CN102964591B

CN102964591B - 聚氨基酸嵌段共聚物的制备方法及聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶

Info

Publication number: CN102964591B
Application number: CN201210492369.XA
Authority: CN
Inventors: 丁建勋; 石丰华; 庄秀丽; 陈莉; 陈学思
Original assignee: Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS
Current assignee: Changzhou Institute Of Energy Storage Materials & Devices
Priority date: 2012-11-27
Filing date: 2012-11-27
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2032-11-27
Also published as: CN102964591A

Abstract

本发明提供一种聚氨基酸嵌段共聚物的制备方法，包括以下步骤：将式（I）所示的化合物、L-胱氨酸-N-内羧酸酐和氨基酸-N-内羧酸酐在有机溶剂中反应，得到聚氨基酸嵌段共聚物；式（I）所示的化合物数均分子量为500~30000。本发明还提供了一种聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶，包括所述方法得到的聚氨基酸嵌段共聚物和水性介质。本发明的聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶具有pH敏感性和还原敏感性，其作为载体使用时有利于增强癌细胞的内吞，能够有效释放包载的药物。另外，本发明得到的聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶具有良好的生物相容性和生物降解性。

Description

聚氨基酸嵌段共聚物的制备方法及聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶

技术领域

本发明涉及高分子药物载体领域，特别涉及聚氨基酸嵌段共聚物的制备方法及聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶。

背景技术

恶性肿瘤正在成为威胁人类健康的最严重疾病之一。肿瘤组织与正常组织的区别在于其微环境的pH值低，而肿瘤细胞内环境表现为低氧、低糖、低pH值和高谷胱甘肽浓度。

目前，临床上常用的癌症治疗手段有化疗、放疗和手术治疗等。其中，化疗是最常用和重要的治疗途径。但临床上所用的抗肿瘤药物在应用中仍面临着水溶性及稳定性差，药物对正常组织的毒副作用大等问题。为了解决这些问题，可将药物与药物载体结合，以改善药物的水溶性和稳定性，并达到对药物的控制释放，从而减小药物对正常组织的毒副作用，充分发挥药物的功效。

常见的药物载体有无机材料纳米粒子，树枝状聚合物，脂质体，聚合物胶束以及聚合物纳米水凝胶等。聚合物纳米水凝胶是由内部交联的纳米聚合物粒子在水中分散形成的凝胶，是一种高分子网络体系，不容易受血液循环系统的影响而破坏凝胶结构，是一种理想的药物载体。其中，能对肿瘤组织微环境的pH值、温度、还原剂、氧化剂或酶等做出响应的环境敏感型水凝胶具有良好的应用前景。环境敏感型水凝胶能有效的将药物带到病灶部位，在肿瘤组织特殊环境的刺激下，迅速的释放药物，以减少药物对正常组织的毒副作用，更好的发挥药效。

但是聚合物纳米水凝胶容易与蛋白结合，缩短其在体内循环的时间。为了解决该问题，研究人员通常将抗蛋白非特异性吸附的材料（如聚乙二醇等）对聚合物进行修饰。修饰后的聚合物纳米水凝胶水溶性增强，体内循环时间长。如果利用聚乙二醇修饰后的聚合物纳米水凝胶作为载体，聚乙二醇会阻碍癌细胞对载体的内吞，并且阻碍药物从载体中释放。

所以，最理想的模型是在正常的血液循环中时载体具有聚乙二醇保护结构，当到达肿瘤组织时聚乙二醇能够在环境的刺激下脱落，以使载体能更好的被癌细胞内吞，并迅速的释放药物。ChemicalCommunications(Vol.47,p3550-3552,2011)公开了一种通过还原敏感的二硫键连接的聚乙二醇和聚赖氨酸胶束，其在还原性的环境中能断开二硫键以脱落聚乙二醇，加快对药物的释放。但是，大多数肿瘤组织和正常组织间并没有还原性差异，因此胶束中的聚乙二醇不容易脱落，不能有效的增强癌细胞对载体的内吞。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种聚氨基酸嵌段共聚物的制备方法及聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶，所述聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶在肿瘤组织的微酸性条件下可迅速脱落聚乙二醇，其作为载体使用时有利于增强癌细胞的内吞。

本发明公开了一种聚氨基酸嵌段共聚物的制备方法，包括以下步骤：

将式（I）所示的化合物、L-胱氨酸-N-内羧酸酐和氨基酸-N-内羧酸酐在有机溶剂中反应，得到聚氨基酸嵌段共聚物；

其中R为氢或甲基；

式（I）所示的化合物数均分子量为500~30000。

优选的，所述氨基酸-N-内羧酸酐为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-2-氯乙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、甘氨酸-N-内羧酸酐、L-丙氨酸-N-内羧酸酐、L-缬氨酸-N-内羧酸酐、L-亮氨酸-N-内羧酸酐、L-异亮氨酸-N-内羧酸酐、L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐、L-脯氨酸-N-内羧酸酐、L-色氨酸-N-内羧酸酐、L-丝氨酸-N-内羧酸酐、L-酪氨酸-N-内羧酸酐、ε-苄氧羰基-L-半胱氨酸-N-内羧酸酐、L-蛋氨酸-N-内羧酸酐、L-天冬酰胺-N-内羧酸酐、L-谷氨酰胺-N-内羧酸酐、L-苏氨酸-N-内羧酸酐、γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐、ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐、精氨酸-N-内羧酸酐或组氨酸-N-内羧酸酐。

优选的，所述式（I）所示的化合物按照以下方法制备：

将如式（II）所示的化合物与式（III）所示化合物反应，得到式（I）所示的化合物；式（III）所示化合物的数均分子量为500~30000；

其中R为氢或甲基。

优选的，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二氧六环或三氯甲烷。

优选的，所述L-胱氨酸-N-内羧酸酐和氨基酸-N-内羧酸酐的总摩尔数与式（I）所示的化合物的摩尔数的比例为5~1000:1。

优选的，所述L-胱氨酸-N-内羧酸酐与所述氨基酸-N-内羧酸酐的摩尔比为0.01~100:1。

优选的，所述反应的温度为20℃~30℃。

优选的，所述反应的时间为60h~80h。

本发明公开了一种聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶，包括权利要求1~7任意一项所述的制备方法得到的聚氨基酸嵌段共聚物和水性介质。

优选的，所述水性介质为水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液。

与现有技术相比，本发明以L-胱氨酸-N-内羧酸酐、氨基酸-N-内羧酸酐和具有pH值响应型的缩酮化的式（I）所示的化合物为原料制备得到了聚氨基酸嵌段共聚物。所述聚氨基酸嵌段共聚物与水性介质构成的聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶。所述聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶包括含有二硫键的聚氨基酸链和亲水链，所述亲水性链为含有缩酮基团的聚乙二醇链或含有带有缩酮基团的聚乙二醇单甲醚链。由于缩酮基团具有pH敏感性，其在肿瘤组织的微酸性环境中容易断裂，因此亲水链容易从聚氨基酸嵌段共聚物上脱落，当聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶作为载体使用时，有利于增强癌细胞的内吞。其次，聚氨基酸链含有二硫键，因此所述聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶具有还原敏感性，其作为载体使用时，在高谷胱甘肽浓度刺激下，容易断裂，有效释放包载的药物。另外，本发明得到的聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶具有良好的生物相容性和生物降解性。

附图说明

图1为本发明实施例9制备的式（I）所示化合物在氘代水中的核磁共振谱图；

图2为本发明实施例9制备的式（I）所示化合物在氘代盐酸中的核磁共振谱图；

图3为本发明实施例33得到的聚氨基酸嵌段共聚物的核磁共振氢谱图；

图4为本发明实施例33得到的聚氨基酸嵌段共聚物的红外谱图；

图5为本发明实施例33得到的聚氨基酸嵌段共聚物的流体动力学半径分布图；

图6为本发明实施例33所得到的聚氨基酸嵌段共聚物包载尼罗红后的尼罗红释放曲线图；

图7为本发明实施例33得到的聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶在不同时间的流体动力学半径分布图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明实施例公开了一种聚氨基酸嵌段共聚物的制备方法，包括以下步骤：

其中R为氢或甲基，优选为甲基；

式（I）所示化合物的数均分子量为500~30000。

本发明以式（I）所示的化合物、L-胱氨酸-N-内羧酸酐和氨基酸-N-内羧酸酐为原料制备得到聚氨基酸嵌段共聚物。在式（I）所示的化合物的引发作用下，L-胱氨酸-N-内羧酸酐和氨基酸-N-内羧酸酐发生开环聚合反应，其中L-胱氨酸-N-内羧酸酐含有两个环，在发生开环聚合反应时刻形成交联结构，从而得到的聚氨基酸共聚物还与水形成凝胶。

按照本发明，所述氨基酸-N-内羧酸酐优选为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-2-氯乙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、甘氨酸-N-内羧酸酐、L-丙氨酸-N-内羧酸酐、L-缬氨酸-N-内羧酸酐、L-亮氨酸-N-内羧酸酐、L-异亮氨酸-N-内羧酸酐、L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐、L-脯氨酸-N-内羧酸酐、L-色氨酸-N-内羧酸酐、L-丝氨酸-N-内羧酸酐、L-酪氨酸-N-内羧酸酐、ε-苄氧羰基-L-半胱氨酸-N-内羧酸酐、L-蛋氨酸-N-内羧酸酐、L-天冬酰胺-N-内羧酸酐、L-谷氨酰胺-N-内羧酸酐、L-苏氨酸-N-内羧酸酐、γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐、ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐、精氨酸-N-内羧酸酐或组氨酸-N-内羧酸酐。本发明对所述氨基酸-N-内羧酸酐的来源没有特殊限制，可以为从市场上购得，也可以为按照本领域技术人员熟知的方法制备，如采用相应的氨基酸与双（三氯甲基）碳酸酯发生反应，得到相应的氨基酸-N-内羧酸酐。

按照本发明，对所述L-胱氨酸-N-内羧酸酐的来源没有特殊限制，可以由市场购买，也可以按照本领域技术人员熟知的方法制备。

按照本发明，式（I）所示化合物的数均分子量为500~30000，优选为1000~20000，更优选为3000~10000。所述式（I）所示的化合物优选按照以下方法制备：

其中R为氢或甲基，优选为甲基。

在制备式（I）所示的化合物的过程中，式（III）所示化合物与式（II）所示的化合物反应，所述式（III）所示化合物与式（II）所示的化合物的摩尔比优选为8~12:1，更优选为10：1。所述反应的时间优选为40~60小时，更优选为45~55小时；本发明对所述反应时间没有特殊限制，室温即可。所述反应优选在有机溶剂中进行，所述有机溶剂优选为二氯甲烷。在所述反应前优选将式（III）所示化合物活化，所述活化优选为将式（III）所示化合物活化后溶于二氯甲烷中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温下反应24h，所述式（III）所示化合物、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比优选为1:5:2。

本发明对式（II）所示化合物的来源没有特殊限制，优选按照以下方法制备：

首先将N-（2-羟乙基）邻苯二甲酰亚胺与甲苯共沸除水，然后在冰浴条件下缓慢加入对甲苯磺酸和缓慢滴入2-甲氧基丙烯。在冰浴中反应1h。再与甲苯共沸除水3h,冷却至室温后加入三乙胺终止反应，并加入乙酸酐。其中所述的N-（2-羟乙基）邻苯二甲酰亚胺、对甲苯磺酸、2-甲氧基丙烯、三乙胺、乙酸酐的摩尔比为100:1:100:150:60。所得的产物用乙酸乙酯重结晶三次，然后在6M的氢氧化钠溶液中回流12h，冷却至室温后用体积比为1:1的氯仿和异丙醇混合溶液萃取，所得的有机相用无水硫酸镁干燥过夜，再用旋转蒸发仪出去溶剂后得酸敏感的式（II）所示化合物。

本发明对所述式（III）所示化合物的来源没有特殊限制，优选按照以下方法制备：

将聚乙二醇单甲醚或聚乙二醇和丁二酸酐溶于吡啶溶剂中，25°C下反应72h。所述的聚乙二醇单甲醚和丁二酸酐的摩尔比为1:15。反应结束后用饱和碳酸氢钠溶液中和，并用乙酸乙酯洗3次，再用氯仿萃取，干燥，浓缩，沉降，最终式（III）所示化合物。

按照本发明，式（I）所示的化合物、L-胱氨酸-N-内羧酸酐和氨基酸-N-内羧酸酐在有机溶剂中发生反应。所述L-胱氨酸-N-内羧酸酐和氨基酸-N-内羧酸酐的总摩尔数与式（I）所示化合物的摩尔数的比例优选为5~1000:1，更优选为10~500:1，最优选为100~300:1；所述L-胱氨酸-N-内羧酸酐与所述氨基酸-N-内羧酸酐的摩尔比优选为0.01~100:1，更优选为0.1~90:1，最优选为1~50:1。所述有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺、1,4-二氧六环或三氯甲烷，更优选为N,N-二甲基甲酰胺。所述反应的温度优选为20℃~30℃，更优选为25℃；所述反应的时间为60h~80h，更优选为65h~75h。

在进行反应之前，本发明优选将所述端氨基化的亲水性聚合物与甲苯进行共沸除水。

所述反应结束后，对完成反应后的混合物进行后处理，进行不同的后处理，即可得到聚氨基酸或直接得到聚氨基酸水凝胶，如：反应完毕后，将反应混合物在乙醚中沉降、过滤、洗涤、干燥后，即可得到聚氨基酸，将所述聚氨基酸溶于水中，即可得到聚氨基酸水凝胶；反应完毕后，将反应混合物透析除去有机溶剂后，即可直接得到聚氨基酸水凝胶。

本发明还保护了一种聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶，包括上述技术方案所述的制备方法得到的聚氨基酸嵌段共聚物和水性介质。所述水性介质优选为水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液。在所述水凝胶中，所述嵌段共聚物的质量优选为所述嵌段共聚物占水性介质总质量的15%~35%，更优选为20%~30%。

本发明制备的聚氨基酸嵌段共聚物包括亲水性聚合物聚乙二醇或聚乙二醇单甲醚组成的亲水链段和聚氨基酸组成的疏水性链段，当所述聚氨基酸嵌段共聚物溶于水性介质形成凝胶时，会形成亲水链段在外，疏水链段在内的例子，即形成以内部交联的聚氨基酸为内核、亲水链段为核壳结构的稳定的高分子网络体系。

以所述聚氨基酸嵌段共聚物为载体担载药物，在正常组织的血液循环中，聚氨基酸嵌段共聚物的亲水链段能够抵抗特异性非蛋白的吸收，保护聚氨基酸嵌段共聚物和药物顺利到达肿瘤组织；在肿瘤组织弱酸环境的刺激下，聚氨基酸嵌段共聚物的缩酮键发生水解断裂使亲水链脱离载体体系，这样带有药物的聚氨基酸链段更容易被癌细胞内吞。同时在癌细胞内的还原环境中，聚氨基酸链段的二硫键断裂，生成硫醇，实现聚氨基酸的降解，从而实现药物的释放。本发明提供的聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶具有酸pH敏感性和还原敏感性，能够根据肿瘤组织环境的刺激，控制释放药物。

对本发明制备的聚氨基酸嵌段共聚物的性能进行测试，结果表明，其具有酸pH敏感性和还原敏感性。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的聚氨基酸嵌段共聚物的制备方法及聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

以下各实施例中所用原料均为从市场上购得，反应产率=实际产率/理论产率×100%。

实施例1

称取30g N-（2-羟乙基）邻苯二甲酰亚胺与300ml甲苯共沸除水，然后在冰浴条件下缓慢加入0.285g对甲苯磺酸和缓慢滴入15.3ml 2-甲氧基丙烯。在冰浴中反应1h。再与甲苯共沸除水3h,冷却至室温后加入36ml三乙胺终止反应，并加入9ml乙酸酐中和未反应完全的N-（2-羟乙基）邻苯二甲酰亚胺。所得的产物用50ml乙酸乙酯重结晶三次，然后在6M的氢氧化钠溶液中回流12h，冷却至室温后用50ml体积比为1:1的氯仿和异丙醇混合溶液萃取三次，所得的有机相用无水硫酸镁干燥过夜，再用旋转蒸发仪出去溶剂后得酸敏感的二乙基氨基缩酮，即如式（II）所示的化合物，产率为68.2%。

实施例2~6

分别称取20g数均分子量为1000(0.02mol)、2000(0.01mol)、5000(0.004mol)、10000(0.002mol)和20000(0.001mol)的聚乙二醇单甲醚，分别放入5个干燥的带支口的反应瓶中，分别加入100mL吡啶，再分别加入30.02g(0.3mol)、15.01g(0.15mol)、6.01g(0.06mol)、3.02g(0.03mol)和1.50g(0.0015mol)丁二酸酐，在25°C下反应72h。反应结束后用100ml饱和碳酸氢钠溶液中和，并用50ml乙酸乙酯洗3次，再用50ml氯仿萃取三次，干燥，浓缩，沉降，最终得到如式（III）所示的化合物。对所述式（III）所示化合物进行核磁共振分析，并计算其数均分子量，结果参见表1。

表1实施例2~6制备的式（III）所示化合物的数均分子量及产率

实施例	Mn	产率（%）
			2	1115	90.2

3	2118	90.1
			4	5117	91.3
5	10120	91.7
			6	20110	92.2

实施例7~11

分别称取1mmol实施例2~6制备的式（III）所示化合物，分别放入5个带支口的反应瓶中，各加入50ml二氯甲烷、0.96g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和0.23g N-羟基琥珀酰亚胺，在室温下反应24h以活化端羧基。然后将活化后的聚乙二醇单甲醚分别缓慢滴入五个含1.62g的二乙基氨基缩酮的二氯甲烷溶液中。反应48h后，浓缩，用乙醚沉降。得到式（I）所示的化合物。对所述式（I）所示的化合物进行核磁共振分析，并计算其数均分子量，结果参见表2。

表2实施例7~11制备的式（I）所示的化合物的数均分子量及产率

实施例	Mn	产率（%）
			7	1122	90.6
8	2128	91.7
			9	5122	91.8
10	10129	92.2
			11	20122	93.1

以重水为溶剂对实施例9得到的式（I）所示的化合物进行核磁共振分析，结果参见图1，图1为本发明实施例9得到的式（I）所示化合物的核磁共振氢谱图，图1中，化学位移为3.54ppm时出现的峰为聚乙二醇单甲醚的信号峰，化学位移为1.25ppm时出现的峰为缩酮的两个甲基的信号峰。由此可见式（I）所示化合物的成功合成。为了验证式（I）所示化合物的酸敏感性质，以氘代盐酸为溶剂对实施例9得到的式（I）所示的化合物进行核磁共振分析，结果参见图2，图2中，化学位移为1.25左右并没有出现峰信号，证明在酸性环境中，缩酮水解断裂，即该实施例的式（I）所示化合物具有酸敏感性质。

实施例12γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐的制备

将1molL-谷氨酸与3mol苯甲醇在0℃条件下混合，搅拌子搅拌条件下逐滴滴加1.5mol浓硫酸，滴加完毕后，升温至70℃反应6h，反应结束后，用3mol碳酸氢钠溶液中和反应混合液，再经过过滤、洗涤、重结晶、冻干后，得到γ-苯甲基-L-谷氨酸酯。

将1mol所述γ-苯甲基-L-谷氨酸酯与0.6mol双（三氯甲基）碳酸酯在25℃条件下混合，加入四氢呋喃，加热至50℃反应2h，反应结束后，将反应混合物在过量石油醚中沉降，分离、洗涤、重结晶、干燥后得到γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐。

实施例13L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐的制备

将1molL-苯丙氨酸与0.6mol双（三氯甲基）碳酸酯在25℃条件下混合，加入四氢呋喃，加热至50℃反应2h，反应结束后，将反应混合物在过量石油醚中沉降，分离、洗涤、重结晶、干燥后得到L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐。

实施例14ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐的制备

将1molε-苄氧羰基-L-赖氨酸与0.6mol双（三氯甲基）碳酸酯在25℃条件下混合，加入四氢呋喃，加热至50℃反应2h，反应结束后，将反应混合物在过量石油醚中沉降，分离、洗涤、重结晶、干燥后得到ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐。

实施例15L-胱氨酸-N-内羧酸酐的制备

将1mol L-胱氨酸与0.6mol双（三氯甲基）碳酸酯在25℃条件下混合，加入四氢呋喃，加热至50℃反应2h，反应结束后，将反应混合物在过量石油醚中沉降，分离、洗涤、重结晶、干燥后得到L-胱氨酸-N-内羧酸酐。

实施例16~30

分别称取0.1mmol实施例7~11制备的式（I）所示的化合物，分别放入5个带支口的反应瓶中，各加入50mL甲苯共沸除水后，每个反应瓶中分别加入1.31625g(0.005mol)实施例12制备的γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐单体，0.29229g(0.001mol)实施例15制备的L-胱氨酸-N-内羧酸酐单体，然后分别加入50mL无水N,N-二甲基甲酰胺将上述反应原料溶解，然后将溶液在25℃搅拌下继续反应72h，反应结束后，反应体系用500mL乙醚沉降，过滤，用乙醚洗涤三次后，25℃下真空干燥24h，分别得到聚氨基酸，将所述聚氨基酸溶解于水中，得到聚氨基酸纳米水凝胶。对所述聚氨基酸及聚氨基酸纳米水凝胶进行测定，结果参见表3，表3为本发明实施例16~20制备的产物的平均聚合度及产率。

表3本发明实施例16~20制备的产物的平均聚合度及产率

表3中，原料为式（I）所示的化合物，DP1为通过元素分析测定得到的、γ-苯甲基-L-谷氨酸酯相对于式（I）所示的化合物的平均聚合度；DP2为通过元素分析测定得到的、L-胱氨酸相对于式（I）所示的化合物的平均聚合度；流体动力学半径为得到的聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶的流体动力学半径。

实施例21~23

分别称取3份0.1mmol实施例9制备的式（I）所示化合物，分别放入3个带支口的反应瓶中，各加入50mL甲苯共沸除水后，向各反应瓶中加入实施例12制备的γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐单体和实施例15制备的L-胱氨酸-N-内羧酸酐单体，其中，各反应瓶中加入γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐单体的质量分别为26.04g(0.099mol)、2.39g(0.0091mol)和0.263g(0.001mol)，L-胱氨酸-N-内羧酸酐单体的质量分别为0.292g(0.001mol)、26.57g(0.0909mol)和28.94g(0.099mol)；分别向各反应瓶中加入600mL无水N,N-二甲基甲酰胺将反应物溶解，然后将溶液在25℃搅拌下继续反应72h，反应结束后，反应体系用6000mL乙醚沉降，过滤，用乙醚洗涤三次后，25℃下真空干燥24h，得到聚氨基酸嵌段共聚物，将所述聚氨基酸嵌段共聚物溶解于水中后，得到聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶。对所述聚氨基酸嵌段共聚物及聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶进行测定，结果参见表4，表4为本发明实施例21~23制备的产物的平均聚合度及产率。

表4本发明实施例21~23制备的产物的平均聚合度及产率

表4中，A/I1为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐单体与式（I）所示化合物的摩尔比，A/I2为L-胱氨酸-N-内羧酸酐单体与式（I）所示化合物的摩尔比；DP1为通过元素分析测定得到、γ-苯甲基-L-谷氨酸酯相对于式（I）所示化合物的平均聚合度，DP2为通过元素分析测定得到、L-胱氨酸相对于式（I）所示化合物的平均聚合度，流体动力学半径为得到的聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶的流体动力学半径。

实施例24~30

分别称取7份0.1mmol实施例9制备的式（I）所示化合物，分别放入7个带支口的反应瓶中，各加入50mL甲苯共沸除水后，向各反应瓶中加入实施例12制备的γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐单体和实施例15制备的L-胱氨酸-N-内羧酸酐单体，其中，各反应瓶中加入γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐单体的质量分别为0.0526g(0.0002mol)、0.1315g(0.0005mol)、1.3163g(0.005mol)、2.6325g(0.01mol)、5.265g(0.02mol)、10.53g(0.04mol)和13.1540g(0.05mol)，L-胱氨酸-N-内羧酸酐单体的质量分别为0.0585g(0.0002mol)、0.1461g(0.0005mol)、1.4615g(0.005mol)、2.9229g(0.01mol)、5.8458g(0.02mol)、11.6916g(0.04mol)和14.6145g(0.05mol)；分别向各反应瓶中加入1mL、4mL、60mL、100mL、200mL、400mL和600mL无水N,N-二甲基甲酰胺将反应物溶解，然后将溶液在25℃搅拌下继续反应72h，反应结束后，反应体系分别用10mL、40mL、600mL、1000mL、2000mL、4000mL和6000mL乙醚沉降，过滤，用乙醚洗涤三次后，25℃下真空干燥24h，得到聚氨基酸嵌段共聚物，将所述聚氨基酸嵌段共聚物溶解于水中后，得到聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶。对所述聚氨基酸嵌段共聚物及聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶进行测定，结果参见表5，表5为本发明实施例24~30制备的产物的平均聚合度及产率。

表5本发明实施例24~30制备的产物的平均聚合度及产率

表5中，A/I1为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐单体与式（I）所示化合物的摩尔比，A/I2为L-胱氨酸-N-内羧酸酐单体与式（I）所示化合物的摩尔比；DP1为通过元素分析测定得到、γ-苯甲基-L-谷氨酸酯相对于式（I）所示化合物的平均聚合度，DP2为通过元素分析测定得到、L-胱氨酸相对于式（I）所示化合物的平均聚合度，流体动力学半径为得到的聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶的流体动力学半径。

实施例31

将0.1mmol实施例9制备的式（I）所示化合物加入到带支口的反应瓶中，加入50mL甲苯共沸除水后，向反应瓶中加入2.6325g（0.01mol）实施例12制备的γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐单体和2.9229g（0.01mol）实施例15制备的L-胱氨酸-N-内羧酸酐单体，向反应瓶中加入200mL无水1,4-二氧六环将反应物溶解，然后将溶液在25℃搅拌下继续反应72h，反应结束后，反应体系用2000mL乙醚沉降，过滤，用乙醚洗涤三次后，25℃下真空干燥24h，得到聚氨基酸嵌段共聚物，将所述聚氨基酸嵌段共聚物溶解于水中后，得到聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶。

通过元素分析测定得到的聚氨基酸中，γ-苯甲基-L-谷氨酸酯相对于式（I）所示化合物的平均聚合度为97，L-胱氨酸相对于式（I）所示化合物的平均聚合度为99，聚氨基酸嵌段共聚物的产率为82.4%；得到的水凝胶的流体动力学半径为279±6.6nm。

实施例32

将0.1mmol实施例9制备的式（I）所示化合物加入到带支口的反应瓶中，加入50mL甲苯共沸除水后，向反应瓶中加入2.6325g（0.01mol）实施例12制备的γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐单体和2.9229g（0.01mol）实施例15制备的L-胱氨酸-N-内羧酸酐单体，向反应瓶中加入150mL无水三氯甲烷将反应物溶解，然后将溶液在25℃搅拌下继续反应72h，反应结束后，反应体系用1500mL乙醚沉降，过滤，用乙醚洗涤三次后，25℃下真空干燥24h，得到聚氨基酸嵌段共聚物，将所述聚氨基酸嵌段共聚物溶解于水中后，得到聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶。

通过元素分析测定得到的聚氨基酸中，γ-苯甲基-L-谷氨酸酯相对于式（I）所示化合物的平均聚合度为96，L-胱氨酸相对于式（I）所示化合物的平均聚合度为102，聚氨基酸嵌段共聚物的产率为82.1%；得到的水凝胶的流体动力学半径为289±7.2nm。

实施例33

将0.1mmol实施例9制备的式（I）所示化合物加入到带支口的反应瓶中，加入50mL甲苯共沸除水后，向反应瓶中加入1.9118g（0.01mol）实施例13制备的L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐单体和0.29229g（0.01mol）实施例15制备的L-胱氨酸-N-内羧酸酐单体，向反应瓶中加入100mL无水N,N-二甲基甲酰胺将反应物溶解，然后将溶液在25℃搅拌下继续反应72h，反应结束后，反应体系用1000mL乙醚沉降，过滤，用乙醚洗涤三次后，25℃下真空干燥24h，得到聚氨基酸嵌段共聚物，将所述聚氨基酸嵌段共聚物溶解于水中后，得到聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶。

通过元素分析测定得到的聚氨基酸嵌段共聚物中，L-苯丙氨酸相对于式（I）所示化合物的平均聚合度为96，L-胱氨酸相对于式（I）所示化合物的平均聚合度为9，聚氨基酸嵌段共聚物的产率为85.1%；得到的水凝胶的流体动力学半径为283±4.9nm。

以氘代二甲基亚砜为溶剂对实施例33得到的聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶进行核磁共振分析，结果参见图3，图3为本发明实施例33得到的聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶的核磁共振氢谱图，图3中，化学位移为3.51ppm时出现的峰位聚乙二醇单甲醚的信号峰，由此可见，所述聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶为具有核壳结构的纳米水凝胶。

对实施例33得到的聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶进行红外分析，结果参见图4，图4为本发明实施例33得到的聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶的红外谱图，图4中，波数为1672cm^-1的峰位羰基的伸缩振动吸收峰(ν_C=O)，波数为1536cm^-1的峰位N-H摇摆振动的吸收峰(δ_N-H)，由此可见，该纳米水凝胶中含有谷氨酸成分；波数为1107cm^-1的信号峰为聚乙二醇单甲醚中C-O伸缩振动的吸收峰(ν_C-O)，由此可见，所述聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶为包括谷氨酸成分和聚乙二醇单甲醚成分。

由图3和图4可知，所述聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶为具有聚乙二醇单甲醚构成的壳和聚氨基酸构成的核的核壳结构。

对实施例33得到的聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶进行流体动力学分析，结果参见图5，图5为本发明实施例33得到的聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶的流体动力学半径分布图，其流体动力学半径为146±6.5nm。

以实施例33得到的聚氨基酸嵌段共聚物为载体，对其担载药物后药物的释放情况进行测试，结果参见图6，图6为本发明实施例33所得到的聚氨基酸纳米凝胶体系包载尼罗红后在不同pH值时尼罗红释放曲线图。图6中，曲线A为pH值为7.4时，尼罗红的释放曲线；曲线B为pH值为6.8时，尼罗红的释放曲线；曲线C为pH值为5.5时，尼罗红的释放曲线。由图6可知，在微酸环境下，担载有药物的的聚氨基酸嵌段共聚物能够快速释放药物。

将实施例33所得的聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶溶于10mM L^-1的谷胱甘肽缓冲溶液中，在特定的时间测其流体动力学半径，结果参加图7，图7为本发明实施例33得到的聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶在不同时间的流体动力学半径分布图，曲线A为0h时测得的流体力学半径，曲线B为8h时测得的流体力学半径，曲线C为24h时测得的流体力学半径，由于在谷胱甘肽环境中二硫键的断裂，聚氨基酸水凝胶的流体力学半径逐渐增大。

实施例34

将0.1mmol实施例9制备的式（I）所示化合物加入到带支口的反应瓶中，加入50mL甲苯共沸除水后，向反应瓶中加入3.0631g（0.01mol）实施例14制备的ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐单体和2.9229g（0.01mol）实施例15制备的L-胱氨酸-N-内羧酸酐单体，向反应瓶中加入100mL无水N,N-二甲基甲酰胺将反应物溶解，然后将溶液在25℃搅拌下继续反应72h，反应结束后，反应体系用1000mL乙醚沉降，过滤，用乙醚洗涤三次后，25℃下真空干燥24h，得到聚氨基酸嵌段共聚物，将所述聚氨基酸嵌段共聚物溶解于水中后，得到聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶。

通过元素分析测定得到的聚氨基酸嵌段共聚物中，ε-苄氧羰基-L-赖氨酸相对于式（I）所示化合物的平均聚合度为95，L-胱氨酸相对于式（I）所示化合物的平均聚合度为98，聚氨基酸嵌段共聚物的产率为89.8%；得到的水凝胶的流体动力学半径为274±5.6nm。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种聚氨基酸嵌段共聚物的制备方法，包括以下步骤：

将式(I)所示的化合物、L-胱氨酸-N-内羧酸酐和氨基酸-N-内羧酸酐在有机溶剂中反应，得到聚氨基酸嵌段共聚物；

其中R为氢或甲基；

式(I)所示的化合物数均分子量为500～30000；

所述L-胱氨酸-N-内羧酸酐和氨基酸-N-内羧酸酐的总摩尔数与式(I)所示的化合物的摩尔数的比例为5～1000:1；

所述L-胱氨酸-N-内羧酸酐与所述氨基酸-N-内羧酸酐的摩尔比为0.01～100:1；所述反应的温度为20℃～30℃；

所述反应的时间为60h～80h。

2.根据权利要求1所示的制备方法，其特征在于，所述氨基酸-N-内羧酸酐为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、γ-2-氯乙基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐、甘氨酸-N-内羧酸酐、L-丙氨酸-N-内羧酸酐、L-缬氨酸-N-内羧酸酐、L-亮氨酸-N-内羧酸酐、L-异亮氨酸-N-内羧酸酐、L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐、L-脯氨酸-N-内羧酸酐、L-色氨酸-N-内羧酸酐、L-丝氨酸-N-内羧酸酐、L-酪氨酸-N-内羧酸酐、ε-苄氧羰基-L-半胱氨酸-N-内羧酸酐、L-蛋氨酸-N-内羧酸酐、L-天冬酰胺-N-内羧酸酐、L-谷氨酰胺-N-内羧酸酐、L-苏氨酸-N-内羧酸酐、γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐、ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐、精氨酸-N-内羧酸酐或组氨酸-N-内羧酸酐。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述式(I)所示的化合物按照以下方法制备：

将如式(II)所示的化合物与式(III)所示化合物反应，得到式(I)所示的化合物；式(III)所示化合物的数均分子量为500～30000；

其中R为氢或甲基。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二氧六环或三氯甲烷。

5.一种聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶，包括权利要求1～4任意一项所述的制备方法得到的聚氨基酸嵌段共聚物和水性介质。

6.根据权利要求5所述的水凝胶，其特征在于，所述水性介质为水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液。