CN118059031A - 一种可注射载药水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可注射载药水凝胶及其制备方法和应用。所述可注射载药水凝胶包括介孔聚多巴胺纳米颗粒、治疗类风湿性关节炎的药物和水凝胶,所述介孔聚多巴胺纳米颗粒负载所述治疗类风湿性关节炎的药物,并分散在所述水凝胶中。本发明设计并制备可注射载药水凝胶,利用介孔聚多巴胺纳米颗粒负载治疗类风湿性关节炎的药物,并分散于水凝胶中,能够对药物进行多级释放,以实现按需释放药物,性能稳定,能有效在类风湿性关节炎关节腔中按需给药的清除关节中的ROS,缓解骨质破坏,从而有效治疗类风湿性关节炎。
Description
技术领域
本发明属于载药水凝胶技术领域,涉及一种可注射载药水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性、使人衰弱的自身免疫性疾病,其特点是滑膜炎症导致渐进性关节破坏。一旦患上类风湿关节炎,关节就会肿胀变形并伴有疼痛,最终导致残疾。虽然引发RA疾病的确切机制尚不清楚,但活性氧(ROS)的过度产生与RA的发展密切相关。免疫细胞(巨噬细胞、T细胞、B细胞、树突状细胞、中性粒细胞等)和滑膜成纤维细胞会分泌多种炎症细胞因子,激活各种氧化酶(NADPH氧化酶、髓过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶和诱导性一氧化氮合酶)等,在RA关节中过度产生ROS。从病理学角度看,类风湿关节中的炎症介质,如ROS、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)会加重炎症。此外,ROS还能反过来促进M1巨噬细胞的极化,并进一步分泌促炎症细胞因子诱发炎症,如IL-6和TNF-α。因此,这些因素共同构成了炎症和氧化应激之间的正反馈,诱导了RA的进展。此外,过量的ROS会影响滑膜增生、新生血管形成和软骨破坏,从而加速RA的进展,这表明ROS在RA的发病机制中具有重要作用。因此,清除RA关节中内源性ROS的策略可能有助于治疗RA患者。
由于纳米技术能够将药物直接输送到目标部位,并具有更高的有效性和安全性,因此已被公认为治疗RA的一种可行策略,以纳米药物为基础的策略(如可注射的水凝胶负载纳米粒子系统)带来了巨大的前景。此外,这些纳米粒子系统还可以在精确控制下随时间释放药物,从而提高药物的有效性和安全性。因此,设计根据病情进展的按需给药ROS响应式的纳米药物,对于治疗类风湿性关节炎具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求,本发明提供一种可注射载药水凝胶及其制备方法和应用,可按需释放药物、性能稳定,有效应用于RA治疗。
为达上述目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种可注射载药水凝胶,所述可注射载药水凝胶包括介孔聚多巴胺纳米颗粒、治疗类风湿性关节炎的药物和水凝胶,所述介孔聚多巴胺纳米颗粒负载所述治疗类风湿性关节炎的药物,并分散在所述水凝胶中。
本发明设计可注射载药水凝胶,利用介孔聚多巴胺纳米颗粒负载治疗类风湿性关节炎的药物,并分散于水凝胶中,能够对药物进行多级释放,以实现按需释放药物,性能稳定,能有效在RA关节腔中按需给药的清除关节中的ROS,缓解骨质破坏,从而有效治疗RA。
优选地,所述可注射载药水凝胶中介孔聚多巴胺纳米颗粒、治疗类风湿性关节炎的药物和水凝胶的质量比为1:(0.5~5):(20~100),包括但不限于1:0.6:22、1:0.8:30、1:1.5:50、1:2:60、1:4.8:99、1:4:80、1:3:70、1:2.5:90、1:3.5:65、1:1.8:55、1:1:40或1:4.5:45。
优选地,所述治疗类风湿性关节炎的药物包括甲氨蝶呤、地塞米松、来氟米特或糖皮质激素中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中所述水凝胶指医用水凝胶。
优选地,所述水凝胶包括透明质酸-聚乙二醇水凝胶。
第二方面,本发明提供第一方面所述的可注射载药水凝胶的制备方法,所述制备方法包括:
将所述介孔聚多巴胺纳米颗粒和含治疗类风湿性关节炎的药物的溶液混合,得到负载治疗类风湿性关节炎的药物的介孔聚多巴胺纳米颗粒,将所述负载治疗类风湿性关节炎的药物的介孔聚多巴胺纳米颗粒分散于水凝胶中,得到所述可注射载药水凝胶。
本发明开发可注射载药水凝胶的制备方法,具有反应步骤简单、成本低、绿色环保等优点,所制备的可注射水凝胶,结构稳定,生物安全性好,并且具有对RA治疗过程可按需给药的功能。
优选地,所述可注射载药水凝胶的制备方法包括:
将均三甲苯、泊洛沙姆和盐酸多巴胺混合,制备介孔聚多巴胺纳米颗粒;将所述介孔聚多巴胺纳米颗粒和含治疗类风湿性关节炎的药物的溶液混合,得到负载治疗类风湿性关节炎的药物的介孔聚多巴胺纳米颗粒;使5-降冰片烯-2-甲胺与透明质酸发生反应,获得降冰片烯修饰的透明质酸,使1,2,4,5-四嗪胺盐酸盐((4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)甲胺盐酸盐)与四臂-聚乙二醇发生反应,获得的四嗪修饰的四臂-聚乙二醇;将所述负载治疗类风湿性关节炎的药物的介孔聚多巴胺纳米颗粒与四嗪修饰的四臂聚乙二醇和降冰片烯修饰的透明质酸混合,得到所述可注射载药水凝胶。
优选地,所述介孔聚多巴胺纳米颗粒的制备方法包括:
利用盐酸多巴胺为原料,均三甲基苯为扩孔剂,氨水为碱性剂,经过离心洗涤、纯化得到介孔聚多巴胺纳米颗粒。
优选地,所述介孔聚多巴胺纳米颗粒的制备方法具体包括:取泊洛沙姆与盐酸多巴胺分散至水-乙醇混合溶液中,加入均三甲苯,混合制备得到乳液;向乳液中加入氨水调节pH值为7.4~10,离心收集的沉淀依次进行洗涤、离心及干燥处理,得到所述介孔聚多巴胺纳米颗粒。
本发明制得介孔聚多巴胺纳米颗粒粒径、孔径均一,并也可较好地分散于水、PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)、生物培养基等溶液体系中以及装载各种各样的药物。
本发制备的介孔聚多巴胺纳米颗粒负载治疗类风湿性关节炎的药物如甲氨蝶呤等,具有良好的清除ROS能力,在ROS存在的条件下进行响应,响应性释放药物,可实现对RA中的ROS浓度响应性释放的功能。
优选地,所述泊洛沙姆、盐酸多巴胺和均三甲苯的质量比为1:(1-1.5):(0.2-0.3)包括但不限于1:1.1:0.21、1:1.2:0.22、1:1.3:0.23、1:1.4:0.25、1:1.3:0.26或1:1.4:0.28。
优选地,所述水-乙醇混合溶液中水、乙醇体积比为1:(1~2),包括但不限于1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8或1:1.9。
优选地,所述降冰片烯修饰的透明质酸的制备方法包括:
使透明质酸钠、缩合剂发生缩合反应,然后加入5-降冰片烯-2-甲胺进行还原反应,得到所述降冰片烯修饰的透明质酸。
优选地,所述缩合剂包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。
优选地,所述透明质酸钠、缩合剂和5-降冰片烯-2-甲胺的摩尔比为1:(1~2):(1~2),包括但不限于1:1:1、1:1.5:1.5、1:1.2:1.8、1:1.6:1.2、1:1.8:1.8、1:1.4:1.9或1:1.9:1.7等等。
优选地,所述透明质酸钠的分子量为30000~50000Da。
优选地,所述还原反应后还包括:将所获还原反应混合物透析以及冷冻干燥的步骤。
优选地,所述冷冻干燥的温度为-50~-40℃。
优选地,所述降冰片烯修饰的透明质酸的制备方法具体包括:
利用透明质酸钠为原料,2-(N-吗啉基)一水乙磺酸为缓冲液,利用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺进行活化,并加入5-降冰片烯-2-甲胺进行还原反应,搅拌,再经透析、冷冻干燥获得降冰片烯修饰的透明质酸。
优选地,所述搅拌的时间为12~18h,包括但不限于13h、14h、15h、16h或17h。
优选地,所述四嗪修饰的四臂聚乙二醇的制备方法包括:
使四臂聚-乙二醇-羧基、活化剂在第一溶剂中混合进行活化,然后加入1,2,4,5-四嗪胺盐酸盐进行反应,获得四嗪修饰的四臂-聚乙二醇。
优选地,所述活化剂包括N,N-二异丙基乙胺与1H-苯并三唑-1-基氧代三吡咯烷基磷六氟磷酸盐。
优选地,所述四臂聚-乙二醇-羧基、缩合剂和1,2,4,5-四嗪胺盐酸盐的质量比为1:(0.02~0.04):(0.25~0.5),包括但不限于1:0.03:0.3、1:0.02:0.35、1:0.035:0.4、1:0.025:0.45或1:0.03:0.48等等。
优选地,所述第一溶剂包括二氯甲烷。
优选地,所述四臂-聚乙二醇-羧基的分子量为15000~25000Da,包括但不限于16000Da、17000Da、18000Da、19000Da、20000Da、21000Da、22000Da、23000Da或24000Da。
优选地,所述四嗪修饰的四臂-聚乙二醇的制备方法具体包括:
利用四臂-聚乙二醇-羧基为原料,二氯甲烷为溶剂,加入N,N-二异丙基乙胺与1H-苯并三唑-1-基氧代三吡咯烷基磷六氟磷酸盐进行活化,并加入1,2,4,5-四嗪胺盐酸盐进行反应,搅拌,乙醚重新沉淀,再溶于水中进行透析、冷冻干燥,获得四嗪修饰的四臂-聚乙二醇。
优选地,所述搅拌的时间为12~18h,包括但不限于13h、14h、15h、16h或17h。
优选地,所述冷冻干燥的温度为-50~-40℃,包括但不限于-49℃、-48℃、-45℃、-43℃或-42℃。
本发明制得水凝胶成份降冰片烯修饰的透明质酸和四嗪修饰的四臂-聚乙二醇之间通过点击反应,反应速度快,能在短时间内快速成胶,具有良好的可塑性和可注射性。
本发明制得可注射水凝胶具有良好的生物安全性和ROS响应性能力,并可对纳米颗粒进行装载,实现对纳米药物装载的药物的二级释放,可实现对RA中的ROS浓度按需释放对应的药物,达到按需给药的功能,有利于实际应用。
作为优选的技术方案,所述可注射载药水凝胶的制备方法包括以下步骤:
(1)载药纳米粒子的合成:取泊洛沙姆与盐酸多巴胺分散至水-乙醇混合溶液中,加入均三甲苯,混合制备得到乳液;向乳液中加入氨水调节pH值为7.4~10,离心收集的沉淀依次进行洗涤、离心及干燥处理,得到所述介孔聚多巴胺纳米颗粒;
(2)降冰片烯修饰的透明质酸的合成:利用透明质酸钠为原料,2-(N-吗啉基)一水乙磺酸为缓冲液,利用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺进行活化,并加入5-降冰片烯-2-甲胺进行反应,搅拌,再经透析、冷冻干燥获得降冰片烯修饰的透明质酸;
(3)四嗪修饰的四臂聚乙二醇的合成:利用四臂-聚乙二醇-羧基为原料,二氯甲烷为溶剂,加入N,N-二异丙基乙胺与1H-苯并三唑-1-基氧代三吡咯烷基磷六氟磷酸盐进行活化,并加入1,2,4,5-四嗪胺盐酸盐进行反应,搅拌,乙醚重新沉淀,再溶于水中进行透析、冷冻干燥获得四嗪修饰的四臂聚乙二醇;
(4)可注射载药水凝胶的制备:将治疗类风湿性关节炎的药物与介孔聚多巴胺颗粒混合,得到混合液,将混合液分别与所述降冰片烯修饰的透明质酸和四嗪修饰的四臂聚乙二醇混合,得到降冰片烯修饰的透明质酸混合液和四嗪修饰的四臂聚乙二醇混合液,所述治疗类风湿性关节炎的药物、介孔聚多巴胺颗粒、降冰片烯修饰的透明质酸和四嗪修饰的四臂聚乙二醇的质量比为1:(0.5~2):(0.5~2):(0.5~2),然后将降冰片烯修饰的透明质酸混合液和四嗪修饰的四臂聚乙二醇混合液按体积比为1:(0.5~2)混合,得到所述可注射载药水凝胶。
本发明制备的按需给药的可注射载药水凝胶,具有ROS响应、多级释放能力,实现对RA治疗过程中的药物按需给药的递送药物系统的构建,为RA精准治疗提供了新的手段与方法。
第三方面,本发明提供第一方面所述的可注射载药水凝胶在制备治疗类风湿性关节炎的产品中的应用。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明设计并制备可注射载药水凝胶,利用介孔聚多巴胺纳米颗粒负载治疗类风湿性关节炎的药物,并分散于水凝胶中,能够对药物进行多级释放,以实现按需释放药物,性能稳定,能有效在RA关节腔中按需给药的清除关节中的ROS,缓解骨质破坏,从而有效治疗RA。
附图说明
图1为本发明一种按需给药的可注射水凝胶中介孔聚多巴胺纳米颗粒的高分辨透射电镜图;
图2为本发明一种按需给药的可注射水凝胶中介孔聚多巴胺纳米颗粒的Zeta电位图;
图3为本发明一种按需给药的可注射水凝胶中介孔聚多巴胺纳米颗粒的水合粒径图;
图4为本发明一种按需给药的可注射水凝胶的混合成胶图;
图5为本发明一种按需给药的可注射水凝胶的扫描电子显微镜图;
图6为本发明一种按需给药的可注射水凝胶的应力应变图;
图7为本发明一种按需给药的可注射水凝胶的溶胀特性图;
图8为本发明一种按需给药的可注射水凝胶的在不同浓度H2O2下的药物释放图;
图9为本发明一种按需给药的可注射水凝胶与HUVEC细胞和Raw264.7共培养24h后,采用CCK-8法测试细胞毒性的结果;
图10为本发明一种按需给药的可注射水凝胶在II型胶原诱导关节炎(CIA)模型的RA老鼠治疗后的爪子厚度图;
图11为本发明一种按需给药的可注射水凝胶在CIA模型的RA疗后的临床评分图;
图12为本发明一种按需给药的可注射水凝胶在CIA模型的RA治疗后的CT图;
图13A为本发明一种按需给药的可注射水凝胶在CIA模型的RA老鼠治疗后的炎症因子TNF-α含量图;
图13B为本发明一种按需给药的可注射水凝胶在CIA模型的RA老鼠治疗后的炎症因子IL-1β含量图;
图13C为本发明一种按需给药的可注射水凝胶在CIA模型的RA老鼠治疗后的炎症因子IL-6含量图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是,此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明,而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
实施例1
本发明进行一种可用于RA治疗方面的按需给药的可注射水凝胶制备,具体包括以下步骤:
(1)称取150mg盐酸多巴胺、100mg泊洛沙姆F127分散溶解在10mL去离子水和10mL无水乙醇的混合溶液中,再加入160μL 1,3,5-三甲基苯,超声2min进行分散,在搅拌下加入400μL氨水,待反应2h后,溶液静置、离心收集,分散于一定量的超纯水或无水乙醇中,离心洗涤,收集滤渣,在一定温度下真空干燥,收集黑色粉末,为介孔聚多巴胺纳米颗粒(Mesopore polydopamine nanoparticles,MPDANPs);
(2)称取500mg分子量为35000Da的透明质酸钠搅拌溶解在25mL 0.1mol/L 2-(N-吗啉基)一水乙磺酸(MES)缓冲液中,在冰浴条件下476mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和286mg N-羟基琥珀酰亚胺进行活化30min,再向溶液中加入240μL 5-降冰片烯-2-甲胺,搅拌过夜,将反应液放入截留分子量为14000Da的透析袋中,在去离子水中透析72h,在一定温度下真空干燥,收集水凝胶成份白色物质A(水凝胶成份A);
(3)称取200mg分子量为20000Da四臂-聚乙二醇-羧基溶解于3mL二氯甲烷中,在加入20μLN,N-二异丙基乙胺和52mg 1H-苯并三唑-1-基氧代三吡咯烷基磷六氟磷酸盐进行活化,在冰浴条件下反应15min后,加入7μLN,N-二异丙基乙胺和11mg(4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)甲胺盐酸盐(CAS号:1416711-59-5)进行反应,反应30min后,撤去冰浴,反应过夜,用冰乙醚重新沉淀3次,旋转除去乙醚,然后溶解于去离子水中,放入截留分子量为3500Da的透析袋中透析72h,在一定温度下真空干燥,收集水凝胶成份粉红色物质B(水凝胶成份B);
(4)将5mg的甲氨蝶呤(CAS号:59-05-2,购买于Ark Pharma Scientific Limited)溶解于1mL二甲基亚砜中,将10mg介孔聚多巴胺纳米颗粒溶解于9mL磷酸盐缓冲溶液中,将甲氨蝶呤溶液慢慢滴入介孔聚多巴胺纳米颗粒溶液中,搅拌2h后得到具有载有甲氨蝶呤药物的介孔聚多巴胺纳米颗粒混合溶液;分别取相同的质量的水凝胶成份A和水凝胶成份B,分别用等量混合溶液进行溶解,取溶解后的溶液A和溶液B进行等体积混合后得到所述一种按需给药的可注射水凝胶(命名为MPDANPs/MTX HA-PEG gel凝胶),混合成胶图如图4所示,分别为水凝胶成份A(HA-Nb)和水凝胶成份B(4-arm-PEG-Tz)混成后形成的水凝胶图(HA-PEG Hydrogels),可以看出形成的水凝胶具有较多的空隙,是由于点击反应生成的气体所导致,增加了水凝胶的载药能力。
同时制备相应对比凝胶,未添加物质的可注射水凝胶(HA-PEG gel)的制备方法:将等体积的降冰片烯修饰的透明质酸混合液和四嗪修饰的四臂聚乙二醇混合液快速混合;介孔聚多巴胺纳米颗粒的可注射水凝胶(MPDANPs HA-PEG gel):将等体积添加了介孔聚多巴胺纳米颗粒的降冰片烯修饰的透明质酸混合液和添加了介孔聚多巴胺纳米颗粒四嗪修饰的四臂聚乙二醇混合液快速混合。
对水凝胶中介孔聚多巴胺纳米颗粒进行高分辨透射电镜检测,结果如图1所示,可见介孔聚多巴胺纳米颗粒为典型的单分散的纳米球,粒径均一,孔径均一且分散均匀,有较大的比表面积;检测水凝胶中介孔聚多巴胺纳米颗粒的Zeta电位,结果如图2所示,Zeta电位的值为-15.2V,说明介孔聚多巴胺纳米颗粒具有较好的稳定性;检测水凝胶中介孔聚多巴胺纳米颗粒的水合粒径,结果如图3所示,粒径大小为412.9nm,PDI为0.0076,说明介孔聚多巴胺粒子粒径分布集中,粒径均一,合成的效果优异;对制备的水凝胶进行扫描电子显微镜检测,结果如图5所示,添加介孔聚多巴胺纳米颗粒和甲氨蝶呤并不影响水凝胶多孔结构的形成,形成的可注射水凝胶孔径在100~300μm之间,孔隙连通性良好,有利于营养物质和代谢废物的交换;分析制备的水凝胶的应力应变特性,结果如图6所示,从力学分析来看,添加了介孔聚多巴胺纳米颗粒和甲氨蝶呤的可注射水凝胶(MPDANPs/MTX HA-PEG gel)、介孔聚多巴胺纳米颗粒的可注射水凝胶(MPDANPs HA-PEG gel)的力学性能均强于未添加物质的可注射水凝胶(HA-PEG gel),这归因于HA-PEG凝胶的刚柔结构有效消散了能量并增加了网络交联;分析制备水凝胶的溶胀特性,结果如图7所示,水凝胶网络中的交联密度越大,抗膨胀性就越强,HA-PEG gel凝胶、MPDANs HA-PEG gel凝胶和MPDANPs/MTX HA-PEG gel凝胶的膨胀特性在24h后基本稳定,并在7天内保持基本不变,这种良好的物理化学稳定性对植入物在体内的长期性能至关重要。
对制备的水凝胶的药物释放特性检测,首先将制备的水凝胶至于不同浓度(0mM、1mM、5mM、10mM)的过氧化氢的50mL溶液中,分别在不用的时间内取1mL溶液并用对应溶液补充,然后,测不同时间取出来的溶液中所含有药物的浓度,结果如图8所示,在MPDANPs/MTXHA-PEG gel凝胶中,甲氨蝶呤的释放时间可长达一个月,这可能是由于甲氨蝶呤的氨基/羧基与水凝胶体系发生了多重相互作用,增加了网络交联密度,阻断了甲氨蝶呤的释放通道;其次是由于先在介孔聚多巴胺纳米颗粒中负载甲氨蝶呤,实现了二次缓释,使甲氨蝶呤在水凝胶中得以持续缓释。
实施例2
本发明进行一种可用于RA治疗方面的按需给药的可注射水凝胶制备,具体包括以下步骤:
(1)称取100mg盐酸多巴胺、100mg泊洛沙姆F127分散溶解在10mL去离子水和20mL无水乙醇的混合溶液中,再加入20mg 1,3,5-三甲基苯,超声2min进行分散,在搅拌下加入400μL氨水,待反应2h后,溶液静置、离心收集,分散于一定量的超纯水或无水乙醇中,离心洗涤,收集滤渣,在一定温度下真空干燥,收集黑色粉末,为介孔聚多巴胺纳米颗粒(Mesopore polydopamine NPs,MPDANPs);
(2)称取500mg分子量为30000Da的透明质酸钠搅拌溶解在25mL 0.1mol/L 2-(N-吗啉基)一水乙磺酸(MES)缓冲液中,在冰浴条件下476mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和286mg N-羟基琥珀酰亚胺进行活化30min,再向溶液中加入240μL 5-降冰片烯-2-甲胺,搅拌过夜,将反应液放入截留分子量为14000Da的透析袋中,在去离子水中透析72h,在一定温度下真空干燥,收集水凝胶成份白色物质A(水凝胶成份A);
(3)称取200mg分子量为15000Da四臂-聚乙二醇-羧基溶解于3mL二氯甲烷中,在加入20μLN,N-二异丙基乙胺和52mg 1H-苯并三唑-1-基氧代三吡咯烷基磷六氟磷酸盐进行活化,在冰浴条件下反应15min后,加入7μLN,N-二异丙基乙胺和100mg(4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)甲胺盐酸盐(CAS号:1416711-59-5)进行反应,反应30min后,撤去冰浴,反应过夜,用冰乙醚重新沉淀3次,旋转除去乙醚,然后溶解于去离子水中,放入截留分子量为3500Da的透析袋中透析72h,在一定温度下真空干燥,收集水凝胶成份粉红色物质B(水凝胶成份B);
(4)将5mg的来氟米特溶解于1mL二甲基亚砜中,将10mg介孔聚多巴胺纳米颗粒溶解于9mL磷酸盐缓冲溶液中,将甲氨蝶呤溶液慢慢滴入介孔聚多巴胺纳米颗粒溶液中,搅拌2h后得到具有载有甲氨蝶呤药物的介孔聚多巴胺纳米颗粒混合溶液;分别取相同的质量(2.5mg)的水凝胶成份A和水凝胶成份B,分别用等量混合溶液进行溶解,取溶解后的溶液A和溶液B进行体积比为1:2混合后得到所述一种按需给药的可注射水凝胶(命名为MPDANPs/MTX HA-PEG gel凝胶),
实施例3
本发明进行一种可用于RA治疗方面的按需给药的可注射水凝胶制备,具体包括以下步骤:
(1)称取150mg盐酸多巴胺、100mg泊洛沙姆F127分散溶解在10mL去离子水和10mL无水乙醇的混合溶液中,再加入30mg 1,3,5-三甲基苯,超声2min进行分散,在搅拌下加入400μL氨水,待反应2h后,溶液静置、离心收集,分散于一定量的超纯水或无水乙醇中,离心洗涤,收集滤渣,在一定温度下真空干燥,收集黑色粉末,为介孔聚多巴胺纳米颗粒(Mesopore polydopamine NPs,MPDANPs);
(2)称取500mg分子量为50000Da的透明质酸钠搅拌溶解在25mL 0.1mol/L 2-(N-吗啉基)一水乙磺酸(MES)缓冲液中,在冰浴条件下476mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和286mg N-羟基琥珀酰亚胺进行活化30min,再向溶液中加入240μL 5-降冰片烯-2-甲胺,搅拌过夜,将反应液放入截留分子量为14000Da的透析袋中,在去离子水中透析72h,在一定温度下真空干燥,收集水凝胶成份白色物质A(水凝胶成份A);
(3)称取200mg分子量为25000Da四臂-聚乙二醇-羧基溶解于3mL二氯甲烷中,在加入20μLN,N-二异丙基乙胺和52mg 1H-苯并三唑-1-基氧代三吡咯烷基磷六氟磷酸盐进行活化,在冰浴条件下反应15min后,加入7μLN,N-二异丙基乙胺和50mg(4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)甲胺盐酸盐(CAS号:1416711-59-5)进行反应,反应30min后,撤去冰浴,反应过夜,用冰乙醚重新沉淀3次,旋转除去乙醚,然后溶解于去离子水中,放入截留分子量为3500Da的透析袋中透析72h,在一定温度下真空干燥,收集水凝胶成份粉红色物质B(水凝胶成份B);
(4)将5mg的地塞米松溶解于1mL二甲基亚砜中,将2.5mg介孔聚多巴胺纳米颗粒溶解于9mL磷酸盐缓冲溶液中,将甲氨蝶呤溶液慢慢滴入介孔聚多巴胺纳米颗粒溶液中,搅拌2h后得到具有载有甲氨蝶呤药物的介孔聚多巴胺纳米颗粒混合溶液;分别取相同的质量(10mg)的水凝胶成份A和水凝胶成份B,分别用等量混合溶液进行溶解,取溶解后的溶液A和溶液B进行体积比为1:0.5混合后得到所述一种按需给药的可注射水凝胶(命名为MPDANPs/MTX HA-PEG gel凝胶),
实施例4
本实施例测试实施例1制备的按需给药的可注射水凝胶的细胞毒性。
HUVEC培养条件:在60nm细胞培养皿中,加入3mL含10%胎牛血清的DMEM培养液,置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。HUVEC为贴壁细胞,待细胞长到80%时,用1mL的0.25%的胰蛋白酶液消化2min,用1mL含10%胎牛血清的培养液终止胰酶作用,反复吹打皿底细胞使其充分分散。在100rpm转速下,离心5min,弃去上清液,在细胞沉淀中加入新鲜培养基,吹打均匀后以1:4的比例转到新培养皿中继续培养待用。
Raw264.7细胞培养条件:在60nm细胞培养皿中,加入3mL含10%胎牛血清的DMEM培养液,置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。待细胞长到80%时,反复吹打皿底细胞使其充分分散。在100rpm转速下,离心5min,弃去上清液,在细胞沉淀中加入新鲜培养基,吹打均匀后以1:4的比例转到新培养皿中继续培养待用。
结果如图9所示,CCK-8细胞毒性测试结果显示HUVEC细胞和Raw264.7细胞与HA-PEG gel、MPDANPs HA-PEG gel、MPDANPs/MTX HA-PEG gel共培养24h后,可注射水凝胶让细胞的存活率均仍维持在80%以上,表明制得的可注射水凝胶具有良好的生物安全性。
实施例5
本实施例测试实施例1制备的按需给药的可注射水凝胶的治疗效果。
CIA小鼠模型建立:选用8周龄以上的雌性Wistar大鼠(江苏华创信诺医药科技有限公司);饲养1周后进行造模。初次免疫:4℃条件下将牛Ⅱ型胶原(2mg mL-1)与弗氏完全佐剂(1mg mL-1)充分混合乳化,并注射于在小鼠尾根部皮下;加强免疫:造模2周后,4℃条件下将牛Ⅱ型胶原(2mg mL-1)与弗氏不完全佐剂(1mg mL-1)充分混合乳化,并注射于在小鼠尾根部皮下。
治疗过程:加强免疫1周后的wistar大鼠分为5组,每组5只,组别分别生理盐水组(CIA+Saline)、甲氨蝶呤组(CIA+MTX)、水凝胶组(CIA+HA-PEG gel)、介孔聚多巴胺纳米颗粒水凝胶组(CIA+MPDANPs HA-PEG gel)、介孔聚多巴胺粒子加甲氨蝶呤水凝胶组(CIA+MPDANPs/MTX HA-PEG gel);另取正常大鼠5只作为正常大鼠组(Normal),各组大鼠均在相同饲养条件下培养,其中,正常大鼠组(Normal)不做任何处理;生理盐水组(CIA+Saline),分别通过4个腿的关节腔、脚踝注射200μL生理盐水,注射1次;甲氨蝶呤组(CIA+MTX),甲氨蝶呤注射量为4个腿的关节腔、脚踝注射200μL甲氨蝶呤,注射1次;水凝胶组(CIA+HA-PEGgel)、介孔聚多巴胺纳米颗粒水凝胶组(CIA+MPDANPs HA-PEG gel)和介孔聚多巴胺粒子加甲氨蝶呤水凝胶组(CIA+MPDANPs/MTX HA-PEG gel),分别通过4个腿的关节腔、脚踝注射200μL相应水凝胶,注射1次。治疗4周过程中记录各种参数,并在4周后对老鼠进行取血后进行处死,取大鼠后爪进行CT成像。
按需给药的可注射水凝胶在II型胶原诱导关节炎(CIA)模型的RA老鼠治疗后的爪子厚度图如图10所示,在注射水凝胶后的不同时间内记录不同组别的CIA模型大鼠的爪子的厚度,发现在治疗4周后,MPDANPs/MTX HA-PEG gel组大鼠的爪子的厚度明显降低,几乎达到正常水平;临床评分标准:0分:无临床症状;活动正常;1分:轻微弥漫性红斑/肿胀(一或两个脚趾受影响);2分:3个以上脚趾轻度弥漫性红斑/肿胀;3分:整个脚掌和脚踝明显弥漫性红斑/肿胀;4分:整个脚掌严重弥漫性红斑/肿胀,手指无法弯曲(强直),按需给药的可注射水凝胶在CIA模型的RA疗后的临床评分图如图11所示,在注射水凝胶后分别对不同组别的大鼠的RA进行临床评分,发现在治疗4周后,MPDANPs/MTX HA-PEG gel组大鼠的RA临床评分低于0.5分,说明MPDANPs/MTX HA-PEG gel组对RA具有较好的治疗效果;按需给药的可注射水凝胶在CIA模型的RA治疗后的CT图如图12所示,在注射水凝胶治疗4周后,可以看出其他对照组小鼠的骨表面粗糙,骨密度较低,但使用MPDANPs HA-PEG gel和MPDANPs/MTXHA-PEG gel治疗组骨边界清晰,骨侵蚀较少,说明清除RA病变中过度产生的ROS对骨吸收至关重要;采集血清组织用于炎症评估,根据上海碧云天生物技术有限公司制造商的说明,使用ELISA试剂盒对血清中表达的细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)进行评估,按需给药的可注射水凝胶在CIA模型的RA老鼠治疗后的炎症因子含量图如图13A-图13C所示,通过对治疗后大鼠体内血清中促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的水平,经MPDANPs/MTX HA-PEG gel处理的小鼠与其他组相比,细胞因子水平最低,显示出与健康组相似的细胞因子水平,表明清除ROS会影响包括TNF-α、IL-6、IL-1β在内的炎症介质,从而缓解炎症。
综上所述,本发明的制备方法具有反应步骤简单、成本低、绿色环保等优点,制得的按需给药的可注射载药水凝胶在模拟RA的微环境条件下,具有ROS特异性响应能力,可根据RA中ROS的含量对药物进行多级释放,实现按需给药的功能,适用于在类风湿性关节炎治疗过程中的早期诊断、中期检测、药物治疗、外科手术治疗等以及相关的治疗过程中的可注射递送药物系统,同时还适用于疾病微环境为ROS相关疾病的可注射递送药物系统,如皮肤癌、伤口修复、牙科、骨关节炎等,有着广泛的应用前景。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种可注射载药水凝胶,其特征在于,所述可注射载药水凝胶包括介孔聚多巴胺纳米颗粒、治疗类风湿性关节炎的药物和水凝胶,所述介孔聚多巴胺纳米颗粒负载所述治疗类风湿性关节炎的药物,并分散在所述水凝胶中。
2.根据权利要求1所述的可注射载药水凝胶,其特征在于,所述可注射载药水凝胶中介孔聚多巴胺纳米颗粒、治疗类风湿性关节炎的药物和水凝胶的质量比为1:(0.5~5):(20~100);
优选地,所述治疗类风湿性关节炎的药物包括甲氨蝶呤、地塞米松、来氟米特或糖皮质激素中的任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1所述的可注射载药水凝胶,其特征在于,所述水凝胶包括透明质酸-聚乙二醇水凝胶。
4.权利要求1-3任一项所述的可注射载药水凝胶的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:
将所述介孔聚多巴胺纳米颗粒和含治疗类风湿性关节炎的药物的溶液混合,得到负载治疗类风湿性关节炎的药物的介孔聚多巴胺纳米颗粒,将所述负载治疗类风湿性关节炎的药物的介孔聚多巴胺纳米颗粒分散于水凝胶中,得到所述可注射载药水凝胶。
5.根据权利要求4所述的可注射载药水凝胶的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:
将均三甲苯、泊洛沙姆和盐酸多巴胺混合,制备介孔聚多巴胺纳米颗粒;将所述介孔聚多巴胺纳米颗粒和含治疗类风湿性关节炎的药物的溶液混合,得到负载治疗类风湿性关节炎的药物的介孔聚多巴胺纳米颗粒;
使5-降冰片烯-2-甲胺与透明质酸发生反应,获得降冰片烯修饰的透明质酸,使1,2,4,5-四嗪胺盐酸盐与四臂-聚乙二醇发生反应,获得的四嗪修饰的四臂-聚乙二醇;
将所述负载治疗类风湿性关节炎的药物的介孔聚多巴胺纳米颗粒与四嗪修饰的四臂聚乙二醇和降冰片烯修饰的透明质酸混合,得到所述可注射载药水凝胶。
6.根据权利要求5所述的可注射载药水凝胶的制备方法,其特征在于,所述介孔聚多巴胺纳米颗粒的制备方法包括:
利用盐酸多巴胺为原料,均三甲基苯为扩孔剂,氨水为碱性剂,经过离心洗涤、纯化得到介孔聚多巴胺纳米颗粒;
优选地,所述介孔聚多巴胺纳米颗粒的制备方法具体包括:取泊洛沙姆与盐酸多巴胺分散至水-乙醇混合溶液中,加入均三甲苯,混合制备得到乳液;向乳液中加入氨水调节pH值为7.4~10,离心收集的沉淀依次进行洗涤、离心及干燥处理,得到所述介孔聚多巴胺纳米颗粒;
优选地,所述泊洛沙姆、盐酸多巴胺和均三甲苯的质量比为1:(1-1.5):(0.2-0.3);
优选地,所述水-乙醇混合溶液中水、乙醇体积比为1:(1~2)。
7.根据权利要求5所述的可注射载药水凝胶的制备方法,其特征在于,所述降冰片烯修饰的透明质酸的制备方法包括:
使透明质酸钠、缩合剂发生缩合反应,然后加入5-降冰片烯-2-甲胺进行还原反应,得到所述降冰片烯修饰的透明质酸;
优选地,所述缩合剂包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺;
优选地,所述透明质酸钠、缩合剂和5-降冰片烯-2-甲胺的摩尔量比为1:(1~2):(1~2);
优选地,所述透明质酸钠的分子量为30000~50000Da;
优选地,所述还原反应后还包括:将所获还原反应混合物透析以及冷冻干燥的步骤;
优选地,所述冷冻干燥的温度为-50~-40℃;
优选地,所述降冰片烯修饰的透明质酸的制备方法具体包括:
利用透明质酸钠为原料,2-(N-吗啉基)一水乙磺酸为缓冲液,利用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺进行活化,并加入5-降冰片烯-2-甲胺进行还原反应,搅拌,再经透析、冷冻干燥获得降冰片烯修饰的透明质酸;
优选地,所述搅拌的时间为12~18h。
8.根据权利要求5所述的可注射载药水凝胶的制备方法,其特征在于,所述四嗪修饰的四臂聚乙二醇的制备方法包括:
使四臂聚-乙二醇-羧基、活化剂在第一溶剂中混合进行活化,然后加入1,2,4,5-四嗪胺盐酸盐进行反应,获得四嗪修饰的四臂-聚乙二醇;
优选地,所述活化剂包括N,N-二异丙基乙胺与1H-苯并三唑-1-基氧代三吡咯烷基磷六氟磷酸盐;
优选地,所述四臂聚-乙二醇-羧基、缩合剂和1,2,4,5-四嗪胺盐酸盐的质量比为1:(0.02~0.04):(0.25~0.5);
优选地,所述第一溶剂包括二氯甲烷;
优选地,所述四臂-聚乙二醇-羧基的分子量为15000~25000Da;
优选地,所述四嗪修饰的四臂-聚乙二醇的制备方法具体包括:
利用四臂-聚乙二醇-羧基为原料,二氯甲烷为溶剂,加入N,N-二异丙基乙胺与1H-苯并三唑-1-基氧代三吡咯烷基磷六氟磷酸盐进行活化,并加入1,2,4,5-四嗪胺盐酸盐进行反应,搅拌,乙醚重新沉淀,再溶于水中进行透析、冷冻干燥,获得四嗪修饰的四臂-聚乙二醇;
优选地,所述搅拌的时间为12~18h;
优选地,所述冷冻干燥的温度为-50~-40℃。
9.根据权利要求4-8任一项所述的可注射载药水凝胶的制备方法,其特征在于,所述可注射载药水凝胶的制备方法包括以下步骤:
(1)载药纳米粒子的合成:取泊洛沙姆与盐酸多巴胺分散至水-乙醇混合溶液中,加入均三甲苯,混合制备得到乳液;向乳液中加入氨水调节pH值为7.4~10,离心收集的沉淀依次进行洗涤、离心及干燥处理,得到所述介孔聚多巴胺纳米颗粒;
(2)降冰片烯修饰的透明质酸的合成:利用透明质酸钠为原料,2-(N-吗啉基)一水乙磺酸为缓冲液,利用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺进行活化,并加入5-降冰片烯-2-甲胺进行反应,搅拌,再经透析、冷冻干燥获得降冰片烯修饰的透明质酸;
(3)四嗪修饰的四臂聚乙二醇的合成:利用四臂-聚乙二醇-羧基为原料,二氯甲烷为溶剂,加入N,N-二异丙基乙胺与1H-苯并三唑-1-基氧代三吡咯烷基磷六氟磷酸盐进行活化,并加入1,2,4,5-四嗪胺盐酸盐进行反应,搅拌,乙醚重新沉淀,再溶于水中进行透析、冷冻干燥获得四嗪修饰的四臂聚乙二醇;
(4)可注射载药水凝胶的制备:将治疗类风湿性关节炎的药物与介孔聚多巴胺颗粒混合,得到混合液,将混合液分别与所述降冰片烯修饰的透明质酸和四嗪修饰的四臂聚乙二醇混合,得到降冰片烯修饰的透明质酸混合液和四嗪修饰的四臂聚乙二醇混合液,所述治疗类风湿性关节炎的药物、介孔聚多巴胺颗粒、降冰片烯修饰的透明质酸和四嗪修饰的四臂聚乙二醇的质量比为1:(0.5~2):(0.5~2):(0.5~2),然后将降冰片烯修饰的透明质酸混合液和四嗪修饰的四臂聚乙二醇混合液按体积比为1:(0.5~2)混合,得到所述可注射载药水凝胶。
10.权利要求1-3任一项所述的可注射载药水凝胶在制备治疗类风湿性关节炎的产品中的应用。
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