CN101831006B - 一种新型含香豆素荧光基团透明质酸衍生物的制备方法 - Google Patents
一种新型含香豆素荧光基团透明质酸衍生物的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种新型含香豆素透明质酸衍生物的合成方法，该方法以4-甲基-7-羟基香豆素为起始原料经过醚化反应先生成7-甲氧基-4-甲基香豆素-1，2-环氧丙烷，然后将其与透明质酸钠经过醚化反应，制备含有香豆素结构单元的透明质酸衍生物；反应后的混合液装入透析袋内，透析时间为72h，然后用无水乙醇沉析、冷冻干燥得到目标产物。本发明的有益效果是：通过将香豆素荧光基团引入到难以检测的透明质酸上，在保留透明质酸的天然结构的同时，又赋予其荧光性能，为透明质酸在动物或人体内相应的药物代谢和药理等多方面的研究提供了实验基础。
Description
技术领域
本发明涉及于制备一种新型含香豆素透明质酸衍生物的方法，属于生物化学技术领域。
背景技术
透明质酸(hyaluronic acid，hyaluronan，HA)又名透明酸或玻璃酸是一种酸性黏多糖，最早是由美国Meyer(Meyer K，Palmer J W.The polysaccharide of the vitreous humor[J].J. Biol.Chem.1934，107：629-634.)等从牛眼玻璃体中分离出来。HA是由β-D-N-乙酰氨基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸为结构单元的以β-1，3和β-1，4-糖苷链交替连接而成的一种直链线型阴离子粘多糖。对不同组织来源的HA进行的结构测定表明，其结构均一致，没有种属差异，只存在相对分子量的不同，范围为105-107，双糖单位数为300-1100对。其结构如结构式1所示：
结构式1
HA广泛存在于动物和人体结缔组织细胞间质中，在眼玻璃体、皮肤、脐带、软骨和关节滑液中含量较高。HA因其高度的黏弹性、独特的保湿性、优良的生物相容性和可降解性，已被广泛应用于临床医学和高级化妆品。在医学领域，HA被广泛应用于关节疾病、眼科手术、预防术后粘连、治疗烫伤以及作为药物传递系统的媒介和药用辅料等。透明质酸及其衍生物作为药物载体，主要利用其良好的生物相容性和可降解性、高粘弹性以及与细胞表面特异受体专一性结合的能力，以达到药物增稠、药物缓释、促进药物透皮能力及靶向性的目的(李奇，王凤山等.中国药学杂志，2005，40(7)：485-488)。
天然HA具有诸多有点，但是对强酸、强碱、热、自由基及透明质酸酶敏感(Lapcik LJr，Lapcik L，De Smedt S，et al.Chemical Reviews，1998，98(8)：2663-2684)，容易发生降解，而限制其作为药物载体的应用。同时，透明质酸作为药物载体，因为透明质酸作为天然高分子在滑液中大量存在，作为药物载体的透明质酸在人体中传输机理与人体滑液中存在的天然透明质酸之间由于一定的相似性，很难区分，为了克服这些缺点，在保留透明质酸优良特性的前提下，有必要通过化学改性以提高其稳定性及其他性能，同时对透明质酸的活性部分进行适当的修饰，引入具有药物活性或非活性无毒的荧光基团，并利用荧光光谱等分析技术研究透明质酸荧光衍生物对药物的包覆作用和药物释放作用及作为药物载体的透明质酸荧光衍生物在模拟体液中的稳定性。
透明质酸可进行化学修饰的4个部位分别为羟基、N-乙酰基、羧基以及还原末端(胡帼颖，顾汉卿.透明质酸交联、酯化衍生物的制备及医学应用进展[J].透析与人工器官，2003，14(3)：30-46.)，其中末端修饰较少见。主要修饰方法有酯化、醚化(P. Mlcochova，V. Hajkova，B.Steiner.Preparation and characterization of biodegradable alkylether derivatives ofhyaluronan[J].Carbohydrate Polymers，2007，69：344-352.)、交联、接枝等。经过改性后形成的HA衍生物，可赋予新的特性。
对于我们提出的含香豆素透明质酸衍生物的合成未见文献报道。
发明内容
本发明采用医用透明质酸钠(Mw 2.0×106)和具有荧光性质的香豆素衍生物反应，对透明质酸钠的羟基部位进行化学改性，以便赋予透明质酸荧光性能，根据不同的反应时间和不同的反应温度制备出不同取代度的香豆素透明质酸衍生物，为下一阶段荧光示踪法研究动物体内药物传输机理研究提供实验基础。
本发明所解决的关键问题是提供制备含香豆素荧光基团透明质酸衍生物的方法。
本发明的合成路线图如下反应式1所示：
反应式1
为解决上述技术问题，所采用的具体方案如下：
首先以7-羟基-4-甲基香豆素为原料经过醚化反应得到环氧丙烷取代的香豆素，然后将其再与透明质酸钠通过醚化反应制备出含有香豆素单元的透明质酸衍生物；其中所述7-羟基-4-甲基香豆素与环氧丙烷的摩尔比为1∶12.75；透明质酸钠和香豆素衍生物的摩尔配比为1∶3-1∶20；反应后的混合液装入透析袋内，透析时间为72h，然后用无水乙醇沉析、冷冻干燥得到目标产物；其中所述的透明质酸钠，具有2,800,000Da的平均分子量
其中所述的反应体系的pH为8-12；
其中所述所用的溶剂为二甲亚砜和水的混合溶剂，且二甲亚砜和水的体积比为4∶1；
其中所述反应温度30℃-40℃，反应时间为20h-50h，优选反应时间均为40h。
本发明的有益效果是：通过将香豆素荧光基团引入到难以检测的透明质酸上，在保留透明质酸的天然结构的同时，又赋予其荧光性能，为透明质酸在动物或人体内相应的药物代谢和药理等多方面的研究提供了实验基础。
附图说明
其中图1为透明质酸Na-HA的1H NMR(500MHz，D2O)谱图；图2为40℃透明质酸香豆素衍生物3的1H NMR(500MHz，D2O)谱。
具体实施方式
本发明以4-甲基-7-羟基香豆素1为起始原料经过醚化反应先生成7-甲氧基-4-甲基香豆素-1，2-环氧丙烷2，然后将其与透明质酸钠(Mw 2.8×106)经过醚化反应，制备含有香豆素结构单元的透明质酸衍生物3。纯化后含环氧结构的香豆素2的1H NMR(DMSO-d6)为：δ7.71(d，J＝8.8Hz，1H，Ar-H)，7.02(s，1H，Ar-H)，7.01(d，J＝8.8Hz，1H，Ar-H)，6.22(s，1H，CH)，4.48(dd，J＝10.0，2.5Hz，1H，ArOCH2)，3.96(dd，J＝10.0，5.0Hz，1H，ArOCH2)，3.37(s，1H，OCH)，2.86-2.88(m，1H，OCH2)，2.73-2.74(m，1H，OCH2)，2.40(s，3H，CH3)。我们同时做了透明质酸的1H NMR(D2O-d6)如图1。这样我们可以通过最终透明质酸产物1H NMR中2.0ppm处乙酰胺上的甲基与所含香豆素结构单元2.45ppm处甲基的积分比计算出产物3中每个透明质酸结构单元中香豆素基团的取代度。我们考察了不同温度下制备透明质酸衍生物3的反应情况(见具体实施例)，不同温度下通过将反应液后经乙醇沉析处理得到产品的1HNMR图可知，在25℃下透明质酸的醚化反应没有发生，在30℃下有透明质酸香豆素衍生物3生成，但在低场芳环附近的氢质子的积分为负值，可能是由于产物中香豆素取代度太少造成的；在35℃下生成的透明质酸衍生物香豆素单元的取代度约为3.9％；而在40℃下生成的透明质酸衍生物香豆素单元的取代度为5.2％(图2)。
香豆素衍生物2的合成方法
将3.5g(20mmol)羟甲基香豆素置于装有空气冷凝管、恒压滴液漏斗和温度计的250mL的三口瓶中，加入100mL无水乙醇和5mL水溶解的1.4g(25mmol)KOH的水溶液，搅拌30min.。向该体系中滴加20mL环氧氯丙烷(255mmol)，滴加完毕后，将体系升温到60℃，反应3h(详细参考Y L Chen，C M Lu，S J Lee，et al.Synthesis，antiproliferative，andvasorelaxing evaluations of coumarin α-methylene-γ-butyrolactones[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry，2005，20(13)：5710-5716.)。将反应液倒入1000mL烧杯中，往烧杯中不断加入水直至不再析出白色沉淀为止。过滤收集滤饼，然后用无水乙醇重结晶得白色固体4-甲基-7-(2，3-环氧丙氧基)香豆素2.62g，产率为56％。
实施例1
25mL圆底烧瓶中加人0.1g(0.25mmol)透明质酸钠，然后加入12mL二甲亚砜和3mL水，强磁力搅拌使透明质酸钠溶解，逐滴加入0.1M NaOH溶液使混合溶液的pH＝8-12，然后加入0.173g(0.75mmol)，4-甲基-7-(2，3-环氧丙氧基)香豆素，反应在30℃反应20h。将反应混合液装入透析袋内透析72h，透析液用乙醇沉析得白色固体，将固体冷冻真空干燥后用1H NMR进行表征，通过比较2.0ppm(3H，-NHCOCH3)和2.45ppm(3H，所引入的香豆素基团上的-CH3)的信号计算出产物的取代度为1.8％。
实施例2
25mL圆底烧瓶中加人0.1g(0.25mmol)透明质酸钠，然后加入12mL二甲亚砜和3mL水，强磁力搅拌使透明质酸钠溶解，逐滴加入0.1M NaOH溶液使混合溶液的pH＝8-12，然后加入0.173g(0.75mmol)香豆素衍生物2，反应在30℃反应30h。将反应混合液装入透析袋内透析72h，透析液用乙醇沉析得白色固体，将固体冷冻真空干燥后用1HNMR进行表征，通过比较2.0ppm(3H，-NHCOCH3)和2.45ppm(3H，所引入的香豆素基团上的-CH3)的信号计算出产物的取代度为2.4％。
实施例3
25mL圆底烧瓶中加人0.1g(0.25mmol)透明质酸钠，然后加入12mL二甲亚砜和3mL水，强磁力搅拌使透明质酸钠溶解，逐滴加入0.1M NaOH溶液使混合溶液的pH＝8-12，然后加入0.173g(0.75mmol)香豆素衍生物2，反应在30℃反应40h。将反应混合液装入透析袋内透析72h，透析液用乙醇沉析得白色固体，将固体冷冻真空干燥后用1HNMR进行表征，通过比较2.0ppm(3H，-NHCOCH3)和2.45ppm(3H，所引入的香豆素基团上的-CH3)的信号计算出产物的取代度为3.6％。
实施例4
25mL圆底烧瓶中加人0.1g(0.25mmol)透明质酸钠，然后加入12mL二甲亚砜和3mL水，强磁力搅拌使透明质酸钠溶解，逐滴加入0.1M NaOH溶液使混合溶液的pH＝8-12，然后加入香豆素衍生物2，反应在30℃反应50h。将反应混合液装入透析袋内透析72h，透析液用乙醇沉析得白色固体，将固体冷冻真空干燥后用1HNMR进行表征，通过比较2.0ppm(3H，-NHCOCH3)和2.45ppm(3H，所引入的香豆素基团上的-CH3)的信号计算出产物的取代度为3.4％。
实施例5
25mL圆底烧瓶中加人0.1g(0.25mmol)透明质酸钠，然后加入12mL二甲亚砜和3mL水，强磁力搅拌使透明质酸钠溶解，逐滴加入0.1M NaOH溶液使混合溶液的pH＝8-12，然后加入香豆素衍生物2，反应在35℃反应40h。将反应混合液装入透析袋内透析72h，透析液用乙醇沉析得白色固体，将固体冷冻真空干燥后用1H NMR进行表征，通过比较2.0ppm(3H，-NHCOCH3)和2.45ppm(3H，所引入的香豆素基团上的-CH3)的信号计算出产物的取代度为4.7％。
实施例6
25mL圆底烧瓶中加人0.1g(0.25mmol)透明质酸钠，然后加入12mL二甲亚砜和3mL水，强磁力搅拌使透明质酸钠溶解，逐滴加入0.1M NaOH溶液使混合溶液的pH＝8-12，然后加入0.173g(0.75mmol)香豆素衍生物2，反应在40℃反应40h。将反应混合液装入透析袋内透析72h，透析液用乙醇沉析得白色固体，将固体冷冻真空干燥后用1HNMR进行表征，通过比较2.0ppm(3H，-NHCOCH3)和2.45ppm(3H，所引入的香豆素基团上的-CH3)的信号计算出产物的取代度为5.2％。
Claims (3)
1.一种制备新型透明质酸香豆素衍生物的方法，其特征在于首先以7-羟基-4-甲基香豆素为原料经过醚化反应得到环氧丙烷取代的香豆素，然后将其再与透明质酸钠通过醚化反应制备出含有香豆素单元的透明质酸衍生物；
其中所述7-羟基-4-甲基香豆素与环氧丙烷的摩尔比为1∶12.75；透明质酸钠和香豆素衍生物的摩尔配比为1∶3-1∶20；
其中反应温度30℃-40℃，反应时间为20h-50h；
其中反应体系的pH为8-12；
其中所用的溶剂为二甲亚砜和水的混合溶剂，且二甲亚砜和水的体积比为4∶1；反应后的混合液装入透析袋内，透析时间为72h，然后用无水乙醇沉析、冷冻干燥得到目标产物。
2.根据权利要求1所述的一种制备新型透明质酸香豆素衍生物的方法，其特征在于其中所述的透明质酸钠具有2,800,000D a的平均分子量。
3.根据权利要求1所述的一种制备新型透明质酸香豆素衍生物的方法，其特征在于其中所述的反应时间为40h。
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