CN103897118B - 一种可视化含tempo聚炔衍生物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于有机化学领域，具体涉及一种可视化含TEMPO聚炔衍生物的制备方法，该制备方法由以下步骤组成，首先将丙炔胺和丁二酸酐在无水二氯甲烷中反应得到N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸；将N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸和4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物进行酯化反应得到含TEMPO的丙炔胺衍生物；将N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸和分子量为2000的聚乙二醇进行酯化反应得到含PEG2K的丙炔胺衍生物；然后将含TEMPO的丙炔胺衍生物和含PEG2K的丙炔胺衍生物在40℃下反应12～24h，得到含TEMPO聚炔衍生物；最后将5(6)-羧基荧光素和含TEMPO聚炔衍生物进行酯化反应得到可视化含TEMPO聚炔衍生物。本发明制备的可视化含TEMPO聚炔衍生物具有低细胞毒性，良好的细胞穿透性，可以MRI和荧光显像，应用为MRI对比剂。
Description
技术领域
本发明属于有机化学领域，涉及含氮杂环化合物的制备方法。
背景技术
分子影像学能够在活体状态下对正常及病变组织的细胞和分子进行结构与功能变化信息的定性和定量研究，为癌症的早期诊断、治疗及疗效监测提供了新的思路；影像学检查在癌症病变的显示、诊断及分期方面十分重要，对临床制定治疗方案具有重要的指导作用。目前可用于癌症的分子影像学技术主要有CT成像、核素分子显像、超声分子成像、ＭＲI（磁共振）成像和光学分子成像技术。CT具有密度分辨率较高，以及钙化显示比较敏感等优点。但对人体软组织的分辨力有限，不能用于早期的前列腺癌诊断。核素分子显像具有高灵敏性和可用于治疗等优势，但由于空间分辨力低、存在放射性污染，限制使其临床应用。超声分子成像具有敏感性较高，以及可以检查出较小的前列腺癌等优势，但对等回声的前列腺癌病灶的敏感度和特异度均不高。MRI成像具有空间分辨率高、软组织结构显示清晰、无电离辐射等特点，但是其靶向敏感性较低，时间分辨力差。光学分子成像具有低能量辐射、信号敏感性较高、可以实时监测荧光信号的分布，但其组织穿透性较差、荧光容易淬灭。因此，采用MRI/光学双模态成像可以优势互补，提高诊断的准确性。
目前关于磁共振成像技术的研究重点主要集中在设计合成新MRI造影剂，即通过缩短周围水质子的T1或T2弛豫时间，加速弛豫速率，提升组织之间的图像对比，提高MRI诊断的敏感性与特异性。钆及其络合物具有缩短组织的横向弛豫时间，增加组织在Tl加权像上的磁共振信号强度的作用，是一种临床上常用的T1或顺磁性造影剂(T1orparamagneticagent)，已经广泛应用于临床的MRI成像。应用于临床的钆及其络合物，如Gd-DTPA，Gd-DOTA，Gd-BOPTA和Gd-EOB-DTPA均是小分子造影剂，该造影剂存在着以下缺陷：钆类T1造影剂在体内停留时间短，不适合一些需要长时间观测的临床病例，也不适用于动态MRI成像。此外，2007年英国药品和健康产品管理局(MHRA)认为一些钆类T1造影剂增加肾源性系统纤维化(NSF)的发生风险，并限制这类造影剂用于严重肾功能不全患者。因此，仍然需要研发生物相容性好、安全性能高、成像效果好、在体内有适当的滞留时间且易于排泄的新型T1造影剂，以满足临床各种诊断技术需求，弥补目前上市造影剂的一些缺陷。
以2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物（2，2，6，6-Tetramethylpiperidinooxy，TEMPO）为代表的稳定有机自由基含有自旋单电子，具有超磁性，氧化还原性能、良好的光热稳定剂和生物活性，广泛应用在已应用为蛋白质、核酸类酯和药物分子的新型自旋标记物、不稳定自由基的俘获剂、醇类氧化剂和生物探针[Baur，J.E.;Wang，S.;Brandt，M.C.Fast-scanvoltammetryofcyclicnitroxidefreeradicals.Anal.Chem.1996，68(21)，3815～3821；Zhelev，Z.;Bakalova，R.;Aoki，I.;KMatsumoto，K.;Gadjeva，V.;Anzai，K.;Kanno，I.NitroxylRadicalsforLabelingofConventionalMolecularPharmaceutics，2009，6(2)，504～512]。因其自旋单电子生产的超磁性，TEMPO等有机自由基具有高T1弛豫性能，可以作为MRI造影剂应用在细胞及分子水平的MRI成像。如用TEMPO修饰多肽和ＤＮＡ，发现该类含有机自由基大分子显示出高的水质子弛豫时间[Sato，Y.;Hayashi，H.;Okazaki，M.;Aso，M.;Karasawa，S.;Ueki，S.;Suemune，H.;Koga，N.Water-protonrelaxivitiesofDNAoligomerscarryingTEMPOradicalsMagn.Reson.Chem.2008，46(11)，1055–1058]。但是未见其应用为可视化MRI对比剂的报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种可视化含TEMPO聚炔衍生物的制备方法，该方法制备的可视化含TEMPO聚炔衍生物具有良好的生物相容性，可以对肿瘤进行MRI和荧光显像。
本发明解决上述问题的技术方案是：
一种可视化含TEMPO聚炔衍生物的制备方法，由以下步骤组成：
（1）将1摩尔量的丙炔胺和1摩尔量的丁二酸酐在适量无水二氯甲烷中反应得到N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸；将1摩尔量的N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸和1摩尔量的4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物在适量二氯甲烷中进行酯化反应得到含TEMPO的丙炔胺衍生物；将1摩尔量的N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸和1摩尔量的分子量为2000的聚乙二醇在适量二氯甲烷中进行酯化反应得到含PEG2K的丙炔胺衍生物；
（2）将1摩尔量的含PEG2K的丙炔胺衍生物，0.5～2摩尔量的含TEMPO的丙炔胺衍生物和适量[Rh(nbd)Cl]2，在适量N,N-二甲基甲酰胺或者四氢呋喃中，40℃下反应12～24h，得到含TEMPO聚炔衍生物；
(3)将重量比为5～50：100的5(6)-羧基荧光素和含TEMPO聚炔衍生物在适量N,N-二甲基甲酰胺或者DMSO中进行酯化反应得到可视化含TEMPO聚炔衍生物。
本发明所述的酯化反应采用的催化剂是本领域常用的催化剂，如采用EDC.HCl/NHS,EDC.HCl/DMAP或者DCC/DMAP作为催化剂，其中所述的EDC.HCl为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，NHS为N-羟基丁二酰亚胺，DMAP为4-二甲氨基吡啶，DCC为二环己基碳二亚胺。
本发明所述的制备方法的步骤2中，含TEMPO的丙炔胺衍生物和含PEG2K的丙炔胺衍生物的摩尔比最好是1：1。
本发明所述的制备方法的步骤3中，5(6)-羧基荧光素和含TEMPO聚炔衍生物的重量比为较好为10～40：100。
本发明所述的制备方法步骤1中，含TEMPO的丙炔胺衍生物按下式（I）进行酯化反应得到：
本发明所述的制备方法步骤1中，含PEG2K的丙炔胺衍生物按下式（II）进行酯化反应得到：
式中的PEG2K表示分子量为2000的聚乙二醇。
本发明所述的方法中的步骤2，含TEMPO的丙炔胺衍生物和含PEG2K的丙炔胺衍生物按下式（III）进行反应得到含TEMPO聚炔衍生物：
式中的x为0.5～2，PEG2K表示分子量为2000的聚乙二醇。
本发明所述的方法制备的可视化含TEMPO聚炔衍生物中含有2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物，该2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物具有超顺磁性，因此可以应用为MRI对比剂。
聚乙二醇(polyetllyleneglycol，PEG)是常用的生物相容性材料，它不仅能增加其他高分子的亲水性，还能改善其体内分布。聚乙二醇是高度亲水的柔性链，可结合大量的水分子，形成一层水性的外壳，将造影剂“隐藏”在内，避免被网状内皮系统和巨噬细胞识别，增加在血液系统中的循环时间。本发明在可视化含TEMPO聚炔衍生物的制备过程中引入含PEG的丙炔胺衍生物，提高含TEMPO聚炔衍生物的亲水性和生物相容性。
同时制备过程中，采用具有荧光性能的化合物和含TEMPO聚炔衍生物进行反应，制备得到的含TEMPO聚炔衍生物具有光学性能，能够在细胞和活体动物内进行荧光显像。
因此本发明制备的可视化含TEMPO聚炔衍生物具有低细胞毒性，高生物相容性，细胞穿透性和高T1弛豫率，可以应用为MRI和光学对比剂。
附图说明
图1为氢核磁谱图，其中，(a)图为含TEMPO丙炔胺衍生物的氢核磁谱图，(b)图为含PEG2K丙炔胺衍生物的氢核磁谱图，(c)图为含TEMPO聚炔衍生物的氢核磁谱图。
图2为红外谱图，其中，(a)图为含TEMPO丙炔胺衍生物的红外谱图，(b)图为含PEG2K丙炔胺衍生物的红外谱图，(c)图为含TEMPO聚炔衍生物的红外谱图。
图3为T1弛豫率随含TEMPO聚炔衍生物和含叶酸可视化含TEMPO聚炔衍生物浓度变化的曲线图，其中，曲线a为T1弛豫率随含TEMPO聚炔衍生物的浓度变化的曲线图，曲线b为T1弛豫率随含叶酸可视化含TEMPO聚炔衍生物浓度变化的曲线图。
图4为可视化含TEMPO聚炔衍生物的细胞毒性的条形图。
具体实施方式
下面用具体实施例来进一步详细描述本发明的制备方法及其效果。
实施例1
（1）丙炔胺衍生物的制备
（a）含TEMPO丙炔胺衍生物的制备
丙炔胺（1.1g，20mmol）和丁二酸酐（2.0g，20mmol）加入50mL二氯甲烷，室温下反应过夜。旋蒸除去溶剂，在甲醇中重结晶得到3.0gN-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸。将N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸（1.55g，10mmol）和NHS（1.15g，10mmol）溶解在100mL二氯甲烷中，室温下搅拌30min。EDC.HCl(1.92g，10mmol)和4-羟基-TEMPO(1.72g，10mmol)加入上述溶液，室温下反应过夜。旋蒸除去溶剂。残余物用正己烷/乙酸乙酯（4/1，v/v）作洗脱剂经硅胶柱层析分离纯化，重结晶得到2.4g红色固体，收率78%。
化合物的表征
1HNMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)=5.08～5.11(m，1H)，4.05～4.07(t，2H)，2.65～2.68(t，2H)，2.46～2.50(t，2H)，2.27(s，1H)，1.95～1.96(m，2H)，1.89(s，1H)，1.58～1.64(m，2H)，1.22～1.23(m，12H).13CNMR(100MHz，CDCl3)δ=171.44，170.17，81.00，78.64，70.56，66.60，58.82，42.58，29.62，28.60，19.54.IR(v-1，LiBr):3336，3239，2983，2123，1729，1614，1595，1518，1453，1415，1243，972，813，774.MS(ESI):C16H25N2O4m/z309.1814for[M]+Na+.332.1707.ElementalAnalysis:CalcdC，62.12;H，8.15;N，9.05;O，20.68.FoundC，62.14;H，8.22;N，9.00.核磁测量条件为：加入10倍的苯肼，反应0.5h后测量。
以上数据证明上述制备的化合物为结构式（IV）所示的含TEMPO丙炔胺衍生物。
（b）含PEG2K丙炔胺衍生物的制备
将N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸（1.55g，10mmol）和DMAP（0.61g，5mmol）溶解在100mL二氯甲烷中，室温下搅拌30min。EDC.HCl(1.92g，10mmol)和PEG（Mw=2K）(80g，40mmol)加入上述溶液，室温下反应过夜。反应后的溶液依次用1M的盐酸、饱和NaHCO3水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤3次，有机层在无水MgSO4中干燥，然后旋蒸除去溶剂，残余物用二氯甲烷/甲醇（9/1，v/v）作洗脱剂经硅胶柱层析分离纯化，重结晶得到白色蜡状固体11.1g，收率52%。
化合物的表征
1HNMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)=8.28～8.31(t，1H)，4.56～4.58(t，4H)，4.11～4.13(d，1H)，3.34～3.85(m，502H)，2.59～2.62(t，2H)，2.47～2.50(t，2H)，2.32(s，1H).13CNMR(100MHz，CDCl3)δ=172.28，169.99，83.49，79.48，72.33，69.77，68.24，63.34，60.20，55.11，30.85，28.45，27.51.IR(v-1，LiBr):3341，2836，2122，1714，1545，1502，1415，1217，1156，957，811，720.
式中所述的PEG2K为分子量为2000的聚乙二醇。
以上数据证明上述制备的化合物为结构式（V）所示的含PEG2K的丙炔胺衍生物，
（2）含TEMPO聚炔衍生物的合成
在20mL烘焙的带三通阀的Schlenk瓶中加入1(309mg，1mmol)和2（2137mg，1mmol），通过侧臂抽真空，充氮气三次，注入4mL现蒸的THF溶解单体。在另外的瓶中将催化剂[Rh(nbd)Cl]2(0.004mmol)溶于1mLTHF，加入1滴Et3N，再转移到单体溶液中，溶液在40℃反应24h。反应后的溶液倒入大量的乙醚中沉淀，过滤，沉淀物溶解在水中，用CelluSepH1-membrane(MWCO10000)在纯水中透析1天，最后冷冻干燥得到含TEMPO聚炔衍生物1.3g.
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ(ppm)=5.04(s，1H)，3.41～4.21(m，225H)2.58～2.60(m，2H)，2.38～2.41(m，2H)，1.88～1.91(m，1H)，1.54～1.60(m，2H)，1.18(s，12H).IR(v-1，LiBr):3339，2908，1704，1650，1528，1445，1167，987.核磁测量条件为：加入10倍的苯肼，反应0.5h后测量。
对照结构式（IV）所示的含TEMPO丙炔胺衍生物、结构式（V）所示的含PEG2K的丙炔胺衍生物和含TEMPO聚炔衍生物的氢核磁谱图，结果图1。通过比较可知，结构式（IV）所示的含TEMPO丙炔胺衍生物和结构式（V）所示的含PEG2K的丙炔胺衍生物分别在2.27和2.32ppm显示出乙炔三键的氢质子峰。而在有机自由基MRI造影剂的氢核磁谱图中，上述峰消失。这说明结构式（IV）所示的含TEMPO丙炔胺衍生物和结构式（V）所示的含PEG2K的丙炔胺衍生物发生了聚合反应，制备得到有机自由基MRI造影剂。
同时也对结构式（IV）所示的含TEMPO丙炔胺衍生物、结构式（V）所示的含PEG2K的丙炔胺衍生物和有机自由基MRI造影剂进行红外分析，如图2。结构式（IV）所示的含TEMPO丙炔胺衍生物和结构式（V）所示的含PEG2K的丙炔胺衍生物分别在2123和2122cm-1出显示出乙炔三键的振动峰；而在有机自由基MRI造影剂的红外谱图中，上述波数未出现峰。这同样表明结构式（IV）所示的含TEMPO丙炔胺衍生物和结构式（V）所示的含PEG2K的丙炔胺衍生物发生了反应，制备得到含TEMPO聚炔衍生物。
（3）可视化含TEMPO聚炔衍生物的合成
将5(6)-羧基荧光素(80mg)和N-羟基丁二酰亚胺（80mg）溶解在10mLDMSO中，室温下搅拌30min。EDC.HCl(80mg)和含TEMPO聚炔衍生物(200mg)加入上述溶液，室温下反应24h。反应后的溶液倒入大量的乙醚中沉淀，过滤，沉淀物溶解在水中，用CelluSepH1-membrane(MWCO10000)在纯水中透析1天，最后冷冻干燥得到可视化含TEMPO聚炔衍生物。
(4)含叶酸的可视化含TEMPO聚炔衍生物的合成
将叶酸(22mg)和N-羟基丁二酰亚胺（5.75mg）溶解在10mLDMSO中，室温下搅拌30min。EDC.HCl(10mg)和可视化含TEMPO聚炔衍生物(200mg)加入上述溶液，室温下反应24h。反应后的溶液倒入大量的乙醚中沉淀，过滤，沉淀物溶解在水中，用CelluSepH1-membrane(MWCO5000)在纯水中透析1天，最后冷冻干燥得到含叶酸的可视化含TEMPO聚炔衍生物。
（5）可视化含TEMPO聚炔衍生物和含叶酸的可视化含TEMPO聚炔衍生物的T1弛豫率的测定
将可视化含TEMPO聚炔衍生物和含叶酸的可视化含TEMPO聚炔衍生物用PBS稀释，分别配置TEMPO浓度为0，2，4，6，8，10mmol/mlPBS溶液分装于管径为1cm的试管中，置于塑料试管架上，采用3.0TMR（GE，SIGNAEXCITE）8通道头部线圈进行扫描，扫描序列采用试管横断面，扫描序列采用T1mapping，随后测量各个浓度试管中部4个层面的T1值，取其平均值，计算样品的T1弛豫率，即含TEMPO浓度与1/T1直线方程的斜率。结果如图3所示。从图3可以看出可视化含TEMPO聚炔衍生物和含叶酸的可视化含TEMPO聚炔衍生物具有良好的T1弛豫性能。
（5）MTT法检测细胞生长活性
将HeLa细胞以每孔6X103个细胞接种于96孔板，培养过夜，换用TEMPO浓度分别为2，4，6，8，10mmol/ml的可视化含TEMPO聚炔衍生物的细胞培养液，继续培养24h后，吸弃上清液，每孔加入200mlMTT试剂（5mg/ml，用PBS配制）；继续培养4h，弃去培养液，每孔加入150μlDMSO，置于细胞摇床中10min，至蓝色颗粒完全溶解。用酶标仪(ELX800全自动酶标仪，美国宝特仪器有限公司)在激发波长为490nm条件下，测定各孔吸光度值，以含有细胞的培养液和MTT为对照组，以只加等量的培养液和MTT为空白孔。按照下述公式计算细胞存活率:细胞存活率(%)=(实验孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(对照孔吸光度值-空白孔吸光度值)×100%。以细胞存活率为纵坐标，TEMPO浓度为纵坐标绘制可视化含TEMPO聚炔衍生物的细胞毒性曲线。其细胞毒性结果如图4所示。图4显示可视化含TEMPO聚炔衍生物的细胞毒性低。
（6）细胞培养和成像
取对数生长期的HeLa细胞接种于置有6孔板中，培养过夜，换用含有8mol/ml可视化含TEMPO聚炔衍生物的1640培养液继续培养30min后，用磷酸盐缓冲液清洗6孔板3次，除去过量的可视化含TEMPO聚炔衍生物。继续加入DAPI(10mg/ml)的1640培养液继续培养30min后，用磷酸盐缓冲液清洗6孔板3次，除去过量的DAPI。将细胞置于倒置荧光显微镜下观察，DAPI处理后的细胞在细胞质中出现绿色荧光。细胞的荧光成像结果表明可视化含TEMPO聚炔衍生物具有良好的细胞穿透性和荧光成像效果。
（7）可视化含TEMPO聚炔衍生物的HeLa细胞体外MR成像实验
将HeLa细胞悬液接种于6孔板中(5×105个/mL每孔)，培养24h后分别加入可视化含TEMPO聚炔衍生物溶液，浓度分别为每孔TEMPO含量为0，2，4，6，8，10mmol/mL，以仅含正常HeLa细胞者为正常对照组。孵育4h后，用胰酶消化细胞，置于1.5ml离心管中，离心后用PBS再洗涤三遍，分散悬浮在500mL的0.1%agarosegel，然后按浓度梯度顺序摆放于试管架中，使用3.0TMR8通道头部线圈中进行扫描，扫描序列采用快速自旋回波T1WI，具体参数如下：TR400ms，TE12.2ms，FOV16×16mm，矩阵256×192，层厚5mm，重复激励次数8。细胞MRI成像结果表明，可视化含TEMPO聚炔衍生物培养4h后，HeLa细胞的MRI信号明显增强。上述结果说明可视化含TEMPO聚炔衍生物在细胞内显示良好的MRI成像性能。
实施例2
（1）丙炔胺衍生物的制备
（a）含TEMPO丙炔胺衍生物的制备
N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸的制备方法同实施例1步骤（1）。将N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸（1.55g，10mmol）和DMAP（0.122g，1mmol）溶解在100mL二氯甲烷中，室温下搅拌30min。EDC.HCl(1.92g，10mmol)和4-羟基-TEMPO(1.72g，10mmol)加入上述溶液，室温下反应过夜。旋蒸除去溶剂。残余物用正己烷/乙酸乙酯（4/1，v/v）作洗脱剂经硅胶柱层析分离纯化，重结晶得到2.3g红色固体。
（b）含PEG2K丙炔胺衍生物的制备
将N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸（1.55g，10mmol）和NHS（0.46g，4mmol）溶解在100mL二氯甲烷中，室温下搅拌30min。EDC.HCl(1.92g，10mmol)和PEG（Mw=2K）(80g，40mmol)加入上述溶液，室温下反应过夜。反应后的溶液依次用1M的盐酸、饱和NaHCO3水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤3次，有机层在无水MgSO4中干燥，然后旋蒸除去溶剂，残余物用二氯甲烷/甲醇（9/1，v/v）作洗脱剂经硅胶柱层析分离纯化，重结晶得到白色蜡状固体9.2g。
（2）含TEMPO聚炔衍生物的合成
在20mL烘焙的带三通阀的Schlenk瓶中加入含TEMPO丙炔胺衍生物(154.5mg，0.5mmol)和含PEG2K丙炔胺衍生物（2137mg，1mmol），通过侧臂抽真空，充氮气三次，注入4mL无水DMF溶解单体。在另外的瓶中将催化剂[Rh(nbd)Cl]2(0.003mmol)溶于1mLDMF，加入1滴Et3N，再转移到单体溶液中，溶液在40℃反应12h。反应后的溶液倒入大量的乙醚中沉淀，过滤，沉淀物溶解在水中，用CelluSepH1-membrane(MWCO10000)在纯水中透析1天，最后冷冻干燥得到含TEMPO聚炔衍生物1.08g.
（3）可视化含TEMPO聚炔衍生物的合成
将5-羧基荧光素(100mg)和DMAP（100mg）溶解在10mLDMF中，室温下搅拌30min。EDC.HCl(100mg)和含TEMPO聚炔衍生物(200mg)加入上述溶液，室温下反应24h。反应后的溶液倒入大量的乙醚中沉淀，过滤，沉淀物溶解在水中，用CelluSepH1-membrane(MWCO10000)在纯水中透析1天，最后冷冻干燥得到可视化含TEMPO聚炔衍生物。
（4）MTT法检测细胞生长活性
以HeLa细胞作为模型细胞，采用MTT法检测细胞生长活性。其步骤同实施例1步骤5。结果显示其细胞毒性低，生物相容性好。
（5）细胞培养和成像
以HeLa细胞作为模型细胞,考察步骤3制备的可视化含TEMPO聚炔衍生物的荧光成像性能。其步骤同实施例1步骤6。细胞的荧光成像结果表明发现可视化含TEMPO聚炔衍生物具有良好的细胞穿透性和荧光成像效果。
（6）可视化含TEMPO聚炔衍生物的HeLa细胞体外MR成像实验
以HeLa细胞作为模型细胞,考察步骤3制备的可视化含TEMPO聚炔衍生物的MRI成像性能。其步骤同实施例1步骤7。细胞的MRI成像结果表明可视化含TEMPO聚炔衍生物在细胞内显示良好的MRI成像性能。
实施例3
（1）丙炔胺衍生物的制备
（a）含TEMPO丙炔胺衍生物的制备
N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸的制备方法同实施例1步骤（1）。
将N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸（1.55g，10mmol）和DMAP（1.22g，10mmol）溶解在100mL二氯甲烷中，室温下搅拌30min。DCC(2.06g，10mmol)和4-羟基-TEMPO(1.72g，10mmol)加入上述溶液，室温下反应过夜。旋蒸除去溶剂。残余物用正己烷/乙酸乙酯（4/1，v/v）作洗脱剂经硅胶柱层析分离纯化，重结晶得到2.6g红色固体。
（b）含PEG2K丙炔胺衍生物的制备
将N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸（1.55g，10mmol）和DMAP（0.98g，8mmol）溶解在100mL二氯甲烷中，室温下搅拌30min。DCC(2.06g，10mmol)和PEG（Mw=2K）(80g，40mmol)加入上述溶液，室温下反应过夜。反应后的溶液依次用1M的盐酸、饱和NaHCO3水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤3次，有机层在无水MgSO4中干燥，然后旋蒸除去溶剂，残余物用二氯甲烷/甲醇（9/1，v/v）作洗脱剂经硅胶柱层析分离纯化，重结晶得到白色蜡状固体10.3g。
（2）含TEMPO聚炔衍生物的合成
在20mL烘焙的带三通阀的Schlenk瓶中加入含TEMPO丙炔胺衍生物(618mg，2mmol)和含PEG2K丙炔胺衍生物（2137mg，1mmol），通过侧臂抽真空，充氮气三次，注入4mL无水DMSO溶解单体。在另外的瓶中将催化剂[Rh(nbd)Cl]2(0.005mmol)溶于1mLDMSO，加入1滴Et3N，再转移到单体溶液中，溶液在40℃反应18h。反应后的溶液倒入大量的乙醚中沉淀，过滤，沉淀物溶解在水中，用CelluSepH1-membrane(MWCO10000)在纯水中透析1天，最后冷冻干燥得到含TEMPO聚炔衍生物1.57g.
（3）可视化含TEMPO聚炔衍生物的合成
将5(6)-羧基荧光素(10mg)和N-羟基丁二酰亚胺（10mg）溶解在10mLDMF中，室温下搅拌30min。EDC.HCl(10mg)和含TEMPO聚炔衍生物(200mg)加入上述溶液，室温下反应24h。反应后的溶液倒入大量的乙醚中沉淀，过滤，沉淀物溶解在水中，用CelluSepH1-membrane(MWCO10000)在纯水中透析1天，最后冷冻干燥得到可视化含TEMPO聚炔衍生物。
（4）MTT法检测细胞生长活性
以HeLa细胞作为模型细胞，采用MTT法检测细胞生长活性。其步骤同实施例1步骤5。结果显示其细胞毒性低，生物相容性好。
（5）细胞培养和成像
以HeLa细胞作为模型细胞,考察步骤3制备的可视化含TEMPO聚炔衍生物的荧光成像性能。其步骤同实施例1步骤6。细胞的荧光成像结果表明可视化含TEMPO聚炔衍生物具有良好的细胞穿透性和荧光成像效果。
（6）可视化有机自由MRI对比剂的Hela细胞体外MR成像实验
以HeLa细胞作为模型细胞,考察步骤3制备的可视化含TEMPO聚炔衍生物的MRI成像性能。其步骤同实施例1步骤7。细胞的MRI成像结果可视化有机自由MRI对比剂在细胞内显示良好的MRI成像性能。
实施例4
（1）丙炔胺衍生物的制备
（a）含TEMPO丙炔胺衍生物的制备
N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸的制备方法同实施例1步骤（1）。将N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸（1.55g，10mmol）和DMAP（0.244g，2mmol）溶解在100mL二氯甲烷中，室温下搅拌30min。EDC.HCl(1.92g，10mmol)和4-羟基-TEMPO(1.72g，10mmol)加入上述溶液，室温下反应过夜。旋蒸除去溶剂。残余物用正己烷/乙酸乙酯（4/1，v/v）作洗脱剂经硅胶柱层析分离纯化，重结晶得到2.3g红色固体。
（b）含PEG2K丙炔胺衍生物的制备
将N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸（1.55g，10mmol）和NHS（0.85g，7mmol）溶解在100mL二氯甲烷中，室温下搅拌30min。EDC.HCl(1.92g，10mmol)和PEG（Mw=2K）(80g，40mmol)加入上述溶液，室温下反应过夜。反应后的溶液依次用1M的盐酸、饱和NaHCO3水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤3次，有机层在无水MgSO4中干燥，然后旋蒸除去溶剂，残余物用二氯甲烷/甲醇（9/1，v/v）作洗脱剂经硅胶柱层析分离纯化，重结晶得到白色蜡状固体10.8g。
（2）含TEMPO聚炔衍生物的合成
在20mL烘焙的带三通阀的Schlenk瓶中加入含TEMPO丙炔胺衍生物(247.2mg，0.8mmol)和含PEG2K丙炔胺衍生物（2137mg，1mmol），通过侧臂抽真空，充氮气三次，注入4mL无水THF溶解单体。在另外的瓶中将催化剂[Rh(nbd)Cl]2(0.004mmol)溶于1mLTHF，加入1滴Et3N，再转移到单体溶液中，溶液在40℃反应20h。反应后的溶液倒入大量的乙醚中沉淀，过滤，沉淀物溶解在水中，用CelluSepH1-membrane(MWCO10000)在纯水中透析1天，最后冷冻干燥得到含TEMPO聚炔衍生物1.38g.
（3）可视化含TEMPO聚炔衍生物的合成
将6-羧基荧光素(80mg)和N-羟基丁二酰亚胺（80mg）溶解在10mLDMF中，室温下搅拌30min。EDC.HCl(80mg)和含TEMPO聚炔衍生物(200mg)加入上述溶液，室温下反应24h。反应后的溶液倒入大量的乙醚中沉淀，过滤，沉淀物溶解在水中，用CelluSepH1-membrane(MWCO10000)在纯水中透析1天，最后冷冻干燥得到可视化含TEMPO聚炔衍生物。
（4）MTT法检测细胞生长活性
以HeLa细胞作为模型细胞，采用MTT法检测细胞生长活性。其步骤同实施例1步骤5。结果显示其细胞毒性低，生物相容性好。
（5）细胞培养和成像
以HeLa细胞作为模型细胞,考察步骤3制备的可视化含TEMPO聚炔衍生物的荧光成像性能。其步骤同实施例1步骤6。细胞的荧光成像结果表明可视化含TEMPO聚炔衍生物具有良好的细胞穿透性和荧光成像效果。
（6）可视化有机自由MRI对比剂的Hela细胞体外MR成像实验
以HeLa细胞作为模型细胞,考察步骤3制备的可视化含TEMPO聚炔衍生物的MRI成像性能。其步骤同实施例1步骤7。细胞的MRI成像结果显示可视化含TEMPO聚炔衍生物在细胞内显示良好的MRI成像性能。
实施例5
（1）丙炔胺衍生物的制备
含TEMPO丙炔胺衍生物和含PEG2K丙炔胺衍生物的制备方法同实施例1.
（2）含TEMPO聚炔衍生物的合成
在20mL烘焙的带三通阀的Schlenk瓶中加入含TEMPO丙炔胺衍生物(556.2mg，1.8mmol)和含PEG2K丙炔胺衍生物（2137mg，1mmol），通过侧臂抽真空，充氮气三次，注入4mL无水THF溶解单体。在另外的瓶中将催化剂[Rh(nbd)Cl]2(0.005mmol)溶于1mLTHF，加入1滴Et3N，再转移到单体溶液中，溶液在40℃反应20h。反应后的溶液倒入大量的乙醚中沉淀，过滤，沉淀物溶解在水中，用CelluSepH1-membrane(MWCO10000)在纯水中透析1天，最后冷冻干燥得到含TEMPO聚炔衍生物1.49g.
（3）可视化含TEMPO聚炔衍生物的合成
将6-羧基荧光素(20mg)和N-羟基丁二酰亚胺（20mg）溶解在10mLDMF中，室温下搅拌30min。EDC.HCl(20mg)和含TEMPO聚炔衍生物(200mg)加入上述溶液，室温下反应24h。反应后的溶液倒入大量的乙醚中沉淀，过滤，沉淀物溶解在水中，用CelluSepH1-membrane(MWCO10000)在纯水中透析1天，最后冷冻干燥得到可视化含TEMPO聚炔衍生物。
（4）MTT法检测细胞生长活性
以HeLa细胞作为模型细胞，采用MTT法检测细胞生长活性。其步骤同实施例1步骤5。结果显示其细胞毒性低，生物相容性好。
（5）细胞培养和成像
以HeLa细胞作为模型细胞,考察步骤3制备的可视化含TEMPO聚炔衍生物的荧光成像性能。其步骤同实施例1步骤6。细胞的荧光成像结果表明可视化含TEMPO聚炔衍生物具有良好的细胞穿透性和荧光成像效果。
（6）可视化有机自由MRI对比剂的Hela细胞体外MR成像实验
以HeLa细胞作为模型细胞,考察步骤3制备的可视化含TEMPO聚炔衍生物的MRI成像性能。其步骤同实施例1步骤7。细胞的MRI成像结果显示可视化含TEMPO聚炔衍生物在细胞内显示良好的MRI成像性能。
实施例6
（1）丙炔胺衍生物的制备
含TEMPO丙炔胺衍生物和含PEG2K丙炔胺衍生物的制备方法同实施例1.
（2）含TEMPO聚炔衍生物的合成
在20mL烘焙的带三通阀的Schlenk瓶中加入含TEMPO丙炔胺衍生物(309mg，1mmol)和含PEG2K丙炔胺衍生物（2137mg，1mmol），通过侧臂抽真空，充氮气三次，注入4mL无水THF溶解单体。在另外的瓶中将催化剂[Rh(nbd)Cl]2(0.005mmol)溶于1mLTHF，加入1滴Et3N，再转移到单体溶液中，溶液在40℃反应16h。反应后的溶液倒入大量的乙醚中沉淀，过滤，沉淀物溶解在水中，用CelluSepH1-membrane(MWCO10000)在纯水中透析1天，最后冷冻干燥得到含TEMPO聚炔衍生物1.02g.
（3）可视化含TEMPO聚炔衍生物的合成
将5(6)-羧基荧光素(50mg)和N-羟基丁二酰亚胺（50mg）溶解在10mLDMF中，室温下搅拌30min。EDC.HCl(50mg)和含TEMPO聚炔衍生物(200mg)加入上述溶液，室温下反应24h。反应后的溶液倒入大量的乙醚中沉淀，过滤，沉淀物溶解在水中，用CelluSepH1-membrane(MWCO10000)在纯水中透析1天，最后冷冻干燥得到可视化含TEMPO聚炔衍生物。
（4）MTT法检测细胞生长活性
以HeLa细胞作为模型细胞，采用MTT法检测细胞生长活性。其步骤同实施例1步骤5。结果显示其细胞毒性低，生物相容性好。
（5）细胞培养和成像
以HeLa细胞作为模型细胞,考察步骤3制备的可视化含TEMPO聚炔衍生物的荧光成像性能。其步骤同实施例1步骤6。细胞的荧光成像结果表明发现可视化含TEMPO聚炔衍生物具有良好的细胞穿透性和荧光成像效果。
（6）可视化有机自由MRI对比剂的Hela细胞体外MR成像实验
以HeLa细胞作为模型细胞,考察步骤3制备的可视化含TEMPO聚炔衍生物的MRI成像性能。其步骤同实施例1步骤7。细胞的MRI成像结果显示可视化含TEMPO聚炔衍生物在细胞内显示良好的MRI成像性能。
Claims (3)
1.一种可视化含TEMPO聚炔衍生物的制备方法，由以下步骤组成：
（1）将1摩尔量的丙炔胺和1摩尔量的丁二酸酐在适量无水二氯甲烷中反应得到N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸；将1摩尔量的N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸和1摩尔量的4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物在适量二氯甲烷中进行酯化反应得到含TEMPO的丙炔胺衍生物；将1摩尔量的N-丙炔基-4-氨基-4-氧代丁酸和1摩尔量的分子量为2000的聚乙二醇在适量二氯甲烷中进行酯化反应得到含PEG2K的丙炔胺衍生物；
（2）将1摩尔量的含PEG2K的丙炔胺衍生物，0.5～2摩尔量的含TEMPO的丙炔胺衍生物和适量[Rh(nbd)Cl]2，在适量N,N-二甲基甲酰胺或者四氢呋喃中，40℃下反应12～24h，得到含TEMPO聚炔衍生物；
(3)将重量比为5～50：100的5(6)-羧基荧光素和含TEMPO聚炔衍生物在适量N,N-二甲基甲酰胺或者DMSO中进行酯化反应得到可视化含TEMPO聚炔衍生物。
2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的含TEMPO的丙炔胺衍生物和含PEG2K的丙炔胺衍生物的摩尔比是1：1。
3.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的5(6)-羧基荧光素和含TEMPO聚炔衍生物的重量比为10～40：100。
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