CN104231036B

CN104231036B - 一种具有类肽连接臂的量子点-多肽复合物的合成方法

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Publication number: CN104231036B
Application number: CN201410407998.7A
Authority: CN
Inventors: 贾明宏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-08-15
Filing date: 2014-08-15
Publication date: 2018-08-31
Anticipated expiration: 2034-08-15
Also published as: CN104231036A

Abstract

本发明提供了一种量子点‑多肽复合物的合成方法。通过多肽末端氨基引发N‑取代‑N‑内羧酸酐开环聚合，形成指定聚合度的类肽连接臂，以类肽侧链的碱性取代基团与量子点外壳层的金属离子螯合，合成量子点‑多肽复合物。

Description

一种具有类肽连接臂的量子点-多肽复合物的合成方法

技术领域

本发明涉及一种以N-取代-N-内羧酸酐为类肽链段单体，以具有末端氨基的多肽为引发剂，引发N-取代-N-内羧酸酐的开环聚合，实现类肽链段与多肽的共价偶联，并以类肽单元中的侧链碱性基团与量子点壳层螯合连接，形成量子点-多肽复合物。本发明属于化学合成领域。

背景技术

由于具有独特的电子和发光特性，量子点被广泛应用于生物标记成像、活细胞生命动态过程示踪、活体动物体内肿瘤细胞靶向示踪等生物医学领域。量子点在生命科学中得以广泛应用的前提是，其经过表面化学修饰后可与一个或多个生物靶向分子连接，进而形成集合自身特性和生物活性的生物复合物。其中最为广泛的方法为，引入金属盐外壳层，通过连接着多肽(peptide)的聚合物与外壳层之间形成配位缔合作用，实现量子点对多肽的对应标记。

上述聚合物作为连接臂，在量子点与多肽之间起到桥梁作用。而作用的机制在于聚合物链段单元中，一般具有路易斯碱性基团，路易斯碱中心的孤对电子可进入外壳层中的金属原子的空d轨道，进而形成配位螯合。这种配位作用其强度接近于离子键，作用稳定持续，拓展并增强这种配位作用，即设计出不同的聚合物连接臂，成为近年拓展量子点种类及适用范围的有效研究手段。

目前研究最为广泛的是通过某些聚氨基酸侧链上的碱性基团与量子点壳层形成配位螯合作用。上述的聚氨基酸即肽链可以是由常见氨基酸得到，如聚组氨酸链段其侧链为咪唑基团， 3位氮原子为强路易斯碱，可与量子点外壳层金属原子形成配位作用；上述的肽链也可以由常见聚氨基酸通过侧链改性而制得。现行方法中，量子点与标记蛋白间的构筑连接臂，即功能性肽段连接方式须采用醛和胺的成腙反应，过程复杂，成腙与成脎反应竞争激烈，产品成脎路径中，易分解为原底物导致连接臂断裂。

N-取代-N-内羧酸酐(N-Substituted N-Carboxylanhydrides，R-NCAs，R为N原子取代基团) 开环均聚后形成类肽(peptoid)，N原子上的取代基R，作为类肽链段的侧链基团，其最大的特点在于所述侧链基团R可以通过分子设计实现不同的化学性质。天然蛋白质中基本不含有类肽链段，不会干扰蛋白质和量子点的功能，结合方式为定点连接，是发展量子点生物标记潜在的有效途径。

另一方面，由于N-取代-N-内羧酸酐在开环过程中存在脱羧驱动力，故反应条件温和、宽泛。热力学方面，N-取代-N-内羧酸酐开环聚合产物稳定，选择性高，体系中基本无副产物，并可以通过调节单体与引发剂比例精确控制类肽聚合度。在制备五元环单体过程中，原料易得，路径适用范围广，见下式1，胺类试剂均可作为原料提供潜在的侧链基团。

以乙醛酸为原料，通过转胺反应引入N原子，通过Boc保护与脱保护，得到五元环单体。其中底物胺的R基团可在较大范围调节，这为精确合成指定类肽提供了可靠的方法；内羧酸酐在亲核试剂作用下，能进行可控开环聚合，也为精确制备指定聚合度的类肽提供了思路。

具有类肽连接臂的量子点-多肽复合物的合成方法的思路为：多肽末端氨基在溶液或者固态合成条件下，直接引发N-取代-N-内羧酸酐开环脱羧，生成肿胺负离子作为活性引发位点，进一步引发体系中其他N-内羧酸酐单体开环，直至体系中环状单体消耗完毕。通过多肽末端氨基引发N-取代-N-内羧酸酐开环聚合，形成指定聚合度的类肽连接臂，以类肽链段中的侧链基团与量子点外壳层的金属离子螯合，合成量子点-多肽复合物。上述过程见式2，此方法目前未见报道。创新性尤其体现在：1.以类肽为量子点连接臂尚未有报道；2.以噻唑、三唑、咪唑啉为碱性基团连接量子点外层金属，尚未有报道。

发明内容

本发明提供了一种具有类胎连接臂的量子点-多肽复合物的合成方法。通过多肽末端氨基引发N-取代-N-内羧酸酐开环聚合，形成指定聚合度的类肽连接臂。以类肽侧链的碱性基团与量子点外壳层的金属离子螯合，合成量子点-多肽复合物。在本发明中，多肽末端氨基在溶液或者固态合成条件下，直接引发N-取代-N-内羧酸酐开环脱羧，生成胺负离子作为活性引发位点，进一步引发体系中其他N-取代-N-内羧酸酐单体开环，直至体系中环状单体消耗完毕。

为了保证所连接功能性多肽的生物活性，N-取代-N-内羧酸酐开环聚合过程所选用的溶剂为所述连接功能性多肽所能承受的有机溶剂体系。所述有机溶剂可以是二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、甲苯中的一种或者几种。单体N-取代-N- 内羧酸酐与引发剂多肽的摩尔比值为2～20的整数，优选为6～14。聚组氨酸理论聚合度为2～20 之间的整数，优选为6～14之间的整数。而所述多肽末端氨基可以为自然的伯胺基团，伯胺氮原子因其具有孤对电子具有路易斯碱性，可对靠近环侧链的羰基碳原子进行亲核进攻。根据对多肽末端氨基的保护要求以及特殊的溶剂极性要求，多肽末端的氨基也可以来源于保护基团去保护后形成的伯胺基。

本发明中所涉及的量子点，可以是本领域技术人员所能理解并实施的含有金属盐壳层的 II-VI族或III-V族元素组成的三维纳米颗粒，例如CdSe/ZnS量子点。Cd类纳米颗粒与体材料相比，具有非常大的比表面积，表面具有较多的缺陷和悬键，量子点的光学性质较差。为了提高量子点的荧光量子产率以及增强其发光稳定性，常以宽带隙半导体微粒ZnS为壳层包覆。 ZnS作为壳层包覆时，其外层可以是进一步的金属盐壳层或者聚合物，连接臂碱性位点正是与包覆壳层中的Zn²⁺形成螯合，实现对量子点的连接。本发明中组氨酸侧链的咪唑基团由于 2-位N原子带有富余孤对电子，易于进入包覆壳层中Zn²⁺的空d轨道，形成螯合作用，起到连接量子点的效果。本发明中所涉及的多肽，可以是本领域技术人员所能理解并实施的多肽。

具体实施方式

用具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限制于此。

实施例1：猪肠毒素源性大肠杆菌K88ac粘附抗原-8单元噻唑侧链类肽连接臂-量子点复合物的合成：

1.N-噻唑-N-内羧酸酐的合成

称取乙醛酸(14.9g)与氨基噻唑(3.4g)，溶解于二氯甲烷(250mL)，室温下搅拌18小时后，旋蒸溶剂，加入盐酸溶液(1M，250mL)。混合液回流加热18小时后，蒸发除去溶剂，得到灰白色固体即乙醛胺，12.3g，产率83％。称取乙醛胺(8.62g)，二碳酸二叔丁酯(28.1 g)，三乙胺(35.8mL)，共混溶解于蒸馏水(200mL)，室温下搅拌18小时，以正己烷(100 mL)萃取3次。水相与盐酸溶液(4M，50mL)共混，乙酸乙酯(100mL)萃取5次。有机相以浓盐水萃取3次，分离有机相，浸泡硫酸镁干燥。过滤后，旋蒸除去溶剂，得到粘稠液体，即2-(N，N-噻唑碳酸酯正丁基胺)乙酸(11.4g，产率72.5％)。称取2-(N，N-噻唑碳酸酯正丁基胺)乙酸(10.2g)，惰气保护下溶解于二氯甲烷中(200mL)，降温至0℃，缓慢滴加三氯化磷(4mL)，混合体系搅拌2小时，真空减压旋蒸除去溶剂。旋蒸产物以二氯甲烷(20 mL)萃取三次，分离有机相，旋蒸除去溶剂得到白色晶体，粗产品以二氯甲烷/正己烷重结晶，得到N-噻唑-N-内羧酸酐(3.5g，产率62％)。

2.量子点复合物的合成

将猪肠毒素源性大肠杆菌K88ac粘附抗原1.21g与N-噻唑-N-内羧酸酐1.45g混合于DMF 溶液中，惰气保护下，室温搅拌2小时。反应液倒入正己烷中析出白色胶壮固体，过滤后真空干燥滤饼。选用CdSe/ZnS壳层量子点，于室温下分散在磷酸盐缓冲液，量子点浓度0.1 mol/L。以N-羟基硫代琥珀酸亚胺为活化剂，浓度为20mol/L，室温下摇床反应1小时，以中性乙腈洗涤，除去过量活化剂。将多肽-类肽连接臂复合物，即猪肠毒素源性大肠杆菌K88ac 粘附抗原-His₈臂，加入上述磷酸缓冲液，所得到的反应产物，在高速离心机(8000r/min)，离心1～2小时，弃去离心上清后，将沉淀分散在磷酸盐缓冲液中，得到猪肠毒素源性大肠杆菌K88ac粘附抗原-8单元噻唑侧链类肽连接臂-量子点复合物，产率51％。

实施例2：乙型肝炎病毒核心抗原-12单元咪唑啉侧链类肽连接臂-量子点复合物的合成：

1.N-咪唑啉-N-内羧酸酐的合成

称取乙醛酸(14.9g)与氨基咪唑(2.9g)，溶解于二氯甲烷(250mL)，室温下搅拌18小时后，旋蒸溶剂，加入盐酸溶液(4M，100mL)。混合液回流加热36小时后，蒸发除去溶剂，得到灰白色固体即乙醛胺，12.1g，产率86％。称取乙醛胺(7.44g)，二碳酸二叔丁酯(27.2 g)，三乙胺(31.0mL)，溶解于蒸馏水(200mL)，室温下搅拌18小时，以正己烷(100mL) 萃取3次。水相与盐酸溶液(4M，50mL)共混，乙酸乙酯(100mL)萃取5次。有机相以浓盐水萃取3次，分离有机相，浸泡硫酸镁干燥。过滤后，旋蒸除去溶剂，得到粘稠液体，即2-(N，N-咪唑啉碳酸酯正丁基胺)乙酸(8.2g，产率67.5％)。称取2-（N，N-咪唑啉碳酸酯正丁基胺)乙酸(8.0g)，惰气保护下溶解于二氯甲烷中(200mL)，降温至0℃，缓慢滴加三氯化磷(4mL)，混合体系搅拌12小时后，真空减压旋蒸除去溶剂。旋蒸产物以二氯甲烷(20mL) 萃取三次，分离有机相，旋蒸除去溶剂得到白色晶体，粗产品以二氯甲烷/正己烷重结晶，得到N-咪唑啉-N-内羧酸酐(3.7g，产率62％)。

2.量子点复合物的合成

将乙型肝炎病毒核心抗原0.67g与N-噻唑-N-内羧酸酐1.25g混合于DMF溶液中，惰气保护下，室温搅拌2小时。反应液倒入正己烷中析出白色胶壮固体，过滤后真空干燥滤饼。选用CdSe/ZnS壳层量子点，于室温下分散在磷酸盐缓冲液，量子点浓度0.1mol/L。以N-羟基硫代琥珀酸亚胺为活化剂，浓度为20mol/L，室温下摇床反应1小时，以中性乙腈洗涤，除去过量活化剂。将多肽-类肽连接臂复合物，即乙型肝炎病毒核心抗原-12单元咪唑啉侧链类肽，加入上述磷酸缓冲液，所得到的反应产物，在高速离心机(8000r/min)，离心1小时，弃去离心上清后，将沉淀分散在磷酸盐缓冲液中，得到乙型肝炎病毒核心抗原-12单元咪唑啉侧链类肽连接臂-量子点复合物，产率64％。

Claims

1.一种具有类肽连接臂的量子点-多肽复合物的合成方法，其特征在于，以N-取代-N-内羧酸酐为类肽链段重复单元来源，以多肽末端氨基为引发位点，引发N-取代-N-内羧酸酐的开环聚合，实现类肽链段与多肽的共价偶联；并且所述类肽链段，作为连接臂，连接多肽与量子点，所述类肽链具有侧链基团，所述侧链基团与量子点壳层通过螯合作用连接；

所述类肽链段的侧链基团来自于N-取代-N-内羧酸酐中N原子的取代基，所述侧链基团为咪唑基团、噻唑基团、三唑基团、咪唑啉基团中的一种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述类肽连接臂的聚合度，为N-取代-N-内羧酸酐与多肽的摩尔量比值。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述N-取代-N-内羧酸酐与多肽的摩尔比值为2～20的整数。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽末端具有伯胺基团。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，多肽末端伯胺基团在有机溶剂中引发N-取代-N-内羧酸酐开环聚合。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述量子点为具有金属盐壳层的量子点。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述类肽连接臂通过侧链基团与量子点金属盐壳层中的金属原子形成螯合，实现稳定连接。