pro-IGF-1은 쿠마시 블루 염색된 겔 상에서 평가되었고 그 농도는 동일한 단백질 겔 상에서 공지된 IGF-1 펩타이드 농도로 제조된 표준 곡선을 기초로 계산된 후 이어서 (Abcam, Cambridge, UK) 상기 기재된 바와 같이 면역블롯 분석되었다. 특정 세포 수 [100 μL 성장 배지 중에 2,500개의 HOK (인간 구강 각질 형성 세포), 5,000개의 GMSC (인간 치은 유래 중간엽 간질 세포), 3,000개의 SCC (인간 두경부 편평세포암종 세포), 및 4,000개의 MC3TC (마우스 골아세포)]가 3개의 96웰 플레이트에 분주되었다. 5% CO2와 함께 37℃에서 16시간 후, 일련의 농도의 정제된 CTB-Pro-IGF-1 및 인간 IGF-1 상업적 펩타이드 (Abcam, Cambridge, UK)가 PBS 10 μL에 희석된 후 세포와 함께 인큐베이션되었다. 세포에 추가된 PBS 10 μL는 펩타이드 0 ng에 대한 음성 대조군으로 사용되었다. 24, 48, 및 72시간 후, 살아있는 증식된 세포의 흡광도가 MTT 검정 (Roche, Basel, Switzerland)에 의해 570 mm에서 측정되었으며 참조는 655 nm에서 측정되었다. 데이터는 생물학적으로 2회 반복되었으며 3배수로 실행되었다.
골 형성성 분화를 검사하기 위해, MC3T3 세포는 골 형성 배지 (OS 배지)로 처리되었다. OS 배지는 10% FBS, 10 mM β-글리세로포스페이트 (Sigma, St Louis, MO), 50 μg/ml 아스코르브산 (Sigma) 및 10-8 M 덱사메타손 (Sigma)을 함유한 α-MEM (Gibco)이다. OS 배지 및 100ng/ml, 200ng/ml 및 300ng/ml로 정제된 CTB-Pro-IGF-1로 5일 처리 후, 세포는 RNA 추출물로부터 단리되었고 골 형성 마커, 알칼리성 포스파타제 (ALP), 소모 관련 전사 인자 2 (RUNX2) 및 오스테릭스 (Osx)에 대하여 qPCR 분석되었다.
동물 연구
8 내지 10주령의 C57BL/6J 마우스는 Jackson Laboratories로부터 구입되었고 제도적으로 승인된 프로토콜 하에 펜실베니아 대학교(University of Pennsylvania)에서 무 병원체 조건으로 사육되었다. 동결건조된 식물 세포는 PBS에서 섭식 용량 (CTB 또는 PTD 태그된(tagged) IGF-1 5 μg 함유) 당 200 μL의 최종 부피로 재수화되었고 3 내지 4초 동안 간단히 보텍싱되었다(vortexed). 3개의 군의 마우스, 군 당 18마리 (수컷 9마리 및 암컷 9마리)는 20 게이지 위장 섭식 바늘을 사용하여 공급되었다. 혈액 (50-80 μL)을 섭식 전, 및 섭식 후 2시간에 턱밑 정맥에서 뽑아냈고 실온에서 2시간 동안 응고시켰다. 그 이후, 혈청이 4℃에서 15분 동안 3000 RPM으로 원심분리하여 분리되었고 -80 ℃에 저장되었다. 혈청 내 IGF-1 수준은 ELISA 검정에 의해 평가되었다. 가자미근 또는 비장근이 대조군 및 CTB 또는 PTD 태그된 IGF-1이 공급된 마우스의 뒷다리에서 절개되었고, 액체 질소에서 냉동되었고 웨스턴 블롯에 의해 IGF-1에 대해 평가되었다.
혈청에서
IGF
-1의 ELISA 검정
IGF-1 표준 (Abcam, Cambridge, UK) 및 혈청 샘플은 코팅 버퍼 (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, 3 mM NaH3, pH9.6)에 희석되었고 Costar (3590) 고-결합 EIA/RIA 플레이트에 밤새도록 결합시켰다. 그 이후, 플레이트는 PBS-0.1% Tween-20 (PBST)에서 3회 세척되었고, PBST 중의 3% 탈지유 (PTM)로 1시간 동안 블로킹하였고 1차 항체, 1:2000의 PTM 중의 토끼 항-IGF-1 (Abcam, Cambridge, UK)에서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션되었다. 그 다음에, 플레이트는 PBST에서 3회 세척되었고 2차 항체, 1:4000의 PTM 중의, HRP에 컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG1 (Southern Biotechnology, Birmingham, AL)에서 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션되었다. 플레이트는 PBST에서 세척되었고, TMB 퍼옥시다제 기질 (Rockland)에서 실온에서 10분 동안 인큐베이션된 후 이어서, 정지 용액 (2 N H2SO4)에서 인큐베이션되었다. 흡광도는 450nm에서 판독되었다.
근육 조직의
면역블롯팅
분석
가자미근 및 비장근 조직은 액체 질소로부터 해동되었고 50 mM Tris-HCL, pH 7.4; 0.25% 나트륨 데옥시콜레이트; 150 mM NaCl 및 1% Triton X-100; 프로테아제 및 포스파타제 억제자 (Sigma, St Louis, MO)로 이루어진 용해 버퍼 (근육 습중량 당 10배 부피)에서 균질화되었다. 조직 균질액은 브래드포드 검정 (Bio-rad Laboratories, Hercules, CA)에 의해 단백질에 대하여 평가되었다. 조직은 상기 기재된 바와 같이 전기영동 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석되었다. 로딩 대조군에 대하여, 막은 웨스턴 스트리핑 버퍼 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에서 37℃에서 5분 동안 인큐베이션되었고, 1차 항체, PTM 중의 마우스 항-액틴 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX), 1:4000 또는 마우스 항-GAPDH (Abcam, Cambridge, UK), 1:4000에서 인큐베이션되었고, PBST로 세척되었고, HRP 컨쥬게이션된 염소-항-마우스 IgG (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) 1:4000에서 인큐베이션되고 화학발광에 의해 현상되었다.
쥐 당뇨병 대퇴골 골절 모델
Jackson Laboratory로부터의 25마리의 8주령 C57BL/6J 수컷 마우스는 4개의 군으로 무작위로 할당되었다: CON 군 (6마리 수컷 비-당뇨병 마우스, 동결건조된 야생형 (WT) 식물 세포로 경구 섭식), IGF-1 군 (6마리 수컷 비-당뇨병 마우스, CTB-Pro-IGF-1을 함유하는 동결건조된 식물 세포로 경구 섭식), Dia 군 (7마리 수컷 당뇨병 마우스, 동결건조된 WT 식물 세포로 경구 섭식), Dia-IGF-1 군 (6마리 수컷 당뇨병 마우스, CTB-Pro-IGF-1을 함유하는 동결건조된 식물 세포로 경구 섭식). WT 식물 세포 분말 및 5 μg CTB-Pro-IGF-1을 함유하는 동결건조된 식물 세포 (20 mg)는 각각 PBS에서 섭식 용량 당 300 μl의 최종 부피로 재수화되었다. 경구 섭식 기간은 6주였고 그 빈도는 1일 1회였다.
Dia 및 Dia-IGF-1 군의 마우스는 골절 전 3주에 당뇨병을 유도하기 위해 5일 동안 STZ (0.1M 시트레이트 버퍼 중에 50 μg/g 체중)로 매일 복강내 주사가 제공되었다. 혈당 수준은 최종 스트렙토조토신 주사 후 7일에 꼬리 정맥으로부터 혈액을 얻고 혈당 측정기 (ONE TOUCH Ultra 2, LifeScan, Switzerland)로 글루코스 농도를 측정함으로써 검사되었다. 300mg/dl보다 높은 혈당 수준을 가진 마우스는 당뇨병으로 간주되었다. 척수내 고정못 고정술(intramedullary nail fixation)을 이용한 대퇴골 폐쇄 골절이 상기 기재된 12주령 (wk) 마우스에서 수행되었다. 간략히 말하면, 폐쇄 골절은 체중 감소에 의해 구동된 3점 뭉툭한 길로틴(guillotine)에 의해 생성되었으며, 이것은 대퇴골의 균일한 가로 골절(transverse fracture)을 생성한다. 골절된 대퇴골은 분석을 위해 골절 후 6주에 수확되었다.
미세 전산화 단층촬영 (
microCT
) 이미지화 및 방사선 촬영
마우스는 아이소플루란에 의해 마취되었고 골절 부위는 골절 치유 과정을 모니터링하기 위해 Faxitron MX-20 (Faxitron X-Ray)을 사용하여 D0, D7, D14 및 D21에 방사선 사진 촬영되었다. 연구가 끝나면, 골절된 대퇴골의 골 마이크로아키텍쳐(microarchitecture)는 Imaging Core, Penn Center for Musculoskeletal Disorders에서 Scanco Medical μCT 35를 사용하여 테스트되었다. 55keV에서 스캔을 수행하였고 3D 이미지는 근위부 및 원위부에 대해 적어도 3 mm 연장된 골절선에서 재구성되었다. 전체 부피에 대한 골 부피의 비율 (BV/TV) 및 골 밀도는 골절 가골(fracture callus)에서 결정되었으며 밀도 임계치는 300 mg/cm3 HA로 설정되었다.
조직학적 분석
골절 가골은 절제되어, 4% 파라포름알데하이드로 고정되었고 4℃에서 최소 3주 동안 10% 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)에서 탈석회화되었다. 샘플은 OCT에 OCT에 임베딩되었다(embedded). 종단면 (8 μm 두께)은 가골의 중간 부분으로부터 절단되었고 젤라틴-코팅된 유리 슬라이드 상에 일렬로 마운팅되었고(mounted) 조직학적 검사를 위해 헤마톡실린 및 에오신 (Sigma-Aldrich)으로 염색되었다. 골 치유의 형태학적 특성은 Leica 형광 현미경 (DMI6000B, Leica, Germany)에 의해 관찰되었다.
본 발명의 특정 구체예를 예시하기 위해 다음 실시예가 제공된다. 그것들은 어떠한 방법으로도 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
실시예
I
엽록체에서
무 항생제
IGF
-1의 생성
이 연구에서, 발명자들은 엽록체에서 경점막 담체 콜레라 비-독성 B 서브유닛 (CTB) 또는 세포 침투 단백질 변환 도메인 (PTD)과 융합된 e-펩타이드를 함유하는, 코돈 최적화된 Pro-IGF-1을 발현하는 상추 및 담배 라인을 생성하였다. 발명자들은 항생제 저항성 유전자 (aadA)의 완전한 결실을 달성하였고 다음 세대에서 Pro-IGF-1의 안정한 유지 및 발현을 관찰하였다. 엽록체 유래된 Pro-IGF-1의 생물학적 활성을 4개의 상이한 인간/마우스 경구 세포의 향상된 증식을 관찰하여 시험관 내에서 확인하였다. 수컷 및 암컷 마우스 둘 다를 활용하여, 발명자들은 색소체 전환 식물에서 생산된 IGF-1이 순환 및 골 조직으로 경구로 성공적으로 전달될 수 있다는 것을 관찰하였다. 경구 섭식에 의한 IGF-1의 투여는 골아세포 분화 및 당뇨성 골절 치유를 크게 촉진하여, 이 독특한 생물약제를 인간 연구로 번역할 수 있을 가능성을 확인하였다. 항생제 저항성 유전자의 완전한 제거와 함께, 이 신규한 플랫폼은 합리적인 가격의 경구 약물 전달 및 향상된 환자의 수용 상태를 위해 생체 캡슐화된 생물약제의 임상 연구에 사용될 수 있다.
결과
CTB
/
PTD
-Pro-
IGF
-1을 발현하는 상추/담배 색소체 전환 라인의 생성
엽록체에서 발현 수준을 개선하기 위한 코돈 최적화 후 e-펩타이드를 갖는 인간 IGF-1의 전구체 형태 (Pro-IGF-1)를 합성하였으며, 기준으로 psbA 유전자를 사용하였다 (Kwon et al., 2016). Pro-IGF-1의 총 105개의 코돈 중에서, 65개의 코돈을 최적화하였으며 AT 함유량을 43%에서 57%까지 증가시켰다. 이에 더하여, e-펩타이드 분열을 방지하기 위해 엔도프로테아제에 의한 인식을 방지하도록 세 개의 아미노산, Lsy68, Arg74 및 Arg77을 각각 Gly68, Ala74 및 Ala77로 교체하였다 (Duguay et al., 1995) (도 1G 및 도 8). 이 연구에서 예상되는 글리코실화되는 부위를 편집하지 않았는데 엽록체가 글리코실화되지 않는 구역이고 잠재적으로 글리코실화되는 부위에서도 글리코실화로부터의 보호를 제공하는 것으로 널리 공지되어 있기 때문이다.
코돈 최적화된 Pro-IGF-1을 힌지 (GPGP) 및 퓨린 서열 (KKRKSV)을 통해 CTB에 융합시켰고, 융합 구조체를 상추 (pLsLF) (도 1A) 및 담배 (pLD-utr) 엽록체 형질전환 벡터에 클로닝하였다 (도 1E). 이전에 기재된 바와 같이 플라스미드로 상추/담배 엽록체 게놈에 충격을 가했다 (Kwon et al., 2017; Verma et al., 2008). 충격 이후, 선택의 제1 라운드에서 재생된 순을 특이적 프라이머 세트를 이용한 PCR 분석을 사용하여 테스트하여 (도 1B 및 도 1E) 발현 카세트의 부위 특이적 통합을 확인하였다 (도 1B). PCR-양성 순은 동형 세포질성을 달성하기 위해 또 다른 선택의 라운드를 거쳤다. 동형 세포질성 상태를 적합한 프로브 (SB-P)를 사용한 서던 블롯 검정에 의해 확인하였고 (도 1C 및 도 1F) CTB-Pro-IGF-1의 발현을 웨스턴 블롯에서 검출하였다 (도 1D). 형질전환된 엽록체 게놈은 상추에서 11.6 kb 및 담배에서 6.7 kb의 별개의 단편을 나타냈으며 형질전환되지 않은 엽록체 게놈에서의 더 작은 단편 (상추에서 9.1 kb 및 담배에서 4.4 kb)과 비교하여 CTB-Pro-IGF-1 발현 카세트의 부위-특이적 통합을 확인하였다. 웨스턴 블롯은 예상된 크기 (24.3 kDa)의 CTB-Pro-IGF-1 단백질의 발현을 나타냈다. 이들 결과는 CTB-Pro-IGF-1을 발현하는 상추/담배 동형 세포질성 라인의 생성을 확인하였다.
무
마커
PTD
-Pro-
IGF
-1 동형
세포질성
상추 라인의 생성
색소체 리보솜 RNA 프로모터 (Prrn)의 제어 하에 스펙티노마이신 저항성 아미노글리코사이드-3'-아데닐일-트랜스퍼라제 (aadA) 유전자에 이어서, 3'UTR, TrbcL을 함유하는 무 마커 엽록체 벡터 (pLsLF-MF)를 다중 클로닝 단계 (도 2J)에 의해 생성하였다. aadA는 도 2A에서 나타난 바와 같이 엽록체 암호화된 CF1 ATP 신타제 서브유닛 베타 (atpB) 프로모터 영역 (649 bp)의 두 개의 카피 사이에 위치한다. PTD에 융합된 코돈 최적화된 합성 Pro-IGF-1을 psbA 프로모터/5' UTR 및 3' UTR의 제어 하에 무 마커 엽록체 발현 카세트에 클로닝하였다. 충격을 받은 상추 잎을 스펙티노마이신 (30S 리보솜에 결합하는 색소체 단백질 합성의 억제자) 함유 배지에서 재생시켰고 그 이후 제1 (데이터 미도시) 및 제2 선택 라운드 (도 2B) 동안에 특이적 PCR 프라이머 세트로 스크리닝하였다. 16s-F/aadA-R 프라이머 세트는 카세트 내에서 내인성 엽록체 게놈 서열 및 aadA 전이유전자에 어닐링하여(anneal) (도 2A), 3.3 kb DNA 단편을 증폭시켰다 (도 2B). UTR-F/23s-R 프라이머의 세트를 사용하여 발현 카세트의 3' 측면을 검증하고 (도 2A), 2.4 kb의 단편을 생산하였다 (도 2B).
스펙티노마이신 상에서 상추 엽록체 형질전환체의 선택 중에, 선택 마커를 절제하여, 상동 재조합에 의해 두 개의 직접 반복되는 atpB 단편 사이에 색소체 전환 게놈 내의 atpB 영역의 하나의 카피를 남겨두었다. 상동성-기반 마커 절제가 일어나면, 16s-F/atpB-R의 프라이머 세트는 2.4 kb PCR 생성물을 증폭시켜야 하고 16s-F/aadA-R은 어떠한 PCR 생성물도 생산해서는 안 된다. 도 2B에서 나타난 바와 같이, 색소체 전환 라인 1은 16s-F/aadA-R 프라이머 세트로 증폭될 때 임의의 PCR 생성물을 나타내지 않았으며, aadA 유전자의 절제, 및 16s-F/atpB-R로 증폭된 2.4 kb 단편의 존재에 기인한다. 이 절제는 PTD-IGF-1 발현 카세트의 안정한 통합에 영향을 미치지 않았으며, 이것은 UTR-F/23s-R 프라이머 세트를 사용한 2.4 kb 단편의 PCR 증폭에 의해 확인되었다. 라인 2, 3, 및 4에서, 3.3 kb PCR 생성물을 16s-F/aadA-R에 의해 생산하였으며, aadA 마커 유전자가 여전히 엽록체 게놈에 존재한다는 것을 나타낸다 (도 2B). 세 개의 1차 순은 1st PCR 스크리닝에서 양성 결과를 나타냈고; 3개의 1차 중 하나로부터 2nd 라운드 선택에서 스크리닝된 9개의 순 중에서, 6개의 순이 전이유전자 카세트 통합에 대해 양성이었고 하나의 순이 aadA 유전자의 완전한 제거를 나타냈다.
도 2B에서 PCR 양성 순 (라인 2, 3 및 4)을 항생제 저항성 유전자가 없는 순 (라인 1) 및 형질전환되지 않은 야생형 상추와 함께 서던 블롯 분석에 의해 검사하였다 (도 2C). 서던 블롯에서, 형질전환되지 않은 상추는 단일 9.1 kb 단편을 나타내는 한편, 색소체 전환 라인 1은 10.7 kb 단편을 나타냈으며 PCR 결과 (도 2B) 및 동형 세포질성 무 마커 라인의 달성 (엽록체 게놈의 모든 카피로부터의 마커 유전자 절제)을 지지한다. 흥미롭게도, 라인 2, 3, 및 4에서, 크기가 12.7 kb 및 10.7 kb인 두 개의 단편을 검출하였으며, 이것은 마커 절제 여부에 관계없이 이형 세포질성 상태를 나타낸다. aadA 유전자 절제에 관계없이, IGF-1 항체를 사용할 때 PTD-Pro-IGF-1 단백질의 발현은 모든 검사된 라인에서 예상된 크기, 14.5 kDa에서 검출되었지만, 형질전환되지 않은 야생형 상추에서는 밴드가 검출되지 않았다 (도 2D).
다음 세대에서 무 마커 동형 세포질성의 안정성을 평가하기 위해서, 10개의 무 마커 시드를 무 스펙티노마이신 배지 상에서 발아시켰다. 게놈 DNA를 T1 식물로부터 추출하였고 T0 색소체 전환 라인 평가에서 사용된 동일한 프라이머 세트를 이용한 PCR에 의해 검사하였고 서던 블롯을 수행하였다 (도 2E 및 도 2F). 모든 검사된 묘목은 항생제 유전자 절제를 나타냈지만 PTD-Pro-IGF-1 발현 카세트의 통합을 유지하였다. T1 세대에서 PTD-Pro-IGF-1의 발현을 또한 항-IGF-1에 대한 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다 (도 2G). T0 식물에서 나타난 바와 같이 (도 2D), 모든 검사된 T1 식물은 마커 유전자 절제 후 PTD-Pro-IGF-1을 발현하였다. 또한, T1 무 항생제 색소체 전환 라인이 항생제 (스펙티노마이신 25 및 50 μg/mL) 함유 배지에서 발아할 때, 잎은 발아 후 6일 내에 탈색되었고 식물은 발아 후 15일에 성장이 중단되었다 (도 3O). T2 무 마커 식물의 4개의 무작위로 선택된 라인은 또한 Pro-IGF-1을 발현하는 항생제 저항성 유전자가 없는 동형 세포질성 상태를 나타냈으며, 각각 서던 블롯 및 면역블롯 분석에 의해 확인되었다 (도 2H 및 도 2I). 이들 데이터는 무 마커 상태가 이후의 T1 및 T2 세대를 통해 안정하게 유지되지만, 외래 단백질, Pro-IGF-1의 발현을 유지한다는 것을 확인한다.
동결건조된 식물 세포에서
CTB
/
PTD
-Pro-
IGF
-1 발현의 특성
상추 (도 3A 및 3B) 및 담배 (도 3C 및 3D) 엽록체 둘 다에서 CTB-Pro-IGF-1의 발현을 CTB 또는 IGF-1에 대한 항체를 사용하여 평가하였고 두 개의 상이한 항체는 동일한 크기의 표적 단백질을 검출하였다. 공지된 양의 IGF-1 펩타이드를 사용하여 생성된 표준 곡선에 기초하여, 동결건조된 상추 잎에서 발현된 PTD-Pro-IGF-1의 농도를 270 μg/g 건조 중량으로 추정하였다 (도 3E). 유사하게, CTB 표준 곡선을 사용할 때, 동결건조된 상추 T0 라인에서 CTB-Pro-IGF-1의 발현 수준을 370 μg/g으로 추정하였다 (데이터 미도시). CTB 또는 IGF-1에 대한 항체를 이용한 면역블롯 분석을 사용하여 신선한 세포와 동결건조된 세포 사이에서 발현된 치료 단백질의 농도를 비교하였다 (도 3F 및 3G). CTB-Pro-IGF-1 및 PTD-Pro-IGF-1 둘 다의 발현 수준은 중량 기준으로 신선한 잎에서와 비교하여 동결건조된 샘플에서 ~10배 더 높았다.
CTB 모노머들 사이에서 이황화 결합, 30개의 수소 결합, 7개의 염 다리 및 여러 개의 소수성 상호작용에 의해 생성된 펜타머 형태의 CTB는 GM1 수용체에 결합할 수 있다 (Sanchez et al., 2008). 융합된 단백질이 편재하는 프로테아제 퓨린에 의해 CTB로부터 분열된 후 순환계에 전달될 수 있도록 CTB는 GM1 수용체에 결합함으로써 소화관 상피 세포를 가로질러 임의의 융합된 단백질을 운반한다 (Kwon et al., 2016). 펜타머 CTB 구조의 형성을 조사하기 위해서, GM1 결합 ELISA를 CTB-Pro-IGF-1을 발현하는 각각의 상추 (도 3H) 및 담배 (도 3I) 식물 세포에 대해 신선한 잎 재료와 동결건조된 잎 재료를 사용하여 수행하였다. 450 nm에서 CTB 융합 단백질을 발현하는 신선한 세포와 동결건조된 세포의 흡광도 값은 CTB 표준 단백질 (양성 대조군)만큼 높았으며 음성 대조군에서는 유의한 신호가 없었다. 이들 결과는 엽록체에서 발현된 CTB-Pro-IGF-1 융합 단백질이 펜타머 형태로 적절하게 폴딩될 수 있고 펜타머 구조의 온전성은 동결건조 이후에도 유지될 수 있다는 것을 나타낸다. 담배 동결건조된 재료에서 펜타머 CTB-Pro-IGF-1 구조의 존재를 또한 비-환원성 SDS-PAGE를 사용하여 확인하였다 (도 3J). 펜타머 형태의 CTB-Pro-IGF-1의 크기는 대략 121.5 kDa이지만 더 큰 크기가 관찰되었으며, 이것은 아마도 펜타머 구조의 다이머 형태일 것이다. 이는 환원제의 부재시 CTB 펜타머 간의 강력한 상호작용 (Sanchez et al., 2008) 및/또는 CTB-IGF-1에서 분자 간 또는 분자 내 이황화 결합 때문일 수도 있다. 가장 중요하게는, 도 3J에서 단일 단백질 밴드는 단지 식물 세포에서 조립된 CTB-Pro-IGF-1 펜타머의 존재 및 놀라운 안정성을 가진 임의의 분열된 또는 모노머 생성물의 부재를 지지한다.
색소체 전환 라인에서 Pro-IGF-1의 발현 수준은 다음 세대에서 크게 증가되었다 (도 3K 및 3L). CTB-Pro-IGF-1 및 PTD-Pro-IGF-1 둘 다의 수준은 마커 제거 또는 융합 태그의 종류에 관계없이 T0 라인보다 T1 라인에서 CTB-Pro-IGF-1에서 평균 15배 및 PTD-Pro-IGF-1에서 7배 더 높았다. 동결건조된 상추 재료에서 CTB-Pro-IGF-1 및 PTD-Pro-IGF-1 융합 단백질은 둘 다 주위 온도에서 최대 12개월 동안 안정하게 유지되었다 (도 3M 및 3N). 장기간 저장 중에 동결건조된 분말 (IGF-1 μg/g 건조 중량)에서 발현된 IGF-1의 수준에서는 유의한 변화가 발견되지 않았으며, 동일한 배치의 식물 분말이 선택 가능한 마커 절제와 관계없이 상이한 저장 시점에 웨스턴 블롯으로 검사될 때 CTB--Pro-IGF-1은 평균 370 μg/g이고 PTD-Pro-IGF-1은 270 μg/g이었다.
엽록체 발현된
CTB
-Pro-
IGF
-1에 의해 유도된 세포 증식
시험관 내에서 식물 유래된 CTB-Pro-IGF-1의 세포 증식 효과를 평가하기 위해서, 네 가지 상이한 인간 및 마우스 세포 유형, HOK (인간 구강 각질 형성 세포), GMSC (인간 치은-유래 중간엽 간질 세포), SCC (인간 두경부 편평세포암종 세포), 및 마우스 골아세포 (MC3T3)에서 MTT 검정을 수행하였다. CTB-Pro-IGF-1을 CTB 모노머가 접근하여 펜타머 CTB-Pro-IGF-1 구조를 형성할 때 히스티딘 잔기의 결과적인 근접성에 의해 생성된 이미다졸 고리의 클러스터(cluster)에 결합하는 니켈의 친화도를 사용하여 동결건조된 식물 세포로부터 정제하였다. 정제된 엽록체 유래된 단백질을 대조군으로서 인간 IGF-1 펩타이드를 이용한 면역블롯 분석에 의해 평가한 후 (데이터 미도시), CTB-Pro-IGF-1의 단계 희석액을 상이한 구강 세포 유형과 함께 인큐베이션하였다. 엽록체 유래된 CTB-Pro-IGF-1은 상업적인 IGF-1과 비교하여 HOK (~1.2배), GMSC (~1.7배) 및 마우스 골아세포 (~1.7배)의 증식을 자극하는 한편 (도 4A, 4B, 및 4D) SCC에서 증식에 대하여 유사한 효과를 관찰하였다 (도 4C). 이들 결과는 식물 유래된 Pro-IGF-1이 네 가지 구강 세포 유형 모두에서 용량 의존적인 방식으로 증식을 촉진하고 비율은 성숙한 IGF-1과 비교하여 HOK, GMSC, 및 마우스 골아세포에서 더 높다는 것을 입증하였으며 식물 엽록체에서 발현된 Pro-IGF-1이 충분히 기능성이고 상업적인 IGF-1 제품보다 더 강력하다는 것을 나타낸다. IGF-1이 골아세포 분화를 촉진할 수 있는지를 결정하기 위해서, MC3T3 세포를 정제된 CTB-Pro-IGF-1의 유무에 관계없이 5일 동안 OS 배지로 처리한 다음 골 형성 마커 (ALP, OSX, RUNX2)의 유전자 발현을 검사하였다. 예상된 바와 같이, 발명자들의 데이터는 300ng/ml의 CTB-Pro-IGF-1로의 처리가 ALP, OSX, 및 RUNX2의 발현을 크게 상향 조절했다는 것을 나타내며, IGF-1은 OB 분화를 촉진할 수 있다는 것을 입증한다 (도 4E).
IGF
-1의 경구 전달의 평가
각각 CTB-Pro-IGF-1 및 PTD-Pro-IGF-1 또는 CTB-Pro-IGF-1을 발현하는 동결건조된 담배 및 상추 식물 세포를 PBS에 현탁시키고 경구 섭식에 의해 C57BL/6J 마우스에 투여하였다. 공급 후 2시간에 순환에서 IGF-1의 수준이 크게 증가하였다 (도 5A). 증가는 2 내지 3 배 (67% 내지 200%)의 범위에 있으며, 무 마커 상추로부터 유래된 PTD-Pro-IGF-1 및 상추 또는 담배로부터 유래된 CTBPro-IGF-1로부터 관찰된 IGF-1에서 평균 100%였다. 수컷과 암컷 사이에서 흡수의 차이는 관찰되지 않았다. 이들 결과는 GM1 수용체에 결합된 펜타머 CTB 융합 단백질이 수용체-매개된 경상피 수송 경로를 통해 상피 장벽을 통과한다는 것을 나타낸다. 또한, 양으로 대전된 PTD 도메인은 수용체-독립적인 유동상 미소세포 흡수 작용(micropinocytosis)에 의해 융합된 단백질을 세포로 운반할 수 있다. 두 수송 시스템은 IGF-1을 혈액으로 전달하는데 효과적이었다. 게다가, 경구 섭식 후 5시간에 비장근 (도 5B) 및 가자미근 (도 5C)에서 증가된 IGF-1의 존재는 CTB 및 PTD가 IGF-1을 근육 조직으로 전달하기 위한 경점막 담체의 역할을 한다는 것을 나타낸다. IGF-1은 공급 후 5시간에 비장근 및 가자미근 둘 다에서 대략 28%만큼 증가하였다.
IGF
-1의 전신 투여는 당뇨성 골절 치유시 골 재생을
촉진한다
생체 내에서 골 재생에 대한 CTB-Pro-IGF-1의 효과를 더 특성화하기 위해서, 발명자들은 당뇨병 (Dia) 연령 및 성별이 일치된 야생형 (CON) 마우스 둘 다에서 골절 모델을 생성하였다. 골절 부위, 0에 대해 대략 3mm 근위부 및 3mm 원위부를 커버하는 Micro-CT 이미지를 골절 후 6주에 획득하였다. 예상된 바와 같이, microCT 이미지의 3D 재구성은 CON 마우스와 비교하여 Dia 마우스에서 골 형성의 상당한 감소를 나타냈다. Dia 마우스는 CON 마우스와 비교하여 골절 부위에서 낮은 골 밀도 및 다공성 직골(woven bone)과 함께 훨씬 더 낮은 골 질량을 갖는다 (도 6A). 따라서, BV/TV의 비율 및 골 밀도는 각각 54% 및 39%까지 감소하였다. 더욱이, 조직학적 분석 결과는 CON 마우스와 비교하여 Dia 마우스에서 상대적인 골 면적이 31%까지 감소하였다는 것을 나타낸다 (도 6B). 골 부피, 밀도 및 면적은 IGF-1 처리 후 WT 식물 처리된 Dia 마우스와 비교하여 크게 증가하였다 (도 6A 및 도 6B).
논의
식물 세포에서 생물약제의 생산은 2012년 5월에 FDA에 의해 승인되었으며 (Xu et al., 2014), 분자생물 농업 적용을 위해 식물을 사용하는 주요 목표 중 하나를 달성하였다. 불행하게도, 식물 세포에서 생산된 글루코세레브로시다제 (Devescovi et al., 2008)는 정제, 저온 유통 및 주사 가능 물질 전달의 높은 비용으로 인해 경쟁 물질, 예컨대 이미글루세라제 (CHO 세포에 의해 생산됨) 및 벨라글루세라제 (인간 섬유육종(fibrosarcoma) 세포에 의해 생산됨)과 비교하여 고셰 병(Gaucher's disease) 환자에게 예상 비용 효과적인 이점을 제공하지 못 했다 (Taliglucerase for Gaucher Disease, 2012). 글루코세레브로시다제의 경구 전달을 통해 비용을 감소시키기 위한 노력은 낮은 수준의 발현으로 인해 성공적이지 않았다 (Shaaltiel et al., 2015). 획기적인 임상 시험에서는 소량으로 조기 도입시 땅콩 알레르기(allergy)가 억제될 수 있을 것으로 나타났고 곧 FDA 승인이 예상된다 (Tilles et al., 2018). 이 경구 전달 접근법은 식물 세포 항원 및 소화관 면역 시스템을 사용하여 많은 음식 또는 화분 알레르기를 치료하고 주사된 단백질 약물에 대한 항체를 억제하거나 기능성 단백질을 전달하기 위한 길을 열었다.
유사하게, 식물 엽록체 시스템은 높은 수준의 발현 및 경구 투여의 용이함을 포함한 다양한 이점을 가진 치료 단백질을 전달하기 위해 발전되었다. 하지만, 색소체 전환 라인에서 항생제 저항성 유전자의 체류는 규제 승인 과정에서 장애물이 될 수 있다. 이전의 연구에서는 >600 bp의 DNA 직접 반복부가 담배 엽록체 게놈에서 상동성-기반 마커 절제를 촉진하는 것으로 나타났다 (Iamtham et al., 2000). 더 최근에는, 발명자들은 음식/공급 효소를 발현하는 무 마커 색소체 전환 상추의 첫 번째 적용을 입증하였다 (Daniell et al., 2019 및 Kumari et al., 2019). 그러므로, Pro-IGF-1을 생성하기 위해서, 발명자들은 649 bp의 두 개의 atpB 프로모터 영역을 사용하여 상추 엽록체 게놈으로부터의 마커 절제를 시작하였다. 흥미롭게도, aadA 유전자는 제1 라운드의 선택에서도 성공적으로 절제되었다. 이것은 >800 시퀀싱된 엽록체 게놈에서 발견된 동일한 역반복 영역 (스페이서 영역을 포함함)을 유지하는 카피 정정 메커니즘 때문일 수도 있다 (Daniell et al., 2016). 상추에서 aadA 유전자가 초기 선택 과정에서 절제되지 않을 때, 항생제 함유 배지에서 시드를 발아시킴으로써 다음 세대에서 제거하는 것은 매우 어려운 일이다. 이들 결과는 무 마커 색소체 전환 식용 식물의 생성이 효과적이며 추가적인 형질전환 단계가 필요없이 짧고 간단한 방법으로 선택 가능한 마커 유전자를 정확하게 제거한다는 것을 시사한다. 또한, 항생제 저항성 유전자의 절제는 색소체 전환 작물의 대사적 부하를 감소시킬 뿐 아니라, 동일한 선택 마커가 추가적인 유전자의 후속 형질전환에 재사용될 수 있게 한다.
이전의 연구에서 e-펩타이드의 잠재적인 생물학적 역할을 시사하였다. Pro-IGF-1 및 Gly-Pro-IGF-1은 골격근 조직에서 성숙한 IGF-1보다 더 지배적이고 이 비율은 Igf1 유전자의 바이러스 과발현 이후에도 유지되었다. IGF-1의 과발현 후 어린 마우스에서 근비대증(muscle hypertrophy)에 대한 개선의 부족에 기초하여 근육량에 대한 e-펩타이드 요건이 제안되었고 Pro-IGF-1이 바이러스에 의해 과발현될 때 캐스케이드 단백질의 인산화의 증가가 나타난다 (Philippou et al., 2014). 더욱이, 독립적인 e-펩타이드는 IGF-1R 신호전달을 자극하였고 다양한 인간 세포 및 세포주에서 세포 증식 및 분화를 조절하였다 (Philippou et al., 2014). 따라서, 이 연구에서 생성된 색소체 전환 라인에서 Pro-IGF-1을 발현하는 e-펩타이드의 체류는 IGF-1 처리의 효험을 증가시켜야 한다.
IGF-1은 다수의 근육 장애를 치료하기 위한 치료적 후보로서 사용되었다. 대부분 간에서 생산되는 순환 IGF-1은 근비대증을 개선하기에 충분하지 않으며, 그러므로 근육 조직으로의 전달이 효험에 필요하다. 순환 시스템에서 IGF-1 수준을 증진시키는 것이 적합한 전략이며 혈청 내에서 높아진 IGF-1 수준이 근육 조직으로의 전위로 인한 근육량 향상을 초래하기 때문이다 (Philippou et al., 2014). 태그되지 않은(untagged) IGF-1의 경구 투여로 혈청에서 검출 가능한 IGF-1은 거의 없거나 전혀 없으며 그러므로 IGF-1은 임상 연구에서 주사에 의해 투여된다는 것은 잘 확립되어 있다. 4일 동안 하루에 3.4 mg/kg IGF-1이 공급된 돼지의 혈청에서 검출 가능한 IGF-1이 발견되지 않았다 (Burrin et al., 1996). 영양실조된 지속성 외래 복막 투석 (CAPD) 환자에서 12시간마다 주사하는 20일에 걸쳐 인간의 혈청 수준에서 재조합 IGF-1이 대략 100% 증가하였다 (Fouque et al., 2000). 그에 반해, 본 연구는 경구로 전달된 Pro-IGF-1이 마우스에서 1회의 섭식 공급 후 2시간에 IGF-1의 순환 수준을 ~100% 증가시키고 5시간에 국소 근육 조직에서 ~28% 증가시킨다는 것을 입증한다. IGF-1의 경구 투여는 혈액에서 IGF-1의 12시간 반감기로 인해 환자에게 필요한 매일 주사에 바람직하다. 이들 결과는 엽록체 유래된 Pro-IGF-1이 장 상피 세포를 통한 흡수 및 근육 조직으로의 전달에 의해 기능적인 특성 및 경구 전달의 용이함을 유지함으로써 근육 장애를 치료하기에 효과적인 접근법일 수 있다는 것을 나타낸다.
IGF-1 신호전달 경로는 IGF-1 결합시 IGF-1 수용체 (IGF-1R) 인산화에 의해 시작된다. 그것은 위성 세포 및 근아세포에서 IGF-1의 증식 후 효과를 향상시키는 것으로 보여지는 PI3K/Akt 및 MEK/Erk (미토겐-활성화된 단백질 키나제, MAPK) 신호전달 경로를 수반하며, 이는 근육 성장을 유발한다 (Bikle et al.). 발명자들의 연구에서, 아마도 매우 많은 IGF-1R의 수로 인해 상업적인 IGF-1 및 CTB-Pro-IGF-1에 노출된 편평세포 암종 세포의 증식 간에 차이가 검출되지 않았으며 (Rios et al., 2015), 이로써 세포 표면 상에서 CTB-GM1 결합과 효과적으로 경쟁한다. 수용체와의 IGF-1 상호작용이 세포 증식을 유도하는 대안의 경로는 수용체-매개된 세포 내 흡수(endocytosis)를 수반한다. 현재의 증거는 IGF-1R로의 IGF-1 결합에 이은 IGF-1R 내재화가 SHc/MAPK 경로를 조절한다는 것을 시사한다. 본 연구에서, 발명자들은 상업적 IGF-1과 비교하여 CTB-Pro-IGF-1에 반응하여 인간 구강 각질 형성 세포 (HOK), 인간 치은-유래 중간엽 간질 세포 (GMSC) 및 마우스 골아세포 (MC3T3)의 증식이 증가하는 것을 관찰하였다. 이것은 세포 표면에서 IGF-1/IGF-1R 상호작용에 더하여 GM1 수용체에 결합하는 CTB-Pro-IGF-1의 내재화에 의한 다수의 경로의 활성화 때문일 수도 있다. 대안으로, IGF-1의 상업적 조제물은 IGF-1 신호전달 경로를 향상시킬 수 있는 CTB-Pro-IGF-1에 존재하는 e-펩타이드를 함유하지 않는다 (Philippou et al., 2014). IGF-1은 연골 발생 및 골 형성 세포의 증식 및 분화로부터 발생한 골 성장을 포함한 다수의 성장 신호전달 경로에 수반된다 (Bikle et al., 2015). 발명자들은 CTB-Pro-IGF-1이 골아세포 증식을 촉진할 뿐 아니라 ALP, OSX, 및 RUNX2를 포함한 골아세포 마커 유전자 발현을 크게 상향 조절한다는 것을 발견하였으며, 골 형성에 대한 CTB-Pro-IGF-1의 효험을 입증하였다. 이 연구는 기존의 증거를 기반으로 치과 치료를 위한 엽록체 유래된 Pro-IGF-1의 치료 능력을 발전시킨다: 골아세포 증식은 골 형성 및 재생을 향상시키고, 이식된 GMSC는 손상된 치주 조직의 재생 및 골아세포로의 분화를 유발하고, 인간 구강 상피 성장은 각질 형성 세포 형성 및 분화를 조절하는 각질 형성 세포 성장 인자에 의해 자극된다. 최근의 임상 시험은 재조합 인간 섬유아세포 (FGF)-2 및 테리파라타이드 (부갑상선 1-34)의 적용이 개방 플랩 좌멸 조직 제거 수술(open flap debridement surgery)을 통해 치주 병소로 전달된 후 골 형성을 유발한다는 것을 보여주었다 (Rios et al., 2015). 하지만, 유망한 신흥 기술에도, 치의학에서 치료 단백질을 전달하기 위해서는 여전히 수술 전달이 필요하다. 엽록체 시스템은 신규한 치주 약물 전달을 위한 플랫폼을 제공하여 환자의 수용 상태 및 경제성을 증가시킨다.
골절 회복은 매우 복잡하고 역동적인 생리학적 과정이며, 이것은 염증, 가골(bony callus) 형성 및 골 재형성의 특징적인 단계를 수반한다 (Marsell et al., 2011). 여러 생물학적 성장 인자, 예컨대 TGF-β, BMP, PDGF, FGF 및 VEGF는 세포 증식, 이동, 분화 및 다른 세포 과정을 조절함으로써 골 치유의 과정에 영향을 미치는 것으로 나타났다 (Devescovi et al., 2008). 이들 성장 인자 중에서도, IGF-1은 또한 골절 치유시 골 재생에 대해 강력한 영향을 나타낸다. IGF-1의 국소 및 전신 투여는 둘 다 개선된 증가된 골 치유 및 빠른 임상적 개선을 초래한다 (Govoni et al., 2007; Jiang et al., 2006, Schmidmaier et al., 2002; 및 Locatelli et al., 2014). 생체 내 당뇨 조건에서 골 재생에 대한 경구로 전달된 IGF-1의 효과를 검사하기 위해서, 발명자들은 당뇨성 골절 치유 모델을 이 연구에 적용하였다. 발명자들은 비-당뇨성 마우스에서 IGF-1 처리 후 골절 치유에 대해 큰 영향을 관찰하지 못 했으며 내인성 IGF-1 수준이 정상이기 때문이다. 매우 흥미롭게도, 병리학적 당뇨 조건에서, 골 재생이 감소될 때, IGF-1은 당뇨병에 의해 유발된 불완전 골 재생을 복구시킬 수 있다. 발명자들은 WT 식물 처리된 당뇨성 마우스와 비교하여 IGF-1 처리 후 골 부피, 밀도 및 면적이 크기 증가했다는 것을 발견하였다. 이 연구 동안에 IGF-1과 함께 또는 없이 IGF-1 처리된 당뇨성 마우스 사이에서 혈당 수준이 상이하지 않다는 것을 주목할 필요가 있다. 이것은 개선된 골 형성이 골에 대한 효과 때문이며 당뇨 조건의 개선 때문은 아니라는 것을 나타낸다. 당뇨병-유도된 골격 손상에 수반된 메커니즘은 아직 완전히 이해된 것은 아니다. 그것은 연골 세포 아폽토시스(apoptosis)의 불균형, 연골의 조숙한 제거, 감소된 골아세포 분화 및 기능 또는 혈관화의 변화를 초래하는 일련의 분자적 및 세포적 변화를 수반한다. 당뇨성 골에서 IGF-1 처리의 메커니즘을 설명하기 위해서는 추가의 조사가 필요하다.
이에 더하여, 발명자들은 비-수용체 매개된 전달 대 수용체 매개된 전달의 효율을 구별하기 위해 PTD-Pro-IGF-1 및 CTB-Pro-IGF-1 공급된 마우스의 혈청 및 근육에서 IGF-1의 증가를 비교하였다. 발명자들은 PTD-Pro-IGF-1 및 CTB-Pro-IGF-1 공급된 마우스 둘 다에 대해 근육 조직에서 IGF-1의 ~28% 증가를 관찰하였다. CTB에 의한 모든 세포 유형으로의 수용체-매개된 약물의 수송과는 대조적으로, PTD는 거대세포 흡수 작용(macropinocytosis)을 자극함으로써 세포막을 관통하지만 면역 조절 세포에 들어가지 않았다 (Xiao et al., 2016). PTD를 사용하여 Pro-IGF1을 근육 조직에 전달하는 능력은 항체 발달의 방지를 위한 약물 전달에 있어서 독특한 이점을 제공하며, 이것은 종종 혈우병(hemophilia) 또는 다른 질환에서 여러 주사된 단백질 약물에 대한 도전이다 (Herzog et al., 2017 및 Daniell et al., 2016).
결론적으로, 이 연구는 식물 엽록체에서 발현되고 식물 세포벽에 의해 생체 캡슐화된 Pro-IGF-1이 완전히 기능적인 형태로 경구 전달 가능하다는 것을 입증한다. 동결건조된 식물 세포는, 치의학에서 단백질 약물의 수술에 의한 전달과는 현저히 대조적으로, 기능성 효험을 상실하지 않으면서 실온에서 수개월 동안 저장될 수 있으며, 경제성 및 향상된 환자의 수용 상태를 용이하게 한다. 현재의 임상 제품에 존재하지 않는 IGF1의 기능 및 반복적인 경구 약물 전달의 용이함을 향상시키기 위해 e-펩타이드를 포함하는, 형질전환된 상추 엽록체 게놈으로부터의 항생제 저항성 유전자의 정확한 절제는 다양한 유전적 근질환, 급성 위축증, 손상 또는 골 손실로 고통받고 있는 환자에게 주요 개선을 제공한다.
실시예
II
구강 소비를 위한
무 항생제
생물약제
단백질의 발현 및 정제
실시예 I은 IGF-1의 생산에 의해 예시된 바와 같이 항생제가 없는 고등 식물의 색소체에서 생물약제를 생산하기 위한 패러다임을 제공한다. 도 7A는 본 발명에 따라 무 마커 생물약제를 생산하는데 사용된 분자적 클로닝 전략의 개략도를 제공한다. 도 7B는 최종 클로닝 벡터의 개략도를 제공한다. 도 7C는 실시예에서 기재된 649bp 반복부의 서열을 제공한다. 항생제 선택 가능한 마커 제거 과정은 rbcL 프로모터의 일부를 결실시키고 pLS-MF 벡터에서 atpB의 방향을 뒤집는 단계를 포함한다. 실시예 I에서 논의된 바와 같이, pLS-MF-ptxD 벡터는 프로모터 영역이 결여된 짧은 (<50) rbcL로 대체되는 atpB 서열을 제거하기 위한 독특한 PfoI/StuI 및 PvuII/NdeI 부위를 함유한다. 649 bp 서열 반복부 (서열 번호: 16, 도 7C)가 일부 실험에 사용되었지만, 이 서열은 특정 프로모터 요소를 제거하도록 변화되었다. 고유한 atpB 반복 서열 (649 bp)은 반대 방향으로 rbcL 및 atpB 프로모터 영역을 함유하고 이것은 전이유전자 카세트가 전사적으로 활성인 스페이서 영역으로 도입될 때 안티센스 RNA를 제조함으로써 유전자 발현을 방해한다. 하지만, 이러한 스페이서 영역은 전이유전자 발현 수준이 전사적 침묵 스페이서 영역보다 더 높기 때문에 선호된다 (Jin & Daniell, Trends in Plant Science, 2015; Daniell et al, Genome Biology 2016). 그러므로, 상이한 버전의 무 마커 발현 카세트에서 하나 또는 두 개의 프로모터 영역이 결실되었다.
항생제 상추 식물에서 IGF-1의 성공적인 발현은, 제한되는 것은 아니지만, 하기 표에서 나열된 것들을 포함하는 다양한 생물약제 단백질의 발현을 가능하게 한다.
특정 양태에서, IGF-1 요법이 필요한 대상체의 치료를 위한 방법이 또한 제공된다. 예시의 방법은 PTD 펩타이드 및 IGF1 기능을 향상시키는 e-펩타이드에 작동 가능하게 연결된 IGF-1 단백질을 포함하는 무 항생제 상추 식물 또는 상추 식물 제품의 유효량의 경구 투여를 수반하며, 상기 투여는 유전적 근질환, 급성 위축증, 손상 또는 골 손실의 증상을 완화하거나 개선하는데 효과적이다. IGF-1이 본원에 예시되어 있지만, 상기 나열된 단백질 중 어느 것도 본원에 기재된 무 마커 식물에서 발현될 수 있다. 이러한 식물 및 식물 제품은 당뇨병, 응고 장애, 선천성 대사 장애, 등의 치료를 위해 다양한 유용성을 가질 것이다.
참고문헌
본 발명의 바람직한 구체예 중 특정한 것들이 상기 기재되고 구체적으로 예시되어 있지만, 본 발명이 이러한 구체예에 제한되도록 의도하는 것은 아니다. 다음 청구범위에서 제시된 바와 같이, 본 발명의 범위 및 사상에서 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> The Trustees of the University of Pennsylvania
Daniell, Henry
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<400> 14
cataataata aaataaatta aatatgtcga aatgttttgc aaaaattatc gaattcaaaa 60
taaatgtccg ctagcacgtc gatcggttaa ttcaataaaa tgggaattag cactcgattt 120
cgttggcacc atgcaattga accgattcaa ttgtttactt attcactgag actgagtgaa 180
tttgcaagcc cacccaacct attttaattt taaaatctca agtggatgaa tcagaatctt 240
gagaaagtct ttcatttgtc tatcattata gacaatccca tccatattat ctattctatg 300
gaattcgaac ctgaacttta ttttctattt ctattacgat tcattatttg tatctaattg 360
gctcctcttc ttatttattt ttgatttcaa tttcagcata tcgatttatg cctagcctat 420
tcttttcttt gtgtttttct ttctttttta tacctttcat agattcatag aggaattccg 480
tatattttca catctaggat ttacatatac aacatatacc actgtcaagg gggaagttct 540
tattatttag gttagtcagg tatttccatt tcaaaaaaaa aaaaagtaaa aaagaaaaat 600
tggg 604
<210> 15
<211> 207
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> plasmid construct
<400> 15
gtcgactagt gtatagaaat cctttttttt ttatttttgc aaaccgcttt tgatttacaa 60
aaaattgaac tagatccaga tagatattgg ttgacacggg catataagtc atgttatact 120
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attaaataaa ccaagatttt acatatg 207
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> plasmid construct
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ataatttttg caaaaacatt tcgacatatt tatttatttt attattatg 649
Claims (27)
- 색소체에서 생물약제 단백질을 발현하는 무 항생제 색소체 전환 식물로서, 상기 단백질은 CTB-proIGF1, PTD-proIGF1, CTB-프로인슐린, CTB-AMA, CTB-MSP, CTB-FIX, CTB-FIX-퓨린, CTB-엑센딘, CTB-ESAT6, CTB-Mtb72F, CTB-VP1, CTB-MBP, CTB-Ace 2, CTB-Ang1-7, CTB-GAA, CTB-FVIII-HC, CTB-FVIII-C2, 코돈 최적화된 CTB-FVIII-HC, 코돈 최적화된 CTB-FVIII-LC, 및 코돈 최적화된 CTB-FVIII-SC로 이루어진 군으로부터 선택된, 무 항생제 색소체 전환 식물.
- 제1 항에 있어서, 상기 단백질은 CTB-proIGF1 및 PTD-proIGF1로부터 선택되며, 상기 단백질 각각은 e-펩타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 식물.
- 제2 항에 있어서, 상기 IGF1은 글리코실화 부위를 제거하도록 변화된 것을 특징으로 하는 식물.
- 제1 항에 있어서, 상기 단백질은 색소체 발현을 위해 코돈 최적화된 핵산에 의해 암호화된 것을 특징으로 하는 식물.
- 제2 항의 식물로부터 얻어진 단리된 식물 세포.
- 고등 식물의 색소체에서 구강 소비를 위한 무 항생제 생물약제를 생산하는 식물을 생산하기 위한 방법으로서,
a) 색소체 형질전환 벡터를 식물 세포로 도입하는 단계로서, 상기 벡터는 색소체 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 항생제를 암호화하는 선택 가능한 마커 유전자를 포함하고, 상기 유전자 및 프로모터는 길이가 600-800개의 뉴클레오타이드 사이에서 직접 반복되는 DNA 서열에 의해 플랭킹되고, 상기 벡터는 관심있는 생물약제 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 색소체 프로모터를 포함하는 이종성 핵산을 더 포함하며, 상기 관심있는 단백질은 선택적으로 표적화 펩타이드를 포함하고 및/또는 핵산을 암호화하는 상기 단백질은 상기 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화된, 단계,
b) 상기 항생제의 존재 하에 재생 배지에서 순 생산이 일어나기에 적합한 기간 동안 단계 a)의 식물 세포를 배양하는 단계,
c) 상기 순을 선택 가능한 마커 유전자 절제에 대해 평가하는 단계,
d) 선택 가능한 마커 유전자 절제를 나타내는 순을 뿌리 성장을 유도하는데 적합한 무 항생제 배지로 옮기는 단계, 및
e) 단계 d)에서 유도된 뿌리로부터, 상기 선택 가능한 마커 유전자가 결여된 상기 관심있는 단백질을 발현하는 색소체 전환 식물을 생성하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제6 항에 있어서, 단계 e)의 식물은 동형 세포질성(homoplasmy)에 대해 평가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6 항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커 유전자는 aadA 유전자이고 상기 항생제는 스펙티노마이신인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6 항에 있어서, 상기 직접 반복부는 서열 번호: 16에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6 항에 있어서, 상기 이종성 핵산은 PTD 펩타이드 및 e-펩타이드에 작동 가능하게 연결된 코돈 최적화된 IGF1을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6 항에 있어서, 상기 이종성 핵산은 CTB 펩타이드에 작동 가능하게 연결된 코돈 최적화된 IGF1을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6 항에 있어서, 상기 관심있는 이종성 단백질은 CTB-프로인슐린, CTB-AMA, CTB-MSP, CTB-FIX, CTB-FIX-퓨린, CTB-엑센딘, CTB-ESAT6, CTB-Mtb72F, CTB-VP1, CTB-MBP, CTB-Ace 2, CTB-Ang1-7, CTB-GAA, CTB-FVIII-HC, CTB-FVIII-C2, 코돈 최적화된 CTB-FVIII-HC, 코돈 최적화된 CTB-FVIII-LC, 및 코돈 최적화된 CTB-FVIII-SC로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6 항에 있어서, 상기 식물은 상추, 토마토, 당근 및 대두로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제13 항에 있어서, 상기 식물은 상추 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6 항에 있어서, 단계 b)의 상기 기간은 4 내지 6주인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제15 항에 있어서, 상기 기간은 4주인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6 항에 있어서, 상기 관심있는 이종성 단백질의 발현은 후속 세대에서 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6 항에 있어서, 상기 식물은 절제 생성물의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머를 이용한 PCR을 사용하여 마커 절제에 대해 평가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6 항에 있어서, 상기 직접 반복되는 DNA 서열은 atpB 유전자로부터 유래되고 도 6에서 나타난 하나 이상의 내인성 프로모터 요소가 결여된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6 항에 있어서, 상기 제2 프로모터는 형질전환되는 식물 종에 대해 내인성인 psbA 프로모터 및 5'UTR을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6 항에 있어서, 단계 e)의 식물로부터 상기 생물약제 단백질을 단리시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- PTD 펩타이드 및 e-펩타이드에 작동 가능하게 연결된 IGF-1 단백질을 포함하는 무 항생제 상추 식물 또는 상추 식물 제품의 유효량의 경구 투여를 포함하는, IGF-1 요법을 필요로 하는 대상체의 치료를 위한 방법으로서, 상기 e-펩타이드는 IGF-1 기능을 향상시키고, 상기 투여는 유전적 근질환, 급성 위축증, 손상, 또는 골 손실 또는 골절의 증상을 완화하거나 개선하는데 효과적인, 방법.
- 제22 항에 있어서, 투여는 혈청, 근육, 또는 골 중 하나 이상에서 증가된 IGF-1 수준을 초래하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제22 항에 있어서, 투여는 ALP, Osx, 및/또는 RUNX2의 증가된 발현 수준으로 나타난 바와 같이 골아세포 증식 및/또는 분화를 초래하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제22 항에 있어서, 투여는 골 부피, 밀도, 및/또는 면적을 증가시키기에 효과적인 것을 특징으로 하는 방법.
- 색소체 프로모터에 작동 가능하게 연결된 항생제를 암호화하는 선택 가능한마커 유전자를 포함하는 식물 색소체 형질전환 벡터로서, 상기 유전자 및 프로모터는 길이가 600-800개의 뉴클레오타이드 사이에서 직접 반복된 DNA 서열에 의해 플랭킹되고, 상기 벡터는 관심있는 생물약제 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 색소체 프로모터를 포함하는 이종성 핵산을 더 포함하고, 상기 관심있는 단백질은 선택적으로 표적화 펩타이드를 포함하고, 및/또는 상기 단백질을 암호화하는 핵산은 상기 식물에서 발현을 위해 코돈 최적화되고, 상기 이종성 핵산은 PTD 및 e-펩타이드 암호화 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 코돈 최적화된 IGF-1인, 식물 색소체 형질전환 벡터.
- 색소체에서 생물약제 단백질을 발현하는 단리된 색소체 전환 무 항생제 식물 세포로서, 상기 단백질은 CTP-proIGF1-PTD, CTB-프로인슐린, CTB-AMA, CTB-MSP, CTB-FIX, CTB-FIX-퓨린, CTB-엑센딘, CTB-ESAT6, CTB-Mtb72F, CTB-VP1, CTB-MBP, CTB-Ace 2, CTB-Ang1-7, CTB-GAA, CTB-FVIII-HC, CTB-FVIII-C2, 코돈 최적화된 CTB-FVIII-HC, 코돈 최적화된 CTB-FVIII-LC, 및 코돈 최적화된 CTB-FVIII-SC로 이루어진 군으로부터 선택되고 선택 가능한 마커 유전자가 결여된 벡터로부터 발현되는, 단리된 색소체 전환 무 항생제 식물 세포.
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