JP4523812B2 - 胚性幹細胞の培養用基材及びその用途 - Google Patents
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Description
ES細胞:胚性幹細胞(embryonic stem cell)
ESM:ES培地(ES medium)
FGF4:繊維芽細胞増殖因子4(fibroblast growth factor 4)
GAG:グリコサミノグリカン
GFP:緑色蛍光タンパク質(green fluorescent protein)
HA:ヒアルロン酸(hyaluronic acid)
HCM:肝細胞培養培地(hepatocyte culture medium)
HGF:肝細胞増殖因子(hepatocyte growth factor)
LIF:白血球阻害因子(leukocyte inhibitory factor)
OsM:オンコスタチンM(oncostatin M)
RA:レチノイン酸(retinoic acid)
臓器移植に頼らずに肝臓の機能を再生する方法として、細胞をベースにした方法が注目されている。特許文献1には、細胞と細胞増殖因子とからなる組織器官のインビボ再生のための材料が記載されている。特許文献2には、細胞増殖因子を含有するヒドロゲルからなる細胞移植療法用材料が記載されている。特許文献3には、HAからなり、実質的に化学的架橋剤又は化学的修飾剤によって改質されておらず、中性溶液に難溶性であるHAゲルを含有する細胞組織再生用基材が記載されている。特許文献4には、少なくとも1種類の糖鎖をスペーサー分子を介して側鎖として結合させた糖鎖高分子からなる細胞培養基材を、三次元形状に付形したことを特徴とする三次元細胞培養基材が記載されている。特許文献5には、軟骨と骨組織の組織工学及び筋骨格障害の修復のために生体適合性及び生分解性を有するマトリクスとして使用できる、HA誘導体及び加水分解コラーゲンとから形成される多孔質複合マトリクスが開示されている。
(1)1mm2当たりの孔の数が760個以上である。
(2)50%以上の孔の孔径が10〜50μmである。
<1>本発明基材
本発明基材は、スポンジ形態の架橋多糖を主成分とする、ES細胞の培養用基材である。この「多糖」は特に限定されないが、親水性が高く、細胞や生体組織に対して親和性を有するものが好ましい。好ましい多糖としては、GAG(HA、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸等)、ポリウロン酸(アルギン酸、ペクチン酸等)、マンナン、デンプン、寒天、アラビアゴム、トラガカントゴム、セルロース又はその親水性誘導体(カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等)、ポリアミノ多糖(キチン、キトサン等)が挙げられる。
また、光反応性残基の多糖に対する影響を極力低下させるために、スペーサーを介して多糖に光反応性残基が結合していることが好ましい。したがって、光架橋基としては、ケイ皮酸又は置換ケイ皮酸にスペーサーが結合した誘導体が最も好ましい。
<製造方法1>
(1)工程(A)
工程(A)は、光反応性多糖の溶液を凍結する工程である。調製する溶液中の光反応性多糖の濃度は、光反応性多糖における多糖の分子量と光架橋基の導入率との関係によって適宜選択されるが、通常0.1〜10重量%の範囲である。例えば、重量平均分子量40〜120万のHAに対して導入率1.0〜8.0%で光架橋基が導入されている場合は0.5〜6.0重量%が例示される。
(2)工程(B)
工程(B)は、工程(A)で得られた「凍結した光反応性多糖の溶液」に光を照射することにより、光反応性多糖を架橋して、スポンジ形状の架橋多糖を得る工程である。使用する使用する光架橋基に応じて照射する光線の種類を選択して行う。例えば、光架橋基としてケイ皮酸を使用した場合は、照射する光として紫外線を使用する。この場合、紫外線の波長は100〜400nmの範囲から選択するのが好ましい。
<製造方法2>
工程(C)は、光反応性多糖の溶液を凍結し、常法によって凍結乾燥する工程である。光反応性多糖溶液の凍結までは、前記製造方法1における工程(A)と共通である。
(1)工程(C)
工程(C)の凍結乾燥は、「凍結した光反応性多糖の溶液」から凍結した状態で溶媒を除去する処理であれば特に限定されず、冷却を行いながら凍結した光反応性多糖の溶液を減圧して溶媒を昇華させても良く、また常温で急激に減圧して溶媒を昇華させても良い。このような処理をすることで、凍結時に溶媒が存在した部分に空隙が生じ、スポンジ形態の架橋多糖が有する孔が、好ましい孔径で形成されることになる。この工程(C)を経ることで、光反応性多糖によって形成されるスポンジ形態の架橋多糖が得られることになる。このようなスポンジ形態の架橋多糖は、160x246μmの単位面積あたり、孔数が30個以上、好ましくは40個以上であり、その孔数のうちの50%以上、好ましくは60%以上、更に好ましくは70%以上の孔径が10〜50μmであるという特徴を有している。
(2)工程(D)
工程(D)は、工程(C)で得られる「光反応性多糖の溶液の凍結乾燥物」に光を照射することにより、光反応性多糖を架橋してスポンジ形態の架橋多糖を得る工程である。
(1)1mm2当たりの孔の数が760個以上である。なお、1mm2当たりの孔の数は1000個以上であることが好ましい。また、1mm2当たりの孔の数は4000個以下であることが好ましく、3000個以下であることがより好ましい。したがって、1mm2当たりの孔の数は760個以上4000個以下が好ましく、760個以上3000個以下が好ましく、1000個以上4000個以下が好ましく、1000個以上3000個以下がより好ましい。
(2)50%以上の孔の孔径が10〜50μmである。なお、60%以上の孔が10〜50μmの孔径を有していることが好ましく、70%以上の孔が10〜50μmの孔径を有していることがより好ましい。このようなスポンジの単位面積(1mm2)あたりの孔数や孔径は、得られたスポンジ形態の架橋多糖の電子顕微鏡写真などを用いて計測することができる。
<2>本発明培養方法
本発明培養方法は、本発明基材を用いてES細胞を培養することを特徴とする、ES細胞の培養方法である。本発明基材については前記の通りである。
ステップ1:「FGF4、aFGF及びHGF」の存在下で培養する。
ステップ2:「OsM」の存在下で培養する。
2〜3日間程度が好ましい。
<3>本発明誘導方法
本発明誘導方法は、本発明培養方法を用いてES細胞を培養するステップを少なくとも含む、ES細胞の分化誘導方法である。本発明培養方法によってES細胞を効率的に分化誘導させることができることから、これを分化誘導方法として応用したものである。
<4>本発明生産方法
本発明生産方法は、本発明培養方法を用いて胚性幹細胞を培養するステップを少なくとも含む、肝細胞の生産方法である。本発明培養方法によってES細胞を効率的に分化誘導(特に、肝細胞に分化誘導)させることができることから、これを肝細胞の生産方法として応用したものである。
<1>材料
以下に、本実施例で用いた材料を説明する。
<2>方法と結果
(1)HAスポンジとマウスES細胞を用いた実験
(1−1)成長因子の存在下での培養
HAスポンジ(サイズ:10mm x 10mm x 1mm)を培養シャーレ(24ウエルのプレート)の中央に置き、このシャーレにLIF(終濃度:100 単位/ml)及びRA(終濃度:
10-8 M)を含有するESM 1.0mlを添加した後、マウス由来のES細胞(株の名称:J1;以下、マウスES細胞という。)(細胞数:2 x 106)を添加して培養を開始した(培養条件:37℃、CO2濃度0.5%)。
(1−2)成長因子の非存在下での培養
培養開始から3日目の培地の置換において、成長因子(FGF4、aFGF及びHGF)を含有しないESMを用いた以外は前記(1−1)と同様にマウスES細胞を培養し、培地中のアルブミン濃度を測定した。
(2)コラーゲンスポンジを用いた実験
上記(1)におけるHAスポンジに代えてコラーゲンスポンジ(株式会社高研製)を用いて、同様に実験を行った。
(3)サルES細胞を用いた実験
前記(1)と同様にHAスポンジを培養シャーレの中央に置き、このシャーレにESM1.0mlを添加した後、サルES細胞(細胞数:2 x 106)を添加して培養を開始した(培養条件:37℃、CO2濃度0.5%)。
(4)マウスES細胞から分化した肝細胞の機能等の確認実験
(4−1)スフェロイドの形成
DNA断片(pALB-EGFP)を組み込んだマウスES細胞(GFP陽性細胞)を、前記と同様にHAスポンジに添加し、HCMを用いて培養を行った。
その結果、HAスポンジの網状の孔の中に、多くの細胞からなる球状組織体(スフェロイド)が形成された。組織化学的な分析により、これらのスフェロイドには20〜50個程度の肝細胞が含まれることが確認された。
(4−2)肝グルコースの産生
上記(4−1)と同様にHAスポンジを用いて培養したマウスES細胞(GFP陽性細胞
)について、培養開始後1日目の培養上清中のグルコースのレベルをグルコースオキシダーゼ法(J. Biol. Chem., 260, p12748-12753, 1985)で測定することにより、肝グルコースの産生量を調べた。
(4−3)アンモニアの解毒作用
前記(4−1)におけるHCMに代えて、2.5mM NH4Clを含有するDMEMを培地として用い、前記(4−1)と同様にHAスポンジを用いてマウスES細胞(GFP陽性細胞)を培養した。培養開始後0、6、12及び24時間目に、培養上清中のNH4Cl濃度を、アンモニア−テストワコー(和光純薬工業株式会社製)を用いて測定した。その結果培地中のNH4Cl濃度は時間とともに減少した。培地上清中の尿素の濃度を測定したところ、時間とともに増加した。
Claims (7)
- スポンジ形態の架橋ヒアルロン酸を主成分とする、胚性幹細胞の肝細胞への分化誘導用の培養用基材。
- スポンジ形態の架橋ヒアルロン酸が、以下の(1)及び(2)の性質を有することを特徴とする、請求項1に記載の基材。
(1)1mm 2 当たりの孔の数が760個以上である。
(2)50%以上の孔の孔径が10〜50μmである。 - 架橋ヒアルロン酸が、光反応性ヒアルロン酸を光照射によって架橋させて得られるものであることを特徴とする、請求項1又は2に記載の基材。
- 光反応性ヒアルロン酸が、ケイ皮酸、置換ケイ皮酸、フリルアクリル酸又はチオフェンアクリル酸を光反応性残基として有する光架橋基が結合したヒアルロン酸であることを特徴とする、請求項3に記載の基材。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の基材を用いて胚性幹細胞を培養するステップを少なくとも含む、胚性幹細胞の肝細胞への分化誘導方法。
- 培養が、増殖因子の存在下で行われることを特徴とする、請求項5に記載の分化誘導方法。
- 請求項5又は6に記載の分化誘導方法を用いて胚性幹細胞を分化誘導させるステップを少なくとも含む、肝細胞の生産方法。
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