ES2538111T3

ES2538111T3 - Grelina no acilada como agente terapéutico en el tratamiento de trastornos metabólicos

Info

Publication number: ES2538111T3
Application number: ES08760314.8T
Authority: ES
Inventors: Ezio Ghigo; Aart Jan Van Der Lely; Riccarda Granata
Original assignee: Alize Pharma SAS
Current assignee: Millendo Therapeutics SAS
Priority date: 2007-05-31
Filing date: 2008-05-30
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2028-05-30
Also published as: AU2008257448A1; CA2686803A1; JP2010528092A; AU2008257448B2; WO2008145749A1; US20100168033A1; EP2152297A1; EP2152297B1; US8222217B2; CA2686803C; CN101678084A; MX2009012969A; JP5485876B2; AU2008257448B9; US20080312133A1; DK2152297T3; CN101678084B

Abstract

Un polipéptido aislado que consiste en un fragmento de grelina no acilada como se expone en la SEQ ID NO: 1, y sus análogos, teniendo dicho fragmento 5, 6, 7 u 8 aminoácidos y comprendiendo la secuencia de aminoácidos Glu-His-Gln-Arg-Val como se expone en la SEQ ID NO: 8 y teniendo una actividad seleccionada del grupo que consiste en a) disminuir los niveles de glucosa en sangre; b) aumentar la secreción y/o sensibilidad a la insulina; c) unirse a células secretoras de insulina; y d) promover la supervivencia de células secretoras de insulina, y en donde los análogos de dichos fragmentos son fragmentos que varían de la secuencia del fragmento de UAG natural por sustituciones conservativas de aminoácidos.

Description

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Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Hentikoff y Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919 (1992);

Penalización por hueco: 12; Penalización por longitud de hueco: 4.

Un programa útil con estos parámetros está disponible al público como el programa de “hueco” de Genetics Computer Group, Madison, Wis. Los parámetros mencionados anteriormente son los parámetros por defecto para comparaciones de secuencias de aminoácidos (junto con sin penalización por huecos finales).

Los polipéptidos de la invención se pueden preparar en cualquier manera adecuada como se conoce en la técnica. Dichos polipéptidos incluyen polipéptidos de origen natural aislados, polipéptidos producidos de manera recombinante, polipéptidos producidos de manera sintética, o polipéptidos producidos por una combinación de estos métodos. Los medios y métodos para preparar dichos polipéptidos son bien conocidos en la técnica.

Ciertos aspectos de la invención usan polinucleótidos de UAG. Estos incluyen polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos UAG, fragmentos y análogos definidos en la solicitud.

Como se usa en la presente memoria, el término “polinucleótido” se refiere a una molécula que comprende una pluralidad de deoxiribonucleótidos o subunidades de nucleósido. El enlace entre las subunidades de nucleósido se puede proporcionar mediante fosfatos, fosfonatos, fosforamidatos, fosforotioatos, o similares, o mediante grupos no fosfato como se conoce en la técnica, tal como enlaces tipo peptoide utilizados en ácidos péptidonucleicos (PNA). Los grupos de unión pueden ser quirales o aquirales. Los oligonucleótidos o polinucleótidos pueden variar de longitud en 2 subunidades de nucleósido a cientos o miles de subunidades de nucleósido. Aunque los oligonucleótidos son preferiblemente de 5 a 100 subunidades de longitud, y más preferiblemente, de 5 a 60 subunidades de longitud, la longitud del polinucleótido puede ser mucho mayor (por ejemplo, hasta 100). El polinucleótido puede ser cualquiera de ADN y ARN. El ADN puede estar en cualquier forma de ADN genómico, una genoteca de ADN genómico, ADNc derivado de una célula o tejido, y ADN sintético. Además, la presente invención puede, en ciertos aspectos, usar vectores que incluyen bacteriófago, plásmido, cósmido, o fagemido.

Efecto en la supervivencia de fragmentos de UAG y sus análogos

En un aspecto de la invención, se investigaron los efectos proliferativos y antiapoptóticos de fragmentos de UAG y sus análogos frente a la UAG en la línea celular  INS-1E, línea celular  HIT-T15 así como en islotes pancreáticos humanas.

Los fragmentos de UAG y sus análogos que estimulan la proliferación y/o inhiben la apoptosis en estas líneas celulares tendrán también otras propiedades metabólicas de la UAG incluyendo, pero sin limitarse a, disminución de niveles de glucosa en sangre, mejora de la sensibilidad a la insulina, disminución de niveles de cortisol, mejora del perfil de lípido en seres humanos, y de esta manera, tendrán el uso potencial para tratar trastornos metabólicos asociados, por ejemplo, con la resistencia a la insulina, deficiencia de insulina, dislipidemia o exceso de cortisol.

En un aspecto de la invención, se analizaron los efectos en la supervivencia de algunos fragmentos de UAG humanos citados en la tabla 1 a continuación:

Tabla 1

Nombre: SEQ ID NO: Secuencia

UAG (1-14): 2 Gly-Ser-Ser-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-Gln

UAG (1-18): 3 Gly-Ser-Ser-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-Gln-Arg-Lys-Glu-Ser

UAG (1-5): 4 Gly-Ser-Ser-Phe-Leu

UAG (17-28): 5 Glu-Ser-Lys-Lys-Pro-Pro-Ala-Lys-Leu-Gln-Pro-Arg

UAG (6-13): 6 Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln

UAG (8-13): 7 Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln

UAG (8-12): 8 Glu-His-Gln-Arg-Val

UAG (8-11): 10 Glu-His-Gln-Arg

UAG (9-12): 11 His-Gln-Arg-Val

UAG (9-11): - His-Gln-Arg

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También se analizaron fragmentos UAG citados en la tabla 2 a continuación: Tabla 2

Nombre: SEQ ID NO: Secuencia (Restos de aminoácido de 6 a 13 de SEQ ID NO: 1)

(Asp) 8 UAG (6-13)NH2: 12 Ser-Pro-Asp-His-Gln-Arg-Val-Gln-NH2

(Lys) 11 UAG (6-13)NH2: 13 Ser-Pro-Glu-His-Gln-Lys-Val-Gln-NH2

(Gly) 6 UAG (6-13)NH2: 14 Gly-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-NH2

(Ala) 6 UAG (6-13)NH2: 15 Ala-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-NH2

(Ala) 7 UAG (6-13)NH2: 16 Ser-Ala-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-NH2

(Ala) 8 UAG (6-13)NH2: 17 Ser-Pro-Ala-His-Gln-Arg-Val-Gln-NH2

(Ala) 9 UAG (6-13)NH2: 18 Ser-Pro-Glu-Ala-Gln-Arg-Val-Gln-NH2

(Ala) 10 UAG (6-13)NH2: 19 Ser-Pro-Glu-His-Ala-Arg-Val-Gln-NH2

(Ala) 11 UAG (6-13)NH2: 20 Ser-Pro-Glu-His-Gln-Ala-Val-Gln-NH2

(Ala) 12 UAG (6-13)NH2: 21 Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Ala-Gln-NH2

(Ala) 13 UAG (6-13)NH2: 22 Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Ala-NH2

(Acetil-Ser)6 UAG (6-13)NH2: 23 Ac-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-NH2

(Acetil-Ser)6, (DPro) 7 UAG (6-13)NH2: 24 Ac-Ser-pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-NH2

Ciclo (6-13) UAG: 25 Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln (cicl)

Ciclo (8,11), Lys 11, UAG (6-13)amida: 26 Ser-Pro-Glu-His-Gln-Lys-Val-Gln-amida

Ciclo (8,11), Acetil-Ser6, Lys 11, UAG (6-13)amida: 27 Ac-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Lys-Val-Gln (cicl)

Acetil-Ser6, Lys 11, UAG (6-13)NH2: 28 Ac-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Lys-Val-Gln-NH2

5 La UAG (1-14) y UAG (1-18) aumentaban potencialmente la supervivencia celular tanto de células  INS-1E como de células  HIT-T15 en condiciones exentas de suero y después del tratamiento con citoquinas (figuras 1-2 para células INS-1E, figuras 3A, 3B, 4A y 4B para células  HIT-T15). Estos efectos eran similares a los presentados por la molécula de UAG de longitud completa (1-28). La UAG (1-14) parecía aún más fuerte que la UAG natural como una protección contra la apoptosis inducida por citoquinas en células INS-1E. La UAG (1-5) y UAG (17-28) ejercían

10 solamente un efecto trivial en células INS-1E (figuras 1-2) y un efecto muy pequeño en células HIT-T15 (figuras 4A y 4B). Sorprendentemente, los fragmentos cortos UAG (6-13), UAG (8-13) y UAG (8-12) eran todos muy eficaces en el aumento de la supervivencia en la apoptosis inducida por citoquinas en células HIT-T15 (figura 5A). Realmente, los péptidos UAG (8-12) y UAG (8-13) eran al menos tan potentes como la UAG (1-14), mientras que el péptido UAG (613) era claramente superior. La UAG (1-5) y UAG (17-28) eran solamente mínimamente eficaces.

15 Se mostró que la UAG (6-13), UAG (8-12) y UAG (8-13) ejercían el efecto antiapoptótico más fuerte en células  HIT-T15 tratadas con citoquinas (figuras 6A, 6B y 6C).

Los datos presentados en la presente memoria demuestran que los fragmentos de UAG aumentan potencialmente la supervivencia celular y previenen la muerte celular en líneas celulares  con potencias muy comparables a aquellas de la propia UAG de longitud completa o mejores. La UAG (1-14) presentaba una potencia equivalente, si no mejor

20 que la propia UAG de longitud completa, mientras que el fragmento (8-12), un péptido de 5 aminoácidos, retenía toda la actividad biológica y la UAG (6-13) era incluso más potente.

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sustitución de un aminoácido ácido por otro resto ácido preserva la actividad biológica de la UAG (6-13). (Lys)11 UAG (6-13) donde la R (Arg) se sustituye por K (Lys), también es tan activo como la UAG (6-13), que ilustra el hecho de que una sustitución de un aminoácido básico por otro resto básico preserva la actividad biológica de la UAG (613). (Gly)6 UAG (6-13) donde la S (ser) se sustituye por G (Gly), es también tan activo como la UAG (6-13), que ilustra que una sustitución basada en tamaño preserva la actividad biológica de la UAG (6-13). En general, estos análogos de UAG (6-13) demuestran que las sustituciones conservadoras preservan la actividad biológica de la UAG (6-13).

Además, la acetilación de la Ser en la posición 6 (N-terminal) de la UAG (6-13) preserva la actividad biológica de la UAG (6-13) y una combinación de acetilación N-terminal y la sustitución de, por ejemplo, Pro7 por D-Pro (su forma D) produce un análogo que también presenta actividad biológica. Por lo tanto, las estrategias que se dirigen a la estabilización del extremo N de la UAG (6-13) para mejorar su resistencia a la degradación por ejemplo, por exopeptidasas y endopeptidasas (tales como, pero son limitarse a, DPP IV) producen péptidos que aún presentan actividad biológica de UAG (6-13), haciéndolos útiles para usos in vivo.

Los péptidos de la presente invención, incluyendo sus análogos, se pueden producir en células hospedantes diseñadas genéticamente de acuerdo con técnicas convencionales. Las células hospedantes adecuadas son aquellos tipos de células que se pueden transformar o transfectar con ADN exógeno y crecen en cultivo, e incluyen bacterias, células fúngicas, y células eucariotas superiores cultivadas. Se prefieren células eucariotas, particularmente células cultivadas de organismos multicelulares. Las técnicas de manipulación de moléculas de ADN clonado e introducción de ADN exógeno en una variedad de células hospedantes se describen al menos por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, y Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY., 1987.

En general, una secuencia de ADN que codifica el polipéptido de la presente invención se une operativamente a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, incluyendo en general un promotor de la transcripción y terminador dentro de un vector de expresión. El vector también contendrá habitualmente uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque los expertos en la técnica reconocerán que dentro de ciertos sistemas se pueden proporcionar marcadores seleccionables en vectores separados, y la replicación del ADN exógeno se puede proporcionar por integración en el genoma celular hospedante. La selección de promotores, terminadores, marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es una materia de diseño rutinario de la experiencia ordinaria en la técnica. Muchos de estos elementos se describen en la bibliografía y están disponibles a través de proveedores comerciales.

Para dirigir un polipéptido a la ruta secretora de una célula hospedante, se puede proporcionar una secuencia señal secretora (también conocida como una secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre) en el vector de expresión. La secuencia señal secretora se une a la secuencia de ADN en el marco de lectura correcto. Las secuencias señal secretoras se colocan habitualmente en 5’ de la secuencia de ADN que codifica el propéptido de interés, aunque algunas secuencias señal se pueden colocar en otra parte en la secuencia de ADN de interés (véase, por ejemplo, Welch et al., patente de EE.UU. Nº 5.037.743; Holland et al., patente de EE.UU. Nº 5.143.830). Los métodos para producir y/o fabricar el polipéptido de la invención se conocen bien y practican en la técnica.

Los péptidos de la invención se pueden sintetizar mediante síntesis en fase sólida. La síntesis en fase sólida es un método común para la síntesis de péptidos. Básicamente, en esta técnica, se unen moléculas en una perla y se sintetizan etapa por etapa en una solución de reaccionante; en comparación con la síntesis normal en un estado líquido, es más fácil retirar el reaccionante en exceso o producto secundario del producto. En este método, las unidades estructurales se protegen en todos los grupos funcionales reactivos. Los dos grupos funcionales que pueden participar en la reacción deseada entre unidades estructurales en la solución y en la perla se pueden controlar por el orden de desprotección.

En el método básico de la síntesis en fase sólida, se usan unidades estructurales que tienen dos grupos funcionales. Uno de los grupos funcionales de la unidad estructural normalmente se protege con un grupo protector. El material de partida es una perla que se une a la unidad estructural. En primer lugar, esta perla se añade a la solución de la unidad estructural protegida y se agita. Después de completarse la reacción entre la perla y la unidad estructural protegida, se separa la solución y la perla se lava. Después se elimina el grupo protector y las etapas anteriores se repiten. Después de terminar todas las etapas, el compuesto sintetizado se escinde de la perla.

Si se sintetiza un compuesto que contiene más de dos tipos de unidades estructurales, se añade una etapa antes de la desprotección de la unidad estructural unida a la perla; debe protegerse un grupo funcional que está en la perla y no reacciona con una unidad estructural añadida, mediante otro grupo protector que no se elimina en las condiciones de desprotección de la unidad estructural. Los productos secundarios que carecen de la unidad estructural de esta etapa solamente se evitan por esta etapa. Además, esta etapa hace más fácil la purificación del compuesto sintetizado después de la escisión de la perla.

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Además de estas propiedades, los fragmentos de grelina no acilada y sus análogos pueden estimular la proliferación y la supervivencia, así como inhibir la muerte de células secretoras de insulina tales como, células- pancreáticas.

Por lo tanto, la invención proporciona un potencial terapéutico de fragmentos de grelina no acilada y sus análogos en el tratamiento de, por ejemplo, diabetes, otras afecciones médicas relacionadas con el metabolismo alterado de la glucosa o insulina, deficiencias o resistencia a la insulina, dislipidemia, obesidad, el síndrome metabólico y el tratamiento de células secretoras de insulina tales como células- pancreáticas.

Es un aspecto adicional, la invención proporciona cualquier composición farmacéutica que incorpora al menos uno de los péptidos de la invención, que comparte la misma indicación terapéutica potencial que la propia UAG.

Los péptidos de la presente invención se pueden usar para, y se pueden incorporar en las formulaciones farmacéuticas para usarse en la prevención, reducción y/o tratamiento de, por ejemplo, pero sin limitación, trastornos

o afecciones médicas asociadas con el metabolismo alterado de glucosa, metabolismo alterado de insulina, metabolismo alterado de lípidos, diabetes de tipo I, diabetes de tipo II, obesidad, dislipidemia, aterosclerosis, enfermedades cardiovasculares, trastornos del síndrome metabólico asociados con proliferación alterada de células secretoras de insulina o con resistencia a insulina.

Para usos terapéuticos y/o farmacéuticos, los péptidos de la invención se pueden formular para, pero sin limitación, suministro intravenoso, subcutáneo, transdérmico, oral, bucal, sublingual, nasal, inhalación, pulmonar, o parenteral de acuerdo con métodos convencionales. La inyección intravenosa puede ser por medio de bolo o infusión durante un periodo de tiempo convencional. Los péptidos de la invención también pueden ser compatibles con el sistema de suministro de fármacos tal como, pero sin limitación, formulaciones de depósito basadas en polímero.

Los ingredientes activos para ser administrados por vía oral como una suspensión se pueden preparar de acuerdo con técnicas bien conocidas en la técnica de la formulación farmacéutica y pueden contener, pero sin limitación, celulosa microcristalina para impartir volumen, ácido algínico o alginato de sodio como un agente de suspensión, metilcelulosa como un potenciador de la viscosidad, y agentes edulcorantes/saborizantes. Como comprimidos de liberación inmediata, estas composiciones pueden contener, pero sin limitación, celulosa microcristalina, fosfato dicálcico, almidón, estearato de magnesio y lactosa y/u otros excipientes, aglutinantes, extensores, disgregantes, diluyentes y lubricantes.

Las formulaciones administradas por aerosol nasal o inhalación se pueden preparar, como soluciones en solución salina, usando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de absorción para potenciar la biodisponibilidad, usando fluorocarbonos, y/o usando otros agentes de solubilización o dispersión.

Los péptidos de la invención se pueden administrar en forma intravenosa (tanto en bolo como infusión), intraperitoneal, subcutánea, tópica con o sin oclusión, o forma intramuscular. Cuando se administra por inyección, la solución o suspensión inyectable se puede formular usando diluyentes o disolventes adecuados aceptables por vía parenteral, no tóxicos, bien conocidos en la técnica.

En general, las composiciones farmacéuticas comprenderán al menos uno de los péptidos de la invención junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable que será bien conocido por los expertos en la técnica. Las composiciones pueden comprender adicionalmente, por ejemplo, uno o más excipientes, diluyentes, cargas, solubilizantes, conservantes, sales, agentes de tamponamiento y otros materiales adecuados bien conocidos en la técnica dependiendo de la forma farmacéutica usada. Los métodos de la composición se conocen bien en la técnica.

En el presente contexto, la expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” pretende indicar cualquier material, que es inerte en el sentido de que no tiene sustancialmente ningún efecto terapéutico y/o profiláctico por sí mismo. Un excipiente farmacéuticamente aceptable se puede añadir a los péptidos de la invención con el propósito de permitir la obtención de una composición farmacéutica, que tiene propiedades técnicas aceptables.

Los intervalos de dosis terapéutica de la invención generalmente variarán de aproximadamente 0,01 g/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Las dosis terapéuticas que están fuera de este intervalo pero que tienen los efectos terapéuticos deseados también están abarcadas por la presente invención.

Los regímenes de dosificación adecuados preferiblemente se determinan considerando factores bien conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse, el tipo de sujeto al que se administra; edad, peso, sexo y afección médica del sujeto, la ruta de administración; la función renal y hepática del sujeto; el efecto deseado; y el compuesto particular usado.

Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de los péptidos de la invención (también denominados en la presente memoria “compuesto activo”) es una cantidad suficiente para producir un cambio clínicamente significativo en la disminución de los niveles de glucosa en sangre, mejorando la sensibilidad a la insulina y/o secreción, reduciendo los niveles de ácidos grasos libres en la sangre, disminuyendo el peso de grasa corporal, disminuyendo los niveles de cortisol y/o aumentando la supervivencia de células secretoras de insulina, entre otros cambios. Las pruebas para medir dichos parámetros son conocidas para los expertos en la técnica.

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Los péptidos de la invención se pueden proporcionar en un kit. Dicho kit típicamente comprende un compuesto activo en una forma farmacéutica para la administración. Una forma farmacéutica comprende una cantidad suficiente de compuesto activo de tal manera que se puede obtener un efecto deseable. Preferiblemente, un kit comprende instrucciones indicando el uso de la forma farmacéutica para lograr el efecto deseado y la cantidad de forma farmacéutica que debe tomarse durante un periodo de tiempo especificado.

Experimentos y análisis de datos

Los fragmentos de UAG promueven la supervivencia de células- INS-1E

La supervivencia de células se valoró por el ensayo de MTT en células- INS-1E de rata incubadas con UAG humana de longitud completa (1-28) o UAG (1-14), UAG (1-18), UAG (1-5) y UAG (17-28) en medio desprovisto de suero, ya sea solo o con IFN/TNF-/IL-1, cuya sinergia se ha mostrado que está implicada en la muerte de células  en la diabetes de tipo 1 y tipo 2 (Ref. 16). Los péptidos se ensayaron en concentraciones crecientes, que variaban de 0,1 nM a 100 nM. En condiciones exentas de suero, las UAG (1-14) y (1-18) mostraron un efecto de supervivencia significativo, comparable al de la UAG (1-28). En las mismas condiciones, las UAG (1-5) y (17-28) presentaron una acción reducida, aunque significativa, de supervivencia (figura 1). En presencia de citoquinas, todos los péptidos aumentaron significativamente la supervivencia celular en cada concentración ensayada (figura 2). Sin embargo, de forma similar a las condiciones exentas de suero, la UAG (1-5) y UAG (17-28) presentaron un efecto reducido. De manera interesante, la UAG (1-14) y también la UAG (1-18) mostraron que eran más potentes que la UAG de longitud completa (1-28) (figura 2). Estos resultados indican que los fragmentos UAG, en particular UAG (114) y (1-18), de forma similar a la UAG de longitud completa (1-28), son capaces de contrarrestar la muerte de células- inducida por privación de suero o tratamiento con citoquinas.

Los fragmentos de UAG promueven la supervivencia de célula- HIT-T15

También se llevaron a cabo experimentos de MTT en células- HIT-T15 de hámster, para analizar el efecto en la supervivencia de la UAG (1-28) o sus fragmentos UAG (1-14), UAG (1-18), UAG (1-5) y UAG (17-28) en medio desprovisto de suero, ya sea solo o con IFN/TNF-/IL-1. Como para los experimentos realizados en células- INS1E, los péptidos se ensayaron en concentraciones crecientes, que variaban de 0,1 nM a 100 nM. Con respecto a INS-1E, en células HIT-T15, los péptidos presentaban diferentes efectos protectores contra la muerte celular inducida por privación de suero y por citoquinas. Realmente, mientras que la UAG (1-14) y UAG (1-18) aumentaban significativamente la viabilidad celular en ambas condiciones experimentales (figuras 3A y 3B), la UAG (1-5) aumentaba ligeramente la supervivencia celular solo en células tratadas con citoquinas, mientras que la UAG (1728) no tenía efecto significativo, en cualesquiera condiciones examinadas (figuras 4A y 4B).

El efecto en la supervivencia de la UAG (6-13), UAG (8-13), UAG (8-12), UAG (8-11), UAG (9-12), y UAG (9-11) se valoró en células- HIT-T15 tratadas con citoquinas. Como se esperaba, las citoquinas (IFN/TNF-/IL-1) reducían fuertemente la supervivencia celular con respecto a condiciones de cultivo normal (medio que contiene suero). La UAG (6-13), en todas las concentraciones ensayadas (1 nM a 100 nM) y particularmente 100 nM, inhibía potentemente la muerte celular inducida por citoquinas aumentando la supervivencia celular hasta valores similares a o aún mayores a los observados en presencia de suero. De manera interesante, el efecto en la supervivencia de la UAG (6-13) era comparable a aquel de la UAG (1-28) de longitud completa (figura 5A).

Bajo las mismas condiciones experimentales, la UAG (8-13), aunque menos que la UAG (6-13), mostraba un efecto protector significativo en todas las concentraciones examinadas, mientras que la UAG (8-12) presentaba una protección significativa, aunque reducida, solo con 10 nM y 100 nM. Los efectos protectores de los péptidos UAG (813) y UAG (8-12) se encontraron similares a los de UAG (1-14) y UAG (1-18). Un péptido hecho de la secuencia inversa de UAG (1-14) y denominado UAG (14-1), se usó como control negativo para estos experimentos (figura 5A). Con respecto a la UAG (8-11), UAG (9-12) y UAG (9-11) (figura 5B), los resultados de MTT indicaban que la UAG (8-11) ejercía un efecto significativo en la supervivencia solo con 100 nM y la UAG (9-12) aumentaba significativamente la supervivencia celular en ambas concentraciones analizadas (1 y 100 nM). Sin embargo, estos efectos eran más bajos, a los de la UAG (6-13) (figura 5B). La UAG (9-11) no tenía un efecto significativo en ambas concentraciones ensayadas (figura 5B).

Los fragmentos de UAG ejercen efectos antiapoptóticos en células- HIT-T15

Se cultivaron células- HIT-T15 durante 24 horas en medio exento de suero, ya sea solo o con IFN/TNF-/IL-1. En ambas líneas celulares, la apoptosis aumentaba con el tratamiento con citoquinas, con respecto a la privación de suero solamente. La UAG (6-13) aumentaba el número de células, inducía agrandamiento celular y formación de islotes pequeños, con respecto a las condiciones con citoquinas (datos no mostrados). Además, reducía significativamente la apoptosis inducida por citoquinas en la concentración de 1 nM, 10 nM y, particularmente, 100 nM donde el efecto antiapoptótico era aún más fuerte que el presentado por la UAG (1-28) (figura 6A). La UAG (813), aunque menos que la UAG (6-13), inhibía significativamente la apoptosis con 10 y 100 nM, mientras que la UAG (8-12) mostraba algún efecto protector solo con 100 nM (figuras 6B y 6C, respectivamente). La UAG (14-1), la secuencia inversa de la UAG (1-14), se usó como control negativo, mientras que la UAG (1-28), se usó como control

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positivo en cada experimento. Estos resultados indican que, similarmente a los resultados obtenidos para la supervivencia celular, con respecto a la UAG (8-13) y UAG (8-12), la UAG (6-13) ejerce el efecto antiapoptótico más fuerte en las células- HIT-T15 tratadas con citoquinas.

Efecto en la supervivencia de fragmentos de UAG en islotes pancreáticos humanos

El efecto en la supervivencia de la UAG (1-14), UAG (1-18), UAG (1-5) y UAG (17-28), con respecto al de la UAG (128) de longitud completa, se valoró en islotes pancreáticos humanos por MTT. Los péptidos se analizaron en células de islote cultivadas en medio desprovisto de suero, ya sea solo o con IFN/TNF-/IL-1 (5 ng/ml cada una). La UAG (1-14) aumentaba significativamente la supervivencia celular en medio desprovisto de suero con 10 nM y 100 nM, mientras que en presencia de citoquinas prevenía la muerte celular con 100 nM (figura 7A). La UAG (1-18) aumentaba significativamente la supervivencia celular con 1 nM y 10 nM (figura 7A). La UAG (1-5) presentaba poca acción de supervivencia, aunque significativa, con 10 nM en medio desprovisto de suero, pero no mostraba protección celular después de la adición de citoquinas, en cualquiera de las concentraciones ensayadas (de 1 nM a 100 nM) (figura 7B). La UAG (17-28) aumentaba significativamente la supervivencia de células de islotes cultivadas en condiciones desprovistas de suero, con 10 nM y 100 nM, pero no tenía efecto en presencia de citoquinas (figura 7B). En todos, estos resultados indican que en los islotes humanos, la UAG (1-14) y UAG (1-18) ejercen efectos protectores en condiciones exentas de suero que son similares a las presentadas por la UAG (1-28), mientras que su capacidad de supervivencia se pierde al menos parcialmente en células tratadas con citoquinas donde el efecto de la UAG (1-28) es todavía evidente.

Efecto de fragmentos de UAG en la secreción de insulina en islotes pancreáticos humanos

Se investigaron los efectos de la UAG (1-14) y UAG (1-18), ambos usados en concentración 100 nM, en la secreción de insulina en islotes humanos. La figura 8A muestra que la UAG (1-14), de forma similar a la UAG (1-28) (figura 8C) y a la exendina-4 (figura 8D), aumentaba significativamente la secreción de insulina tanto en ausencia como en presencia de glucosa (de 2 a 25 mM), mientras que la UAG (1-18) mostraba un efecto significativo con glucosa 7,5 mM (figura 8B). Se usaron la UAG (1-28) y la exendina-4 como controles positivos (figuras 8C y 8D). Estos resultados indican que en islotes pancreáticos humanos la UAG (1-14) y UAG (1-18) estimulan la secreción de insulina inducida por glucosa.

Efecto in vivo del fragmento UAG en animales tratados con estreptozotocina (STZ)

Se conoce bien que el tratamiento con estreptozotocina (STZ) en ratas recién nacidos causa diabetes (Refs. 24, 25, 26). En la presente memoria, se investigaron los efectos a largo plazo de la UAG (6-13) (una semana de tratamiento seguido por administración de STZ, valoración a los 70 días después de la administración de STZ frente a los de UAG en ratas recién nacidas tratadas con STZ el día 1 de nacimiento). La UAG (6-13) se ensayó en una concentración que era igual (30 nmol/l) o mayor (100 nmol/l) que la de la UAG. De manera interesante, el día 9 después de la inyección con STZ, la tasa de supervivencia del animal, que había disminuido por la STZ con respecto al grupo de control ( 52%), aumentó mucho por la UAG ( 72%), y por ambas concentraciones de UAG (6-13) ( 71% y 89% para 30 nmol/l y 100 nmol/l, respectivamente) (figura 9A). El día 70, la glucosa plasmática aumentó significativamente en 150% (p<0,01) en el grupo de STZ con respecto al control. La UAG, como se esperaba, contrarrestaba el efecto de la STZ al reducir los niveles de glucosa (en  21%). Se obtuvo un efecto similar con UAG (6-13) tanto 30 nmol/l como 100 nmol/l (reducción de 31% y 14%, respectivamente frente al grupo de STZ). De manera interesante, la UAG (6-13) en una concentración igual mostraba un efecto que era más fuerte que el de la UAG (figura 9B). Los animales tratados con STZ mostraron una reducción significativa de niveles de insulina plasmática; la UAG, así como la UAG (6-13), en ambas concentraciones, reducían significativamente este efecto aumentando los niveles de insulina en ratas tratadas con STZ (figura 9C). Se obtuvieron resultados similares con respecto a la secreción de insulina pancreática (figura 9D). Estos resultados indican que el día 70 después del tratamiento con STZ, la UAG (6-13), de forma similar o aún más que la UAG, es capaz de reducir el aumento de glucosa plasmática inducido por la STZ y mejorar los niveles de insulina tanto plasmática como pancreática.

Los fragmentos de UAG modulan los niveles de glucosa plasmática, la sensibilidad a la insulina así como el peso de grasa gonadal in vivo en un modelo genético de diabetes asociado con obesidad y resistencia a la insulina, los ratones ob/ob.

Se recogieron muestras de plasma basal de la vena de la cola de ratones ob/ob con alimentación libre y de 16 horas en ayunas, 7 y 6 días antes del implante de la bomba en tubos capilares recubiertos con K2EDTA (Microvette CB300 K2E; Sarstedt, Alemania). Después los animales se separaron en tres grupos con intervalos de peso aproximadamente equivalentes. Se anestesiaron ratones de 10 semanas de edad, y se insertó una bomba Alzet 1004 cargada, suministro porta primero, en la cavidad peritoneal. Las capas musculoperitoneales y de piel después se cerraron usando suturas interrumpidas (sutura absorbible Vicryl 5,0 FS-2). Los animales recibieron bombas que contenían solución salina, UAG 10 mg/ml, o UAG (6-13) 3,5 mg/ml (n=8 por grupo). Las bombas Alzet 1004 suministran 12 l/día, e infunden 30 g de hUAG/animal/día (600 g/kg/día) y 10 g de UAG (6-13)/animal/día (200 g/kg/día).

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UAG (6-13) (30 nmol/kg s.c., dos veces al día) durante 7 días (del día 2 al 8) después del nacimiento; 5) el grupo de STZ + UAG (6-13), que recibía una sola inyección i.p. de STZ seguido de inyecciones de UAG (6-13), (100 nmol/kg s.c., dos veces al día) durante 7 días (del día 2 al 8) después del nacimiento. Se asignaron madres aleatoriamente a los cinco grupos y las crías de la misma camada se asignaron al mismo grupo. Los números de madres en cada uno de los cuatro grupos eran 11 (control), 11 (STZ), 16 (STZ+UAG), y 21 (STZ + UAG (6-13), 30 nmol/kg) y 15 (STZ + UAG (6-13), 100 nmol/kg). Se dejó a las crías con sus madres. Se ensayó en todos los recién nacidos el día 2 la glicosuria usando Accu-chek Compact Plus (Roche). Solamente aquellos animales que eran glicosúricos el día 2 después del nacimiento se incluyeron en el grupo del modelo de STZ. Los tratamientos con UAG y UAG (6-13) se iniciaron después de confirmar la glicosuria. Los animales se sacrificaron el día 70 después del nacimiento por decapitación. Se recogieron muestras de sangre después de la decapitación e inmediatamente se centrifugaron a

20.000 x g durante 2 minutos a 4°C, y se almacenaron a -20°C hasta que se ensayaron.

Para los datos experimentales ilustrados en las figuras 14A, 14B, 15 y 16, los animales se obtuvieron de Charles River Laboratories (Maastricht, Países Bajos). Los animales (B6. V-Lepob/J, Charles River Laboratories, Colonia de Bélgica) se recibieron en las instalaciones de animales de los autores de la invención, con 8 semanas de edad, y se aclimataron en jaulas individuales durante 2 semanas antes de empezar los tratamientos. Se mantuvieron en condiciones estándar de luz:oscuridad de 12:12 horas, 21°C, y se permitió libre acceso al alimento y agua. Los animales también se manipularon diariamente para que se acostumbraran al método usado para recoger sangre. Los péptidos se disolvieron en solución salina estéril no pirogénica al 0,9% (Baxter BV, Utrecht, Países Bajos). La Dglucosa se obtuvo de Sigma-Aldrich Chemie BV (Zwijndrecht, Países Bajos), y se disolvió a 400 mg/ml en solución salina al 0,9%. Las bombas Alzet (modelo 1004) se obtuvieron de Charles River Laboratories (Maastricht, Países bajos). Las bombas se llenaron con solución salina al 0,9%, UAG o UAG (6-13) en condiciones estériles, y se preincubaron en solución salina al 0,9% durante al menos 48 horas a 37°C para iniciar el flujo. Los niveles de glucosa en sangre se midieron directamente de las incisiones de la vena de la cola usando un mini-glucómetro Feestyle y tiras de prueba (ART05214 Rev. A; Abbot, Amersfoort, Países Bajos). Los niveles de insulina plasmática se ensayaron mediante ELISA ultrasensible para insulina de ratón (nº de Catálogo 10-1150-10; Mercodia, Suecia).

Extracción del páncreas y tratamiento – Después de la escisión, los páncreas se extrajeron y pesaron. Para la determinación del contenido de insulina, los páncreas (35-50 mg) se homogenizaron y centrifugaron en 5 ml de ácido-etanol (HCl 0,15 mol/l en etanol al 75% [vol/vol] en 1000 g durante 20 min; los líquidos sobrenadantes se almacenaron a -80°C.

Para la inmunohistoquímica, páncreas adicionales se fijaron en paraformaldehído fijador al 4% durante 24 horas y se introdujeron en parafina.

Técnicas analíticas – Los niveles de glucosa plasmática se determinaron usando un analizador de glucosa. La insulina se midió del páncreas o del plasma con RIA como se ha descrito previamente (ref. 15).

Ensayo de unión – Las membranas de células- pancreáticas HIT-T15 de hámster y INS-1E de rata se prepararon y se ensayaron la presencia de unión [125I-Tyr4]-UAG. La capacidad de los fragmentos de UAG para competir con el radioligando por dichos sitios de unión se ha evaluado como se ha descrito previamente (Ref. 4). Los datos se presentan como la media  S.E.M. de los tres experimentos independientes.

Análisis estadísticos – Los resultados se expresan como media  SE. Los análisis estadísticos se realizaron usando una prueba T de Student o ANOVA de una vía. Se estableció significancia cuando p < 0,05.

Se entiende que los datos descritos en la presente memoria descriptiva únicamente se dan para ilustrar la invención y no se deben considerar como que constituyen una limitación de la misma.

Aunque la invención se ha descrito junto con las realizaciones específicas de la misma, se entenderá que se pueden hacer modificaciones adicionales y se pretende que esta solicitud cubra cualquier variación, uso, o adaptación de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo dichas desviaciones de la presente descripción como vienen dentro de la práctica conocida o común de la técnica a la cual la invención pertenece y como se pueden aplicar a las características esenciales expuestas antes, y como sigue en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Todos los documentos publicados mencionados en la memoria descriptiva anterior se incorporan en la presente memoria por referencia.

Referencias

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Claims

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