CN102796235B - 一种环境响应基础共聚物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种环境响应基础共聚物及其制备方法，具有明确的三嵌段结构，依次分别为疏水段、亲水环境响应段和具有反应活性的聚N-甲基丙烯酰氧琥珀酰亚胺(PNAS)链；制备方法为：将疏水段与一个小分子链转移剂连接，制备一种大分子引发剂；将环境响应单体与大分子引发剂进行第一步聚合；将N-甲基丙烯酰氧琥珀酰亚胺(NAS)单体与第一步的产物进行第二步聚合，制备出环境响应基础共聚物。本发明的优点：环境响应基础共聚物的结构是可控的，疏水段、亲水环境响应段与PNAS链相互独立，具有清晰明确的结构，可以充分发挥各链段的性能。

Description

一种环境响应基础共聚物及其制备方法
【技术领域】
本发明涉及智能药物技术领域，具体地说，是一种环境响应基础共聚物及其制备方法。
【背景技术】
很多药物在体内的分布不具选择性，或是水溶性差，使药物对健康组织产生毒性或是极易被清除。靶向给药、可控释药能够在取得治疗效果的同时将药物对健康组织的毒性降低，一直是药物开发和治疗研究的重点。以共聚物胶束作为载体，包埋药物制备用于疾病治疗的靶向载药胶束。运用具有可检测功能的共聚物，使胶束本身具有可检测性或包埋诊断试剂就能制备用于疾病进行诊断的同时具有疾病治疗与检测诊断功能的多功能疾病胶束诊疗平台。
以制备一种用于肿瘤的诊疗平台为例。肿瘤靶向分为主动靶向和被动靶向。前者利用抗体与抗原或肿瘤相关受体的配体与受体间的特异性结合来实现。后者通过实体肿瘤的EPR(enhanced permeability and retention)效应实现。EPR效应：肿瘤细胞快速无节制的生长需要大量血液输送营养物质、氧气，引发血管生长过度丰富而杂乱，结构不完整，存在大量的增殖性血管壁内皮细胞，导致血管内皮细胞之间的间隙达到了200-600nm；血管通透因子引发的外渗；损坏的淋巴毛细管引起的肿瘤淋巴排泄功能低下。EPR效应可以促进大分子和纳米颗粒在肿瘤组织中被动蓄积。肿瘤靶向的药物输送系统，能够将治疗剂量控制在尽可能低的范围内，以降低对非靶点的毒性，又能够将足够剂量的药物输送到病灶取得治疗效果。
共聚物胶束适合作为抗肿瘤药物载体的优势：(1)共聚物胶束生物相容性良好的亲水外壳包裹着包埋有难溶药物的疏水内核，将抗肿瘤药物与外界隔离，避免药物起效前失效，并能够抑制胶束与生物组分的非特异性作用。因此可以延长胶束在血液中循环的时间；(2)具有合适的窄分布粒径(数十到两百纳米)，可以避免快速肾小球滤除。在静注给药后能通过EPR效应蓄积至肿瘤组织；(3)共聚物胶束外壳接入具有主动肿瘤靶向功能的配体，如抗体、表皮生长因子、α2-糖蛋白、转铁蛋白、叶酸等，使胶束能够主动被肿瘤细胞内吞；
(4)在实体肿瘤中，局部温度较健康组织升高(2～5℃)或者pH值的降低(1～2.5pH值)，多数肿瘤细胞周围的pH在5.7～7.8。当胶束被细胞内吞后将进入细胞的溶酶体(lysosome)和内涵体(endosome)，其中的pH在5.0～6.0。将胶束的外壳设计成具有pH协同温敏性能，能够对pH和温度进行综合响应，并且带有主动肿瘤靶向配体，这对于肿瘤靶向给药是大有裨益的。
近年来，随着纳米技术的突飞猛进，一门新的交叉学科诊疗学(Theranostics)逐步发展了起来。诊疗学主要综合了治疗和诊断两个概念，可以实现同步的诊断与治疗。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种环境响应基础共聚物及其制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种环境响应基础共聚物，共聚物的结构如结构式1所示，具有明确的三嵌段结构，依次分别为疏水段、亲水环境响应段和具有反应活性的聚N-甲基丙烯酰氧琥珀酰亚胺(PNAS)链。
Figure BDA00001736923600021
式1
所述的疏水段的材料选自可生物降解疏水性聚合物，包括聚氨基酸、多肽、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚己内酯、聚乳酸聚己内酯共混材料及其衍生物中的一种或几种。
所述的亲水环境响应段的环境响应包括温度、pH、超声、光。环境响应材料选自N-烷基丙烯酰胺类，如：N-(异)丙基(甲基)丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、2-羧基异丙基丙烯酰胺。烯酸类及其酯类，如：甲基丙烯酸、双甲基丙烯酸、10-十一烯酸、甲基丙烯酸[2-(二甲基氨基)乙基]酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸二异丙胺基乙酯、甲基丙烯酸二乙胺基乙酯。其他如：甲基纤维素、羧基丙基纤维素、乙烯醇-乙酸乙烯酯共聚物、乙烯基甲醚、N-乙烯基己内酰胺、聚氨酯。亲水环境响应段形成具有极好生物相容性的胶束外壳。起到稳定、保护胶束的作用，并可进行环境响应释放胶束包埋的药物和诊断试剂。
所述的具有反应活性的聚N-甲基丙烯酰氧琥珀酰亚胺(PNAS)聚合物链为N-甲基丙烯酰氧琥珀酰亚胺聚合而成。
疏水段形成胶束的疏水内核，用于包埋疏水性难溶药物和诊断试剂。
亲水环境响应段形成具有极好生物相容性的胶束外壳；起到稳定、保护胶束的作用，并可进行环境响应释放胶束包埋的药物和诊断试剂；PNAS链使基础共聚物能够与不同的功能配体，如叶酸、荧光素、氮氧自由基，连接制备各种功能模块，包括靶向和检测功能模块。
各功能模块，包括靶向和检测功能模块，都具有一致的环境响应性能；各功能模块可以整合成为一个仓储式功能模块库；根据需要从库中选取多种不同功能模块，包括靶向和检测功能模块，按需要比例混合，包埋药物或诊断试剂，组成多功能疾病诊疗胶束，实现同时靶向给药和仪器的检测。可为疾病的实验室研究与临床治疗提供一种使用简便的多功能平台(如附图1所示)。
仓储式功能模块库是开放式的；若库中现有功能模块不能满足需要；本发明的基础共聚物能够迅速而简单地与新的功能配体相连接，方便地扩展出新的功能模块，扩充功能模块库，而不必从头设计合成功能材料，大大简化功能材料的制备过程。实现在生物医学领域更多、更广的应用。
一种环境响应基础共聚物在制备肿瘤药物领域中的应用。
本发明可为疾病的实验室研究与临床治疗提供一种使用简便的多功能平台。
所述的多功能疾病诊疗胶束，所述的胶束粒径小于200nm，最优值为100～150nm。
所述的多功能疾病诊疗胶束，制备过程中无需添加其他额外的乳化剂。最适合的制备方法有如下两种：
透析法：用可以溶解功能模块，包括靶向和检测功能模块，和药物或诊断试剂，同时又与水能够互溶的有机溶剂，如DMF(二甲基甲酰胺)，DMSO(二甲基亚砜)，溶解功能模块与药物或诊断试剂，将混合溶液置入透析袋内对水透析，自组装形成包埋有药物或诊断试剂的胶束。
溶剂挥发成膜法制备法：将功能模块，包括靶向和检测功能模块，和药物或诊断试剂同时溶解于易挥发的有机溶剂，如氯仿，二氯甲烷，将混合溶液置于烧瓶中，减压旋蒸除去有机溶剂，使功能模块与药物或诊断试剂在瓶壁形成一层薄膜。然后向瓶中注入水，使薄膜充分被水浸润，自组装形成包埋有药物或诊断试剂的胶束。最后透析除去未包埋的药物或诊断试剂和其他杂质。
一种环境响应基础共聚物的制备方法，其具体步骤为：
(1)将疏水段与一个小分子RAFT链转移剂以摩尔比1∶1的比例连接，制备一种大分子RAFT引发剂；RAFT是指可逆加成-断裂链转移聚合方法；
(2)将环境响应单体与大分子RAFT引发剂以摩尔比100∶0.01到100∶1的比例进行一步RAFT聚合；
(3)将N-甲基丙烯酰氧琥珀酰亚胺(NAS)单体与第一步的产物以摩尔比100∶0.01到100∶1的比例进行第二步RAFT聚合，制备出环境响应基础共聚物。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：
本发明的优点在于环境响应基础共聚物的结构是可控的，疏水段、亲水环境响应段与PNAS链相互独立，具有清晰明确的结构，可以充分发挥各链段的性能。由基础共聚物能够简单地制备多种功能模块，包括靶向与检测模块。根据治疗的需要和检测手段的不同，灵活选取相应的靶向和检测功能模块，制备包埋药物或诊断试剂的多功能疾病诊疗胶束，实现同时靶向给药和仪器的检测。
【附图说明】
附图1以基础共聚物开发出功能模块组成仓储式功能模块库，根据需要选取相应的功能模块自组装成功能胶束。
附图2基础共聚物PLA-PNNUA-PNAS的合成及其三种功能模块PLA-PNNUA-FA、PLA-PNNUA-FITC和PLA-PNNUA-TEMPO的合成。
附图3基础共聚物PLA-PNNUA-PNAS的结构(A)与1H NMR谱(B)。
附图4胶束的pH协同温敏性能。
附图5多功能胶束的荧光图谱。
附图6多功能胶束的电子顺磁共振图谱。
附图7多功能胶束的透射电镜照片(A)与粒径分布(B)
附图8多功能胶束对KB细胞与NIH 3T3细胞共同孵育3小时的激光共聚焦显微镜照片(图8A、B)与电子顺磁共振图谱(图8a、b)。
附图9阿霉素诊疗胶束的透射电镜照片。
附图10阿霉素诊疗胶束的粒度分布(A)和zeta电位(B)。
附图11阿霉素诊疗胶束37℃下在不同PBS缓冲液中的释药曲线。
附图12游离阿霉素和阿霉素诊疗胶束对MCF-7细胞的细胞毒性。
附图13MCF-7荷瘤小鼠的活体成像(图13a)与组织照片(图13b)。
附图14MCF-7荷瘤小鼠的活体成像(图14a)与组织照片(图14b)。
附图15PLA-PNNUA-FA，PLA-PNNUA-FITC，PLA-PNNUA-TEMPO和PLA-PNNUA的细胞毒性测试。
【具体实施方式】
以下提供本发明一种环境响应基础共聚物及其制备方法的具体实施方式。
实施例1
聚乳酸(PLA)的制备
在烧瓶内加入工业DL-乳酸22.5g。氮气保护下升温至130℃并保温3小时。冷却至50℃后加入20mL甲苯和催化剂二水辛酸亚锡100mg，160℃，反应24小时。反应完后冷却至室温，将反应液全部倒入50％乙醇中，静置产生沉淀。过滤收集沉淀后用无水乙醇清洗，室温真空干燥24小时。即为目标产物聚乳酸(PLA)，Mn＝2300g/mol；Mw/Mn＝1.94(凝胶渗透色谱仪，GPC)。
小分子RAFT链转移剂的合成
烧瓶内加入正十二疏醇20.20g和四丁基溴化铵，丙酮溶解。滴加50％氢氧化钠水溶液10mL。加入二硫化碳7.61g，氯仿20mL和50％氢氧化钠溶液20mL，反应过夜。滴加入浓盐酸，产生固体物。过滤反应液，收集固体，正己烷重结晶，室温真空干燥后得黄色结晶小分子RAFT链转移剂。
1H NMR(δ，ppm)：0.88(t，3H，CH3)，1.23-1.43(m，18H，CH2-CH2)，1.61-1.74(m，8H，C-CH3和S-CH2-CH2)，3.28(t，2H，S-CH2)。
聚乳酸大分子RAFT引发剂的合成
烧瓶中加入小分子RAFT链转移剂3.6g和少量三乙胺，二氯甲烷溶解。加入等摩尔量的草酰氯，反应6小时。过滤，收集滤液，转移入装有聚乳酸3.7g的烧瓶中，室温下反应24小时。然后将反应液减压旋蒸浓缩，倾倒入冰无水乙醚中产生沉淀，离心收集沉淀清洗后真空烘箱40℃烘干，得到淡黄色粉末聚乳酸大分子RAFT引发剂，分子量2300g/mol(凝胶渗透色谱仪，GPC)。
基础共聚物PLA-PNNUA-PNAS的合成
第一步，向烧瓶中加入一定比例的N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基马来酰胺酸、10-十一烯酸，DMF(二甲基甲酰胺)溶解。加入AIBN(偶氮二异丁腈)和聚乳酸大分子RAFT引发剂。通氮气除氧。80℃反应6小时。反应结束后将反应液倒入无水乙醚中，将得到的沉淀离心收集，清洗后室温真空烘干，得白色粉末PLA-PNNUA，Mn＝34400g/mol，Mw/Mn＝1.18(凝胶渗透色谱仪，GPC)。
第二步，以PLA-PNNUA作为RAFT引发剂，与单体NAS(N-甲基丙烯酰氧琥珀酰亚胺)制备基础共聚物PLA-PNNUA-PNAS。烧瓶中加入PLA-PNNUA和NAS单体，加入5mLDMF溶解，加入AIBN。通氮气除氧。80℃反应6小时。反应结束后将反应液倒入无水乙醚中，将得到的沉淀离心收集，清洗后室温真空烘干，得白色粉末PLA-PNNUA-PNAS，Mn＝48800g/mol，Mw/Mn＝1.22(凝胶渗透色谱仪，GPC)。核磁共振氢谱(1H NMR，附图3)对PLA-PNNUA-PNAS的结构经行了表征，结果表明成功制备了环境响应基础共聚物PLA-PNNUA-PNAS。
实施例2
肿瘤靶向PLA-PNNUA-FA、荧光PLA-PNNUA-FITC和TEMPO自旋标记
PLA-PNNUA-TEMPO三种不同功能模块的制备
1.肿瘤靶向PLA-PNNUA-FA功能模块的制备
烧瓶中加入FA(叶酸)0.5g，DMSO(二甲基亚砜)溶解。冰水浴下加入DCC(N，N’-二环己基碳二亚胺)0.5g和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)0.3g。暗处反应过夜。反应完成后，过滤除去白色副产物沉淀，将滤液倒入无水乙醚中，产物为NHS活化的叶酸FA-NHS，离心分离沉淀并清洗，室温真空干燥。烧瓶中先后加入等摩尔2，2’-(乙烯二氧)双(乙胺)和FA-NHS，DMSO溶解，避光反应48小时。反应液倒入无水乙醚中，产生橘黄色浆状物，为氨基化的叶酸FA-NH2，离心收集清洗后真空干燥。
将PLA-PNNUA-PNAS与FA-NH2混合溶于DMSO，避光反应48小时。反应液对1000mL超纯水透析24小时。冻干透析袋内的液体，得到浅黄色粉末，为肿瘤靶向功能模块PLA-PNNUA-FA。
2.荧光PLA-PNNUA-FITC功能模块的制备
烧瓶中加入2，2’-(乙烯二氧)双(乙胺)和FITC(异硫氰酸荧光素)，DMSO溶解。避光反应48小时。反应液倒入无水乙醚中，底部产生黄绿色浆状物，为氨基化异疏氰酸荧光素FITC-NH2，离心后收集清洗后室温真空干燥。
将PLA-PNNUA-PNAS与FITC-NH2溶于DMSO，避光反应48小时。反应液对1000mL超纯水透析24小时。冻干透析袋内的液体，得到浅黄绿色粉末，为荧光功能模块PLA-PNNUA-FITC。
3.TEMPO(4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基)自旋标记PLA-PNNUA-TEMPO功能
模块的制备
将PLA-PNNUA-PNAS与TEMPO溶于DMSO，避光反应48小时。反应液对1000mL超纯水透析24小时。冻干透析袋内的液体，得到橘红色粉末，为TEMPO自旋标记功能模块PLA-PNNUA-TEMPO。
实施例3
仓储式功能模块库的建立
以实施例5中制备的三种功能模块PLA-PNNUA-FA、PLA-PNNUA-FITC和PLA-PNNUA-TEMPO一起建立了一个仓储式的功能模块库。可根据需要从仓储式功能模块库中选取多种不同功能模块，包括肿瘤靶向和检测功能模块，按任意需要比例混合，按需包埋抗肿瘤药物，组成多功能肿瘤诊疗胶束。
实施例4
pH协同温敏LCST(低临界溶解温度)的测定
用可见光吸收法在波长542nm处测定胶束在考察胶束的pH协同温敏响应性能。以超纯水作为透光率＝100％。将PLA-PNNUA胶束分别用pH值为7.4、6.5和5.0的PBS缓冲溶液(0.02M)配制成浓度500mg/mL，以透光率对温度绘制出曲线，得到各pH值下的LCST(附图4)。结果显示，胶束的LCST在pH值5.0时为35.4℃，pH值6.5时为37.5℃，pH值7.4时为39.4℃。
实施例5
具有肿瘤靶向、荧光和TEMPO自旋标记功能的多功能胶束的制备与表征
多功能胶束由透析法制备。将PLA-PNNUA与三种功能模块PLA-PNNUA-FA，PLA-PNNUA-FITC和PLA-PNNUA-TEMPO以适当比例混合，溶于1mL DMSO中。对超纯水1000mL透析24小时。在激发波长488nm下，530nm处的荧光峰是属于PLA-PNNUA-FITC中FITC所发出荧光(附图5)。附图6为电子顺磁共振图谱，谱线具有典型的14N三线态超精细裂分结构，属于PLA-PNNUA-TEMPO中TEMPO的顺磁信号。
透射电镜照片显示多功能胶束为均一分散的球形纳米颗粒，平均水合半径为121.5nm，PDI＝0.19(附图7)。
实施例6
多功能胶束的体外细胞摄取实验
使用激光共聚焦显微镜和电子顺磁共振方法评价多功能胶束对叶酸受体过度表达的KB细胞(人口腔表皮样癌细胞)和叶酸受体表达缺乏的NIH 3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)进行体外细胞摄取考察。
首先是激光共聚焦显微镜观察，取KB细胞或者NIH 3T3细胞种入带有盖玻片的6孔板。培养24小时贴壁后弃去原培养基，加入浓度250mg/L的多功能胶束培养液。继续培养3小时后，PBS缓冲液洗涤，4％多聚甲醛，1％Triton(曲拉通)X-100，1μg/mL DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)染色细胞核。将盖玻片取出密封后用激光共聚焦显微镜观察，激发波长为405、488nm，发射波通道选择分别为DAPI和FITC。
第二部分是电子顺磁共振检测。取KB细胞或者NIH 3T3细胞种入6孔板。培养24小时贴壁后弃去原培养基，加入浓度250mg/L的多功能胶束培养液。继续培养3小时后，PBS缓冲液洗涤，胰酶消化，加入PBS缓冲液使细胞重新悬浮，离心弃去上清液收集细胞。高纯氮气流吹干细胞，加入0.2mL DMSO，超声30分钟后用电子顺磁共振波谱仪X-波段于298K下检测DMSO溶液的电子顺磁共振信号。
激光共聚焦显微镜观察显示胶束能够选择性地被KB细胞摄取。从附图8A的FITC通道中可以看出胶束中PLA-PNNUA-FITC所产生的荧光发自细胞胞浆。这是胶束通过KB细胞的内吞作用进入细胞的典型特征。但当多功能胶束与在同样条件下与NIH 3T3细胞共同孵育后，由于NIH 3T3细胞表面缺乏叶酸受体，从附图8B的FITC通道中未发现FITC所发出的荧光。附图8A、B右下角小图分别是KB细胞和NIH 3T3细胞的顺磁电子信号图谱，可以发现KB细胞具有较强的信号而NIH 3T3细胞未检测出信号。这与激光共聚焦显微镜观察的结果相符。
实施例7
肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束的制备
肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束包埋有具有荧光的抗肿瘤药物阿霉素(DOX)，同时具有肿瘤靶向和荧光功能。将肿瘤靶向功能模块PLA-PNNUA-FA与PLA-PNNUA溶于氯仿，加入阿霉素氯仿溶液。混合后旋蒸除去氯仿。超声下加入10mL双蒸水，即得肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束(样品编号FA-PN4-7)。将胶束置于透析袋中，对1000mL超纯水透析24小时。透析介质在480nm波长下用紫外-可见光分光光度仪测定吸光度，代入阿霉素标准曲线计算包封率、载药量。计算公式如下：
Figure BDA00001736923600111
公式1
Figure BDA00001736923600112
公式2
经计算，肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束的包封率为77.48％，载药量为5.51％。透射电镜照片显示胶束为均一分散的球形纳米颗粒，而且显示出明显的核壳结构，中间深色区域为包埋有阿霉素的胶束疏水核心，包埋在周围的浅色部分是干燥后塌缩的胶束亲水链段(附图9)。粒径为138.2nm，PDI(分散指数)为0.160，单分散分布，zeta电位为-33.65mv(附图10)。
实施例8
肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束的体外释放
肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束(FA-PN4-7)的体外释放在37℃、100rpm的振荡条件下进行。取新鲜制备的胶束溶液5mL置透析袋中对释放介质透析。释放介质为100mL的PBS缓冲液，pH分别为7.4、6.8、5.5。定时取出3.0mL释放介质，立即补同等体积的新鲜释放介质，用紫外-可见光分光光度法测定释放介质中阿霉素的浓度。根据标准曲线计算药物的释放量，以累计释药百分率对时间作释药曲线。由得到的释药曲线(附图11)可知，肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束释药具有pH敏感的特征，在弱酸环境下，可以较快地释放纳米胶束中阿霉素，而在生理pH或者是较高pH下，释放较为缓慢。
实施例9
肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束的体外抗肿瘤性能
取MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)用MTT法评价肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束(FA-PN4-7)和游离阿霉素的细胞毒性。从附图12可知，在相同浓度相同暴露时间的条件下，肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束的细胞毒性大于游离阿霉素。且两者对细胞的毒性均具有浓度和时间依赖性。游离阿霉素是小分子状态，通过被动扩散进入细胞，而表面带有叶酸分子的肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束是通过受体介导内吞作用的方式进入细胞内，然后积聚在酸性环境的溶酶体和内涵体中，在低pH条件下胶束塌缩挤压释放出药物，进入细胞核与DNA作用影响DNA的复制从而杀死细胞。肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束的细胞毒性与药物的释放有关，胶束进入细胞后通过对环境做出响应快速释放药物，使细胞内短时间内药物浓度大大增加，其速率超过被动扩散依赖细胞内外浓度差的方式，使得药物进入细胞核的速度超过游离阿霉素。
实施例10
肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束在荷MCF-7肿瘤小鼠体内的活体成像实验
使用多功能活体成像系统Kodak In-vivo Imaging System FX Pro对荷MCF-7肿瘤小鼠尾静脉单剂量注射阿霉素或肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束后的药物体内分布进行实时的活体成像检测。
将荷瘤小鼠分为两组，每组4头小鼠。用2％戊巴比妥钠0.2mL腹腔注射全身麻醉。
实验组每头小鼠以阿霉素计5mg/Kg体重单剂量尾静脉注射给药。分组情况如下：
第一组4头小鼠的处理方式分别为：
1-A：阴性对照组，不给药。
1-B：阳性对照组，游离阿霉素溶液。
1-C：肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束。
1-D：无叶酸配体的阿霉素载药胶束。
第二组4头小鼠的处理方式分别为：
2-A：阴性对照组，不给药。
2-B：肿瘤部位先注射KH2PO4溶液(0.02M，pH值约为5.5)再注射肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束。
2-C：肿瘤部位先注射KH2PO4溶液(0.02M，pH值约为5.5)并加热至42℃，再注射肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束，保持42℃半小时。
2-D：肿瘤部位加热至42℃，再注射肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束，保持42℃半小时。
每组注射完成后将小鼠由左至右依次摆放在样品台上，并放置一个装有阿霉素溶液的1.5mL离心管作为阳性对照。设置仪器激发波长＝470nm，检测发射波长＝600nm，曝光时间90S。
实验结果
第一组的实验结果如附图13所示，箭头处为荷瘤位置。给药1小时后，小鼠1-B活体成像的荧光呈现全身分布的特征，而且整体强度较弱，荷瘤部位未见明显的荧光，表明荷瘤部位的阿霉素浓度较低。而且将小鼠解剖后各脏器内的荧光强度都较弱。小鼠1-C荷瘤部位的荧光强度很高，表明小鼠荷瘤部位的阿霉素浓度较高，肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束具有主动靶向肿瘤的能力。从脏器荧光成像来看，肿瘤的荧光强度也较高。小鼠1-D注射的是无叶酸配体的PLA-PNNUA阿霉素载药胶束，从活体成像上可以看出小鼠体内阿霉素的分布也是全身性的，荷瘤部位的荧光强度略强于其他部位。各脏器的荧光强度除了肿瘤和肝脏较高之外其余都较平均。这是由于肿瘤的EPR效应使得胶束具有被动靶向肿瘤组织的能力。本组实验结果表明与游离阿霉素和无叶酸配体的PLA-PNNUA阿霉素载药胶束相比，肿瘤靶向阿霉素诊疗胶束在荷瘤小鼠体内表现出主动靶向肿瘤组织的能力，而且能够延长药物在小鼠体内的循环时间。
第二组的实验结果如附图14所示，箭头处为荷瘤位置。小鼠2-B的肿瘤部位预先注射KH2PO4溶液造成局部弱酸性环境，结果显示小鼠2-B的荷瘤部位呈现出较强的荧光，同时解剖后肿瘤组织也产生了较强的荧光。小鼠2-C的荷瘤部位既经过KH2PO4溶液的酸化，同时又在荷瘤部位局部加热至42℃，以触发载药胶束的pH协同温敏响应。结果显示在小鼠的荷瘤部位显示了极其强烈的荧光，解剖后的肿瘤组织也观察到了很强的荧光。小鼠2-D只在荷瘤部位局部加热至42℃，而没有在荷瘤部位注射KH2PO4溶液，其活体成像和解剖的结果也显示在小鼠的荷瘤部位有较强的荧光。小鼠2-B荷瘤部位荧光较2-C和2-D弱，其原因是活体成像是四头小鼠一次成像，小鼠2-C和2-D的荷瘤部位荧光很强，为了使小鼠2-C和2-D不过曝，降低了整体的荧光强度，从而小鼠2-B的荷瘤部位荧光就显得弱了。
实施例11
功能模块和简单共聚物PLA-PNNUA的细胞毒性测试
取NIH 3T3细胞用MTT(噻唑蓝)法评价PLA-PNNUA-FA、PLA-PNNUA-FITC、PLA-PNNUA-TEMPO和PLA-PNNUA的细胞毒性。实验结果如附图15所示，各功能模块和PLA-PNNUA在达到较高浓度500mg/L，并与细胞共同孵育48小时之后也未发现对细胞的存活率有明显的影响。这表明这些共聚物材料的细胞毒性较低，生物相容性较好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种环境响应基础共聚物，其特征在于，共聚物的结构如结构式1所示，具有明确的三嵌段结构，依次分别为疏水段、亲水环境响应段和具有反应活性的聚N-甲基丙烯酰氧琥珀酰亚胺（PNAS）链； 
所述的疏水段的材料为聚乳酸PLA； 
所述的亲水环境响应段为PNNUA。 
2.如权利要求1所述的一种环境响应基础共聚物，其特征在于，所述的亲水环境响应段的环境响应包括温度、pH、超声、光。 
3.如权利要求1所述的一种环境响应基础共聚物，其特征在于，所述的具有反应活性的聚N-甲基丙烯酰氧琥珀酰亚胺（PNAS）聚合物链为N-甲基丙烯酰氧琥珀酰亚胺聚合而成。 
4.如权利要求1所述的一种环境响应基础共聚物，其特征在于，疏水段形成胶束的疏水内核，用于包埋疏水性难溶药物。 
5.如权利要求1所述的一种环境响应基础共聚物，其特征在于，亲水环境响应段形成具有极好生物相容性的胶束外壳；并可进行环境响应释放胶束包埋的药物和诊断试剂。 
6.如权利要求1所述的一种环境响应基础共聚物的制备方法，其特征在于，其具体步骤为： 
（1）将疏水段与一个小分子RAFT链转移剂以摩尔比1:1的比例连接，制备一种大分子RAFT引发剂；RAFT是指可逆加成-断裂链转移聚合方法； 
（2）将环境响应单体与大分子RAFT引发剂以摩尔比100：0.01到100:1的比例进行第一步RAFT聚合； 
（3）将N-甲基丙烯酰氧琥珀酰亚胺（NAS）单体与第一步的产物以摩尔比100：0.01 到100:1的比例进行第二步RAFT聚合，制备出环境响应基础共聚物。 
7.如权利要求1所述的一种环境响应基础共聚物在制备肿瘤药物领域中的应用。 
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