JP2003530888A - トランスジェニック植物 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、直列反復配列を用いることにより、外来遺伝子と共に導入された選択マーカー遺伝子を含まずに外来遺伝子を含有する組換え型プラスチドゲノムを含むトランスジェニック植物を生産する方法、該方法において使用されうる直列反復配列を含有する核酸構築物および該方法によって生産されたトランスジェニック植物を提供する。
Description
【０００１】
（技術分野）
本発明は、トランスジェニック植物および核酸構築物ならびにその生産方法に
関する。
関する。
【０００２】
（背景技術）
近代の遺伝子導入テクノロジーは、所望の特性を有するトランスジェニック植
物の迅速な開発を可能とする。該テクノロジーの範囲は広く、その可能性は社会
に大いに役立つ。例えば、トランスジェニック植物は、工業用有機化合物の再生
可能な供給源を提供するのばかりでなく、食物の量および質を向上する手段を提
供する。
物の迅速な開発を可能とする。該テクノロジーの範囲は広く、その可能性は社会
に大いに役立つ。例えば、トランスジェニック植物は、工業用有機化合物の再生
可能な供給源を提供するのばかりでなく、食物の量および質を向上する手段を提
供する。
【０００３】
作物から雑草系統への導入遺伝子の逸出は、環境に対するその可能性のある心
身に有害な影響について公衆の関心を喚起した。さらに、導入遺伝子が作物から
ヒトへ伝わるかもしれないという懸念がある。したがって、作物からの導入遺伝
子の逸出の危険性を減らすことは、農業におけるトランスジェニック作物の容認
に相当に役立つ。
身に有害な影響について公衆の関心を喚起した。さらに、導入遺伝子が作物から
ヒトへ伝わるかもしれないという懸念がある。したがって、作物からの導入遺伝
子の逸出の危険性を減らすことは、農業におけるトランスジェニック作物の容認
に相当に役立つ。
【０００４】
安定なトランスジェニック植物を製造するための遺伝子導入技術の大多数は、
外来性ＤＮＡを植物核に導入する。核染色体中に組み込まれた外来性遺伝子は花
粉を経て幅広く分散される。プラスチドおよびミトコンドリアなどのオルガネラ
は、多くの作物植物において母性遺伝する。外来性ＤＮＡのオルガネラへの導入
は、導入遺伝子の環境への逸出を減らす一つの方法を提供する。
外来性ＤＮＡを植物核に導入する。核染色体中に組み込まれた外来性遺伝子は花
粉を経て幅広く分散される。プラスチドおよびミトコンドリアなどのオルガネラ
は、多くの作物植物において母性遺伝する。外来性ＤＮＡのオルガネラへの導入
は、導入遺伝子の環境への逸出を減らす一つの方法を提供する。
【０００５】
外来性ＤＮＡをオルガネラへ導入する方法は、核形質転換技術の出現後に発達
した。初期に記載されたプラスチドを形質転換する方法は効率が悪く、再現性が
なく、ほとんど価値がなかった。オルガネラのための再現性のあるＤＮＡ媒介性
形質転換方法は、クラミドモナス・レインハルディ（Chlamydomonas reinhardti
i）プラスチドおよびサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae
）ミトコンドリアについて最初に記載された。次に、タバコの安定なプラスチド
形質転換のための信頼できる手法が記載された。
した。初期に記載されたプラスチドを形質転換する方法は効率が悪く、再現性が
なく、ほとんど価値がなかった。オルガネラのための再現性のあるＤＮＡ媒介性
形質転換方法は、クラミドモナス・レインハルディ（Chlamydomonas reinhardti
i）プラスチドおよびサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae
）ミトコンドリアについて最初に記載された。次に、タバコの安定なプラスチド
形質転換のための信頼できる手法が記載された。
【０００６】
遺伝子をプラスチドに導入するために一般的に使用される技術は、粒子爆撃、
ポリエチレングリコールおよびミクロインジェクションを包含する。かかる技術
は、１００％効果的というわけではない。植物が形質転換したことを決定するた
めに、目的の遺伝子は選択マーカーと共に導入される。最も一般的に使用される
選択マーカーは、形質転換植物に抗生物質耐性を与えるものである。形質転換植
物中の抗生物質耐性遺伝子の存在により、作業者は野生型、非形質転換植物から
形質転換植物を識別および選択することができる。
ポリエチレングリコールおよびミクロインジェクションを包含する。かかる技術
は、１００％効果的というわけではない。植物が形質転換したことを決定するた
めに、目的の遺伝子は選択マーカーと共に導入される。最も一般的に使用される
選択マーカーは、形質転換植物に抗生物質耐性を与えるものである。形質転換植
物中の抗生物質耐性遺伝子の存在により、作業者は野生型、非形質転換植物から
形質転換植物を識別および選択することができる。
【０００７】
過去１０年にわたる陸地植物におけるプラスチド形質転換技術における発展は
、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに耐性を与えるプラスチド形質
転換のための細菌性ａａｄＡ遺伝子の使用に依存してきた。ａａｄＡ遺伝子を含
有する植物は、スペクチノマイシンおよび／またはストレプトマイシン含有培地
において正常に生育し、一方、ａａｄＡ遺伝子を含有しない野生型植物はかかる
培地上で生育するが、白くなり、形質転換緑色植物と野生型白色植物との間の単
純な区別が可能である。
、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに耐性を与えるプラスチド形質
転換のための細菌性ａａｄＡ遺伝子の使用に依存してきた。ａａｄＡ遺伝子を含
有する植物は、スペクチノマイシンおよび／またはストレプトマイシン含有培地
において正常に生育し、一方、ａａｄＡ遺伝子を含有しない野生型植物はかかる
培地上で生育するが、白くなり、形質転換緑色植物と野生型白色植物との間の単
純な区別が可能である。
【０００８】
プラスチド形質転換のためのプラスミドＲ１００．１由来のａａｄＡ遺伝子マ
ーカーの使用は、シー・レインハルディイ（C. reinhardtii）において最初に記
載さあれた。次に、タバコプラスチド形質転換におけるシゲラ（Shigella）由来
のａａｄＡ遺伝子の使用が著しい効率改善を導いた。他の選択マーカー遺伝子、
例えば、カナマイシン耐性遺伝子Ｋａｎは、プラスチド形質転換においてａａｄ
Ａよりも効率がよくないことが証明されたが、ａａｄＡよりも強力でなくとも、
等価の効率を有するさらなる選択マーカーが開発されうると考えられる。
ーカーの使用は、シー・レインハルディイ（C. reinhardtii）において最初に記
載さあれた。次に、タバコプラスチド形質転換におけるシゲラ（Shigella）由来
のａａｄＡ遺伝子の使用が著しい効率改善を導いた。他の選択マーカー遺伝子、
例えば、カナマイシン耐性遺伝子Ｋａｎは、プラスチド形質転換においてａａｄ
Ａよりも効率がよくないことが証明されたが、ａａｄＡよりも強力でなくとも、
等価の効率を有するさらなる選択マーカーが開発されうると考えられる。
【０００９】
遺伝子操作した作物植物中の抗生物質耐性遺伝子の存在によって問われる健康
および環境的危険性に対して相当な不安がある。抗生物質耐性および他の選択マ
ーカー遺伝子をトランスジェニック植物から取り除く一方で、目的遺伝子を保持
する方法は相当に価値のあるものである。
および環境的危険性に対して相当な不安がある。抗生物質耐性および他の選択マ
ーカー遺伝子をトランスジェニック植物から取り除く一方で、目的遺伝子を保持
する方法は相当に価値のあるものである。
【００１０】
現在、抗生物質耐性遺伝子を含有しないトランスジェニック植物を生産するた
めの２つの一般的な方法が存在する。第１の方法において、抗生物質の使用を要
しない選択方法を用いる。例えば、マンノースまたはイソペンテニルトランスフ
ェラーゼをトランスジェニック植物の選択に用いることができる。第２の方法に
おいて、トランスジェニック植物の生産後に抗生物質耐性遺伝子をトランスジェ
ニック植物から除去する。選択マーカー遺伝子を染色体から除去するためのいく
つかのスキームが記載されている。選択マーカー遺伝子が目的遺伝子の近くに連
結されていない場合、子孫の標準的な交雑および分析によって該マーカーを除去
することができる。選択マーカー遺伝子が目的遺伝子の近くに連結されている場
合、その除去を確実にするために他のスキームが考案された。これらは、転移可
能なエレメントまたは部位特異的組換え系の使用を包含する。これらのスキーム
は核遺伝子に限定され、修飾されたプラスチドゲノムを含有するトランスジェニ
ック植物由来の選択マーカー遺伝子の除去には関連しない。
めの２つの一般的な方法が存在する。第１の方法において、抗生物質の使用を要
しない選択方法を用いる。例えば、マンノースまたはイソペンテニルトランスフ
ェラーゼをトランスジェニック植物の選択に用いることができる。第２の方法に
おいて、トランスジェニック植物の生産後に抗生物質耐性遺伝子をトランスジェ
ニック植物から除去する。選択マーカー遺伝子を染色体から除去するためのいく
つかのスキームが記載されている。選択マーカー遺伝子が目的遺伝子の近くに連
結されていない場合、子孫の標準的な交雑および分析によって該マーカーを除去
することができる。選択マーカー遺伝子が目的遺伝子の近くに連結されている場
合、その除去を確実にするために他のスキームが考案された。これらは、転移可
能なエレメントまたは部位特異的組換え系の使用を包含する。これらのスキーム
は核遺伝子に限定され、修飾されたプラスチドゲノムを含有するトランスジェニ
ック植物由来の選択マーカー遺伝子の除去には関連しない。
【００１１】
藻類シー・レインハルディイ（C. reinhardtti）において、光合成突然変異体
に基づく選択スキームは、ａａｄＡのような選択マーカー遺伝子を用いることの
ないプラスチドゲノム中への目的外来遺伝子の導入を可能にした。かかるスキー
ムは、事前の光合成突然変異体の入手に依存するので、高等植物において実際的
ではない。選択マーカー遺伝子を包含する外来性非プラスチド遺伝子の組み込み
を用いることなくプラスチドＤＮＡを修飾するためのいくつかの方法が報告され
た。外来性選択マーカー遺伝子の付随的な組み込みを用いることなくプラスチド
遺伝子を操作することのできるシャトルベクター系（ＮＩＣＥ１）がタバコにお
いて記載された。該系は、内在性プラスチド配列の外来性プラスチドＤＮＡ配列
での置換を可能とした。ＮＩＣＥ１を基礎とするプラスミドもまた、プラスチド
ゲノムのいずれかの部分由来の突然変異をレスキューするのに適当である。
に基づく選択スキームは、ａａｄＡのような選択マーカー遺伝子を用いることの
ないプラスチドゲノム中への目的外来遺伝子の導入を可能にした。かかるスキー
ムは、事前の光合成突然変異体の入手に依存するので、高等植物において実際的
ではない。選択マーカー遺伝子を包含する外来性非プラスチド遺伝子の組み込み
を用いることなくプラスチドＤＮＡを修飾するためのいくつかの方法が報告され
た。外来性選択マーカー遺伝子の付随的な組み込みを用いることなくプラスチド
遺伝子を操作することのできるシャトルベクター系（ＮＩＣＥ１）がタバコにお
いて記載された。該系は、内在性プラスチド配列の外来性プラスチドＤＮＡ配列
での置換を可能とした。ＮＩＣＥ１を基礎とするプラスミドもまた、プラスチド
ゲノムのいずれかの部分由来の突然変異をレスキューするのに適当である。
【００１２】
シー・レインハルディイのプラスチドゲノムからａａｄＡ遺伝子を除去するた
めのスキームが記載された。シー・レインハルディイ葉緑体におけるマーカー再
利用は、シー・レインハルディイプラスチドゲノム中への突然変異の段階的な導
入のための方法を提供する。マーカー再利用もタバコシャトルベクター系もどち
らも、プラスチド遺伝子に対して非相同性である目的の外来遺伝子のプラスチド
ゲノム中への導入を可能としない。
めのスキームが記載された。シー・レインハルディイ葉緑体におけるマーカー再
利用は、シー・レインハルディイプラスチドゲノム中への突然変異の段階的な導
入のための方法を提供する。マーカー再利用もタバコシャトルベクター系もどち
らも、プラスチド遺伝子に対して非相同性である目的の外来遺伝子のプラスチド
ゲノム中への導入を可能としない。
【００１３】
選択可能な表現型を有さない外因性または外来性遺伝子のプラスチドゲノム中
への挿入を、抗生物質耐性遺伝子の長期間の組み込みを伴わずに可能とする方法
を開発するという要望が存在する。
への挿入を、抗生物質耐性遺伝子の長期間の組み込みを伴わずに可能とする方法
を開発するという要望が存在する。
【００１４】
選択マーカー遺伝子の同時挿入を伴わずに目的の外来遺伝子をプラスチドゲノ
ム中に導入するための方法は、高等植物において記載されていない。かかる方法
は、一般大衆によって認められたトランスジェニック植物の環境的および健康的
危険性を減少させることにおいて大いに有用であろう。また、直接選択を含む現
行のプラスチド形質転換手法にとって効率が悪すぎる広範なマーカー遺伝子の使
用を可能にする方法もまた、生産できるトランスプラストミック植物の範囲を拡
大することにおいて広く応用されるであろう。
ム中に導入するための方法は、高等植物において記載されていない。かかる方法
は、一般大衆によって認められたトランスジェニック植物の環境的および健康的
危険性を減少させることにおいて大いに有用であろう。また、直接選択を含む現
行のプラスチド形質転換手法にとって効率が悪すぎる広範なマーカー遺伝子の使
用を可能にする方法もまた、生産できるトランスプラストミック植物の範囲を拡
大することにおいて広く応用されるであろう。
【００１５】
（発明の開示）
本発明によると、第１の態様において、外来遺伝子と共に導入された選択マー
カー遺伝子を含まずに外来遺伝子を含有する組換え型プラスチドゲノムを含むト
ランスジェニック植物を生産する方法であって： （ａ）植物細胞のプラスチドゲノムを、形質転換されたプラスチドゲノム内で
組換え事象を起こして選択マーカー遺伝子を切り出すが、外来遺伝子は保持する
ように配置された外来遺伝子、選択マーカー遺伝子および少なくとも２つの直列
反復配列を含む核酸で安定に形質転換し； （ｂ）プラスチドが選択マーカー遺伝子を含む形質転換植物について１次選択
培地上で選択し；次いで （ｃ）形質転換プラスチドゲノム内での組換えにより選択マーカー遺伝子の切
除を促すが、外来遺伝子は保持するために、選択された形質転換植物を１次選択
培地の不在下で生育させる ことを特徴とする方法が提供される。
カー遺伝子を含まずに外来遺伝子を含有する組換え型プラスチドゲノムを含むト
ランスジェニック植物を生産する方法であって： （ａ）植物細胞のプラスチドゲノムを、形質転換されたプラスチドゲノム内で
組換え事象を起こして選択マーカー遺伝子を切り出すが、外来遺伝子は保持する
ように配置された外来遺伝子、選択マーカー遺伝子および少なくとも２つの直列
反復配列を含む核酸で安定に形質転換し； （ｂ）プラスチドが選択マーカー遺伝子を含む形質転換植物について１次選択
培地上で選択し；次いで （ｃ）形質転換プラスチドゲノム内での組換えにより選択マーカー遺伝子の切
除を促すが、外来遺伝子は保持するために、選択された形質転換植物を１次選択
培地の不在下で生育させる ことを特徴とする方法が提供される。
【００１６】
本発明の第１の態様は、選択マーカー遺伝子を伴わずにプラスチドゲノム内に
目的の外来遺伝子を含有するトランスジェニック植物を生産する方法を提供する
。該方法は、目的の外来遺伝子および選択マーカー遺伝子の植物のプラスチドゲ
ノム中への導入を含む。トランスプラストミック植物がいったん生産されると、
望ましくない選択マーカー遺伝子をプラスチドゲノムから除去する。本発明はそ
の第１の態様において、そのプラスチドゲノムが１以上の所望の遺伝子で形質転
換された植物から望ましくない外来性抗生物質耐性遺伝子を除去する方法を提供
する。望ましくない遺伝子の除去は、抗生物質耐性遺伝子の他の植物への逸出お
よび抗生物質耐性遺伝子の細菌への移入に対する公衆の懸念を減少させるのに相
当に価値がある。
目的の外来遺伝子を含有するトランスジェニック植物を生産する方法を提供する
。該方法は、目的の外来遺伝子および選択マーカー遺伝子の植物のプラスチドゲ
ノム中への導入を含む。トランスプラストミック植物がいったん生産されると、
望ましくない選択マーカー遺伝子をプラスチドゲノムから除去する。本発明はそ
の第１の態様において、そのプラスチドゲノムが１以上の所望の遺伝子で形質転
換された植物から望ましくない外来性抗生物質耐性遺伝子を除去する方法を提供
する。望ましくない遺伝子の除去は、抗生物質耐性遺伝子の他の植物への逸出お
よび抗生物質耐性遺伝子の細菌への移入に対する公衆の懸念を減少させるのに相
当に価値がある。
【００１７】
植物：
本発明の第１の態様による方法は、そのプラスチド中に外来遺伝子を導入する
ことが望まれるいずれの多細胞植物にも応用可能である。タバコのためのプラス
チド形質転換系が開発されたので、該方法は特にタバコに応用可能である。しか
しながら、本発明の第１の態様による方法は、特にそのためにプラスチド形質転
換法が開発された、例えば、穀類、アブラナ科およびナス科、例えば、ジャガイ
モのような他の高等植物にも応用可能である。本発明の第１の態様による方法は
、木および針葉樹ならびに作物植物を包含する単子葉および双子葉植物に応用可
能であると考えられる。
ことが望まれるいずれの多細胞植物にも応用可能である。タバコのためのプラス
チド形質転換系が開発されたので、該方法は特にタバコに応用可能である。しか
しながら、本発明の第１の態様による方法は、特にそのためにプラスチド形質転
換法が開発された、例えば、穀類、アブラナ科およびナス科、例えば、ジャガイ
モのような他の高等植物にも応用可能である。本発明の第１の態様による方法は
、木および針葉樹ならびに作物植物を包含する単子葉および双子葉植物に応用可
能であると考えられる。
【００１８】
形質転換：
高等植物プラスチドを外来性ＤＮＡで安定に形質転換するのに利用できるいく
つかの方法があり、本発明の方法はこれらの方法のいずれにも限定されないこと
が意図される。最も一般的に使用される形質転換法は、粒子爆撃、ポリエチレン
媒介性形質転換およびミクロインジェクションを包含する。挿入された外来遺伝
子を有するプラスチドゲノムを含有する形質転換植物を得るために選択される特
定の方法は、選択される植物種および器官に依存するであろう。下記の実施例に
おいて、プラスチド形質転換ベクターが粒子爆撃によってタバコの葉に導入され
た。
つかの方法があり、本発明の方法はこれらの方法のいずれにも限定されないこと
が意図される。最も一般的に使用される形質転換法は、粒子爆撃、ポリエチレン
媒介性形質転換およびミクロインジェクションを包含する。挿入された外来遺伝
子を有するプラスチドゲノムを含有する形質転換植物を得るために選択される特
定の方法は、選択される植物種および器官に依存するであろう。下記の実施例に
おいて、プラスチド形質転換ベクターが粒子爆撃によってタバコの葉に導入され
た。
【００１９】
「植物細胞のプラスチドゲノムを核酸で安定に形質転換する」なる語は、所望
の条件下で、形質転換植物細胞がトランスフェクトされた表現型を維持し、かつ
、野生型に戻らないことを意味する。ホモプラスミーの状態がトランスフェクシ
ョン後に達成されるように形質転換細胞が維持され、所望の条件が、形質転換細
胞が生き残ることができ、かつ、形質転換ゲノム、プラスチドおよび細胞の生育
および増殖に好ましい選択圧を維持するいずれかの条件であることが好ましい。
の条件下で、形質転換植物細胞がトランスフェクトされた表現型を維持し、かつ
、野生型に戻らないことを意味する。ホモプラスミーの状態がトランスフェクシ
ョン後に達成されるように形質転換細胞が維持され、所望の条件が、形質転換細
胞が生き残ることができ、かつ、形質転換ゲノム、プラスチドおよび細胞の生育
および増殖に好ましい選択圧を維持するいずれかの条件であることが好ましい。
【００２０】
さらに、本明細書で使用される場合、「植物細胞のプラスチドゲノムを核酸で
安定に形質転換する」なる語は、形質転換後にプラスチドゲノムが非天然核酸を
含有することを意味し；該用語は、形質転換が１つの核酸のプラスチドゲノム中
への組換えの結果として起こったか、または複数の核酸のプラスチドゲノム中へ
の組換えの結果として起こったかに関して、何も意味しないと解釈される。
安定に形質転換する」なる語は、形質転換後にプラスチドゲノムが非天然核酸を
含有することを意味し；該用語は、形質転換が１つの核酸のプラスチドゲノム中
への組換えの結果として起こったか、または複数の核酸のプラスチドゲノム中へ
の組換えの結果として起こったかに関して、何も意味しないと解釈される。
【００２１】
安定なプラスチド形質転換のために、選択マーカー遺伝子および目的遺伝子を
含有する核酸は、導入される外来遺伝子に隣接し、かつ、該外来遺伝子をプラス
チドゲノム中の特定位置に向けるプラスチドＤＮＡ配列との相同組換えによって
プラスチドゲノム中に挿入される。これらのプラスチド標的領域は、多数の植物
に関して入手可能なプラスチドＤＮＡのクローンバンクから得られる。例えば、
プラスチドＤＮＡ制限フラグメントを含有するクローンバンクはタバコおよびオ
オムギに関して入手可能である。外来遺伝子のプラスチドＤＮＡ内での正確な組
み込みは、増加数のプラスチドゲノム、例えば、タバコ、コメおよびトウモロコ
シのプラスチドゲノムの完全配列によって容易になる。下記で議論される実施例
において、外来遺伝子は、ｒｂｃＬとａｃｃＤ遺伝子との間の遺伝子間領域にお
けるタバコプラスチドゲノムのＡｏｃＩ制限部位に対応する位置５９３１９に挿
入される。
含有する核酸は、導入される外来遺伝子に隣接し、かつ、該外来遺伝子をプラス
チドゲノム中の特定位置に向けるプラスチドＤＮＡ配列との相同組換えによって
プラスチドゲノム中に挿入される。これらのプラスチド標的領域は、多数の植物
に関して入手可能なプラスチドＤＮＡのクローンバンクから得られる。例えば、
プラスチドＤＮＡ制限フラグメントを含有するクローンバンクはタバコおよびオ
オムギに関して入手可能である。外来遺伝子のプラスチドＤＮＡ内での正確な組
み込みは、増加数のプラスチドゲノム、例えば、タバコ、コメおよびトウモロコ
シのプラスチドゲノムの完全配列によって容易になる。下記で議論される実施例
において、外来遺伝子は、ｒｂｃＬとａｃｃＤ遺伝子との間の遺伝子間領域にお
けるタバコプラスチドゲノムのＡｏｃＩ制限部位に対応する位置５９３１９に挿
入される。
【００２２】
実際、植物細胞を形質転換するために使用されるいずれの核酸も、核酸構築物
の形態であろう。 実際、プラスチドゲノムをトランスフェクトするために使用される構築物は、
さらに、種々の調節エレメントを含むであろう。かかる調節エレメントは、好ま
しくは、プロモーター（例えば、１６ＳｒＲＮＡプロモーターｒｒｎＢｎおよび
ｒｒｎＨｖ）および例えばタバコｒｂｃＬ遺伝子由来の、有効な翻訳開始を確実
にするための翻訳開始コドンの上流に適当な距離をおいて配置されるリボソーム
結合部位（ＲＢＳ）を包含するであろう。葉緑体プロモーターが好ましい。プラ
スチドｐｓｂＡ遺伝子の３’調節領域と共に使用されるブラシカ・ナプス（Bras
sica napus）葉緑体１６Ｓ ｒＲＮＡプロモーターおよびホルデウム・ブルガレ
（Hordeum vulgare）１６Ｓ ｒＲＮＡプロモーターは、好ましい調節エレメント
の２つの例を提供する。本発明は、これらの５’および３’調節配列および多数
の他の細菌性またはプラスチドプロモーターに制限されず、また、３’調節領域
を使用してもよい。
の形態であろう。 実際、プラスチドゲノムをトランスフェクトするために使用される構築物は、
さらに、種々の調節エレメントを含むであろう。かかる調節エレメントは、好ま
しくは、プロモーター（例えば、１６ＳｒＲＮＡプロモーターｒｒｎＢｎおよび
ｒｒｎＨｖ）および例えばタバコｒｂｃＬ遺伝子由来の、有効な翻訳開始を確実
にするための翻訳開始コドンの上流に適当な距離をおいて配置されるリボソーム
結合部位（ＲＢＳ）を包含するであろう。葉緑体プロモーターが好ましい。プラ
スチドｐｓｂＡ遺伝子の３’調節領域と共に使用されるブラシカ・ナプス（Bras
sica napus）葉緑体１６Ｓ ｒＲＮＡプロモーターおよびホルデウム・ブルガレ
（Hordeum vulgare）１６Ｓ ｒＲＮＡプロモーターは、好ましい調節エレメント
の２つの例を提供する。本発明は、これらの５’および３’調節配列および多数
の他の細菌性またはプラスチドプロモーターに制限されず、また、３’調節領域
を使用してもよい。
【００２３】
好ましいプロモーター配列を図２において、ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａ
ｎｋ受託番号ＡＪ２７６６７６およびＡＪ２７６６７７を有する配列番号１５（
ｒｒｎＨｖ）および配列番号１６（ｒｒｎＢｎ）として示す。
ｎｋ受託番号ＡＪ２７６６７６およびＡＪ２７６６７７を有する配列番号１５（
ｒｒｎＨｖ）および配列番号１６（ｒｒｎＢｎ）として示す。
【００２４】
本発明の第１の態様の具体例によると、プラスチドゲノムは、外来遺伝子、選
択マーカー遺伝子および少なくとも２つの直列反復配列を含む発現カセットを含
む核酸構築物で形質転換される。発現カセットを含むトランスフェクト構築物は
、相同組換え事象によってプラスチドゲノム中に組み込む。
択マーカー遺伝子および少なくとも２つの直列反復配列を含む発現カセットを含
む核酸構築物で形質転換される。発現カセットを含むトランスフェクト構築物は
、相同組換え事象によってプラスチドゲノム中に組み込む。
【００２５】
本発明の第１の態様の別の具体例によると、本発明の第１の態様によって形質
転換される植物細胞は、予め１以上の遺伝子で形質転換されていてもよく、また
は本発明の第１の態様の方法を行った後に１以上の遺伝子で形質転換されてもよ
い。換言すると、形質転換されたプラスチドゲノム内で組換え事象を起こして選
択マーカー遺伝子を切除するが、外来遺伝子は保持されるように配置された外来
遺伝子、選択マーカー遺伝子および少なくとも２つの直列反復配列を含む発現カ
セットを含む単一の構築物でプラスチドゲノムを形質転換するよりもむしろ、選
択マーカー遺伝子および直列反復配列とは別に、外来遺伝子を含む核酸をプラス
チドゲノム中に形質転換してもよい。
転換される植物細胞は、予め１以上の遺伝子で形質転換されていてもよく、また
は本発明の第１の態様の方法を行った後に１以上の遺伝子で形質転換されてもよ
い。換言すると、形質転換されたプラスチドゲノム内で組換え事象を起こして選
択マーカー遺伝子を切除するが、外来遺伝子は保持されるように配置された外来
遺伝子、選択マーカー遺伝子および少なくとも２つの直列反復配列を含む発現カ
セットを含む単一の構築物でプラスチドゲノムを形質転換するよりもむしろ、選
択マーカー遺伝子および直列反復配列とは別に、外来遺伝子を含む核酸をプラス
チドゲノム中に形質転換してもよい。
【００２６】
外来遺伝子を含む核酸は、選択マーカー遺伝子および直列反復配列のための発
現カセットを含む構築物上で、プラスチドゲノム中に形質転換してもよい。別法
では、プラスチドゲノムは、１つは外来遺伝子を含み、他方は選択マーカー遺伝
子および直列反復配列を含む別々の核酸配列で形質転換してもよい。 ２つの核酸配列を用いる場合、好ましくは、同時形質転換によってそれらを一
緒に導入する。
現カセットを含む構築物上で、プラスチドゲノム中に形質転換してもよい。別法
では、プラスチドゲノムは、１つは外来遺伝子を含み、他方は選択マーカー遺伝
子および直列反復配列を含む別々の核酸配列で形質転換してもよい。 ２つの核酸配列を用いる場合、好ましくは、同時形質転換によってそれらを一
緒に導入する。
【００２７】
外来遺伝子：
本発明の第１の態様の方法にしたがってプラスチドゲノム中に導入される外来
遺伝子は、トランスジェニック植物中に導入することが望ましいいずれの遺伝子
であってもよい。外来遺伝子を植物のプラスチドゲノム中に挿入する利益は大き
い。所望の遺伝子または目的の遺伝子は、天然植物に存在しない植物に望ましい
表現型を提供する。目的の遺伝子は、疾患耐性、害虫耐性遺伝子、除草剤耐性遺
伝子、特定の生合成経路に関与する遺伝子またはストレス耐性に関与する遺伝子
を包含し得る。所望の遺伝子の性質は、本発明の決定的な部分ではない。
遺伝子は、トランスジェニック植物中に導入することが望ましいいずれの遺伝子
であってもよい。外来遺伝子を植物のプラスチドゲノム中に挿入する利益は大き
い。所望の遺伝子または目的の遺伝子は、天然植物に存在しない植物に望ましい
表現型を提供する。目的の遺伝子は、疾患耐性、害虫耐性遺伝子、除草剤耐性遺
伝子、特定の生合成経路に関与する遺伝子またはストレス耐性に関与する遺伝子
を包含し得る。所望の遺伝子の性質は、本発明の決定的な部分ではない。
【００２８】
選択マーカー：
本発明の第１の態様の方法にしたがって使用される選択マーカーは好ましくは
、そのレシピエントに認識可能な表現型を与える非致死選択マーカーである。一
般に使用される選択マーカーは、耐性遺伝子または対立遺伝子を発現していない
細胞、オルガネラまたは組織に致命的であろう抗生物質、除草剤または他の化合
物に対する耐性を包含する。形質転換体の選択は、選択圧下での細胞または組織
の生育により、すなわち、抗生物質、除草剤または他の化合物を含有する培地上
での生育により、達成される。選択マーカーが「致死」選択マーカーである場合
、選択マーカーを発現している細胞は生存するが、選択マーカーを欠く細胞は死
ぬ。選択マーカーが「非致死」である場合、形質転換体はいくつかの手段によっ
て非形質転換体から同定可能であるが、形質転換体および非形質転換体の両方が
選択圧の存在下で生存する。
、そのレシピエントに認識可能な表現型を与える非致死選択マーカーである。一
般に使用される選択マーカーは、耐性遺伝子または対立遺伝子を発現していない
細胞、オルガネラまたは組織に致命的であろう抗生物質、除草剤または他の化合
物に対する耐性を包含する。形質転換体の選択は、選択圧下での細胞または組織
の生育により、すなわち、抗生物質、除草剤または他の化合物を含有する培地上
での生育により、達成される。選択マーカーが「致死」選択マーカーである場合
、選択マーカーを発現している細胞は生存するが、選択マーカーを欠く細胞は死
ぬ。選択マーカーが「非致死」である場合、形質転換体はいくつかの手段によっ
て非形質転換体から同定可能であるが、形質転換体および非形質転換体の両方が
選択圧の存在下で生存する。
【００２９】
選択マーカーは、細胞レベルで非致死であるが、オルガネラレベルで致死であ
ってもよい。例えば、抗生物質スペクチノマイシンはプラスチドにおけるｍＲＮ
Ａのタンパク質への翻訳を阻害するが、細胞質において阻害しない。スペクチノ
マイシン感受性プラスチドは、プラスチドの生き残りに必要なタンパク質を製造
することができず、スペクチノマイシン上で培養した植物の組織は緑になる代わ
りに白く漂白される。スペクチノマイシン耐性である植物由来の組織は緑色であ
る。形質転換および非形質転換プラスチドを含有する細胞の混合集団において、
感受性非形質転換体は、選択圧下においてプラスチド／細胞分裂の過程で死滅し
、結局、形質転換プラスチドのみがプラスチド集団を構成するであろう。植物が
プラスチドゲノムの一つの型のみからなる均質な集団を含むとき、それをホモプ
ラスミックという。選択により、形質転換されたプラスチドゲノムのみを含有す
るホモプラスミック植物が得られる。
ってもよい。例えば、抗生物質スペクチノマイシンはプラスチドにおけるｍＲＮ
Ａのタンパク質への翻訳を阻害するが、細胞質において阻害しない。スペクチノ
マイシン感受性プラスチドは、プラスチドの生き残りに必要なタンパク質を製造
することができず、スペクチノマイシン上で培養した植物の組織は緑になる代わ
りに白く漂白される。スペクチノマイシン耐性である植物由来の組織は緑色であ
る。形質転換および非形質転換プラスチドを含有する細胞の混合集団において、
感受性非形質転換体は、選択圧下においてプラスチド／細胞分裂の過程で死滅し
、結局、形質転換プラスチドのみがプラスチド集団を構成するであろう。植物が
プラスチドゲノムの一つの型のみからなる均質な集団を含むとき、それをホモプ
ラスミックという。選択により、形質転換されたプラスチドゲノムのみを含有す
るホモプラスミック植物が得られる。
【００３０】
本発明の第１の態様による好ましい選択マーカーは、ａａｄＡ選択マーカーで
あり、それは、スペクチノマイシンおよび／またはストレプトマイシンに対する
耐性を与える。他の有効な選択マーカーの使用も考えられる。
あり、それは、スペクチノマイシンおよび／またはストレプトマイシンに対する
耐性を与える。他の有効な選択マーカーの使用も考えられる。
【００３１】
組換え型プラスチドゲノムからの選択遺伝子切除：
選択マーカー遺伝子の切除は、反復ＤＮＡ配列間の組換え事象により媒介され
る。これは、天然プラスチド組換え酵素または外来性部位特異的組換え酵素によ
って媒介されることができる。プラスチドは、外来性ＤＮＡのプラスチドゲノム
中への正確な標的化を可能にする有効な相同性ＤＮＡ組換え経路を含有する。さ
らに、異なる種由来のプラスチドＤＮＡ間の進化論的比較および突然変異体にお
ける研究は、プラスチドが、短い直列反復ＤＮＡ配列が関わる改変を成立させる
ために必要な複製および組換え酵素を有することを示唆する。複製の間のＤＮＡ
のずれ（slippage）は、２、３塩基対長という短い反復の反復数および長さにお
ける変化を可能にするための１のメカニズムを提供する。ＤＮＡ配列間の組換え
はまた、プラスチドゲノムの配列構成を改変するためのメカニズムを提供する。
これは、異なる種由来のプラスチドゲノムにおける比較可能な研究、プラスチド
ＤＮＡ突然変異体の分析から、およびプラスチド形質転換体を研究することによ
って推測された。
る。これは、天然プラスチド組換え酵素または外来性部位特異的組換え酵素によ
って媒介されることができる。プラスチドは、外来性ＤＮＡのプラスチドゲノム
中への正確な標的化を可能にする有効な相同性ＤＮＡ組換え経路を含有する。さ
らに、異なる種由来のプラスチドＤＮＡ間の進化論的比較および突然変異体にお
ける研究は、プラスチドが、短い直列反復ＤＮＡ配列が関わる改変を成立させる
ために必要な複製および組換え酵素を有することを示唆する。複製の間のＤＮＡ
のずれ（slippage）は、２、３塩基対長という短い反復の反復数および長さにお
ける変化を可能にするための１のメカニズムを提供する。ＤＮＡ配列間の組換え
はまた、プラスチドゲノムの配列構成を改変するためのメカニズムを提供する。
これは、異なる種由来のプラスチドゲノムにおける比較可能な研究、プラスチド
ＤＮＡ突然変異体の分析から、およびプラスチド形質転換体を研究することによ
って推測された。
【００３２】
タバコにおけるプラスチド形質転換体の分析は、３９３ｂｐおよび９５０ｂｐ
のような短い反復配列間のＤＮＡ組換え事象を示唆する。進化論的研究は、２０
塩基対未満のより短いＤＮＡ直列反復間の組換え事象がプラスチドにおいて起こ
ることができることを示唆する。これらの進化論的研究はこれらの組換え事象の
頻度についての情報を提供しないが、プラスチドが非常に短い直列反復ＤＮＡ配
列を認識し、組換えるために必要な機構を含有することを示す。
のような短い反復配列間のＤＮＡ組換え事象を示唆する。進化論的研究は、２０
塩基対未満のより短いＤＮＡ直列反復間の組換え事象がプラスチドにおいて起こ
ることができることを示唆する。これらの進化論的研究はこれらの組換え事象の
頻度についての情報を提供しないが、プラスチドが非常に短い直列反復ＤＮＡ配
列を認識し、組換えるために必要な機構を含有することを示す。
【００３３】
直列反復配列は、構築物中で二重になった核酸配列であり、逆方向よりむしろ
順方向を向いている。 直列反復は、通常、コーディング配列に隣接する調節配列を包含するいずれか
の核酸配列を含んでいてもよい。直列反復は、形質転換されているプラスチドゲ
ノムにほとんど類似していない外来性核酸配列を含みうる。実際、挿入配列とプ
ラスチドの内在配列との間の組換えが起こる機会を減らすことが好ましい。
順方向を向いている。 直列反復は、通常、コーディング配列に隣接する調節配列を包含するいずれか
の核酸配列を含んでいてもよい。直列反復は、形質転換されているプラスチドゲ
ノムにほとんど類似していない外来性核酸配列を含みうる。実際、挿入配列とプ
ラスチドの内在配列との間の組換えが起こる機会を減らすことが好ましい。
【００３４】
選択マーカー切除の頻度は直列反復ＤＮＡ配列の長さに関連すると提案される
。直列反復を形成するために順方向で反復される配列の長さは、少なくとも２０
ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０、最も好ましくは少なくとも１００ヌ
クレオチドである。直列反復配列が長ければ長いほど、より効率のよい組換え事
象が起こると考えられる。実施例において、１７４ｂｐほどの短い直列反復が選
択マーカー遺伝子の切除に効果的であることが示されている。別の例において、
４１８ｂｐの直列反復配列が用いられる。
。直列反復を形成するために順方向で反復される配列の長さは、少なくとも２０
ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０、最も好ましくは少なくとも１００ヌ
クレオチドである。直列反復配列が長ければ長いほど、より効率のよい組換え事
象が起こると考えられる。実施例において、１７４ｂｐほどの短い直列反復が選
択マーカー遺伝子の切除に効果的であることが示されている。別の例において、
４１８ｂｐの直列反復配列が用いられる。
【００３５】
したがって、本発明の第１の態様による方法の効率は、直列反復配列の長さを
改変することによって調節されうることが提案される。直列反復配列の長さが長
ければ長いほど、より効率のよい切除が予測されるが、クローニングを容易にす
るために、直列反復配列は、１０，０００ｂｐ未満、より好ましくは５，０００
ｂｐ未満、最も好ましくは２，０００ｂｐ未満の長さであることが好ましく；プ
ラスチドゲノム中に挿入されている外来性ＤＮＡの全体の大きさが本発明を行う
において重要な因子である。
改変することによって調節されうることが提案される。直列反復配列の長さが長
ければ長いほど、より効率のよい切除が予測されるが、クローニングを容易にす
るために、直列反復配列は、１０，０００ｂｐ未満、より好ましくは５，０００
ｂｐ未満、最も好ましくは２，０００ｂｐ未満の長さであることが好ましく；プ
ラスチドゲノム中に挿入されている外来性ＤＮＡの全体の大きさが本発明を行う
において重要な因子である。
【００３６】
さらに、本発明の第１の態様による方法の効率は直列反復配列の数を改変する
ことによって調節されうることが提案される。 いくつかの直列反復ＤＮＡ配列の、３以上の遺伝子を含有するプラスチド形質
転換構築物中への導入は、選択マーカー遺伝子の喪失を促進する一方で、１以上
の目的遺伝子を保持するための特に効果的な方法を提供する。
ことによって調節されうることが提案される。 いくつかの直列反復ＤＮＡ配列の、３以上の遺伝子を含有するプラスチド形質
転換構築物中への導入は、選択マーカー遺伝子の喪失を促進する一方で、１以上
の目的遺伝子を保持するための特に効果的な方法を提供する。
【００３７】
多遺伝子構築物中における直列反復ＤＮＡ配列の配置は、組換え型プラスチド
ゲノムからの遺伝子の相対的切除頻度に対する調節を提供する。 プラスチドゲノム中に導入されるべき核酸が外来遺伝子および選択マーカー遺
伝子（いずれかの調節エレメントを伴う）のみを含む配列において、直列反復は
好ましくは、選択マーカー遺伝子に隣接するように配置される、すなわち、２つ
の直列反復が用いられる。
ゲノムからの遺伝子の相対的切除頻度に対する調節を提供する。 プラスチドゲノム中に導入されるべき核酸が外来遺伝子および選択マーカー遺
伝子（いずれかの調節エレメントを伴う）のみを含む配列において、直列反復は
好ましくは、選択マーカー遺伝子に隣接するように配置される、すなわち、２つ
の直列反復が用いられる。
【００３８】
プラスチドゲノム中に導入されるべき核酸が１より多くの外来遺伝子および選
択マーカー遺伝子（いずれかの調節エレメントを伴う）を含む配列において、ど
の外来遺伝子も組換え型プラスチドゲノムにおいて必要な場合、直列反復は好ま
しくは選択マーカー遺伝子に隣接するように配置される。選択マーカー遺伝子お
よび複数の外来遺伝子を含有する単一のプラスチド形質転換ベクターもまた、選
択マーカー遺伝子および１以上の外来遺伝子を切除する一方で、目的の外来遺伝
子を保持するために使用できる。これは、その境界が選択マーカー遺伝子および
１以上の外来遺伝子に隣接する一連の直列反復配列を用いることによって行われ
る。選択マーカー遺伝子が２つの外来遺伝子間の中央に配置される場合、マーカ
ー遺伝子および１つの外来遺伝子の喪失を促すために２組の直列反復が配置され
る。１組の直列反復はマーカー遺伝子および左の外来遺伝子の喪失を促す。第２
組の直列反復はマーカー遺伝子および右の外来遺伝子の喪失を促す。これらの切
除事象は、２つの異なるマーカー不含プラスチドゲノムを単一のプラスチド形質
転換構築物から生産することを可能とする。これらの組換え型プラスチドゲノム
には、２つの型：マーカー遺伝子の左に配置された外来遺伝子を含むか、または
元の構築物中、マーカー遺伝子の右に配置された外来遺伝子を含むものである。
択マーカー遺伝子（いずれかの調節エレメントを伴う）を含む配列において、ど
の外来遺伝子も組換え型プラスチドゲノムにおいて必要な場合、直列反復は好ま
しくは選択マーカー遺伝子に隣接するように配置される。選択マーカー遺伝子お
よび複数の外来遺伝子を含有する単一のプラスチド形質転換ベクターもまた、選
択マーカー遺伝子および１以上の外来遺伝子を切除する一方で、目的の外来遺伝
子を保持するために使用できる。これは、その境界が選択マーカー遺伝子および
１以上の外来遺伝子に隣接する一連の直列反復配列を用いることによって行われ
る。選択マーカー遺伝子が２つの外来遺伝子間の中央に配置される場合、マーカ
ー遺伝子および１つの外来遺伝子の喪失を促すために２組の直列反復が配置され
る。１組の直列反復はマーカー遺伝子および左の外来遺伝子の喪失を促す。第２
組の直列反復はマーカー遺伝子および右の外来遺伝子の喪失を促す。これらの切
除事象は、２つの異なるマーカー不含プラスチドゲノムを単一のプラスチド形質
転換構築物から生産することを可能とする。これらの組換え型プラスチドゲノム
には、２つの型：マーカー遺伝子の左に配置された外来遺伝子を含むか、または
元の構築物中、マーカー遺伝子の右に配置された外来遺伝子を含むものである。
【００３９】
トランスプラストミック植物の選択：
形質転換後、それに対し選択マーカー遺伝子によって耐性が与えられるマーカ
ーを含有する培地を用いて、外来性ＤＮＡのプラスチドゲノム中への組み込みが
選択される。例えば、選択マーカー遺伝子としてａａｄＡ遺伝子を用いると、選
択培地はスペクチノマイシンまたはストレプトマイシンを含有する。この最初の
選択ラウンドは、スペクチノマイシンまたはストレプトマイシンを含有する培地
上で生育可能な植物クローンおよび材料を生じる。植物中の全てのプラスチドゲ
ノムが外来インサートを含有するホモプラスミック植物が生産されるまで、これ
らのクローンおよび材料をスペクチノマシンまたはストレプトマイシン選択下で
増殖させる。
ーを含有する培地を用いて、外来性ＤＮＡのプラスチドゲノム中への組み込みが
選択される。例えば、選択マーカー遺伝子としてａａｄＡ遺伝子を用いると、選
択培地はスペクチノマイシンまたはストレプトマイシンを含有する。この最初の
選択ラウンドは、スペクチノマイシンまたはストレプトマイシンを含有する培地
上で生育可能な植物クローンおよび材料を生じる。植物中の全てのプラスチドゲ
ノムが外来インサートを含有するホモプラスミック植物が生産されるまで、これ
らのクローンおよび材料をスペクチノマシンまたはストレプトマイシン選択下で
増殖させる。
【００４０】
望ましくない遺伝子の切除：
いったん組換え型プラスチドゲノムのホモプラスミーが達成されたならば、選
択マーカー遺伝子についての選択は、Ｔ０植物およびその子孫において取り除か
れる。選択の除去は選択マーカー遺伝子の喪失を促す。選択マーカー遺伝子の喪
失は、植物の１次選択培地に対する感受性ならびにサザンブロットハイブリダイ
ゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応のような分子技術によってモニターされ
うる。
択マーカー遺伝子についての選択は、Ｔ０植物およびその子孫において取り除か
れる。選択の除去は選択マーカー遺伝子の喪失を促す。選択マーカー遺伝子の喪
失は、植物の１次選択培地に対する感受性ならびにサザンブロットハイブリダイ
ゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応のような分子技術によってモニターされ
うる。
【００４１】
上記のように、本発明の第１の態様による方法は、外来遺伝子をプラスチドゲ
ノム中に導入し、選択マーカーを用いる形質転換植物の選択を可能とし、また、
生産されたトランスジェニック植物が公衆に許容されるように選択マーカーの切
除を提供するために使用されうる。 本発明の第１の態様の好ましい具体例は、今回、ｕｉｄＡ遺伝子（βグルクロ
ニダーゼをコードしている）と共に導入されたａａｄＡ遺伝子を含まずに外来性
ｕｉｄＡ遺伝子を含有する組換え型プラスチドゲノムを含むトランスジェニック
タバコ植物を生産することに関して記載される。
ノム中に導入し、選択マーカーを用いる形質転換植物の選択を可能とし、また、
生産されたトランスジェニック植物が公衆に許容されるように選択マーカーの切
除を提供するために使用されうる。 本発明の第１の態様の好ましい具体例は、今回、ｕｉｄＡ遺伝子（βグルクロ
ニダーゼをコードしている）と共に導入されたａａｄＡ遺伝子を含まずに外来性
ｕｉｄＡ遺伝子を含有する組換え型プラスチドゲノムを含むトランスジェニック
タバコ植物を生産することに関して記載される。
【００４２】
本発明の第１の態様による典型的な方法において、外来遺伝子およびａａｄＡ
遺伝子を含有する構築物を用いて粒子爆撃によってタバコ植物を形質転換する。
典型的には、爆撃された器官を小さい断片として、植物ホルモンを含有する固形
培地上で４０−７２時間培養して、回復させる。次いで、それらを耐性細胞を生
育および分裂させるスペクチノマイシンおよびストレプトマイシンを含有する選
択培地上に移す。緑色のシュートおよび緑色のカルスのような耐性材料をスペク
チノマイシンおよびストレプトマイシン含有培地上で２次培養する。組換え型プ
ラスチドゲノムのホモプラスミーが達成されるまでシュートを植え継ぐ。次いで
、植物を土壌に移し、若い葉および頂端分裂組織をスペクチノマイシンおよびス
トレプトマイシンの溶液で２−３週間噴霧する。
遺伝子を含有する構築物を用いて粒子爆撃によってタバコ植物を形質転換する。
典型的には、爆撃された器官を小さい断片として、植物ホルモンを含有する固形
培地上で４０−７２時間培養して、回復させる。次いで、それらを耐性細胞を生
育および分裂させるスペクチノマイシンおよびストレプトマイシンを含有する選
択培地上に移す。緑色のシュートおよび緑色のカルスのような耐性材料をスペク
チノマイシンおよびストレプトマイシン含有培地上で２次培養する。組換え型プ
ラスチドゲノムのホモプラスミーが達成されるまでシュートを植え継ぐ。次いで
、植物を土壌に移し、若い葉および頂端分裂組織をスペクチノマイシンおよびス
トレプトマイシンの溶液で２−３週間噴霧する。
【００４３】
本発明の第１の態様は、強力な選択マーカーを用いることに関して上記した。
乏しいプラスチド形質転換頻度をもたらす選択マーカーは、現行のプラスチド形
質転換方法において幅広く使用されない。これらの場合、本発明では、例えば抗
生物質または除草剤に対する耐性を与えるこれらのマーカー遺伝子を、強力な選
択マーカー（例えば、ａａｄＡ遺伝子）が最初に使用される２段階選択手法にお
いてプラスチド形質転換に使用することが可能である。２元的選択は、潜在的な
プラスチド形質転換体の強力なスクリーニングを提供する。それは、非形質転換
植物の背景から本物のプラスチド形質転換体を単離する確率を大いに増加させる
。プラスチド形質転換体を選択するためのより多種の選択薬剤の利用は、既存の
選択薬剤がＤＮＡ媒介性形質転換に不応性の植物種に特に有効であることが示さ
れた場合、特に有益であろう。さらに、２次選択薬剤の使用は、植物のスペクチ
ノマイシンまたはストレプトマイシンへの連続的な曝露が望ましくない場合に柔
軟性を提供する。
乏しいプラスチド形質転換頻度をもたらす選択マーカーは、現行のプラスチド形
質転換方法において幅広く使用されない。これらの場合、本発明では、例えば抗
生物質または除草剤に対する耐性を与えるこれらのマーカー遺伝子を、強力な選
択マーカー（例えば、ａａｄＡ遺伝子）が最初に使用される２段階選択手法にお
いてプラスチド形質転換に使用することが可能である。２元的選択は、潜在的な
プラスチド形質転換体の強力なスクリーニングを提供する。それは、非形質転換
植物の背景から本物のプラスチド形質転換体を単離する確率を大いに増加させる
。プラスチド形質転換体を選択するためのより多種の選択薬剤の利用は、既存の
選択薬剤がＤＮＡ媒介性形質転換に不応性の植物種に特に有効であることが示さ
れた場合、特に有益であろう。さらに、２次選択薬剤の使用は、植物のスペクチ
ノマイシンまたはストレプトマイシンへの連続的な曝露が望ましくない場合に柔
軟性を提供する。
【００４４】
２つの遺伝子系を用いる場合、いったん核酸を植物中に形質転換したならば、
強力な選択マーカー用の選択培地上での生育によって、例えば、ストレプトマイ
シン／スペクチノマイシン上での生育によって、最初の形質転換体を選択する。
形質転換細胞は、選択マーカーの特性によって非形質転換細胞から区別される。
次いで、最初の形質転換体を２次選択マーカー遺伝子について選択する２次培地
上に置く。いったん２次選択マーカー遺伝子について選択が開始すると、１次選
択マーカーはもはや必要ではなく、除去されてもよい。１次選択マーカーの除去
は、それに隣接する直列反復間の組換えによって媒介される。遺伝子切除を伴う
細胞分裂（細胞質ソーティング（cytoplasmic sorting））の間のプラスチドＤ
ＮＡ複製および分離の推計学的過程は、２次選択マーカー遺伝子、例えば、除草
剤耐性遺伝子のみを含有するホモプラスミック植物を生じるであろう。
強力な選択マーカー用の選択培地上での生育によって、例えば、ストレプトマイ
シン／スペクチノマイシン上での生育によって、最初の形質転換体を選択する。
形質転換細胞は、選択マーカーの特性によって非形質転換細胞から区別される。
次いで、最初の形質転換体を２次選択マーカー遺伝子について選択する２次培地
上に置く。いったん２次選択マーカー遺伝子について選択が開始すると、１次選
択マーカーはもはや必要ではなく、除去されてもよい。１次選択マーカーの除去
は、それに隣接する直列反復間の組換えによって媒介される。遺伝子切除を伴う
細胞分裂（細胞質ソーティング（cytoplasmic sorting））の間のプラスチドＤ
ＮＡ複製および分離の推計学的過程は、２次選択マーカー遺伝子、例えば、除草
剤耐性遺伝子のみを含有するホモプラスミック植物を生じるであろう。
【００４５】
プラスチドにおけるＤＮＡ媒介性組換え事象を促進する薬剤を、選択マーカー
遺伝子の喪失を誘導するために使用することができる。例えば、ガンマ照射への
曝露によるプラスチドにおける組換えの促進は、直列反復配列間の組換えにより
選択マーカー遺伝子の喪失を導く。 したがって、本発明の第１の態様はさらに、特定のタンパク質、化学的作用因
または物理的作用因、例えば、ガンマ照射を用いてプラスチドにおけるＤＮＡ媒
介性組換えを刺激して、選択マーカー遺伝子の切除を促進することを含んでもよ
い。
遺伝子の喪失を誘導するために使用することができる。例えば、ガンマ照射への
曝露によるプラスチドにおける組換えの促進は、直列反復配列間の組換えにより
選択マーカー遺伝子の喪失を導く。 したがって、本発明の第１の態様はさらに、特定のタンパク質、化学的作用因
または物理的作用因、例えば、ガンマ照射を用いてプラスチドにおけるＤＮＡ媒
介性組換えを刺激して、選択マーカー遺伝子の切除を促進することを含んでもよ
い。
【００４６】
下記実施例において、修飾ｂａｒ遺伝子を用いてグルホシネート−アンモニウ
ムに対する耐性を提供した。修飾ｂａｒ遺伝子は、６８％という高グアニンおよ
びシトシン含量を有し、プラスチドにおける高レベルの発現に最適ではない。該
ｂａｒ遺伝子またはプラスチドにおいて弱く発現されると予想され得る同様の遺
伝子の使用は、ホモプラスミック組換え型プラスチドゲノムを得るために強力な
選択圧を提供する。２次選択マーカー遺伝子を含有する植物または植物細胞は、
それらを非形質転換細胞から区別するための同定目的で特有の表現型を有するで
あろう。
ムに対する耐性を提供した。修飾ｂａｒ遺伝子は、６８％という高グアニンおよ
びシトシン含量を有し、プラスチドにおける高レベルの発現に最適ではない。該
ｂａｒ遺伝子またはプラスチドにおいて弱く発現されると予想され得る同様の遺
伝子の使用は、ホモプラスミック組換え型プラスチドゲノムを得るために強力な
選択圧を提供する。２次選択マーカー遺伝子を含有する植物または植物細胞は、
それらを非形質転換細胞から区別するための同定目的で特有の表現型を有するで
あろう。
【００４７】
したがって、本発明の第１の態様の具体例によると、外来遺伝子と共に導入さ
れた１次選択マーカー遺伝子を含まずに外来遺伝子を含有する組換え型プラスチ
ドゲノムを含むトランスジェニック植物を生産する方法であって： （ａ）植物細胞のプラスチドゲノムを、形質転換されたプラスチドゲノム内で
組換え事象を起こして１次選択マーカー遺伝子を切り出すが、外来遺伝子は保持
するように配置された外来遺伝子、１次選択マーカー遺伝子および２次選択マー
カー遺伝子ならびに少なくとも２つの直列反復配列を含む核酸で安定に形質転換
し； （ｂ）プラスチドが１次選択マーカー遺伝子を含む形質転換植物について１次
選択培地上で選択し；次いで （ｃ）２次選択マーカー遺伝子を含有する植物の選択を可能とするために、お
よび形質転換プラスチドゲノム内での組換えにより１次選択マーカー遺伝子の切
除を可能とするが、外来遺伝子は保持するために、選択された形質転換植物を２
次選択培地上で生育させる ことを特徴とする方法が提供される。
れた１次選択マーカー遺伝子を含まずに外来遺伝子を含有する組換え型プラスチ
ドゲノムを含むトランスジェニック植物を生産する方法であって： （ａ）植物細胞のプラスチドゲノムを、形質転換されたプラスチドゲノム内で
組換え事象を起こして１次選択マーカー遺伝子を切り出すが、外来遺伝子は保持
するように配置された外来遺伝子、１次選択マーカー遺伝子および２次選択マー
カー遺伝子ならびに少なくとも２つの直列反復配列を含む核酸で安定に形質転換
し； （ｂ）プラスチドが１次選択マーカー遺伝子を含む形質転換植物について１次
選択培地上で選択し；次いで （ｃ）２次選択マーカー遺伝子を含有する植物の選択を可能とするために、お
よび形質転換プラスチドゲノム内での組換えにより１次選択マーカー遺伝子の切
除を可能とするが、外来遺伝子は保持するために、選択された形質転換植物を２
次選択培地上で生育させる ことを特徴とする方法が提供される。
【００４８】
本発明の該具体例は、通常では選択されることのできない特性を与える目的遺
伝子でのプラスチドの形質転換を可能にする。 外来遺伝子は弱く選択できる特性を与えるものであってもよい。かかる状況で
は、２つの選択マーカー遺伝子を有する必要はなく、その選択マーカー遺伝子の
１つは外来遺伝子によって提供される。
伝子でのプラスチドの形質転換を可能にする。 外来遺伝子は弱く選択できる特性を与えるものであってもよい。かかる状況で
は、２つの選択マーカー遺伝子を有する必要はなく、その選択マーカー遺伝子の
１つは外来遺伝子によって提供される。
【００４９】
目的の遺伝子が選択されることのできない特性を与える場合、野生型プラスチ
ドゲノムにおいて欠損があり、抗生物質耐性遺伝子または除草剤耐性遺伝子のよ
うな選択マーカー遺伝子および目的遺伝子で形質転換されたプラスチドゲノムの
みを含有する植物を選択することが重要である。いったん組換え型プラスチドゲ
ノムのホモプラスミーが達成されたならば、選択を取り除いて、望ましくない選
択マーカー遺伝子を切除するが、目的遺伝子は保持することができる。選択の不
在下での細胞系および植物の連続的な増殖は、選択マーカー遺伝子の喪失および
目的遺伝子のみを含有する組換え型プラスチドゲノムの発生をもたらすであろう
。選択マーカー遺伝子の切除は、構築物中の直列反復配列の数ならびに反復の長
さによって促進される。３つの直列反復ＤＮＡ配列は、目的遺伝子を保持するが
２つの選択マーカー遺伝子を除去することにおいて特に有用であることが証明さ
れた。下記実施例において、ｕｉｄＡ遺伝子が目的の非選択遺伝子として使用さ
れた。
ドゲノムにおいて欠損があり、抗生物質耐性遺伝子または除草剤耐性遺伝子のよ
うな選択マーカー遺伝子および目的遺伝子で形質転換されたプラスチドゲノムの
みを含有する植物を選択することが重要である。いったん組換え型プラスチドゲ
ノムのホモプラスミーが達成されたならば、選択を取り除いて、望ましくない選
択マーカー遺伝子を切除するが、目的遺伝子は保持することができる。選択の不
在下での細胞系および植物の連続的な増殖は、選択マーカー遺伝子の喪失および
目的遺伝子のみを含有する組換え型プラスチドゲノムの発生をもたらすであろう
。選択マーカー遺伝子の切除は、構築物中の直列反復配列の数ならびに反復の長
さによって促進される。３つの直列反復ＤＮＡ配列は、目的遺伝子を保持するが
２つの選択マーカー遺伝子を除去することにおいて特に有用であることが証明さ
れた。下記実施例において、ｕｉｄＡ遺伝子が目的の非選択遺伝子として使用さ
れた。
【００５０】
どちらの場合も、１以上の選択マーカーのいずれかを用いて、プラスチドゲノ
ムの正しい位置での組み込みおよび組換え型プラスチドゲノムのホモプラスミー
をサザンブロットハイブリダイゼーションによって証明する。下記実施例におい
て、天然プラスチドＤＮＡによって生産された１１．４ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ
フラグメントを１以上の外来遺伝子を含有する新しいＨｉｎｄＩＩＩフラグメン
トで置換する。
ムの正しい位置での組み込みおよび組換え型プラスチドゲノムのホモプラスミー
をサザンブロットハイブリダイゼーションによって証明する。下記実施例におい
て、天然プラスチドＤＮＡによって生産された１１．４ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ
フラグメントを１以上の外来遺伝子を含有する新しいＨｉｎｄＩＩＩフラグメン
トで置換する。
【００５１】
例えば、本発明の第１の態様による方法を説明するために、２つの目的遺伝子
を用いた。これらは、ストレプトミセス・ヒグロスコピカス（Whiteら、1990）
由来のｂａｒ遺伝子およびエシェリキア・コリ（Escherichia coli）（Jefferso
nら、1986）由来のβ−グルクロニダーゼをコードしているｕｉｄＡ遺伝子のコ
ーディング領域であった。
を用いた。これらは、ストレプトミセス・ヒグロスコピカス（Whiteら、1990）
由来のｂａｒ遺伝子およびエシェリキア・コリ（Escherichia coli）（Jefferso
nら、1986）由来のβ−グルクロニダーゼをコードしているｕｉｄＡ遺伝子のコ
ーディング領域であった。
【００５２】
ｂａｒ遺伝子はグルホシネート−アンモニウムに対する耐性を与え、植物にお
いて選択可能な特性を与える遺伝子の一例である。ｂａｒ遺伝子をプラスチド中
での発現のためにＰＣＲクローニングによって修飾した。これは、ＮｃｏＩ制限
部位をそのＮ末端コーディング領域内に導入し、第２コドンをセリンからグリシ
ンへ変換し、２つのＴＡＡ終止コドンを挿入することを含んだ。β−グルクロニ
ダーゼ遺伝子は、単純な比色または蛍光酵素アッセイによって検出でき、抗生物
質または除草剤を用いて選択できない目的遺伝子の一例である。本発明はこれら
のコーディング配列に制限されず、多数の他の目的遺伝子を用いてもよい。
いて選択可能な特性を与える遺伝子の一例である。ｂａｒ遺伝子をプラスチド中
での発現のためにＰＣＲクローニングによって修飾した。これは、ＮｃｏＩ制限
部位をそのＮ末端コーディング領域内に導入し、第２コドンをセリンからグリシ
ンへ変換し、２つのＴＡＡ終止コドンを挿入することを含んだ。β−グルクロニ
ダーゼ遺伝子は、単純な比色または蛍光酵素アッセイによって検出でき、抗生物
質または除草剤を用いて選択できない目的遺伝子の一例である。本発明はこれら
のコーディング配列に制限されず、多数の他の目的遺伝子を用いてもよい。
【００５３】
本発明によると、第２の態様において、少なくとも２つの直列反復配列および
選択マーカー遺伝子を含む植物プラスチドゲノムの形質転換用核酸構築物が提供
される。本発明の第２の態様による核酸構築物の構造的特徴は、本発明の第１の
態様の記載に詳述される。かかる核酸構築物は当該分野で既知の標準的な技術を
用いて作成できる。
選択マーカー遺伝子を含む植物プラスチドゲノムの形質転換用核酸構築物が提供
される。本発明の第２の態様による核酸構築物の構造的特徴は、本発明の第１の
態様の記載に詳述される。かかる核酸構築物は当該分野で既知の標準的な技術を
用いて作成できる。
【００５４】
本発明の第２の態様の核酸構築物は、さらに外来遺伝子を含んでいてもよく、
好ましくは第２の外来遺伝子を含んでいてもよい。 本発明の第２の態様の核酸構築物において、直列反復配列は少なくとも２０ヌ
クレオチド長、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド長、より好ましくは少な
くとの１００ヌクレオチド長、さらに好ましくは１７４ヌクレオチド長、もっと
も好ましくは４１８ヌクレオチド長であってもよい。
好ましくは第２の外来遺伝子を含んでいてもよい。 本発明の第２の態様の核酸構築物において、直列反復配列は少なくとも２０ヌ
クレオチド長、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド長、より好ましくは少な
くとの１００ヌクレオチド長、さらに好ましくは１７４ヌクレオチド長、もっと
も好ましくは４１８ヌクレオチド長であってもよい。
【００５５】
一般に、遺伝子操作を容易にするために、直列反復配列は１０，０００ヌクレ
オチド長未満であることが好ましい。 直列反復配列は、好ましくは、特に配列番号１４に示される、Ｎｔｐｓｂ Ａ
配列を含む。 直列反復配列は、配列番号１５に示されるようなｒｒｎＨｖプロモーター配列
を含んでいてもよい。 直列反復配列は、配列番号１６に示されるようなｒｒｎＢｖプロモーター配列
を含んでいてもよい。
オチド長未満であることが好ましい。 直列反復配列は、好ましくは、特に配列番号１４に示される、Ｎｔｐｓｂ Ａ
配列を含む。 直列反復配列は、配列番号１５に示されるようなｒｒｎＨｖプロモーター配列
を含んでいてもよい。 直列反復配列は、配列番号１６に示されるようなｒｒｎＢｖプロモーター配列
を含んでいてもよい。
【００５６】
本発明の第２の態様の核酸構築物の外来遺伝子は、好ましくは、疾患耐性遺伝
子、害虫耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、特定の生合成経路に関与する遺伝子ま
たはストレス耐性に関与する遺伝子である。 好ましくは、外来遺伝子はｕｉｄＡ遺伝子またはｂａｒ遺伝子、好ましくは配
列番号１７に示される修飾ｂａｒ遺伝子である。 構築物の選択マーカー遺伝子は好ましくは、非致死である選択マーカーをコー
ドする。かかる選択マーカー遺伝子は細菌性ａａｄＡ遺伝子である。
子、害虫耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、特定の生合成経路に関与する遺伝子ま
たはストレス耐性に関与する遺伝子である。 好ましくは、外来遺伝子はｕｉｄＡ遺伝子またはｂａｒ遺伝子、好ましくは配
列番号１７に示される修飾ｂａｒ遺伝子である。 構築物の選択マーカー遺伝子は好ましくは、非致死である選択マーカーをコー
ドする。かかる選択マーカー遺伝子は細菌性ａａｄＡ遺伝子である。
【００５７】
構築物の第２の外来遺伝子は、選択マーカー遺伝子、たとえば、配列番号１７
に示される配列を有する修飾ｂａｒ遺伝子のようなｂａｒ遺伝子であってもよい
。 本発明の第２の態様の核酸構築物において、直列反復配列は好ましくは、選択
マーカーに隣接する。外来遺伝子の１つを切除することが望ましい２つの外来遺
伝子を有する核酸構築物において、構築物は好ましくは、２つは選択マーカー遺
伝子に隣接し、１つは外来遺伝子の１つに隣接する３つの直列反復配列を含む。
に示される配列を有する修飾ｂａｒ遺伝子のようなｂａｒ遺伝子であってもよい
。 本発明の第２の態様の核酸構築物において、直列反復配列は好ましくは、選択
マーカーに隣接する。外来遺伝子の１つを切除することが望ましい２つの外来遺
伝子を有する核酸構築物において、構築物は好ましくは、２つは選択マーカー遺
伝子に隣接し、１つは外来遺伝子の１つに隣接する３つの直列反復配列を含む。
【００５８】
本発明の第２の態様による核酸構築物は、植物プラスチドゲノムを形質転換す
るためのプラスミド中に組み込まれていてもよい。 好ましいプラスミドは、ｂａｒ遺伝子、ｕｉｄＡ遺伝子、ａａｄＡ遺伝子、Ｎ
ｔｐｓｂＡの直列反復配列の３コピー、ｒｒｎＨｖの直列反復配列の２コピーお
よびｒｒｎＢｖの１コピーを含むｐＵＭ７１、ならびにｕｉｄＡ遺伝子、ａａｄ
Ａ遺伝子およびＮｔｐｓｂＡの直列反復配列の２コピーを含むｐＵＭ７０である
。これら２つのプラスミドの制限地図を図１に提供する。 これらのプラスミドは、本発明の第１の態様の方法による植物プラスチドゲノ
ムを形質転換するために使用してもよい。
るためのプラスミド中に組み込まれていてもよい。 好ましいプラスミドは、ｂａｒ遺伝子、ｕｉｄＡ遺伝子、ａａｄＡ遺伝子、Ｎ
ｔｐｓｂＡの直列反復配列の３コピー、ｒｒｎＨｖの直列反復配列の２コピーお
よびｒｒｎＢｖの１コピーを含むｐＵＭ７１、ならびにｕｉｄＡ遺伝子、ａａｄ
Ａ遺伝子およびＮｔｐｓｂＡの直列反復配列の２コピーを含むｐＵＭ７０である
。これら２つのプラスミドの制限地図を図１に提供する。 これらのプラスミドは、本発明の第１の態様の方法による植物プラスチドゲノ
ムを形質転換するために使用してもよい。
【００５９】
本発明の第１の態様に関して記載されたように、核酸は、５’および３’調節
領域を含むプラスチド発現カセットよりなってもよい。タンパク質のコーディン
グ配列を発現カセット中に挿入する。コーディング領域を有する発現カセットは
、プラスチド内に標的化するために予めクローン化されたプラスチドＤＮＡの遺
伝子間領域中に組み込まれうる。完全な構築物をｐＢＲ３２２、ｐＡＴ１５３、
ｐＵＣシリーズのベクターおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのようなイー
・コリクローニングベクター中で増殖させる。本発明の目的では、遺伝子の切除
を直列反復ＤＮＡ配列の構成によって調節する。構築物中の直列反復配列の長さ
および数は遺伝子切除の頻度を調節する。直列反復ＤＮＡエレメントの実際の配
列は本発明にとって重大ではない。プラスチドゲノム中に挿入されるべき外来性
ＤＮＡ配列の長さを増加させることは、また、その後の遺伝子喪失を促進するの
に有益である。遺伝子の切除が必要でない場合、その隣接するいずれかの直列反
復配列の長さを減らすことが重要である。これは、プロモーターおよびターミネ
ーターのような調節エレメントを包含する非重複隣接ＤＮＡ配列の利用を必要と
する。目的遺伝子およびａａｄＡ遺伝子は、同じ構築物内の一片のＤＮＡとして
または別の構築物として導入できる。別々のプラスミド上での２つの連結してい
ない遺伝子のプラスチドゲノム中への同時形質転換の頻度は高い。
領域を含むプラスチド発現カセットよりなってもよい。タンパク質のコーディン
グ配列を発現カセット中に挿入する。コーディング領域を有する発現カセットは
、プラスチド内に標的化するために予めクローン化されたプラスチドＤＮＡの遺
伝子間領域中に組み込まれうる。完全な構築物をｐＢＲ３２２、ｐＡＴ１５３、
ｐＵＣシリーズのベクターおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのようなイー
・コリクローニングベクター中で増殖させる。本発明の目的では、遺伝子の切除
を直列反復ＤＮＡ配列の構成によって調節する。構築物中の直列反復配列の長さ
および数は遺伝子切除の頻度を調節する。直列反復ＤＮＡエレメントの実際の配
列は本発明にとって重大ではない。プラスチドゲノム中に挿入されるべき外来性
ＤＮＡ配列の長さを増加させることは、また、その後の遺伝子喪失を促進するの
に有益である。遺伝子の切除が必要でない場合、その隣接するいずれかの直列反
復配列の長さを減らすことが重要である。これは、プロモーターおよびターミネ
ーターのような調節エレメントを包含する非重複隣接ＤＮＡ配列の利用を必要と
する。目的遺伝子およびａａｄＡ遺伝子は、同じ構築物内の一片のＤＮＡとして
または別の構築物として導入できる。別々のプラスミド上での２つの連結してい
ない遺伝子のプラスチドゲノム中への同時形質転換の頻度は高い。
【００６０】
第３の態様において、本発明は、そのプラスチドが外来遺伝子を含むが、外来
遺伝子と共に導入された選択マーカー遺伝子を含有しない細胞および該細胞を有
する多細胞植物組織（好ましくは、植物全体、カルスおよび葉組織）を含む。 本発明の第３の態様による細胞および植物組織は、本発明の第１の態様の方法
によって調製される。 第４の態様において、本発明は、本発明の第１の態様の方法によって生産され
た、そのプラスチドゲノム中に外来遺伝子を含むトランスジェニック植物を提供
する。
遺伝子と共に導入された選択マーカー遺伝子を含有しない細胞および該細胞を有
する多細胞植物組織（好ましくは、植物全体、カルスおよび葉組織）を含む。 本発明の第３の態様による細胞および植物組織は、本発明の第１の態様の方法
によって調製される。 第４の態様において、本発明は、本発明の第１の態様の方法によって生産され
た、そのプラスチドゲノム中に外来遺伝子を含むトランスジェニック植物を提供
する。
【００６１】
本発明の第１の態様の方法を用いて植物細胞のプラスチドを形質転換し、次い
で、標準的な条件を用いてかかる細胞の多細胞組織への再生、分化および生長を
容易にする。 無傷植物の再生は、連続的な選択圧を用いるか、またはホモプラスミーがすで
に形質転換細胞系内で到達されている場合、選択圧の不在下で達成されうる。 トランスジェニック植物は、単子葉植物または双子葉植物ならびに光合成およ
び／または非光合成組織の細胞であることができる。 本発明の第４の態様による好ましいトランスジェニック植物は、そのプラスチ
ド中に図４に示される修飾ｂａｒ遺伝子を含有するトランスジェニックタバコ植
物である。該トランスジェニック植物はグルホシネートアンモニウムに対して耐
性である。
で、標準的な条件を用いてかかる細胞の多細胞組織への再生、分化および生長を
容易にする。 無傷植物の再生は、連続的な選択圧を用いるか、またはホモプラスミーがすで
に形質転換細胞系内で到達されている場合、選択圧の不在下で達成されうる。 トランスジェニック植物は、単子葉植物または双子葉植物ならびに光合成およ
び／または非光合成組織の細胞であることができる。 本発明の第４の態様による好ましいトランスジェニック植物は、そのプラスチ
ド中に図４に示される修飾ｂａｒ遺伝子を含有するトランスジェニックタバコ植
物である。該トランスジェニック植物はグルホシネートアンモニウムに対して耐
性である。
【００６２】
選択マーカー遺伝子に関して遺伝子導入され、次いで切除されると記載されて
いるが、本発明の目的は、望ましくない外来性ＤＮＡ配列をトランスプラストミ
ック植物のプラスチドゲノムから除去することである。抗生物質耐性遺伝子の存
在は、ほとんど常に、形質転換プラスチドゲノム中において望ましくない。ほと
んどの場合、望ましくない配列であることの定義は固定されていないが、植物中
で所望される表現型に依存するであろう。例えば、除草剤耐性を与える遺伝子は
、ある状況下で望ましいが、他の場合は望ましくない。除草剤耐性が植物におい
て必要とされる場合、この目的に必要とされない全ての外来遺伝子を除去する。
別法では、目的の遺伝子がいくつかの他の特性に関する場合、除草剤耐性遺伝子
および抗生物質耐性選択マーカーを包含する全ての他の外来遺伝子を除去して目
的遺伝子を残す。外来性の補助的な配列を「含まない（free of）」植物とは、
望ましくない配列がサザンブロットハイブリダイゼーションによって検出不可能
なものである。
いるが、本発明の目的は、望ましくない外来性ＤＮＡ配列をトランスプラストミ
ック植物のプラスチドゲノムから除去することである。抗生物質耐性遺伝子の存
在は、ほとんど常に、形質転換プラスチドゲノム中において望ましくない。ほと
んどの場合、望ましくない配列であることの定義は固定されていないが、植物中
で所望される表現型に依存するであろう。例えば、除草剤耐性を与える遺伝子は
、ある状況下で望ましいが、他の場合は望ましくない。除草剤耐性が植物におい
て必要とされる場合、この目的に必要とされない全ての外来遺伝子を除去する。
別法では、目的の遺伝子がいくつかの他の特性に関する場合、除草剤耐性遺伝子
および抗生物質耐性選択マーカーを包含する全ての他の外来遺伝子を除去して目
的遺伝子を残す。外来性の補助的な配列を「含まない（free of）」植物とは、
望ましくない配列がサザンブロットハイブリダイゼーションによって検出不可能
なものである。
【００６３】
本発明は、今回、単なる例示として下記の図面を引用して記載する。
【００６４】
実施例
一般的方法
組換え型ＤＮＡを操作および検出するための下記の研究室での手法は、当該分
野でよく知られており、一般的に用いられる方法である。標準的技術は、クロー
ニング、核酸単離、増幅および精製に用いられ、Sambrookら、Molecular Clonin
g-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
, N.Y. (1989)に記載されている。ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限
酵素を含む酵素的反応は製造者の説明書にしたがって行われた。 下記の実験的開示において、別記しないかぎり、すべての温度は摂氏（℃）で
あり、重量はグラム（ｇ）、ミリグラム（ｍｇ）またはマイクログラム（μｇ）
であり、濃度はモル濃度（Ｍ）、ミリモル濃度（ｍＭ）またはマイクロモル濃度
（μＭ）であり、全ての体積はリットル（ｌ）、ミリリットル（ｍｌ）またはマ
イクロリットル（μｌ）である。
野でよく知られており、一般的に用いられる方法である。標準的技術は、クロー
ニング、核酸単離、増幅および精製に用いられ、Sambrookら、Molecular Clonin
g-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
, N.Y. (1989)に記載されている。ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限
酵素を含む酵素的反応は製造者の説明書にしたがって行われた。 下記の実験的開示において、別記しないかぎり、すべての温度は摂氏（℃）で
あり、重量はグラム（ｇ）、ミリグラム（ｍｇ）またはマイクログラム（μｇ）
であり、濃度はモル濃度（Ｍ）、ミリモル濃度（ｍＭ）またはマイクロモル濃度
（μＭ）であり、全ての体積はリットル（ｌ）、ミリリットル（ｍｌ）またはマ
イクロリットル（μｌ）である。
【００６５】
実施例１
プラスチド形質転換ベクター
ｐＵＭ７０およびｐＵＭ７１プラスチド形質転換ベクターの制限地図を図１に
示す。図１において、外来遺伝子カセットに５．７および１．３ｋｂｐのタバコ
プラスチドＤＮＡを隣接させて、プラスチド内での相同組換えによる遺伝子ター
ゲティングを成立させる。プラスミドは、タバコプラスチドＤＮＡを含有するｐ
ＴＢ２７から構築される（Sugiuraら、1986）。外来性ｕｉｄＡ、ａａｄＡおよ
びｂａｒ遺伝子の発現を駆動する調節エレメントを図２−３に記載する。White
ら（1991）に記載されたｂａｒ遺伝子はＮおよびＣ末端で修飾され、得られた配
列を図４に示す。ａａｄＡ遺伝子はｐＵＣ−ａｔｐＸ−ＡＡＤ（Goldschmidt-Cl
ermont, 1991）から入手し、ｕｉｄＡ遺伝子は以前に記載されたとおりである（
Jeffersonら、1986）。ＮｔｐｓｂＡターミネーター／３’プロセッシングＤＮ
Ａ配列の直列反復コピーは、番号付によって識別される。ｒｒｎＨｖのプロモー
ター−リボソーム結合部位領域の２コピーはコピーＡまたはＢとして識別される
。外来遺伝子の転写の方向が示される。
示す。図１において、外来遺伝子カセットに５．７および１．３ｋｂｐのタバコ
プラスチドＤＮＡを隣接させて、プラスチド内での相同組換えによる遺伝子ター
ゲティングを成立させる。プラスミドは、タバコプラスチドＤＮＡを含有するｐ
ＴＢ２７から構築される（Sugiuraら、1986）。外来性ｕｉｄＡ、ａａｄＡおよ
びｂａｒ遺伝子の発現を駆動する調節エレメントを図２−３に記載する。White
ら（1991）に記載されたｂａｒ遺伝子はＮおよびＣ末端で修飾され、得られた配
列を図４に示す。ａａｄＡ遺伝子はｐＵＣ−ａｔｐＸ−ＡＡＤ（Goldschmidt-Cl
ermont, 1991）から入手し、ｕｉｄＡ遺伝子は以前に記載されたとおりである（
Jeffersonら、1986）。ＮｔｐｓｂＡターミネーター／３’プロセッシングＤＮ
Ａ配列の直列反復コピーは、番号付によって識別される。ｒｒｎＨｖのプロモー
ター−リボソーム結合部位領域の２コピーはコピーＡまたはＢとして識別される
。外来遺伝子の転写の方向が示される。
【００６６】
ｐＵＭ７０を用いるプラスチド形質転換は、ｕｉｄＡおよびａａｄＡ遺伝子を
含有する３．８ｋｂｐの外来性ＤＮＡインサートをプラスチドゲノム中に導入す
る。ｐＵＭ７１は、ｕｉｄＡ、ａａｄＡおよびｂａｒ遺伝子を含有する４．９ｋ
ｂｐ外来性インサートを形質転換によってプラスチドゲノム中に導入する。
含有する３．８ｋｂｐの外来性ＤＮＡインサートをプラスチドゲノム中に導入す
る。ｐＵＭ７１は、ｕｉｄＡ、ａａｄＡおよびｂａｒ遺伝子を含有する４．９ｋ
ｂｐ外来性インサートを形質転換によってプラスチドゲノム中に導入する。
【００６７】
ｒｒｎＨｖプロモーター（配列番号１５）は、配列番号１および配列番号２を
有するオリゴヌクレオチドをアニーリングし、一本鎖領域にＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼおよびデオキシヌクレオチドを供給することによって作成された。 配列番号１ RBC-FL 5'AATAATCTGAAGCGCTTGGATACGTTGTAGGG-3' 配列番号２ RBC-RL 5'CCCCCCATGGATGCCATAAGTCCCTCCCTACAAC-3'
有するオリゴヌクレオチドをアニーリングし、一本鎖領域にＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼおよびデオキシヌクレオチドを供給することによって作成された。 配列番号１ RBC-FL 5'AATAATCTGAAGCGCTTGGATACGTTGTAGGG-3' 配列番号２ RBC-RL 5'CCCCCCATGGATGCCATAAGTCCCTCCCTACAAC-3'
【００６８】
得られたフラグメントをプライマーＨＶＲＲＮＦ（配列番号３）と共に、鋳型
としてｐＨｖｃＰ８プラスミドＤＮＡ（DayおよびEllis, 1985）に対して用いて
、ｒｂｃＬ遺伝子のリボソーム結合部位に連結した１６ＳｒＲＮＡプロモーター
を増幅した。 配列番号３ 5'CCCCCTCTAGACTCGAGTTTTTTCTATTTTGACTTAC-3'
としてｐＨｖｃＰ８プラスミドＤＮＡ（DayおよびEllis, 1985）に対して用いて
、ｒｂｃＬ遺伝子のリボソーム結合部位に連結した１６ＳｒＲＮＡプロモーター
を増幅した。 配列番号３ 5'CCCCCTCTAGACTCGAGTTTTTTCTATTTTGACTTAC-3'
【００６９】
ｒｒｎＢｎプロモーター（配列番号１６）は、プライマーＳＡＲ５Ｆ（配列番
号４）およびＸＲ３Ｒ（配列番号５）を用いて精製ブラシカ・ナプス（Brassica
nupus）葉緑体ＤＮＡから増幅した１６ＳｒＲＮＡプロモーター領域をクローニ
ングすることによって作成された。 配列番号４ 5'CCCGCATGCCTTAGGTTTTCTAGTTGGATTTGC-3' 配列番号５ 5' GGAGCCCGGGAGTTCGCTCCCAGAAAT-3'
号４）およびＸＲ３Ｒ（配列番号５）を用いて精製ブラシカ・ナプス（Brassica
nupus）葉緑体ＤＮＡから増幅した１６ＳｒＲＮＡプロモーター領域をクローニ
ングすることによって作成された。 配列番号４ 5'CCCGCATGCCTTAGGTTTTCTAGTTGGATTTGC-3' 配列番号５ 5' GGAGCCCGGGAGTTCGCTCCCAGAAAT-3'
【００７０】
これをＳｍａＩ部位を介して、アニールしたオリゴＲＲＴ（配列番号６）およ
びＲＲＢ（配列番号７）をＭｌｕＩおよびＮｃｏＩ消化したベクターＤＮＡ（ｐ
Ｔｒｃ９９：ａａｄＡ：ＮｔｐｓｂＡ）中にクローニングすることによって作成
された合成リボソーム結合部位にライゲートした。 配列番号６ 5'CGCGTCCCGGGCGAATACGAAGCGCTTGGATAC-3' 配列番号７ 5' CATGGATCCCTCCCTACAACTGTATCCAAGCGC-3'
びＲＲＢ（配列番号７）をＭｌｕＩおよびＮｃｏＩ消化したベクターＤＮＡ（ｐ
Ｔｒｃ９９：ａａｄＡ：ＮｔｐｓｂＡ）中にクローニングすることによって作成
された合成リボソーム結合部位にライゲートした。 配列番号６ 5'CGCGTCCCGGGCGAATACGAAGCGCTTGGATAC-3' 配列番号７ 5' CATGGATCCCTCCCTACAACTGTATCCAAGCGC-3'
【００７１】
合成したｒｒｎＨｖおよびｒｒｎＢｎプロモーターの配列を図２において比較
する。配列は約７８％の塩基同一性を有する。これらのプロモーター間の組換え
がトランスジェニックプラスチドにおいて高頻度で起こるとは予想されないであ
ろう。なぜなら、それらは最大の完全な重複がたったの１７塩基長である不完全
な直列反復を形成するからである。 ＮｔＰｓｂＡターミネーター／３’プロセッシング領域は、全ニコチアーナ・
タバカムＤＮＡに対しプライマーＰＳＢＡ５Ｆ（配列番号８）およびＰＳＢＡ３
Ｒ（配列番号９）を用いて作成された。 配列番号８ 5'CCCAAGCTTCTGCAGGCCTAGTCTATAGGAGG-3' 配列番号９ 5'GGGAAGCTTGGATCCTAAGGAATATAGCTCTTC-3'
する。配列は約７８％の塩基同一性を有する。これらのプロモーター間の組換え
がトランスジェニックプラスチドにおいて高頻度で起こるとは予想されないであ
ろう。なぜなら、それらは最大の完全な重複がたったの１７塩基長である不完全
な直列反復を形成するからである。 ＮｔＰｓｂＡターミネーター／３’プロセッシング領域は、全ニコチアーナ・
タバカムＤＮＡに対しプライマーＰＳＢＡ５Ｆ（配列番号８）およびＰＳＢＡ３
Ｒ（配列番号９）を用いて作成された。 配列番号８ 5'CCCAAGCTTCTGCAGGCCTAGTCTATAGGAGG-3' 配列番号９ 5'GGGAAGCTTGGATCCTAAGGAATATAGCTCTTC-3'
【００７２】
増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶ部位中にクローン化し、ｐＵ
Ｍ７０およびｐＵＭ７１中に存在する発現カセット中にクローニングするために
、インサートをＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩまたはＢａｍＨＩで切り出した。
ＮｔＰｓｂＡの２コピーがｐＵＭ７０に存在し、ＮｔＰｓｂＡの３コピーがｐＵ
Ｍ７１に存在する。ＮｔＰｓｂＡを含む二重領域の全長は図３の配列番号１４に
示され、リンカー配列を包含する。
Ｍ７０およびｐＵＭ７１中に存在する発現カセット中にクローニングするために
、インサートをＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩまたはＢａｍＨＩで切り出した。
ＮｔＰｓｂＡの２コピーがｐＵＭ７０に存在し、ＮｔＰｓｂＡの３コピーがｐＵ
Ｍ７１に存在する。ＮｔＰｓｂＡを含む二重領域の全長は図３の配列番号１４に
示され、リンカー配列を包含する。
【００７３】
ａａｄＡコーディング配列を含有する８．０ｋｂｐ ＮｃｏＩ−ＰｓｔＩフラ
グメントは、ｐＵＣ−ａｔｐＸ−ＡＡＤ（Goldschmidt-Clermont, 1991）から得
られた。ｕｉｄＡコーディング配列を含有する１．８ｋｂｐ ＮｃｏＩ−Ｓｍａ
ＩはｐＪＤ３３０から得られた。ストレプトミセス・ヒグロスコピカスのｂａｒ
遺伝子は、プラスミドｐＩＪ４１０４（Whiteら, 1990）から得られた。ｂａｒ
遺伝子は、開始コドンでのＮｃｏＩ部位の導入およびその通常のＴＧＡ終止コド
ンの代わりにＣ末端での２つのＴＡＡ終止コドンの挿入によって修飾された（図
４、配列番号１７）。ＴＡＡ終止コドンはプラスチド遺伝子において共通であり
、タンデムＴＡＡ終止コドンの挿入は、有効なチェーンターミネーションを保証
する。これは、ＰＣＲプライマーＢＡＲＦ（配列番号１０）およびＢＡＲＲ（配
列番号１１）を用いて行われた。 配列番号１０ 5'CCCCCCCATGGGCCCAGAACGACGCCC-3' 配列番号１１ 5'TTATTAGATCTCGGTGACGGGCAG-3'
グメントは、ｐＵＣ−ａｔｐＸ−ＡＡＤ（Goldschmidt-Clermont, 1991）から得
られた。ｕｉｄＡコーディング配列を含有する１．８ｋｂｐ ＮｃｏＩ−Ｓｍａ
ＩはｐＪＤ３３０から得られた。ストレプトミセス・ヒグロスコピカスのｂａｒ
遺伝子は、プラスミドｐＩＪ４１０４（Whiteら, 1990）から得られた。ｂａｒ
遺伝子は、開始コドンでのＮｃｏＩ部位の導入およびその通常のＴＧＡ終止コド
ンの代わりにＣ末端での２つのＴＡＡ終止コドンの挿入によって修飾された（図
４、配列番号１７）。ＴＡＡ終止コドンはプラスチド遺伝子において共通であり
、タンデムＴＡＡ終止コドンの挿入は、有効なチェーンターミネーションを保証
する。これは、ＰＣＲプライマーＢＡＲＦ（配列番号１０）およびＢＡＲＲ（配
列番号１１）を用いて行われた。 配列番号１０ 5'CCCCCCCATGGGCCCAGAACGACGCCC-3' 配列番号１１ 5'TTATTAGATCTCGGTGACGGGCAG-3'
【００７４】
得られた５７０ｂｐコーディング配列をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶ
部位中にクローン化した後、ｐＵＭ７１に存在する発現カセット中に５７０ｂｐ
ＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ制限フラグメントとして挿入した。プラスチド調節領域の
調節下で外来遺伝子を含有する発現カセットは、標準的なクローニングベクター
中で構築された。構築された外来遺伝子発現カセットのプラスチドゲノム中への
組み込みのために、それらを予め単離した葉緑体ＤＮＡのフラグメント中にクロ
ーン化する。プラスミドｐＴＢ２７（Sugiuraら, 1986）を用いて該手法を説明
した。クローニングを容易にするために、ＡｐａＩおよびＮｏｔＩのための部位
を含有する合成リンカーをタバコプラスチドゲノムの位置５９３１９ｂｐに存在
するｐＴＢ２７のＡｏｃＩ部位中に挿入して（Shinozakiら, 1986; DDBJ/EMBL/G
enBank 受託番号 z00044; Version 95 Feb 1999）ｐＴＢ２７−ｌｉｎｋを作成
した。 合成リンカーは、オリゴヌクレオチド配列番号１２および配列番号１３をアニ
ーリングすることによって作成された。 配列番号１２ 5'TTAGGGCCCGGGAAAGCGGCCGC-3' 配列番号１３ 5'TAAGCCGCCGCTTTCCCGGGCCC-3'
部位中にクローン化した後、ｐＵＭ７１に存在する発現カセット中に５７０ｂｐ
ＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ制限フラグメントとして挿入した。プラスチド調節領域の
調節下で外来遺伝子を含有する発現カセットは、標準的なクローニングベクター
中で構築された。構築された外来遺伝子発現カセットのプラスチドゲノム中への
組み込みのために、それらを予め単離した葉緑体ＤＮＡのフラグメント中にクロ
ーン化する。プラスミドｐＴＢ２７（Sugiuraら, 1986）を用いて該手法を説明
した。クローニングを容易にするために、ＡｐａＩおよびＮｏｔＩのための部位
を含有する合成リンカーをタバコプラスチドゲノムの位置５９３１９ｂｐに存在
するｐＴＢ２７のＡｏｃＩ部位中に挿入して（Shinozakiら, 1986; DDBJ/EMBL/G
enBank 受託番号 z00044; Version 95 Feb 1999）ｐＴＢ２７−ｌｉｎｋを作成
した。 合成リンカーは、オリゴヌクレオチド配列番号１２および配列番号１３をアニ
ーリングすることによって作成された。 配列番号１２ 5'TTAGGGCCCGGGAAAGCGGCCGC-3' 配列番号１３ 5'TAAGCCGCCGCTTTCCCGGGCCC-3'
【００７５】
外来遺伝子カセットは、ｐＴＢ２７−ｌｉｎｋのＮｏｔＩおよびＡｐａＩ部位
間に挿入された。リンカーは、タバコプラスチドＤＮＡのｒｂｃＬおよびａｃｃ
Ｄ遺伝子間の遺伝子間領域に位置する。ｐＵＭ７１の場合、ｕｉｄＡ、ａａｄＡ
およびｂａｒを含有する３つの外来遺伝子カセットをＣｌａＩおよびＮｏｔＩを
用いて切り出した。ＣｌａＩ部位をデオキシヌクレオチドおよびクレノウ酵素で
埋めた後、ＡｐａＩ（デオキシヌクレオチドおよびクレノウ酵素で埋められた）
およびＮｏｔＩ消化したｐＴＢ２７−ｌｉｎｋにライゲートした。 ｐＵＭ７０およびｐＵＭ７１中の外来遺伝子は、相同組換えによるプラスチド
ゲノム中への組み込みを成立させるためのタバコプラスチドＤＮＡの５．７ｋｂ
ｐおよび１．３ｋｂｐに隣接する（この組み込みは図５および６に説明される）
。
間に挿入された。リンカーは、タバコプラスチドＤＮＡのｒｂｃＬおよびａｃｃ
Ｄ遺伝子間の遺伝子間領域に位置する。ｐＵＭ７１の場合、ｕｉｄＡ、ａａｄＡ
およびｂａｒを含有する３つの外来遺伝子カセットをＣｌａＩおよびＮｏｔＩを
用いて切り出した。ＣｌａＩ部位をデオキシヌクレオチドおよびクレノウ酵素で
埋めた後、ＡｐａＩ（デオキシヌクレオチドおよびクレノウ酵素で埋められた）
およびＮｏｔＩ消化したｐＴＢ２７−ｌｉｎｋにライゲートした。 ｐＵＭ７０およびｐＵＭ７１中の外来遺伝子は、相同組換えによるプラスチド
ゲノム中への組み込みを成立させるためのタバコプラスチドＤＮＡの５．７ｋｂ
ｐおよび１．３ｋｂｐに隣接する（この組み込みは図５および６に説明される）
。
【００７６】
実施例２
植物のプラスチド形質転換
タバコ種子（Nicotiana tabacum v.Wisconsin 38）を１０％（Ｗ／Ｖ）次亜塩
素酸ナトリウム中に浸漬することにより表面殺菌し、室温で２０分間ジャー中で
穏かに振盪した。次いで、種子を滅菌蒸留水中で５回洗浄した。各洗浄は１０分
間持続させた。種子は発芽し、３０ｇ／ｌシュークロースを有する寒天固形ＭＳ
培地（Murashige and Skoog, 1962）上で増殖させた。 一連の無菌タバコ植物由来の若いおよび古い葉の混合物を切断し、固形ＲＭＯ
Ｐ培地（Svabら, 1990）上に軸側を下に向けて置いた。９ｃｍペトリ皿の中央の
４ｃｍの円内に葉を配置した。この４ｃｍ円の中央に葉のない約０．５ｃｍの穴
を残した。ドーナツに似たこの葉の配置は、ほとんどのプラスチド形質転換体が
生産される噴霧領域に葉を局在させることによってプラスチド形質転換の効率を
最大にする。
素酸ナトリウム中に浸漬することにより表面殺菌し、室温で２０分間ジャー中で
穏かに振盪した。次いで、種子を滅菌蒸留水中で５回洗浄した。各洗浄は１０分
間持続させた。種子は発芽し、３０ｇ／ｌシュークロースを有する寒天固形ＭＳ
培地（Murashige and Skoog, 1962）上で増殖させた。 一連の無菌タバコ植物由来の若いおよび古い葉の混合物を切断し、固形ＲＭＯ
Ｐ培地（Svabら, 1990）上に軸側を下に向けて置いた。９ｃｍペトリ皿の中央の
４ｃｍの円内に葉を配置した。この４ｃｍ円の中央に葉のない約０．５ｃｍの穴
を残した。ドーナツに似たこの葉の配置は、ほとんどのプラスチド形質転換体が
生産される噴霧領域に葉を局在させることによってプラスチド形質転換の効率を
最大にする。
【００７７】
約３ｍｇの金ミクロプロジェクトル（１μｍ）をまず、スペルミジンおよび塩
化カルシウムを用いて５μｇのプラスミドＤＮＡで被覆し、最後に１００％エタ
ノールの６５μｌ中に再懸濁した。ｐＵＭ７０およびｐＵＭ７１を被覆プラスミ
ドとして用いた。Bio-Rad PDS-1000 He 粒子デリバリーシステムを用いる爆撃あ
たり５μｌのエタノール中におけるプラスミド被覆金懸濁液を用いた。葉を含有
するペトリ皿をシェルフ位置３（ラプチャーディスクから約９ｃｍ）に置き、葉
を２７−２８ｍｍＨｇの真空で１，１００ＰＳＩで爆撃した。２つのスペーサー
リング（５ｍｍ）はミクロキャリヤーランチシステムにおいてマクロキャリヤー
ホルダーからストッピングスクリーンを分離した。
化カルシウムを用いて５μｇのプラスミドＤＮＡで被覆し、最後に１００％エタ
ノールの６５μｌ中に再懸濁した。ｐＵＭ７０およびｐＵＭ７１を被覆プラスミ
ドとして用いた。Bio-Rad PDS-1000 He 粒子デリバリーシステムを用いる爆撃あ
たり５μｌのエタノール中におけるプラスミド被覆金懸濁液を用いた。葉を含有
するペトリ皿をシェルフ位置３（ラプチャーディスクから約９ｃｍ）に置き、葉
を２７−２８ｍｍＨｇの真空で１，１００ＰＳＩで爆撃した。２つのスペーサー
リング（５ｍｍ）はミクロキャリヤーランチシステムにおいてマクロキャリヤー
ホルダーからストッピングスクリーンを分離した。
【００７８】
爆撃した葉を４０〜４８時間で回復させた後、幅３〜５ｍｍの小片に切断し、
５００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンおよび５００μｇ／ｍｌストレプトマイシ
ンを含有するＲＭＯＰ培地上に置いた。プレートを積み重ねて置き、２６℃にて
側面照明を用いる１２時間明所、１２時間暗所サイクルでインキュベートした。 最初の耐性緑色シュートおよび緑色カルスは、３ないし２０週後に現れた。ｐ
ＵＭ７０形質転換体の場合、シュートを小片に切断し、スペクチノマイシンおよ
びストレプトマイシンを含有する新鮮なＲＭＯＰ固形培地上に置いた。該培地上
でのシュートの再生後、それらを２回目のために再切断し、スペクチノマイシン
およびストレプトマイシンを有する新鮮なＲＭＯＰ培地上に置いた。抗生物質を
含有するＲＭＯＰ培地上での再生の第３サイクル後、シュートを１００μｇ／ｍ
ｌのスペクチノマイシンを補足した固形ＭＳ培地を含有するマゼンタ（magenta
）ボックスに移した。いったん根が生じると、小植物を土壌に移し、５−１０日
間回復させた。頂点分裂組織および若い葉を毎週、スペクチノマイシン（５００
μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５００μｇ／ｍｌ）および０．１％（Ｖ／
Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０の溶液で３−４週間噴霧した。
５００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンおよび５００μｇ／ｍｌストレプトマイシ
ンを含有するＲＭＯＰ培地上に置いた。プレートを積み重ねて置き、２６℃にて
側面照明を用いる１２時間明所、１２時間暗所サイクルでインキュベートした。 最初の耐性緑色シュートおよび緑色カルスは、３ないし２０週後に現れた。ｐ
ＵＭ７０形質転換体の場合、シュートを小片に切断し、スペクチノマイシンおよ
びストレプトマイシンを含有する新鮮なＲＭＯＰ固形培地上に置いた。該培地上
でのシュートの再生後、それらを２回目のために再切断し、スペクチノマイシン
およびストレプトマイシンを有する新鮮なＲＭＯＰ培地上に置いた。抗生物質を
含有するＲＭＯＰ培地上での再生の第３サイクル後、シュートを１００μｇ／ｍ
ｌのスペクチノマイシンを補足した固形ＭＳ培地を含有するマゼンタ（magenta
）ボックスに移した。いったん根が生じると、小植物を土壌に移し、５−１０日
間回復させた。頂点分裂組織および若い葉を毎週、スペクチノマイシン（５００
μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５００μｇ／ｍｌ）および０．１％（Ｖ／
Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０の溶液で３−４週間噴霧した。
【００７９】
ｐＵＭ７１の場合、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに耐性の最
初のシュートおよび緑色細胞系を切断し、５μｇ／ｍｌのグルホシネート−アン
モニウムを含有する固形ＲＭＯＰ培地に移した。再生の第２サイクル後、植物を
１μｇ／ｍｌのグルホシネート−アンモニウムで補足したＭＳ培地を含有するマ
ゼンタボックスに移した。根を有する小植物を土壌に移し、５−１０日間回復さ
せた。土壌生長植物の頂点分裂組織および若い葉を毎週、グルコシネート−アン
モニウムを含有する０．１％Ｖ／ＶのＣｈａｌｌｅｎｇｅＴＭ（登録商標）（Ho
escht "AgrEvo"）溶液で、３−５週間噴霧した。修飾されたｂａｒ遺伝子は高レ
ベルのグルホシネート耐性をトランスプラストミック植物に与える（図１３）。
初のシュートおよび緑色細胞系を切断し、５μｇ／ｍｌのグルホシネート−アン
モニウムを含有する固形ＲＭＯＰ培地に移した。再生の第２サイクル後、植物を
１μｇ／ｍｌのグルホシネート−アンモニウムで補足したＭＳ培地を含有するマ
ゼンタボックスに移した。根を有する小植物を土壌に移し、５−１０日間回復さ
せた。土壌生長植物の頂点分裂組織および若い葉を毎週、グルコシネート−アン
モニウムを含有する０．１％Ｖ／ＶのＣｈａｌｌｅｎｇｅＴＭ（登録商標）（Ho
escht "AgrEvo"）溶液で、３−５週間噴霧した。修飾されたｂａｒ遺伝子は高レ
ベルのグルホシネート耐性をトランスプラストミック植物に与える（図１３）。
【００８０】
実施例３
トランスプラストミック外来遺伝子の母性遺伝
開花において、プラスチド形質転換体を非形質転換植物の花と相互交雑におい
て交雑した。母親としてプラスチド形質転換体および父親として非形質転換野生
型植物（ＷＴ）を含む交雑由来の全ての子孫は、グルホシネート−アンモニウム
に耐性であった（図７）。対照的に、父親（花粉ドナー）としてプラスチド形質
転換体を含む交雑由来の全ての子孫は、グルホシネート−アンモニウムに感受性
であった。抗生物質または除草剤耐性の該母性遺伝パターンはプラスチドＤＮＡ
中に組み込まれた耐性遺伝子の典型である。
て交雑した。母親としてプラスチド形質転換体および父親として非形質転換野生
型植物（ＷＴ）を含む交雑由来の全ての子孫は、グルホシネート−アンモニウム
に耐性であった（図７）。対照的に、父親（花粉ドナー）としてプラスチド形質
転換体を含む交雑由来の全ての子孫は、グルホシネート−アンモニウムに感受性
であった。抗生物質または除草剤耐性の該母性遺伝パターンはプラスチドＤＮＡ
中に組み込まれた耐性遺伝子の典型である。
【００８１】
実施例４
トランスプラストミック植物からの抗生物質耐性および除草剤耐性遺伝子の切
除 ｐＵＭ７１は３つの４１８ｂｐ直列反復ＮｔｐｓｂＡ配列を含有する（図３）
。これらは図５において１−３番の番号をつける。また、それは図５においてＡ
およびＢと称される２つの１７４ｂｐ直列反復ｒｒｎＨｖ配列（図２）およびｒ
ｒｎＢｎ配列を含有する。ｒｒｎＨｖおよびｒｒｎＢｎプロモーター配列間の組
換えは、その限られた配列同一性（７８％塩基同一性、図２）を考えれば、高頻
度で起こることは予測されなかったであろう。ｐＵＭ７１中に存在するｕｉｄＡ
、ａａｄＡおよびｂａｒ発現カセットの組み込みは、１１．４ｋｂｐ Ｈｉｎｄ
ＩＩＩプラスチドＤＮＡフラグメントを６．９および９．５ｋｂｐの２つのＨｉ
ｎｄＩＩＩフラグメントと置き換える。このことは、図５のスキームにおいて示
される。９．５ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、タバコプラスチドＤＮ
Ａの接合フラグメントに結合した全部で３つの外来遺伝子（ｕｉｄＡ、ａａｄＡ
、ｂａｒ）を含有する。組み込まれた遺伝子は、プラスチドｒｂｃＬとａｃｃＤ
遺伝子との間に位置する。該挿入事象は、４．９ｋｂｐ外来性ＤＮＡ配列をタバ
コプラスチドゲノム中へ導入し；今日までに記載された最も大きい挿入である。
組み込み事象後、１６１ｋｂｐの組換え型プラスチドゲノムについての選択をグ
ルホシネートアンモニウムを用いて維持する。これは、植物を、内在する野生型
プラスチドゲノムの全コピーがｂａｒ遺伝子を含有する組換え型プラスチドゲノ
ムで置換されたホモプラスミーの状態にする。実際、これは、５μｇ／ｍｌグル
ホシネートアンモニウムを含有する培地上で無菌の植物を生育させ、土壌で生育
させた植物に１：１０００希釈のＣｈａｌｌｅｎｇｅ ＴＭ（登録商標）（Ａｇ
ｒＥｖｏ）除草剤を噴霧することによって達成される。
除 ｐＵＭ７１は３つの４１８ｂｐ直列反復ＮｔｐｓｂＡ配列を含有する（図３）
。これらは図５において１−３番の番号をつける。また、それは図５においてＡ
およびＢと称される２つの１７４ｂｐ直列反復ｒｒｎＨｖ配列（図２）およびｒ
ｒｎＢｎ配列を含有する。ｒｒｎＨｖおよびｒｒｎＢｎプロモーター配列間の組
換えは、その限られた配列同一性（７８％塩基同一性、図２）を考えれば、高頻
度で起こることは予測されなかったであろう。ｐＵＭ７１中に存在するｕｉｄＡ
、ａａｄＡおよびｂａｒ発現カセットの組み込みは、１１．４ｋｂｐ Ｈｉｎｄ
ＩＩＩプラスチドＤＮＡフラグメントを６．９および９．５ｋｂｐの２つのＨｉ
ｎｄＩＩＩフラグメントと置き換える。このことは、図５のスキームにおいて示
される。９．５ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、タバコプラスチドＤＮ
Ａの接合フラグメントに結合した全部で３つの外来遺伝子（ｕｉｄＡ、ａａｄＡ
、ｂａｒ）を含有する。組み込まれた遺伝子は、プラスチドｒｂｃＬとａｃｃＤ
遺伝子との間に位置する。該挿入事象は、４．９ｋｂｐ外来性ＤＮＡ配列をタバ
コプラスチドゲノム中へ導入し；今日までに記載された最も大きい挿入である。
組み込み事象後、１６１ｋｂｐの組換え型プラスチドゲノムについての選択をグ
ルホシネートアンモニウムを用いて維持する。これは、植物を、内在する野生型
プラスチドゲノムの全コピーがｂａｒ遺伝子を含有する組換え型プラスチドゲノ
ムで置換されたホモプラスミーの状態にする。実際、これは、５μｇ／ｍｌグル
ホシネートアンモニウムを含有する培地上で無菌の植物を生育させ、土壌で生育
させた植物に１：１０００希釈のＣｈａｌｌｅｎｇｅ ＴＭ（登録商標）（Ａｇ
ｒＥｖｏ）除草剤を噴霧することによって達成される。
【００８２】
いったん全ての野生型プラスチドゲノムが組換え型プラスチドゲノムによって
置換されたならば、選択圧を除去する。該手法は、ｂａｒ遺伝子を含有する組換
え型プラスチドゲノムを選択する。かかるゲノムはまた、外来性インサート中に
存在する直列反復４１８ＮｔｐｓｂＡまたは１７４ｒｒｎＨｖ調節配列間の組換
え事象のために喪失しないかぎり、ｕｉｄＡおよびａａｄＡ遺伝子を含有するで
あろう。
置換されたならば、選択圧を除去する。該手法は、ｂａｒ遺伝子を含有する組換
え型プラスチドゲノムを選択する。かかるゲノムはまた、外来性インサート中に
存在する直列反復４１８ＮｔｐｓｂＡまたは１７４ｒｒｎＨｖ調節配列間の組換
え事象のために喪失しないかぎり、ｕｉｄＡおよびａａｄＡ遺伝子を含有するで
あろう。
【００８３】
ｕｉｄＡ、ａａｄＡおよびｂａｒ遺伝子の喪失を導く組換え事象は、図５に示
される。ケース１におけるａａｄＡおよびｂａｒ遺伝子の喪失は、ＮｔｐｓｂＡ
１およびＮｔｐｓＡ３間の組換え事象に起因する。ケース２において、ｕｉｄＡ
およびａａｄＡ遺伝子の喪失は、ｒｒｎＨｖ ＡおよびｒｒｎＨｖ Ｂ間の組換え
事象に起因する。ケース３において、ＮｔｐｓｂＡ１およびＮｔｐｓＡ２間の組
換えはａａｄＡ喪失をもたらす。ケース４におけるｂａｒ遺伝子の喪失は、Ｎｔ
ｐｓｂＡ２およびＮｔｐｓＡ３間の組換えに起因する。最後に、ｒｒｎＨｖ Ａ
およびｒｒｎＢｎ間の組換えはｕｉｄＡ喪失を導いたであろう（ケース５）。ｒ
ｒｎＢｎおよびｒｒｎＨｖＢ間の組換えはケース３に似ており、示されていない
。
される。ケース１におけるａａｄＡおよびｂａｒ遺伝子の喪失は、ＮｔｐｓｂＡ
１およびＮｔｐｓＡ３間の組換え事象に起因する。ケース２において、ｕｉｄＡ
およびａａｄＡ遺伝子の喪失は、ｒｒｎＨｖ ＡおよびｒｒｎＨｖ Ｂ間の組換え
事象に起因する。ケース３において、ＮｔｐｓｂＡ１およびＮｔｐｓＡ２間の組
換えはａａｄＡ喪失をもたらす。ケース４におけるｂａｒ遺伝子の喪失は、Ｎｔ
ｐｓｂＡ２およびＮｔｐｓＡ３間の組換えに起因する。最後に、ｒｒｎＨｖ Ａ
およびｒｒｎＢｎ間の組換えはｕｉｄＡ喪失を導いたであろう（ケース５）。ｒ
ｒｎＢｎおよびｒｒｎＨｖＢ間の組換えはケース３に似ており、示されていない
。
【００８４】
６０個のトランスプラストミックタバコ植物がｐＵＭ７１を用いる１５の爆撃
から生じた。６０個の植物は４８の独立した形質転換事象から誘導された。これ
らの植物のうち５４個が詳細に研究された。ｕｉｄＡ、ａａｄＡおよびｂａｒ遺
伝子を含有する無傷カセットは、研究された５４個の植物のうち４７個に存在し
た。これは、１１．４ｋｂｐ野生型プラスチドＤＮＡ ＨｉｎｄＩＩＩバンドの
プラスチド形質転換体における９．５ｋｂｐおよび６．９ｋｂｐバンドによる置
換をもたらす。例えば図８を参照し、説明のために図５を参照のこと。トランス
プラストミック植物の大部分における検出可能な１１．４ｋｂｐバンドの不在は
、野生型プラスチドゲノムの大部分の外来遺伝子を含有する組換え型プラスチド
ゲノムによる置換と一致する。強力な野生型１１．４ｋｂｐプラスチドフラグメ
ントは、３つのトランスプラストミック植物（図８の１５Ａ−１１を包含する）
において見ることができ、それは野生型および組換え型プラスチドゲノムのヘテ
ロプラスミーを示す。９．５ｋｂｐバンドは３個の外来遺伝子カセット全てを含
有し、ｕｉｄＡ、ａａｄＡおよびｂａｒ遺伝子に特異的なＤＮＡプローブにハイ
ブリダイズする。無傷９．５ｋｂｐバンドを含有する植物は全て、グルホシネー
ト−アンモニウム耐性、スペクチノマイシン耐性であり、容易に検出可能なβ−
グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性を含有した。ＧＵＳはｕｉｄＡ遺伝子の産物で
ある。ブロットと核リボソームＤＮＡに特異的なプローブとのハイブリダイゼー
ション（図８、底面パネル）は、レーンあたりのＤＮＡの同様な負荷を明らかに
した。無傷外来性インサートを含有しなかった５つの植物のうち４つは、ミスタ
ーゲッティングまたは望ましくない再配列のいずれかを示すハイブリダイゼーシ
ョンパターンを生じ、さらに研究されなかった。
から生じた。６０個の植物は４８の独立した形質転換事象から誘導された。これ
らの植物のうち５４個が詳細に研究された。ｕｉｄＡ、ａａｄＡおよびｂａｒ遺
伝子を含有する無傷カセットは、研究された５４個の植物のうち４７個に存在し
た。これは、１１．４ｋｂｐ野生型プラスチドＤＮＡ ＨｉｎｄＩＩＩバンドの
プラスチド形質転換体における９．５ｋｂｐおよび６．９ｋｂｐバンドによる置
換をもたらす。例えば図８を参照し、説明のために図５を参照のこと。トランス
プラストミック植物の大部分における検出可能な１１．４ｋｂｐバンドの不在は
、野生型プラスチドゲノムの大部分の外来遺伝子を含有する組換え型プラスチド
ゲノムによる置換と一致する。強力な野生型１１．４ｋｂｐプラスチドフラグメ
ントは、３つのトランスプラストミック植物（図８の１５Ａ−１１を包含する）
において見ることができ、それは野生型および組換え型プラスチドゲノムのヘテ
ロプラスミーを示す。９．５ｋｂｐバンドは３個の外来遺伝子カセット全てを含
有し、ｕｉｄＡ、ａａｄＡおよびｂａｒ遺伝子に特異的なＤＮＡプローブにハイ
ブリダイズする。無傷９．５ｋｂｐバンドを含有する植物は全て、グルホシネー
ト−アンモニウム耐性、スペクチノマイシン耐性であり、容易に検出可能なβ−
グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性を含有した。ＧＵＳはｕｉｄＡ遺伝子の産物で
ある。ブロットと核リボソームＤＮＡに特異的なプローブとのハイブリダイゼー
ション（図８、底面パネル）は、レーンあたりのＤＮＡの同様な負荷を明らかに
した。無傷外来性インサートを含有しなかった５つの植物のうち４つは、ミスタ
ーゲッティングまたは望ましくない再配列のいずれかを示すハイブリダイゼーシ
ョンパターンを生じ、さらに研究されなかった。
【００８５】
目的遺伝子を含有するａａｄＡ不含およびｂａｒ不含プラスチドゲノムを生産
するために図５に示される組換え事象の有用性を明らかにするために、サザンブ
ロット分析を用いた。８の異なる爆撃から得られた４８の独立したクローン系統
由来の５１個のトランスプラストミック植物を研究した。かかる大きな試料サイ
ズにより、発明者らは、図５に詳述される組換え事象の頻度を正確に評価するこ
とができる。ａａｄＡおよびｂａｒ遺伝子を切除するＮｔｐｓｂＡ１およびＮｔ
ｐｓｂＡ３間の組換え事象（図５のケース１）が高頻度で起こって、ｕｉｄＡ遺
伝子だけを含有する組換えプラスチドゲノムが生じる。これは、無傷４．９ｋｂ
ｐ ｕｉｄＡ−ａａｄＡ−ｂａｒ外来性インサートも含有する４７個の形質転換
体のうち３５個において、ｕｉｄＡ遺伝子にハイブリダイズする７．０ｋｂｐ
ＨｉｎｄＩＩＩバンドとして容易に見ることができる。例えば、図８を参照のこ
と。これら３５個の植物のうち６個において、７．０ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩバ
ンドの化学量は９．５ｋｂｐバンドと同様か（図８の２Ｄ参照）またはそれより
も高い。
するために図５に示される組換え事象の有用性を明らかにするために、サザンブ
ロット分析を用いた。８の異なる爆撃から得られた４８の独立したクローン系統
由来の５１個のトランスプラストミック植物を研究した。かかる大きな試料サイ
ズにより、発明者らは、図５に詳述される組換え事象の頻度を正確に評価するこ
とができる。ａａｄＡおよびｂａｒ遺伝子を切除するＮｔｐｓｂＡ１およびＮｔ
ｐｓｂＡ３間の組換え事象（図５のケース１）が高頻度で起こって、ｕｉｄＡ遺
伝子だけを含有する組換えプラスチドゲノムが生じる。これは、無傷４．９ｋｂ
ｐ ｕｉｄＡ−ａａｄＡ−ｂａｒ外来性インサートも含有する４７個の形質転換
体のうち３５個において、ｕｉｄＡ遺伝子にハイブリダイズする７．０ｋｂｐ
ＨｉｎｄＩＩＩバンドとして容易に見ることができる。例えば、図８を参照のこ
と。これら３５個の植物のうち６個において、７．０ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩバ
ンドの化学量は９．５ｋｂｐバンドと同様か（図８の２Ｄ参照）またはそれより
も高い。
【００８６】
１１個のｐＵＭ７１トランスプラストミック植物由来のＤＮＡ試料は、ｕｉｄ
Ａプローブに弱くハイブリダイズした少数の７．０ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩバン
ドを生じた（例えば、図８、レーン１５Ａ−８、１５Ａ−１１）。かかる植物の
子孫（例えば、図９の１３Ｇ）を研究したとき、ａａｄＡおよびｂａｒ遺伝子喪
失のためにｕｉｄＡ遺伝子だけを含有する組換え型プラスチドゲノムの生産が継
続的な過程であったことは明らかであった。それは、有性交雑および有糸細胞分
裂を通してプラスチドの伝達に伴う。例えば、親植物１３ＧのＴ１子孫のいくつ
かに由来する葉試料は、濃い７．０ｋｂｐバンド（図９、底面パネル、レーン３
−６）によって示される高レベルのマーカー不含プラスチドゲノムを含有するが
、親１３Ｇ（図９、レーン２）は含有しない。１３Ｇ親は、ＷＴプラスチドＤＮ
Ａを含有せず、予測どおり、１１．４ｋｂｐ ＷＴバンドは子孫植物由来のＤＮ
Ａの消化物中で検出不可能であった（図９、上部パネル、レーン３−６）。細胞
分裂（細胞質ソーティング）の間のプラスチドＤＮＡ複製および分離の推計学的
過程はまた、各ゲノム型の相対レベルにおける変動に寄与するであろう。遺伝子
切除および細胞質ソーティングの組み合わせた作用が、ｕｉｄＡ遺伝子を含有す
る「マーカー不含」ホモプラスミックプラスチド形質転換体を生産する。マーカ
ー不含トランスプラストミック幼植物は、ａａｄＡ遺伝子を欠くので、スペクチ
ノマイシン含有培地上で白くなり、白くなったＷＴ幼植物に似ている（図１０Ａ
）。それらは、１３Ｇ−Ｔ１−２親から誘導されるＴ２幼植物の約２４％（７９
／３２６）を示し、それは高レベルの「マーカー不含」プラスチドゲノムの診断
的７．０ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩバンドを含有した（図９、底面パネル、レーン
５および６）。トランスジェニック種子をスペクチノマイシン欠如培地上に植え
たとき白色幼植物は観察されなかったので、白色幼植物はプラスチドＤＮＡにお
ける突然変異の結果ではない（図１０）。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性
は明らかに、親１３Ｇ−Ｔ１−２由来の緑色Ｔ２幼植物において観察されたが、
ＷＴにおいては観察されなかった（図１０Ｃ）。均質ではない染色は、ＧＵＳ基
質（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の葉への不完全な浸透に大きく起因する。親１３Ｇ−Ｔ１−
２由来の白くなったＴ２幼植物をスペクチノマイシン欠如培地に移して、プラス
チドタンパク質合成（図１０Ｄ）の回復およびｕｉｄＡ遺伝子発現を可能にした
。これらの幼植物中におけるＧＵＳ活性は、プラスチドタンパク質合成の回復が
完全である緑色の葉（図１０Ｄ）に大きく局在した。全ての試験されたスペクチ
ノマイシン感受性トランスプラストミック植物はＧＵＳ陽性であって、グルホシ
ネート−アンモニウム感受性であった。
Ａプローブに弱くハイブリダイズした少数の７．０ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩバン
ドを生じた（例えば、図８、レーン１５Ａ−８、１５Ａ−１１）。かかる植物の
子孫（例えば、図９の１３Ｇ）を研究したとき、ａａｄＡおよびｂａｒ遺伝子喪
失のためにｕｉｄＡ遺伝子だけを含有する組換え型プラスチドゲノムの生産が継
続的な過程であったことは明らかであった。それは、有性交雑および有糸細胞分
裂を通してプラスチドの伝達に伴う。例えば、親植物１３ＧのＴ１子孫のいくつ
かに由来する葉試料は、濃い７．０ｋｂｐバンド（図９、底面パネル、レーン３
−６）によって示される高レベルのマーカー不含プラスチドゲノムを含有するが
、親１３Ｇ（図９、レーン２）は含有しない。１３Ｇ親は、ＷＴプラスチドＤＮ
Ａを含有せず、予測どおり、１１．４ｋｂｐ ＷＴバンドは子孫植物由来のＤＮ
Ａの消化物中で検出不可能であった（図９、上部パネル、レーン３−６）。細胞
分裂（細胞質ソーティング）の間のプラスチドＤＮＡ複製および分離の推計学的
過程はまた、各ゲノム型の相対レベルにおける変動に寄与するであろう。遺伝子
切除および細胞質ソーティングの組み合わせた作用が、ｕｉｄＡ遺伝子を含有す
る「マーカー不含」ホモプラスミックプラスチド形質転換体を生産する。マーカ
ー不含トランスプラストミック幼植物は、ａａｄＡ遺伝子を欠くので、スペクチ
ノマイシン含有培地上で白くなり、白くなったＷＴ幼植物に似ている（図１０Ａ
）。それらは、１３Ｇ−Ｔ１−２親から誘導されるＴ２幼植物の約２４％（７９
／３２６）を示し、それは高レベルの「マーカー不含」プラスチドゲノムの診断
的７．０ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩバンドを含有した（図９、底面パネル、レーン
５および６）。トランスジェニック種子をスペクチノマイシン欠如培地上に植え
たとき白色幼植物は観察されなかったので、白色幼植物はプラスチドＤＮＡにお
ける突然変異の結果ではない（図１０）。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性
は明らかに、親１３Ｇ−Ｔ１−２由来の緑色Ｔ２幼植物において観察されたが、
ＷＴにおいては観察されなかった（図１０Ｃ）。均質ではない染色は、ＧＵＳ基
質（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の葉への不完全な浸透に大きく起因する。親１３Ｇ−Ｔ１−
２由来の白くなったＴ２幼植物をスペクチノマイシン欠如培地に移して、プラス
チドタンパク質合成（図１０Ｄ）の回復およびｕｉｄＡ遺伝子発現を可能にした
。これらの幼植物中におけるＧＵＳ活性は、プラスチドタンパク質合成の回復が
完全である緑色の葉（図１０Ｄ）に大きく局在した。全ての試験されたスペクチ
ノマイシン感受性トランスプラストミック植物はＧＵＳ陽性であって、グルホシ
ネート−アンモニウム感受性であった。
【００８７】
ＮｔｐｓｂＡ １およびＮｔｐｓｂＡ ２間（図５、ケース３）およびＮｔｐｓ
ｂＡ ２およびＮｔｐｓｂＡ ３間（図５、ケース４）の組換え事象の結果は、サ
ザンブロット分析によって検出されなかった。もし、これらの組換え事象が起こ
るのならば、発明者らのデータは、図５のケース３および４に示される得られる
生産物が不安定であることを示唆する（図１１Ａ）。これらの生産物中における
二重のＮｔｐｓｂＡ領域間のさらなる組換えは、ｕｉｄＡを保持したままでさら
なる遺伝子喪失を導く。図５のケース４における組換え産物はまた、タバコプラ
スチドをｐＵＭ７０で形質転換することによっても得られた。７つの独立したｐ
ＵＭ７０プラスチド形質転換体のサザンブロット分析は、２つのＮｔｐｓｂＡ反
復を含有するタンデムｕｉｄＡ、ａａｄＡ遺伝子カセットが比較的安定であるこ
とを示す（図１１Ｂ）。優勢な７．０ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩバンドがないので
、これらのｐＵＭ７０プラスチド形質転換体のうち、ａａｄＡ遺伝子を高頻度で
失うものはない（図６のスキーム参照）。したがって、ｐＵＭ７１プラスチド形
質転換体の発明者らの分析は、３つの直列反復が、これらの反復のうち２つおよ
びそれらの間に挟まっているＤＮＡ領域の迅速な喪失を導く組換え経路を活性化
することを示唆する。ｐＵＭ７０形質転換体に関する研究は、２つのＮｔｐｓｂ
Ａ反復を含有するｐＵＭ７１組換え経路における中間体が本質的に不安定ではな
いことを示唆する。
ｂＡ ２およびＮｔｐｓｂＡ ３間（図５、ケース４）の組換え事象の結果は、サ
ザンブロット分析によって検出されなかった。もし、これらの組換え事象が起こ
るのならば、発明者らのデータは、図５のケース３および４に示される得られる
生産物が不安定であることを示唆する（図１１Ａ）。これらの生産物中における
二重のＮｔｐｓｂＡ領域間のさらなる組換えは、ｕｉｄＡを保持したままでさら
なる遺伝子喪失を導く。図５のケース４における組換え産物はまた、タバコプラ
スチドをｐＵＭ７０で形質転換することによっても得られた。７つの独立したｐ
ＵＭ７０プラスチド形質転換体のサザンブロット分析は、２つのＮｔｐｓｂＡ反
復を含有するタンデムｕｉｄＡ、ａａｄＡ遺伝子カセットが比較的安定であるこ
とを示す（図１１Ｂ）。優勢な７．０ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩバンドがないので
、これらのｐＵＭ７０プラスチド形質転換体のうち、ａａｄＡ遺伝子を高頻度で
失うものはない（図６のスキーム参照）。したがって、ｐＵＭ７１プラスチド形
質転換体の発明者らの分析は、３つの直列反復が、これらの反復のうち２つおよ
びそれらの間に挟まっているＤＮＡ領域の迅速な喪失を導く組換え経路を活性化
することを示唆する。ｐＵＭ７０形質転換体に関する研究は、２つのＮｔｐｓｂ
Ａ反復を含有するｐＵＭ７１組換え経路における中間体が本質的に不安定ではな
いことを示唆する。
【００８８】
ｕｉｄＡおよびａａｄＡ遺伝子の喪失を導くｒｒｎＨｖ ＡおよびｒｒｎＨｖ
Ｂ間の組換え事象（図５、ケース２）は、ＮｔｐｓｂＡ反復間の組換え事象と比
べて減少した頻度で起こる。ｂａｒ遺伝子だけを含有する組換え型プラスチドゲ
ノムは、ｂａｒ遺伝子プローブにハイブリダイズするが、ｕｉｄＡまたはａａｄ
Ａプローブにハイブリダイズしない５．７ｋｂｐバンドとして見ることができる
（図５のケース２）。該５．７ｋｂｐバンドは、９．５ｋｂｐ ｕｉｄＡ−ａａ
ｄＡ−ｂａｒバンドを含有する大多数のｐＵＭ７１形質転換体において少数の種
である。それは、明らかに、３つのｐＵＭ７１プラスチド形質転換体において見
ることができる（例えば、図８、形質転換体１３Ｏ参照）。この低い切除頻度は
、ｕｉｄＡおよびａａｄＡ遺伝子を欠くが、ｂａｒ遺伝子を含有するホモプラス
ミックプラスチド形質転換体を生産するのに十分である（図８、形質転換体１４
Ｂおよび１４Ｃ）。ａａｄＡおよびｕｉｄＡプローブを用いて、１４Ｂおよび１
４Ｃ由来のＤＮＡにおいてハイブリダイゼーションは検出できなかった。植物１
４ＢおよびＣは、グルホシネート−アンモニウムに耐性であったが、ａａｄＡ遺
伝子喪失のためにスペクチノマイシン感受性であった。ｕｉｄＡ遺伝子の産物、
β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）に関する酵素アッセイは、１４ＢおよびＣにお
いて検出可能な活性を示さなかった。ｕｉｄＡの喪失をもたらすｒｒｈＨｖ Ａ
およびｒｒｎＢｎ間の組換え事象は検出されなかった（図５、ケース５）。
Ｂ間の組換え事象（図５、ケース２）は、ＮｔｐｓｂＡ反復間の組換え事象と比
べて減少した頻度で起こる。ｂａｒ遺伝子だけを含有する組換え型プラスチドゲ
ノムは、ｂａｒ遺伝子プローブにハイブリダイズするが、ｕｉｄＡまたはａａｄ
Ａプローブにハイブリダイズしない５．７ｋｂｐバンドとして見ることができる
（図５のケース２）。該５．７ｋｂｐバンドは、９．５ｋｂｐ ｕｉｄＡ−ａａ
ｄＡ−ｂａｒバンドを含有する大多数のｐＵＭ７１形質転換体において少数の種
である。それは、明らかに、３つのｐＵＭ７１プラスチド形質転換体において見
ることができる（例えば、図８、形質転換体１３Ｏ参照）。この低い切除頻度は
、ｕｉｄＡおよびａａｄＡ遺伝子を欠くが、ｂａｒ遺伝子を含有するホモプラス
ミックプラスチド形質転換体を生産するのに十分である（図８、形質転換体１４
Ｂおよび１４Ｃ）。ａａｄＡおよびｕｉｄＡプローブを用いて、１４Ｂおよび１
４Ｃ由来のＤＮＡにおいてハイブリダイゼーションは検出できなかった。植物１
４ＢおよびＣは、グルホシネート−アンモニウムに耐性であったが、ａａｄＡ遺
伝子喪失のためにスペクチノマイシン感受性であった。ｕｉｄＡ遺伝子の産物、
β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）に関する酵素アッセイは、１４ＢおよびＣにお
いて検出可能な活性を示さなかった。ｕｉｄＡの喪失をもたらすｒｒｈＨｖ Ａ
およびｒｒｎＢｎ間の組換え事象は検出されなかった（図５、ケース５）。
【００８９】
実施例５
ｐＵＭ７０トランスプラストミック植物の照射
ｐＵＭ７０をタバコプラスチド中に形質転換して、安定なトランスプラストミ
ック植物を生産した。ｐＵＭ７０−１は、サザンブロット分析によって、ｕｉｄ
ＡおよびａａｄＡ遺伝子を含有する組換え型３．８ｋｂ外来性インサートに関し
てホモプラスミックであることが示された。形質転換体ｐＵＭ７０−１由来の花
を非形質転換ＷＴタバコ植物由来の花粉と交雑した。５００個の種子の発芽によ
り幼植物が生じ、その全てがスペクチノマイシン耐性であった。該母性遺伝パタ
ーンは、プラスチドゲノム中におけるａａｄＡ遺伝子を含有する外来性インサー
トの配置と一致する。ｐＵＭ７０−１トランスプラストミック種子の分離したバ
ッチをコバルト源由来の増加する放射線量に曝露した。使用した線量は、５０、
１００、１５０および２００キロラドであった。表面殺菌後（１０％次亜塩素酸
ナトリウム中３０分、滅菌蒸留水中で３回洗浄）、種子を３％シュークロース、
１ｍｇ／Ｌ ＢＡＰおよび０．１ｍｇ／Ｌ ＮＡＡを補足した固形ＭＳ培地上で発
芽させた。３−４週間後、植物を新鮮な培地に移した。移植後３−４週間以内で
、植物のフラクションが葉上に白色セクターを生じた。これらの班入りの植物の
白色および緑色シュートを分離し、イン・ビトロで同時に増殖させた。いくつか
の場合、黄色シュートが観察され、それは不安定であり、全体として白色または
緑色シュートを生じた。全部で２５系統がアルビノおよび緑色植物として増殖し
た。これらの系統の全ては、１００−２００キロラドで照射された種子から誘導
された。ガンマ照射は、プラスチドＤＮＡ中で二本鎖を破壊させ、ＤＮＡ組換え
および修復酵素を誘導すると予想されたであろう。二本鎖破壊の修復は、白化を
もたらすプラスチドＤＮＡにおける欠失を導くことができる。したがって、白化
は、増加した組換えを被ったプラスチドゲノムのインジケーターを提供すること
ができる。これらの一般的な組換え酵素は、ａａｄＡ遺伝子に隣接し、その切除
を導く二重ＮｔｐｓｂＡ反復において作用することが予測されうる。
ック植物を生産した。ｐＵＭ７０−１は、サザンブロット分析によって、ｕｉｄ
ＡおよびａａｄＡ遺伝子を含有する組換え型３．８ｋｂ外来性インサートに関し
てホモプラスミックであることが示された。形質転換体ｐＵＭ７０−１由来の花
を非形質転換ＷＴタバコ植物由来の花粉と交雑した。５００個の種子の発芽によ
り幼植物が生じ、その全てがスペクチノマイシン耐性であった。該母性遺伝パタ
ーンは、プラスチドゲノム中におけるａａｄＡ遺伝子を含有する外来性インサー
トの配置と一致する。ｐＵＭ７０−１トランスプラストミック種子の分離したバ
ッチをコバルト源由来の増加する放射線量に曝露した。使用した線量は、５０、
１００、１５０および２００キロラドであった。表面殺菌後（１０％次亜塩素酸
ナトリウム中３０分、滅菌蒸留水中で３回洗浄）、種子を３％シュークロース、
１ｍｇ／Ｌ ＢＡＰおよび０．１ｍｇ／Ｌ ＮＡＡを補足した固形ＭＳ培地上で発
芽させた。３−４週間後、植物を新鮮な培地に移した。移植後３−４週間以内で
、植物のフラクションが葉上に白色セクターを生じた。これらの班入りの植物の
白色および緑色シュートを分離し、イン・ビトロで同時に増殖させた。いくつか
の場合、黄色シュートが観察され、それは不安定であり、全体として白色または
緑色シュートを生じた。全部で２５系統がアルビノおよび緑色植物として増殖し
た。これらの系統の全ては、１００−２００キロラドで照射された種子から誘導
された。ガンマ照射は、プラスチドＤＮＡ中で二本鎖を破壊させ、ＤＮＡ組換え
および修復酵素を誘導すると予想されたであろう。二本鎖破壊の修復は、白化を
もたらすプラスチドＤＮＡにおける欠失を導くことができる。したがって、白化
は、増加した組換えを被ったプラスチドゲノムのインジケーターを提供すること
ができる。これらの一般的な組換え酵素は、ａａｄＡ遺伝子に隣接し、その切除
を導く二重ＮｔｐｓｂＡ反復において作用することが予測されうる。
【００９０】
７つの種子から誘導された緑色（Ｇ）およびアルビノ（Ａ）植物は、サザンブ
ロット分析によって詳細に研究された。８．３ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩバンドは
、ｕｉｄＡおよびａａｄＡ遺伝子を含有する無傷外来性インサートのプラスチド
ゲノム中への組み込みに起因する（図６）。８．３ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩは、
緑色およびアルビノ植物の大部分に存在し、ａａｄＡおよびｕｉｄＡ遺伝子プロ
ーブにハイブリダイズする（図１２）。ａａｄＡ遺伝子の切除は、ｕｉｄＡ遺伝
子だけを含有する７．０ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩを生じる（図６）。該７．０ｋ
ｂｐバンドは、無傷８．３ｋｂｐバンドをも含有する植物２Ｇ、７Ｇおよび７Ａ
において見ることができる。これらの植物はヘテロプラスミックであり、無傷ｕ
ｉｄＡ−ａａｄＡインサートを有するプラスチドゲノムおよびａａｄＡ遺伝子を
喪失したがｕｉｄＡを保持しているプラスチドゲノムを含有する。植物５Ａにお
けるプラスチドゲノムからのａａｄＡ遺伝子の切除は、ｕｉｄＡ遺伝子を含有す
る「マーカー不含」トランスプラストミック植物を生産した。植物５Ａ由来のＤ
ＮＡにおいて、ａａｄＡ遺伝子はサザンブロットハイブリダイゼーションにより
検出不可能である（図１２）。植物５Ａは、ＧＵＳ酵素を含有するが、ａａｄＡ
遺伝子を欠くので、スペクチノマイシン感受性である。感受性は、植物のスペク
チノマイシン含有培地上で根を生じる能力によって決定される。
ロット分析によって詳細に研究された。８．３ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩバンドは
、ｕｉｄＡおよびａａｄＡ遺伝子を含有する無傷外来性インサートのプラスチド
ゲノム中への組み込みに起因する（図６）。８．３ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩは、
緑色およびアルビノ植物の大部分に存在し、ａａｄＡおよびｕｉｄＡ遺伝子プロ
ーブにハイブリダイズする（図１２）。ａａｄＡ遺伝子の切除は、ｕｉｄＡ遺伝
子だけを含有する７．０ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩを生じる（図６）。該７．０ｋ
ｂｐバンドは、無傷８．３ｋｂｐバンドをも含有する植物２Ｇ、７Ｇおよび７Ａ
において見ることができる。これらの植物はヘテロプラスミックであり、無傷ｕ
ｉｄＡ−ａａｄＡインサートを有するプラスチドゲノムおよびａａｄＡ遺伝子を
喪失したがｕｉｄＡを保持しているプラスチドゲノムを含有する。植物５Ａにお
けるプラスチドゲノムからのａａｄＡ遺伝子の切除は、ｕｉｄＡ遺伝子を含有す
る「マーカー不含」トランスプラストミック植物を生産した。植物５Ａ由来のＤ
ＮＡにおいて、ａａｄＡ遺伝子はサザンブロットハイブリダイゼーションにより
検出不可能である（図１２）。植物５Ａは、ＧＵＳ酵素を含有するが、ａａｄＡ
遺伝子を欠くので、スペクチノマイシン感受性である。感受性は、植物のスペク
チノマイシン含有培地上で根を生じる能力によって決定される。
【００９１】
参考文献
Day, A.および THN. Ellis. (1985) 穀類葯培養由来のアルビノ植物における
プラスチドＤＮＡの欠失形態（Deleted forms of plastid DNA in albino plant
s from cereal anther culture），Current Genet. 9:671-678. Goldschmidtclermont, M. (1991) クロロプラストにおけるアミノグリコシド
アデニントランスフェラーゼのトランスジェニック発現：コナミドリムシにおけ
る部位特異的形質転換のための選択マーカー（Transgenic expression of amino
glycoside adenine transferase in the chloroplast: a selectable marker fo
r site-directed transformation in Chlamydomonas），Nucleic Acids Researc
h 19:4083-4089. Jefferson, R.A., S.M. BurgessおよびD. Hirsh. (1986) 遺伝子融合マーカー
としてのエシェリキア・コリ由来のベータグルクロニダーゼ（Beta glucuronida
se from Escherichia coli as a gene fusion marker），Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA. 83:8447-8451. Murashige, T.およびF. Skoog. (1962) タバコ組織培養を用いる迅速な生長お
よびバイオアッセイのための改良培地（A revised medium for rapid growth an
d bioassays with tobacco tissue cultures），Physiol Plant. 15:473-497. Shinozaki, K., M. Ohme, M. Tanaka, T. Wakasugi, N. Hayashida, T. Matsu
bayashi, N. Zaita, J. Chunwongse, J. Obokata, K. Yamaguchishinozaki, C.
Ohto, K. Torazawa, B.Y. Meng, M. Sugita, H. Deno, T. Kamogashira, K. Yam
ada, J. Kusuda, F. Takaiwa, A. Kato, N. Tohdoh, H. ShimadaおよびM. Sugiu
ra. (1986) タバコクロロプラストゲノムの完全ヌクレオチド配列：その遺伝子
構成および発現（The complete nucleotide sequence of the tobacco chloropl
ast genome: its gene organization and expression），EMBO J 5:2043-2049. Sugiura, M., K. Shinozaki, N. Zaita, M. KusudaおよびM. Kumano. (1986)
一連のオーバーラップする制限エンドヌクレアーゼフラグメントとしてのタバコ
クロロプラストゲノムのクローンバンク：１１リボソームタンパク質遺伝子のマ
ッピング（Clone bank of the tobacco (Nicotiana tabacum) chloroplast geno
me as a set of overlapping restriction endonuclease fragments: mapping o
f 11 ribosomal protein genes），Plant Science 44:211-217. Svab, Z., P. HajdukiewiczおよびP. Maliga. (1990) 高等植物におけるプラ
スチドの安定な形質転換（Stable transformation of plastids in higher plan
ts），Proc Natl Acad Sci USA 87:8526-8530. White, J., S.Y.P. ChangおよびM.J. Bibb. (1990) ストレプトミセス・ヒグ
ロスコピカスのｂａｒ遺伝子を含有するカセット：植物形質転換のための選択マ
ーカー（A cassette containing the bar gene of Streptomyces hygroscopicus
: a selectable marker for plant transformation）， Nucl Acids Res 18:106
2.
プラスチドＤＮＡの欠失形態（Deleted forms of plastid DNA in albino plant
s from cereal anther culture），Current Genet. 9:671-678. Goldschmidtclermont, M. (1991) クロロプラストにおけるアミノグリコシド
アデニントランスフェラーゼのトランスジェニック発現：コナミドリムシにおけ
る部位特異的形質転換のための選択マーカー（Transgenic expression of amino
glycoside adenine transferase in the chloroplast: a selectable marker fo
r site-directed transformation in Chlamydomonas），Nucleic Acids Researc
h 19:4083-4089. Jefferson, R.A., S.M. BurgessおよびD. Hirsh. (1986) 遺伝子融合マーカー
としてのエシェリキア・コリ由来のベータグルクロニダーゼ（Beta glucuronida
se from Escherichia coli as a gene fusion marker），Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA. 83:8447-8451. Murashige, T.およびF. Skoog. (1962) タバコ組織培養を用いる迅速な生長お
よびバイオアッセイのための改良培地（A revised medium for rapid growth an
d bioassays with tobacco tissue cultures），Physiol Plant. 15:473-497. Shinozaki, K., M. Ohme, M. Tanaka, T. Wakasugi, N. Hayashida, T. Matsu
bayashi, N. Zaita, J. Chunwongse, J. Obokata, K. Yamaguchishinozaki, C.
Ohto, K. Torazawa, B.Y. Meng, M. Sugita, H. Deno, T. Kamogashira, K. Yam
ada, J. Kusuda, F. Takaiwa, A. Kato, N. Tohdoh, H. ShimadaおよびM. Sugiu
ra. (1986) タバコクロロプラストゲノムの完全ヌクレオチド配列：その遺伝子
構成および発現（The complete nucleotide sequence of the tobacco chloropl
ast genome: its gene organization and expression），EMBO J 5:2043-2049. Sugiura, M., K. Shinozaki, N. Zaita, M. KusudaおよびM. Kumano. (1986)
一連のオーバーラップする制限エンドヌクレアーゼフラグメントとしてのタバコ
クロロプラストゲノムのクローンバンク：１１リボソームタンパク質遺伝子のマ
ッピング（Clone bank of the tobacco (Nicotiana tabacum) chloroplast geno
me as a set of overlapping restriction endonuclease fragments: mapping o
f 11 ribosomal protein genes），Plant Science 44:211-217. Svab, Z., P. HajdukiewiczおよびP. Maliga. (1990) 高等植物におけるプラ
スチドの安定な形質転換（Stable transformation of plastids in higher plan
ts），Proc Natl Acad Sci USA 87:8526-8530. White, J., S.Y.P. ChangおよびM.J. Bibb. (1990) ストレプトミセス・ヒグ
ロスコピカスのｂａｒ遺伝子を含有するカセット：植物形質転換のための選択マ
ーカー（A cassette containing the bar gene of Streptomyces hygroscopicus
: a selectable marker for plant transformation）， Nucl Acids Res 18:106
2.
【図１】 図１は、プラスチド形質転換ベクターｐＵＭ７０およびｐＵＭ７
１の制限地図を示す。
１の制限地図を示す。
【図２】 図２は、プラスチドプロモーターｒｒｎＨｖ（配列番号１５）お
よびｒｒｎＢｎ（配列番号１６）の配列および比較を示す。ｒｒｎＨｖは、リボ
ソーム結合部位（ＲＢＳ）に融合したオオムギプラスチドＤＮＡの修飾された１
６Ｓ ｒＲＮＡプロモーターおよびオオムギｒｂｃＬ遺伝子の開始ＡＴＧコドン
を含有する。該プロモーターは穀類のような単子葉植物に最も適当である。ｒｒ
ｎＢｎの１６ＳｒＲＮＡプロモーター領域は、修飾されたニコチアーナ・タバカ
ム（Nicotiana tabacum）プラスチドＤＮＡ配列に融合したブラシカ・ナプス（B
rassica napus）プラスチドＤＮＡ配列を含有する。該キメラ１６ＳｒＲＮＡプ
ロモーター領域はエヌ・タバカム（N. tabacum）ｒｂｃＬ遺伝子のＲＢＳに融合
される。エヌ・タバカム配列に下線を付し、塩基４６−１１６はビー・ナプス（
B. napus）由来である。該プロモーターは双子葉植物に最も適当である。
よびｒｒｎＢｎ（配列番号１６）の配列および比較を示す。ｒｒｎＨｖは、リボ
ソーム結合部位（ＲＢＳ）に融合したオオムギプラスチドＤＮＡの修飾された１
６Ｓ ｒＲＮＡプロモーターおよびオオムギｒｂｃＬ遺伝子の開始ＡＴＧコドン
を含有する。該プロモーターは穀類のような単子葉植物に最も適当である。ｒｒ
ｎＢｎの１６ＳｒＲＮＡプロモーター領域は、修飾されたニコチアーナ・タバカ
ム（Nicotiana tabacum）プラスチドＤＮＡ配列に融合したブラシカ・ナプス（B
rassica napus）プラスチドＤＮＡ配列を含有する。該キメラ１６ＳｒＲＮＡプ
ロモーター領域はエヌ・タバカム（N. tabacum）ｒｂｃＬ遺伝子のＲＢＳに融合
される。エヌ・タバカム配列に下線を付し、塩基４６−１１６はビー・ナプス（
B. napus）由来である。該プロモーターは双子葉植物に最も適当である。
【図３】 図３は、ＮｔｐｓｂＡの３’プロセッシング／ターミネーター領
域の配列を示す（配列番号１４）。エヌ・タバカムｐｓｂＡ遺伝子のターミネー
ター領域は、プラスチド発現カセット中へのクローニングを容易にするために、
上流にＰｓｔＩ部位ならびに下流にＡｏｃＩおよびＢａｍＨＩ部位を挿入するこ
とによって修飾された。
域の配列を示す（配列番号１４）。エヌ・タバカムｐｓｂＡ遺伝子のターミネー
ター領域は、プラスチド発現カセット中へのクローニングを容易にするために、
上流にＰｓｔＩ部位ならびに下流にＡｏｃＩおよびＢａｍＨＩ部位を挿入するこ
とによって修飾された。
【図４】 図４は、修飾されたｂａｒ遺伝子の配列を示す（配列番号１７）
。ｂａｒ遺伝子（Whiteら、1991）は、図２および３において記載のプラスチド
調節配列を用いてプラスチド内でのその発現が可能になるように、ＮおよびＣ末
端が修飾された。修飾は、ＮｃｏＩ部位をそのＮ末端に、２つのＴＡＡ終止コド
ンをＣ末端に導入する。ｂａｒ遺伝子の第２のアミノ酸をセリンからグリシンに
変化させた。
。ｂａｒ遺伝子（Whiteら、1991）は、図２および３において記載のプラスチド
調節配列を用いてプラスチド内でのその発現が可能になるように、ＮおよびＣ末
端が修飾された。修飾は、ＮｃｏＩ部位をそのＮ末端に、２つのＴＡＡ終止コド
ンをＣ末端に導入する。ｂａｒ遺伝子の第２のアミノ酸をセリンからグリシンに
変化させた。
【図５】 図５は、ｐＵＭ７１カセットのプラスチドゲノム中への組み込み
および組換え事象によって媒介される遺伝子喪失のスキームを示す。ｕｉｄＡ、
ａａｄＡおよびｂａｒ遺伝子を含有する無傷４．９ｋｂｐインサートのプラスチ
ドゲノム中への組み込みは、１６１ｋｂｐの組換え型プラスチドゲノムを生じる
。グルホシネート−アンモニウムを用いるｂａｒ遺伝子の選択は、天然プラスチ
ドゲノムのｂａｒ遺伝子を含有する組換え型ゲノムによる置換を保証する。直列
反復ＤＮＡ配列の長さおよび置換は、遺伝子喪失の頻度および型を調節する。ｐ
ＵＭ７１プラスチド形質転換体において、ｂａｒ遺伝子についての選択は、ｒｒ
ｎＨｖ ＡおよびｒｒｎＨｖ Ｂ間の組換え事象によって媒介されるａａｄＡおよ
びｕｉｄＡ遺伝子喪失と矛盾しない（ケース２）。ＮｔｐｓｂＡ１およびＮｔｐ
ｓｂＡ３間の組換えはａａｄＡおよびｂａｒを切除する（ケース１）。Ｎｔｐｓ
ｂＡ１およびＮｔｐｓｂＡ２間、またはｒｒｎＢｎおよびｒｒｎＨｖＢ間の組換
えは、ａａｄＡを切除する（ケース３）。ＮｔｐｓｂＡ ２およびＮｔｐｓｂＡ
間の組換えはｂａｒを切除する（ケース４）。ｒｒｎＨｖ ＡおよびｒｒｎＢｎ
間の組換えはｕｉｄＡを切除する（ケース５）。ケース１および２は、ｂａｒま
たはｕｉｄＡのいずれかである目的遺伝子のみを含有するプラスチドゲノムを生
じる。ｒｒｎＨｖ ＡおよびＢ間の組換えは高頻度ではないと予測されるであろ
う。
および組換え事象によって媒介される遺伝子喪失のスキームを示す。ｕｉｄＡ、
ａａｄＡおよびｂａｒ遺伝子を含有する無傷４．９ｋｂｐインサートのプラスチ
ドゲノム中への組み込みは、１６１ｋｂｐの組換え型プラスチドゲノムを生じる
。グルホシネート−アンモニウムを用いるｂａｒ遺伝子の選択は、天然プラスチ
ドゲノムのｂａｒ遺伝子を含有する組換え型ゲノムによる置換を保証する。直列
反復ＤＮＡ配列の長さおよび置換は、遺伝子喪失の頻度および型を調節する。ｐ
ＵＭ７１プラスチド形質転換体において、ｂａｒ遺伝子についての選択は、ｒｒ
ｎＨｖ ＡおよびｒｒｎＨｖ Ｂ間の組換え事象によって媒介されるａａｄＡおよ
びｕｉｄＡ遺伝子喪失と矛盾しない（ケース２）。ＮｔｐｓｂＡ１およびＮｔｐ
ｓｂＡ３間の組換えはａａｄＡおよびｂａｒを切除する（ケース１）。Ｎｔｐｓ
ｂＡ１およびＮｔｐｓｂＡ２間、またはｒｒｎＢｎおよびｒｒｎＨｖＢ間の組換
えは、ａａｄＡを切除する（ケース３）。ＮｔｐｓｂＡ ２およびＮｔｐｓｂＡ
間の組換えはｂａｒを切除する（ケース４）。ｒｒｎＨｖ ＡおよびｒｒｎＢｎ
間の組換えはｕｉｄＡを切除する（ケース５）。ケース１および２は、ｂａｒま
たはｕｉｄＡのいずれかである目的遺伝子のみを含有するプラスチドゲノムを生
じる。ｒｒｎＨｖ ＡおよびＢ間の組換えは高頻度ではないと予測されるであろ
う。
【図６】 図６は、ｐＵＭ７０カセットのプラスチドゲノム中への組み込み
および組換え事象によって媒介される遺伝子喪失のスキームを示す。ｕｉｄＡお
よびａａｄＡ遺伝子を含有する無傷３．８ｋｂｐインサートのプラスチドゲノム
中への組み込みは、１６０ｋｂｐの組換え型プラスチドゲノムを生じる。スペク
チノマイシンおよびストレプトマイシンを用いるａａｄＡ遺伝子についての選択
は、天然プラスチドゲノムのａａｄＡ遺伝子を含有する組換え型ゲノムによる置
換を保証する。いったんゲノムを含有する組換え型ａａｄＡのホモプラスミーが
達成すれば、選択圧を除く。ａａｄＡの切除は２つのＮｔｐｓｂＡ直列反復間の
組換えによって媒介される（ケース１）。ｕｉｄＡの切除は、ｒｒｎＨｖおよび
ｒｒｎＢｎ不完全直列反復間の組換えによって媒介され（ケース２）、高頻度で
はないと予測される。ケース１は、ｕｉｄＡのみを含有する組換え型プラスチド
ゲノムの発生を導く。
および組換え事象によって媒介される遺伝子喪失のスキームを示す。ｕｉｄＡお
よびａａｄＡ遺伝子を含有する無傷３．８ｋｂｐインサートのプラスチドゲノム
中への組み込みは、１６０ｋｂｐの組換え型プラスチドゲノムを生じる。スペク
チノマイシンおよびストレプトマイシンを用いるａａｄＡ遺伝子についての選択
は、天然プラスチドゲノムのａａｄＡ遺伝子を含有する組換え型ゲノムによる置
換を保証する。いったんゲノムを含有する組換え型ａａｄＡのホモプラスミーが
達成すれば、選択圧を除く。ａａｄＡの切除は２つのＮｔｐｓｂＡ直列反復間の
組換えによって媒介される（ケース１）。ｕｉｄＡの切除は、ｒｒｎＨｖおよび
ｒｒｎＢｎ不完全直列反復間の組換えによって媒介され（ケース２）、高頻度で
はないと予測される。ケース１は、ｕｉｄＡのみを含有する組換え型プラスチド
ゲノムの発生を導く。
【図７】 図７は、ｐＵＭ７１トランスプラストミック植物におけるグルホ
シネート−アンモニウム耐性の母性遺伝パターンを示す。形質転換されていない
野生型（ＷＴ）タバコ植物における花との交雑において、ｐＵＭ７１形質転換体
１３Ｇにおける花が花粉ドナーおよびアクセプター部位の両方として用いられた
相互交雑が行われた。交雑において、ｐＵＭ７１−１３Ｇ（雌）ｘＷＴ（雄）全
子孫は、母系１３Ｇ親のグルホシネート−アンモニウム耐性表現型を有する。交
雑において、ＷＴ（雌）ｘｐＵＭ７１（雄）全子孫は、母系ＷＴ（非形質転換）
親のグルホシネート−アンモニウム感受性表現型を有する。対照植物は、植えつ
け後３６、４３および５０日目に０．１％（Ｖ／Ｖ）チャレンジ（Challenge）
溶液（ＡｇｒＥｖｏ，１５０ｇ／ｌグルホシネート−アンモニウム）で噴霧され
た植物と比較する。ポットは、５７日目に写真撮影した。各ポットは５つの植物
体を含んだ。
シネート−アンモニウム耐性の母性遺伝パターンを示す。形質転換されていない
野生型（ＷＴ）タバコ植物における花との交雑において、ｐＵＭ７１形質転換体
１３Ｇにおける花が花粉ドナーおよびアクセプター部位の両方として用いられた
相互交雑が行われた。交雑において、ｐＵＭ７１−１３Ｇ（雌）ｘＷＴ（雄）全
子孫は、母系１３Ｇ親のグルホシネート−アンモニウム耐性表現型を有する。交
雑において、ＷＴ（雌）ｘｐＵＭ７１（雄）全子孫は、母系ＷＴ（非形質転換）
親のグルホシネート−アンモニウム感受性表現型を有する。対照植物は、植えつ
け後３６、４３および５０日目に０．１％（Ｖ／Ｖ）チャレンジ（Challenge）
溶液（ＡｇｒＥｖｏ，１５０ｇ／ｌグルホシネート−アンモニウム）で噴霧され
た植物と比較する。ポットは、５７日目に写真撮影した。各ポットは５つの植物
体を含んだ。
【図８】 図８は、遺伝子喪失およびｂａｒ遺伝子を含有するａａｄＡ不含
トランスプラストミック植物の生産を示す初代ｐＵＭ７１形質転換体（Ｔ０世代
）のサザンブロット分析を示す。個々の植物由来のＨｉｎｄＩＩＩ消化した全Ｄ
ＮＡ（２μｇ）を：挿入部位に隣接するｃｐＤＮＡ（エヌ・タバカムプラスチド
ゲノムの５７１７６ないし６０６０４塩基にまたがる３．４ｋｂｐ ＣｌａＩ−
ＥｃｏＲＶフラグメント）、ｕｉｄＡ、ａａｄＡおよびｂａｒでプローブした。
ビー・ナプス由来の核リボソームＤＮＡを用いてレーンあたりの同様のＤＮＡ負
荷をモニターした。９．５ｋｂｐＨｉｎｄＩＩＩバンドは３遺伝子（ｕｉｄＡ、
ａａｄＡおよびｂａｒ）全てにハイブリダイズする。７．０ｋｂｐＨｉｎｄＩＩ
ＩバンドはｕｉｄＡプローブのみにハイブリダイズする。５．７ｋｂｐＨｉｎｄ
ＩＩＩバンドはｂａｒ遺伝子のみにハイブリダイズする。７．０および５．７ｋ
ｂｐバンドの大きさおよびハイブリダイゼーションパターンは、図５に示される
組換え事象の結果である（ケース１および２）。植物１４Ａおよび１４Ｂはいず
れの検出可能なａａｄＡまたはｕｉｄＡ配列も含まず、グルホシネート−アンモ
ニウム耐性であるがスペクチノマイシン感受性である。ブロットは６０℃にてハ
イブリダイズされ、０．１％ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６０℃で洗浄された。制
限フラグメントの大きさはＤＮＡサイズマーカーから概算された。
トランスプラストミック植物の生産を示す初代ｐＵＭ７１形質転換体（Ｔ０世代
）のサザンブロット分析を示す。個々の植物由来のＨｉｎｄＩＩＩ消化した全Ｄ
ＮＡ（２μｇ）を：挿入部位に隣接するｃｐＤＮＡ（エヌ・タバカムプラスチド
ゲノムの５７１７６ないし６０６０４塩基にまたがる３．４ｋｂｐ ＣｌａＩ−
ＥｃｏＲＶフラグメント）、ｕｉｄＡ、ａａｄＡおよびｂａｒでプローブした。
ビー・ナプス由来の核リボソームＤＮＡを用いてレーンあたりの同様のＤＮＡ負
荷をモニターした。９．５ｋｂｐＨｉｎｄＩＩＩバンドは３遺伝子（ｕｉｄＡ、
ａａｄＡおよびｂａｒ）全てにハイブリダイズする。７．０ｋｂｐＨｉｎｄＩＩ
ＩバンドはｕｉｄＡプローブのみにハイブリダイズする。５．７ｋｂｐＨｉｎｄ
ＩＩＩバンドはｂａｒ遺伝子のみにハイブリダイズする。７．０および５．７ｋ
ｂｐバンドの大きさおよびハイブリダイゼーションパターンは、図５に示される
組換え事象の結果である（ケース１および２）。植物１４Ａおよび１４Ｂはいず
れの検出可能なａａｄＡまたはｕｉｄＡ配列も含まず、グルホシネート−アンモ
ニウム耐性であるがスペクチノマイシン感受性である。ブロットは６０℃にてハ
イブリダイズされ、０．１％ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６０℃で洗浄された。制
限フラグメントの大きさはＤＮＡサイズマーカーから概算された。
【図９】 図９は、増殖の間のａａｄＡ遺伝子喪失を示すｐＵＭ７１形質転
換体の子孫（Ｔ１世代）のサザンブロット分析を示す。全ＤＮＡは、１３Ｇ（雌
）ｘＷＴ（雄）交雑の２つのＴ２子孫（２および３）の別々の葉領域から調製さ
れた。子孫および親ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物を：（ａ）挿入部位に隣接す
るｃｐＤＮＡ、（ｂ）ｕｉｄＡでプローブした。ブロットは０．１％ＳＳＣ、０
．１％ＳＤＳ中６０℃で洗浄された。
換体の子孫（Ｔ１世代）のサザンブロット分析を示す。全ＤＮＡは、１３Ｇ（雌
）ｘＷＴ（雄）交雑の２つのＴ２子孫（２および３）の別々の葉領域から調製さ
れた。子孫および親ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物を：（ａ）挿入部位に隣接す
るｃｐＤＮＡ、（ｂ）ｕｉｄＡでプローブした。ブロットは０．１％ＳＳＣ、０
．１％ＳＤＳ中６０℃で洗浄された。
【図１０】 図１０は、ｕｉｄＡ遺伝子を含有するマーカー不含プラスチド
形質転換体を示す。トランスプラストミック植物１３Ｇ−Ｔ１−２および対照Ｗ
Ｔ植物由来の種子（Ｔ２）を表面殺菌し、（Ａ）５００ｍｇ／ｍｌスペクチノマ
イシンを含有するＭＳ塩類培地（親１３Ｇ−Ｔ１−２由来の漂白された種子を矢
印で示す）または（Ｂ）ＭＳ塩類培地上に植えた。（Ｃ）緑色ＷＴおよび親１３
Ｇ−Ｔ１−２由来のスペクチノマイシン耐性幼植物におけるβ−グルクロニダー
ゼ（ＧＵＳ）活性。（Ｄ）スペクチノマイシンを欠くＭＳ塩類培地上の漂白され
た１３Ｇ−Ｔ１−２幼植物の再緑化は、ＧＵＳ活性の検出を可能にする。ｕｉｄ
Ａ遺伝子を含有するこれらのスペクチノマシン感受性幼植物は、マーカー不含ト
ランスプラストミック幼植物である。ＧＵＳは、ｕｉｄＡレポーター遺伝子の産
物であり、Ｘ−Ｇｌｕｃを青色産物に変換し、それは白色ＧＵＳ陰性野生型幼植
物とは対照的に濃く染色された葉として現れる。
形質転換体を示す。トランスプラストミック植物１３Ｇ−Ｔ１−２および対照Ｗ
Ｔ植物由来の種子（Ｔ２）を表面殺菌し、（Ａ）５００ｍｇ／ｍｌスペクチノマ
イシンを含有するＭＳ塩類培地（親１３Ｇ−Ｔ１−２由来の漂白された種子を矢
印で示す）または（Ｂ）ＭＳ塩類培地上に植えた。（Ｃ）緑色ＷＴおよび親１３
Ｇ−Ｔ１−２由来のスペクチノマイシン耐性幼植物におけるβ−グルクロニダー
ゼ（ＧＵＳ）活性。（Ｄ）スペクチノマイシンを欠くＭＳ塩類培地上の漂白され
た１３Ｇ−Ｔ１−２幼植物の再緑化は、ＧＵＳ活性の検出を可能にする。ｕｉｄ
Ａ遺伝子を含有するこれらのスペクチノマシン感受性幼植物は、マーカー不含ト
ランスプラストミック幼植物である。ＧＵＳは、ｕｉｄＡレポーター遺伝子の産
物であり、Ｘ−Ｇｌｕｃを青色産物に変換し、それは白色ＧＵＳ陰性野生型幼植
物とは対照的に濃く染色された葉として現れる。
【図１１】 図１１は、ｐＵＭ７１プラスチド形質転換体由来のａａｄＡ不
含およびマーカー不含プラスチドゲノムの発生を示す。（Ａ）ｕｉｄＡ、ａａｄ
Ａおよびｂａｒ遺伝子を含有するトランスプラストミックｐＵＭ７１形質転換体
は、ｂａｒ遺伝子を含有するａａｄＡ不含プラスチドゲノムまたはｕｉｄＡ遺伝
子を含有するマーカー不含プラスチドゲノムのいずれかを生じる。２つの１７４
塩基直列反復間で唯一の組換え事象が可能であり、これはｂａｒ遺伝子を含有す
るａａｄＡ不含プラスチドゲノムを生じる。ｐＵＭ７１形質転換体において３つ
の４１８ｂｐＮｔｐｓｂＡ反復間では、３つの組換え事象が可能であり、ｕｉｄ
Ａのみ、ｕｉｄＡ−ｂａｒまたはｕｉｄＡ−ａａｄＡを含有するゲノムを生じる
。２つのＮｔｐｓｂＡ反復を含有するプラスチドゲノムｕｉｄＡ−ｂａｒおよび
ｕｉｄＡ−ａａｄＡは、高レベルまで蓄積しない。もしこれらのゲノムが生じる
ならば、それらは、残りのＮｔｐｓｂＡ直列反復間の組換えのために不安定であ
る。（Ｂ）ｕｉｄＡでプローブされた３つのｐＵＭ７０形質転換体由来のＤＮＡ
のサザンブロット。ブロットは０．１％ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６０℃で洗浄
した。タンデムｕｉｄＡおよびａａｄＡ遺伝子を含有する８．３ｋｂｐ Ｈｉｎ
ｄＩＩＩバンドは、（Ａ）に示されるｕｉｄＡ−ａａｄＡプラスチドゲノムの特
徴である。これは、（Ａ）におけるｕｉｄＡ−ａａｄＡ中間体が本質的に不安定
でないことを示す。
含およびマーカー不含プラスチドゲノムの発生を示す。（Ａ）ｕｉｄＡ、ａａｄ
Ａおよびｂａｒ遺伝子を含有するトランスプラストミックｐＵＭ７１形質転換体
は、ｂａｒ遺伝子を含有するａａｄＡ不含プラスチドゲノムまたはｕｉｄＡ遺伝
子を含有するマーカー不含プラスチドゲノムのいずれかを生じる。２つの１７４
塩基直列反復間で唯一の組換え事象が可能であり、これはｂａｒ遺伝子を含有す
るａａｄＡ不含プラスチドゲノムを生じる。ｐＵＭ７１形質転換体において３つ
の４１８ｂｐＮｔｐｓｂＡ反復間では、３つの組換え事象が可能であり、ｕｉｄ
Ａのみ、ｕｉｄＡ−ｂａｒまたはｕｉｄＡ−ａａｄＡを含有するゲノムを生じる
。２つのＮｔｐｓｂＡ反復を含有するプラスチドゲノムｕｉｄＡ−ｂａｒおよび
ｕｉｄＡ−ａａｄＡは、高レベルまで蓄積しない。もしこれらのゲノムが生じる
ならば、それらは、残りのＮｔｐｓｂＡ直列反復間の組換えのために不安定であ
る。（Ｂ）ｕｉｄＡでプローブされた３つのｐＵＭ７０形質転換体由来のＤＮＡ
のサザンブロット。ブロットは０．１％ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６０℃で洗浄
した。タンデムｕｉｄＡおよびａａｄＡ遺伝子を含有する８．３ｋｂｐ Ｈｉｎ
ｄＩＩＩバンドは、（Ａ）に示されるｕｉｄＡ−ａａｄＡプラスチドゲノムの特
徴である。これは、（Ａ）におけるｕｉｄＡ−ａａｄＡ中間体が本質的に不安定
でないことを示す。
【図１２】 図１２は、遺伝子喪失およびｕｉｄＡ遺伝子を含有するａａｄ
Ａ不含トランスプラストミック植物の生産を示すｐＵＭ７０形質転換体の照射し
た子孫（Ｔ１世代）のサザンブロット分析を示す。照射後、個々の種子由来の植
物は緑／白色斑を示した。緑色（Ｇ）およびアルビノ（Ａ）シュートは、別々に
増殖させた全体として緑色および白色の植物を生じた。同じ種子から誘導される
緑および白色植物由来のＤＮＡは、隣接するレーンにおいてブロット上で分析さ
れた。２μｇの全ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩまたはＢａｍＨＩのいずれかで消化し
、示されるように、ｕｉｄＡおよびａａｄＡ特異的プローブでプローブした。８
．３ｋｂｐバンドはｕｉｄＡおよびａａｄＡ遺伝子の両方を含有し、植物の大部
分に存在する。植物５Ａにおいて、この８．３ｋｂｐバンドはｕｉｄＡにのみハ
イブリダイズする７．０ｋｂｐのバンドによって置換される。植物５Ａはいずれ
の検出可能なａａｄＡ配列も含有せず、スペクチノマイシン感受性である。それ
は、「マーカー不含」トランスプラストミック植物の一例である。ｕｉｄＡのみ
を含有する７．０ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩバンドは、２つのＮｔｐｓｂＡ反復間
の組換えから誘導される（図６、ケース１）。
Ａ不含トランスプラストミック植物の生産を示すｐＵＭ７０形質転換体の照射し
た子孫（Ｔ１世代）のサザンブロット分析を示す。照射後、個々の種子由来の植
物は緑／白色斑を示した。緑色（Ｇ）およびアルビノ（Ａ）シュートは、別々に
増殖させた全体として緑色および白色の植物を生じた。同じ種子から誘導される
緑および白色植物由来のＤＮＡは、隣接するレーンにおいてブロット上で分析さ
れた。２μｇの全ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩまたはＢａｍＨＩのいずれかで消化し
、示されるように、ｕｉｄＡおよびａａｄＡ特異的プローブでプローブした。８
．３ｋｂｐバンドはｕｉｄＡおよびａａｄＡ遺伝子の両方を含有し、植物の大部
分に存在する。植物５Ａにおいて、この８．３ｋｂｐバンドはｕｉｄＡにのみハ
イブリダイズする７．０ｋｂｐのバンドによって置換される。植物５Ａはいずれ
の検出可能なａａｄＡ配列も含有せず、スペクチノマイシン感受性である。それ
は、「マーカー不含」トランスプラストミック植物の一例である。ｕｉｄＡのみ
を含有する７．０ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩバンドは、２つのＮｔｐｓｂＡ反復間
の組換えから誘導される（図６、ケース１）。
【図１３】 図１３は、ｐＵＭ７１で形質転換されたトランスプラストミッ
クタバコ植物のグルホシネート−アンモニウム耐性を示す。植えつけ後４５、４
９および５３日目にＣｈａｌｌｅｎｇｅ（登録商標）の０％、０．１％、０．５
％および２．５％（Ｖ／Ｖ）溶液で噴霧し、７１目に写真撮影した、対照の非形
質転換植物およびｐＵＭ７１トランスプラストミック植物、１３Ｇ（雌）ｘＷＴ
（雄）交雑のＴ２子孫。各ポットは４つの植物体を含んだ。
クタバコ植物のグルホシネート−アンモニウム耐性を示す。植えつけ後４５、４
９および５３日目にＣｈａｌｌｅｎｇｅ（登録商標）の０％、０．１％、０．５
％および２．５％（Ｖ／Ｖ）溶液で噴霧し、７１目に写真撮影した、対照の非形
質転換植物およびｐＵＭ７１トランスプラストミック植物、１３Ｇ（雌）ｘＷＴ
（雄）交雑のＴ２子孫。各ポットは４つの植物体を含んだ。
【配列表】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(31)優先権主張番号 ００１７３３８．５
(32)優先日 平成12年７月15日(2000．7．15)
(33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ
，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，
ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ
Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ
，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，
ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ
Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ
，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，
ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ミハイロ・ズブコ
イギリス、エム33・２ディイー、チェシャ
ー、セール、クラレンドン・クレセント５
番
Ｆターム(参考） 2B030 AD04 AD05 CA05 CA15 CA17
CA19
4B024 AA08 AA20 BA07 BA10 BA12
BA79 BA80 CA02 CA09 CA10
CA20 DA02 EA04 FA02 FA10
FA20 GA11 HA13 HA14 HA20
4B065 AA50Y AA88X AB01 AC10
AC14 AC20 BA02 CA27 CA29
CA31 CA53
Claims (62)
- 【請求項１】 外来遺伝子と共に導入された選択マーカー遺伝子を含まずに
外来遺伝子を含有する組換え型プラスチドゲノムを含むトランスジェニック植物
を生産する方法であって： （ａ）植物細胞のプラスチドゲノムを、形質転換されたプラスチドゲノム内で
組換え事象を起こして選択マーカー遺伝子を切り出すが、外来遺伝子は保持する
ように配置された外来遺伝子、選択マーカー遺伝子および少なくとも２つの直列
反復配列を含む核酸で安定に形質転換し； （ｂ）プラスチドが選択マーカー遺伝子を含む形質転換植物について１次選択
培地上で選択し；次いで （ｃ）形質転換プラスチドゲノム内での組換えにより選択マーカー遺伝子の切
除を促すが、外来遺伝子は保持するために、選択された形質転換植物を１次選択
培地の不在下で生育させる ことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 植物細胞がタバコ植物またはナス科由来の他の植物、アブラ
ナ科由来の植物のような双子葉植物、あるいは穀類または牧草のようなイネ科由
来の植物を包含する単子葉植物から選択される請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 核酸が相同組換えによりプラスチドゲノム中に安定に形質転
換される請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 プラスチドゲノムが外来遺伝子、選択マーカー遺伝子および
少なくとも２つの直列反復配列を含む発現カセットを含む核酸構築物で形質転換
される請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 プラスチドゲノムが、１つは直列反復配列に隣接する選択マ
ーカー遺伝子を含み、他の１つは外来遺伝子を含む２つの別個の核酸構築物で同
時形質転換される請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 外来遺伝子が疾患耐性遺伝子、害虫耐性遺伝子、除草剤耐性
遺伝子、特定の生合成経路に関与する遺伝子またはストレス耐性に関与する遺伝
子である請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 外来遺伝子がストレプトミセス・ヒグロスコピカスのｂａｒ
遺伝子である請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 選択マーカーが非致死である請求項１記載の方法。
- 【請求項９】 選択マーカー遺伝子が細菌性ａａｄＡ遺伝子である請求項８
記載の方法。 - 【請求項１０】 挿入配列とプラスチドの内在配列との間の組換えが起こる
機会を減少させるために、直列反復配列が形質転換されているプラスチドゲノム
にほとんど類似していない核酸配列を含む請求項１記載の方法。 - 【請求項１１】 直列反復配列が少なくとも２０ヌクレオチド長である請求
項１記載の方法。 - 【請求項１２】 直列反復配列が少なくとも５０ヌクレオチド長である請求
項１１記載の方法。 - 【請求項１３】 直列反復配列が少なくとも１００ヌクレオチド長である請
求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 直列反復配列が１７４ヌクレオチド長である請求項１３記
載の方法。 - 【請求項１５】 直列反復配列が４１８ヌクレオチド長である請求項１４記
載の方法。 - 【請求項１６】 直列反復配列が１０，０００ヌクレオチド長未満である請
求項１１記載の方法。 - 【請求項１７】 直列反復配列が選択マーカー遺伝子に隣接する請求項１記
載の方法。 - 【請求項１８】 プラスチドゲノム中に導入されるべき核酸が外来遺伝子お
よびどちらも選択マーカー遺伝子に隣接している２つの直列反復配列を伴う選択
マーカー遺伝子を含む請求項１記載の方法。 - 【請求項１９】 プラスチドゲノム中に導入されるべき核酸が１以上の外来
遺伝子および２つが選択マーカー遺伝子に隣接し、１つが外来遺伝子に隣接して
いる３つの直列反復配列を伴う選択マーカー遺伝子を含む請求項１記載の方法。 - 【請求項２０】 プラスチドゲノム中に導入されるべき核酸が１以上の外来
遺伝子およびどちらも選択マーカー遺伝子に隣接している２つの直列反復配列を
伴う選択マーカー遺伝子を含む請求項１記載の方法。 - 【請求項２１】 １次選択培地上での選択をホモプラスミーになるまで続け
る請求項１記載の方法。 - 【請求項２２】 さらに、１次選択培地上で生育させた形質転換植物をガン
マ照射して選択マーカー遺伝子の切除を促すことを含む請求項１記載の方法。 - 【請求項２３】 外来性ｕｉｄＡ遺伝子（βグルクロニダーゼをコードして
いる）を含有し、ｕｉｄＡ遺伝子と共に導入されたａａｄＡ遺伝子を含まない組
換え型プラスチドゲノムを含むトランスジェニックタバコ植物を生産するための
請求項１記載の方法。 - 【請求項２４】 外来遺伝子と共に導入された１次選択マーカー遺伝子を含
まずに外来遺伝子を含有する組換え型プラスチドゲノムを含むトランスジェニッ
ク植物を生産するための請求項１記載の方法であって： （ａ）植物細胞のプラスチドゲノムを、形質転換されたプラスチドゲノム内で
組換え事象を起こして１次選択マーカー遺伝子を切り出すが、外来遺伝子は保持
するように配置された外来遺伝子、１次選択マーカー遺伝子および２次選択マー
カー遺伝子ならびに少なくとも２つの直列反復配列を含む核酸で安定に形質転換
し； （ｂ）プラスチドが１次選択マーカー遺伝子を含む形質転換植物について１次
選択培地上で選択し；次いで （ｃ）２次選択マーカー遺伝子を含有する植物の選択を可能とするために、お
よび形質転換プラスチドゲノム内での組換えにより選択マーカー遺伝子の切除を
促すが、外来遺伝子は保持するために、選択された形質転換植物を２次選択培地
中で生育させる ことを特徴とする方法。 - 【請求項２５】 ２次選択マーカーが外来遺伝子である請求項２４記載の方
法。 - 【請求項２６】 ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコード
しているｂａｒ遺伝子が２次選択マーカーである請求項２５記載の方法。 - 【請求項２７】 少なくとも２つの直列反復配列および選択マーカー遺伝子
を含む植物プラスチドゲノムを形質転換するための核酸構築物。 - 【請求項２８】 さらに外来遺伝子を含む請求項２７記載の核酸構築物。
- 【請求項２９】 さらに第２の外来遺伝子を含む請求項２８記載の核酸構築
物。 - 【請求項３０】 直列反復配列が少なくとも２０ヌクレオチド長である請求
項２７〜２９のいずれか１項記載の核酸構築物。 - 【請求項３１】 直列反復配列が少なくとも５０ヌクレオチド長である請求
項２７〜２９のいずれか１項記載の核酸構築物。 - 【請求項３２】 直列反復配列が少なくとも１００ヌクレオチド長である請
求項２７〜２９のいずれか１項記載の核酸構築物。 - 【請求項３３】 直列反復配列が１７４ヌクレオチド長である請求項２７〜
２９のいずれか１項記載の核酸構築物。 - 【請求項３４】 直列反復配列が４１８ヌクレオチド長である請求項２７〜
２９のいずれか１項記載の核酸構築物。 - 【請求項３５】 直列反復配列が１０，０００ヌクレオチド長未満である請
求項２７〜２９のいずれか１項記載の核酸構築物。 - 【請求項３６】 直列反復配列がＮｔｐｓｂ Ａ配列を含む請求項２７〜２
９のいずれか１項記載の核酸構築物。 - 【請求項３７】 Ｎｔｐｓｂ Ａ配列が配列番号１４に示されるものである
請求項３６記載の核酸構築物。 - 【請求項３８】 直列反復配列がｒｒｎＨｖプロモーター配列を含む請求項
２７〜２９のいずれか１項記載の核酸構築物。 - 【請求項３９】 ｒｒｎＨｖプロモーター配列が配列番号１５に示されるも
のである請求項３８記載の核酸構築物。 - 【請求項４０】 直列反復配列がｒｒｎＢｖプロモーター配列を含む請求項
２７〜２９のいずれか１項記載の核酸構築物。 - 【請求項４１】 ｒｒｎＢｖプロモーター配列が配列番号１６に示されるも
のである請求項４０記載の核酸構築物。 - 【請求項４２】 外来遺伝子が疾患耐性遺伝子、害虫耐性遺伝子、除草剤耐
性遺伝子、特定の生合成経路に関与する遺伝子またはストレス耐性に関与する遺
伝子から選択される請求項２７〜２９のいずれか１項記載の核酸構築物。 - 【請求項４３】 外来遺伝子がｕｉｄＡ遺伝子である請求項４２記載の核酸
構築物。 - 【請求項４４】 外来遺伝子がｂａｒ遺伝子である請求項４４記載の核酸構
築物。 - 【請求項４５】 選択マーカー遺伝子が非致死である選択マーカーをコード
する請求項２７〜２９のいずれか１項記載の核酸構築物。 - 【請求項４６】 選択マーカー遺伝子が細菌性ａａｄＡ遺伝子である請求項
４５記載の核酸構築物。 - 【請求項４７】 第２の外来遺伝子が選択マーカー遺伝子である請求項２９
記載の核酸構築物。 - 【請求項４８】 第２の外来遺伝子がｂａｒ遺伝子である請求項４７記載の
核酸構築物。 - 【請求項４９】 ｂａｒ遺伝子が配列番号１７に示される配列を含む修飾さ
れたｂａｒ遺伝子である請求項４８記載の核酸構築物。 - 【請求項５０】 直列反復配列が選択マーカーに隣接する請求項２７〜２９
のいずれか１項記載の核酸構築物。 - 【請求項５１】 ２つが選択マーカー遺伝子に隣接し、１つが外来遺伝子の
１つに隣接する少なくとも３つの直列反復配列が存在する請求項２９記載の核酸
構築物。 - 【請求項５２】 請求項２７〜５１のいずれか１項記載の核酸構築物を含む
植物プラスチドゲノムを形質転換するための核酸プラスミド。 - 【請求項５３】 ｂａｒ遺伝子、ｕｉｄＡ遺伝子、ａａｄＡ遺伝子、Ｎｔｐ
ｓｂＡの直列反復配列の３コピー、ｒｒｎＨｖの直列反復配列の２コピーおよび
ｒｒｎＢｖの１コピーを含むプラスミドｐＵＭ７１。 - 【請求項５４】 ｕｉｄＡ遺伝子、ａａｄＡ遺伝子およびＮｔｐｓｂＡの直
列反復配列の２コピーを含むプラスミドｐＵＭ７０。 - 【請求項５５】 植物プラスチドゲノムを形質転換するための請求項５２〜
５４のいずれか１項記載のプラスミドの使用。 - 【請求項５６】 請求項１記載の方法による植物プラスチドゲノムを形質転
換するための請求項５２〜５４のいずれか１項記載のプラスミドの使用。 - 【請求項５７】 プラスチドが請求項５２〜５４のいずれか１項記載のプラ
スミドによって形質転換されたトランスジェニック植物細胞または組織。 - 【請求項５８】 請求項１記載の方法によって生産された、トランスジェニ
ック植物細胞または組織であって、そのプラスチドは外来遺伝子を含むが、外来
遺伝子と共に導入された選択マーカー遺伝子を含まないトランスジェニック植物
細胞または組織。 - 【請求項５９】 請求項１記載の方法によって生産された、プラスチドゲノ
ム中に外来遺伝子を含むトランスジェニック植物。 - 【請求項６０】 外来性ｂａｒ遺伝子を含む請求項５９記載のトランスジェ
ニック植物。 - 【請求項６１】 プラスミドｐＵＭ７１を用いてｂａｒ遺伝子が提供される
請求項６０記載のトランスジェニック植物。 - 【請求項６２】 核に位置するｂａｒ遺伝子を欠くグルホシネート−アンモ
ニウム耐性植物を生産するための請求項１記載の方法の使用。
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