MX2014010390A - Copolimeros funcionales pla-peg, las nanoparticulas de los mismos, su preparacion y su uso para la administracion dirigida de farmacos e imagenologia. - Google Patents

Copolimeros funcionales pla-peg, las nanoparticulas de los mismos, su preparacion y su uso para la administracion dirigida de farmacos e imagenologia.

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Abstract

La presente invención se refiere a polímeros funcionales PEG-PLA, a las nanopartículas que contiene los mismos, su proceso de preparación y su uso para la administración dirigida de medicamentos e imagenología. La presente invención se refiere polímeros funcionales PLA-PEG novedosos, a las nanopartículas que los contienen, a su preparación y su uso para la administración dirigida en sitio de fármacos e imagenología.

Description

COPOLÍMEROS FUNCIONALES PLA-PEG. LAS NANOPARTÍCULAS DE LOS MISMOS. SU PREPARACIÓN Y SU USO PARA LA ADMINISTRACIÓN DIRIGIDA DE FÁRMACOS E IMAGENOLOGÍA La presente invención pertenece al campo de entrega dirigida de fármacos e imagenología y en particular la entrega por medio de encapsulación o conjugación no covalente de un fármaco en una nanopartícula de poli(etilenglicol)-poli(ácido láctico) (PEG-PLA).
La síntesis de nanopartículas de PLA-PEG y sus aplicaciones en entrega de fármacos se ha descrito ampliamente en la literatura. En la composición de PLA-PEG, el PLA (poli(ácido láctico)) es hidrófobo y PEG es hidrófilo. Los conjuntos de PLA-PEG en nanopartículas en medio acuoso, con PLA que forma el núcleo y PEG que forma la corona. Se ha mostrado que mediante inyección intravenosa, la corona de PEG en las nanopartículas de PLA-PEG protege la nanopartícula de la fagocitosis ("efecto furtivo") y así minimiza el despejado sistémico rápido de nanopartículas, e incrementa así su vida media sistémica (la patente de US 5,683,723 describe nanopartículas basadas en polioxietileno y copolímero de bloque de ácido poliláctico). Además, tales nanopartículas se acumulan en el tumor mediante el afecto de "Permeabilidad y Retención Incrementadas" (EPR) previamente descrito. En el campo del cáncer en particular, son deseables los tratamientos específicos de tumores debido a los fuertes efectos secundarios de las quimioterapias, y en este contexto, las nanopartículas poliméricas se han considerado como sistemas de entrega de fármacos prometedores. Cuando se incorporan en las nanopartículas de PLA-PEG, los fármacos experimentan una circulación sistémica prolongada y una concentración potencialmente mayor en el tumor debido al efecto EPR. Con el fin de entregar la nanopartícula con especificidad incrementada para el tumor, se podría emplear el enfoque de direccionamiento/acumulación al tejido usando un dispositivo buscador (Pulkkinen et al. Eur J Pharm Biopharm 70 (2008) 66-74, Zhan et al. J Control Reí 143 (2010) 136-142, Farokhzad et al. Cáncer Res 64 (2004) 7668-7672, Gao et al. Biomaterials 27 (2006) 3482-3490).
El uso de nanopartículas de PLA-PEG funcionalizadas además con un ligando de direccionamiento ha sido investigado entonces por los inventores.
El uso de la química clic (Huisgen coupling) ha sido descrito en la literatura para la síntesis de diferentes nanopartículas poliméricas (Lv et al. J Colloid Interface Sci. 356 (2011) 16-23, Jubeli et al. J Polim Sci Part A: Polim Chem. 48 (2010) 3178-3187, Lecomte et al. Macromol Rapid Commun. 29 (2008) 982-997) o metálicas (Hanson et al. US2010/0260676 A1, 2010).
La química clic es de interés porque este enfoque resulta en alto rendimiento, las condiciones de reacción son fáciles de manejar y escalables porque la reacción es insensible al oxígeno y al agua. El antecedente de esta reacción es bien conocido, involucra una cantidad baja de catalizador y conduce a un alto rendimiento de acoplamiento.
Recientemente, Deshayes et al (Pharm. Res. (2011), 28, 1631-1642) reportaron la conjugación de un ciclopéptido (usado como un ligando que une específicamente al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) de direccionamiento, a una nanopartícula de fluoruro de polivinilideno-poli(ácido acrílico) mediante química-clic. La química clic ya ha sido considerada para sintetizar macromoléculas que contienen ambos polímeros PLA y PEG. Tang et al Macromolecules 2011, 44, 1491-1499 describió el acoplamiento de un Intermedio de PEG-g-PLA-alquinilo con un derivado azido (poli(azidopropM-L-glutamato)). Además, Yu et al. Macromolecules, 2011, 44(12), 4793-4800 recientemente describió una nanopartícula hecha mediante la macromolécula PLA-g-paclitaxel-PEG donde el paclitaxel puentea la estructura de PLA y cadenas laterales de PEG. El fármaco, sin embargo, no está físicamente encapsulado en la nanopartícula y la estructura no comprende un ligando de direccionamiento. Lu et al Bioconjugate Chem 2009, 20, 87-94 describe también una macromolécula que contiene PLA y PEG hechos mediante química clic y sobre la cual se une un péptido (RGD = arginina-glicina-aspartato) para direccionamiento de célula. La estructura de la macromolécula involucra la síntesis de intermedios estructuralmente complejos: el copolímero de azida ( poli (2-metil-2-carboxitri metí le n-carbonato-co- D,L-lacturo)-g-P EG-Azida) y los péptidos alquino-modificados KGRGDS.
Zhang et al (Mol. Pharmaceutics 2012,9, 2228-2236) describe nanopartículas hechas de una macromolécula que contiene PLA y PEG, en donde la superficie se conjuga con ligandos usando química clic, resultando así en un ligando directamente unido al grupo triazol. Xiao et al (International Jounal of nanomedicine 5, 1, 2010, 1057-1065) generalmente trata PEG-PLA que contiene nanopartículas. Arutselvan et al (Chemical Communications 7, 2007, 695-697), WO 2011/046946, Steinmetz et al Journal of the American Chemical Society 131, 47, 2009, 17093-17095) y Adibekian et al (Nature Chemical Biology 7, 2011, 469-479) describen derivados alquino-PEG.
Existe, por lo tanto, una necesidad de diseñar un proceso directo de preparación de PEG-PLA que contiene nanopartículas capaces de encapsular fármacos para entrega en sitio específico en el cual un ligando funcional deseado puede ser unido usando química clic.
La presente invención trata entonces de la provisión de nanopartículas de PLA-PEG que comprenden una cadena de PLA-PEG fácil de preparar unida covalentemente a un ligando de direccionamiento a través de un enlazador, obtenible mediante química clic.
De acuerdo con la invención, la preparación de las nanopartículas involucra la síntesis de un compuesto de PLA-PEG-azida que puede actuar como una plataforma de copolímero que se puede clicar sobre la cual se puede acoplar cualquier fármaco ligando alquino-funcional, por ejemplo dispositivo buscador, agente de imagenolog ía, agente que responde a estímulos , agente de acoplam iento, agente de aumento de penetración cel ular, agente desintoxicante, usando qu ímica clic mediante un enfoq ue versátil.
De acuerdo con un primer objeto, la presente invención trata así de u n compuesto de la fórm ula (A) donde: PLA representa un resto de poliácido láctico; PEG representa un resto de pol ietilenglicol ; El eniazador de PEG' es un resto de polietilenglicol ; y El ligando es un resto de un ligando funcional.
Como se usa en la presente, el térmi no "resto" se refiere a un radical divalente o monovalente dependiendo de la molécula de la cual deriva , o de un derivado del mismo.
En la fórmula general (A) anterior, se pueden considerar las siguientes modalidades particulares o cualquiera de las combinaciones de las mismas: de acuerdo con u na modalidad , PEG' es de la fórmula donde: n' es el número de unidades y está entre 1 y 1 0 (1 ) es la unión del enlace al grupo -(CH2)-triazol; (2) es la unión del enlace al ligando. - de acuerdo con una modalidad, PLA es de la fórmula: donde: (3) es la unión del enlace a la porción de PEG; y m es el número de unidades y está entre 1 y 500, lo que corresponde a un peso molecular entre aproximadamente 144 y 72000. En una modalidad más, m está generalmente entre 100 y 300, lo que corresponde a un peso molar entre aproximadamente 14400 y 43200 g/mol. - de acuerdo con una modalidad, PEG es de la fórmula: donde: (4) es la unión del enlace a -PLA; (5) es la unión del enlace al átomo de nitrógeno de y n es el número de unidades y está entre 1 y 300, lo que corresponde a un peso molar entre aproximadamente 44 y 13200 g/mol. En una modalidad adicional, n está entre 20 y 70, lo que corresponde a un peso molar entre aproximadamente 880 y 3080 g/mol.
La unión entre PLA y PEG (PLA-PEG) consiste en un enlace de éster entre el grupo carboxílico terminal de la porción de PLA y el grupo hidroxilo terminal de la porción de PEG.
La unión entre PEG' y ligando (PEG'-Ligando) no está representada, pero consiste en un enlace de amida formado por el grupo carboxílico del ligando y el grupo amino resultante del grupo hidroxi terminal de PEG'.
En una modalidad, se puede seleccionar un ligando de los restos de los dispositivos buscadores, agentes de diagnóstico, agentes de imagenología, agentes sensibles a estímulos, agentes de acoplamiento, agentes de penetración celular, agentes desintoxicantes, fármacos. En una modalidad particular de un compuesto de la fórmula (A), se puede seleccionar un ligando de anisamida, ácido fólico y fluorocromos tal como FP-547.
En el contexto de la presente invención: se entiende que un átomo de halógeno significa un flúor, un cloro, un bromo o un yodo; se entiende que un grupo alquilo (?-?-?e) significa un grupo alifático saturado que comprende desde 1 hasta 6 átomos de carbono (ventajosamente desde 1 hasta 4 átomos de carbono) y que es lineal o ramificado. Se puede hacer mención, a manera de ejemplos, de metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, ter-butilo, pentilo, hexilo y los similares.
Los compuestos de la fórmula (A) se pueden proporcionar en la forma de una base libre o en la forma de sales de adición con ácidos, las cuales también forman parte de la invención.
Estas sales se preparan ventajosamente con ácidos farmacéuticamente aceptables, pero también forman parte de la invención sales con otros ácidos, útiles, por ejemplo, para la purificación o para el aislamiento de los compuestos de la fórmula (A).
Los compuestos de la fórmula (A) pueden formar nanopartículas. Así, de acuerdo con otro objeto, la presente invención se refiere también a una nanopartícula que comprende uno o más compuestos idénticos o diferentes de la fórmula (A).
La expresión "compuestos idénticos o diferentes", como se usa en la presente, indica que dichos compuestos pueden tener la misma o distinta fórmula dependiendo de las definiciones de sus varios PEG, PLA, PEG', R, m, n, etc.
Dichas nanopartículas pueden comprender también uno o más compuestos idénticos o diferentes de la fórmula (G): PLA-PEG-OR (G) donde PLA, PEG se definen como en la fórmula (A) y R es H o un alquilo de Ci-C6, tal como metilo.
Dichas nanopartículas pueden comprender opcionalmente un fármaco.
El término "fármaco" usado en la presente se refiere a sustancias terapéuticas que pueden ser administradas a un paciente en necesidad del mismo. Cualquier fármaco relevante de interés (especialmente fármacos insolubles en agua) podría estar encapsulado no covalentemente en la nanopartícula y/o conjugado covalentemente con la nanopartícula (opcionalmente a través de un enlazador), para ser entregado al cuerpo.
El fármaco puede ser en particular un antibiótico, agente anti-cáncer, agente antiviral, agente anti-inflamatorio, un antígeno de vacuna o un producto nutricéutico.
En particular, el fármaco puede ser un agente citotóxico, tal como un taxoide y más particularmente docetaxel.
Así, en una modalidad el fármaco está encapsulado no covalentemente (tal como físicamente encapsulado) dentro de las nanopartículas. En otra modalidad del mismo, el fármaco está conjugado covalentemente, opcionalmente a través de un enlazador, a las nanopartículas, en particular donde el ligando es un fármaco.
En una modalidad particular, el ligando no es un fármaco, pero el fármaco está encapsulado no covalentemente en la nanopartícula.
Como se usa en la presente, el término "nanopartículas" se refiere a partículas que tienen un diámetro medio entre 10 nm y 900 nm. En una modalidad adicional, las nanopartículas de la invención tienen un diámetro medio entre 50 y 300 nm.
Exhiben típicamente un índice de polidispersidad (Pdl) entre 0.01 y 0.4, más específicamente entre 0.1 y 0.4, y tienen un potencial zeta entre -30 y + 30 mV.
Con un ligando catiónico el potencial zeta puede estar entre 1 y 30 mV, con un ligando aniónico entre -30 y -1 mV.
Las nanopartículas de la invención se ilustran en las Figuras 2 a 3.
De acuerdo con la invención , dichas nanopartículas pueden prepararse mediante nanoprecipitación de compuestos de la fórmula (A), opcionalmente en la presencia de compuestos de la fórmula (? ') anterior y/u opcionalmente seguido por enca psulación no covalente o conj ugación covalente de un fármaco.
Como se usa en la presente, el térmi no "nanoprecipitación" se refiere a un proceso que com prende preci pitación o emulsificación y reducción de tamaño de uno o más compuestos en la forma de nanopartículas en suspensión .
Típicamente, d icho proceso com prende la centrifugación de la suspensión. El proceso puede incluir tam bién uno o más pasos seleccionados de: - preparar una fase orgánica de los compuestos de la fórmula (A) y opcionalmente (G) en un solvente adecuado o mezcla de solventes, tales como cloruro de metileno, acetato de etilo, acetona, etanol , tetrahidrofurano, etc. - preparar una fase acuosa opcionalmente estabilizada con uno o más agentes de estabilización , tales como colato de sod io, alcohol polivinílico (PVA), poloxámero, fosfol ípidos, etc. ; - mezclar las fases orgánica y acuosa ; - reducción de tamaño de la suspensión ( por ejemplo usando ultrasonicación ); - eliminación de la fase orgánica, por ejemplo por evaporación con vacío o bajo flujo de aire; centrifugación de la fase acuosa, en particular ultracentrifugación de hasta 50000 g ; - recolectar las nanopartículas; y/o - resuspender las nanopartículas obtenidas en medio acuoso. Típicamente, las nanopartículas de la invención se obtienen usando un solvente orgán ico miscible con agua (tal como acetona) como la fase orgán ica precipitada dentro de una fase acuosa usada opcional mente con u n agente de estabilización , o usando d iclorometano o acetato de etilo como la fase orgánica mezclada con fase acuosa q ue contiene PVA o un poloxámero o colato de sod io como agente de estabilización. Los poloxámeros para uso en la fabricación de las nanopartículas están disponi bles bajo la marca registrada Pluronic. U n poloxámero adecuado es poloxá mero 188 (disponi ble como Pluronic® F68 o Lutrol® F68 , BAS F).
De acuerdo con la invención , las nanopartículas hechas del ligando PLA-PEG-fu ncional pued en usarse para u na variedad de propósitos que incl uyen la entrega de sustancias terapéuticas (fármacos) al cuerpo humano. En una modalidad de la presente invención la nanopartícula com prende además u n fármaco. En este caso, la sustancia terapéutica está encapsulada no covalentemente (encapsulación física) en la matriz de la nanopartícula, y se entrega mejor al tejido de destino.
En otra modalidad , el fármaco puede estar conj ugado covalentemente con el compuesto de la fórm u la (A) por ejem plo en lugar del ligando, opcionalmente a través de un enlazador. La conjugación covalente puede ser de interés para mantener la asociación del fármaco con el portador in vivo, para aplicaciones de entrega de fármacos e imagenología.
Mezclando diferentes compuestos de la fórmula (A) con diferentes ligandos, se puede obtener nanopartículas multifuncionales. Estas nanopartículas multifuncionales se pueden usar para aplicaciones combinatorias (ver Figura 3).
De acuerdo con la invención, la nanopartícula puede prepararse mediante la nanoprecipitación de uno o más compuestos de la fórmula (A), y opcionalmente (?'), opcionalmente en la presencia de un fármaco o diferentes fármacos (para terapia en combinación).
La expresión "ligando funcional" como se usa en la presente en un compuesto de la fórmula (A) o en las nanopartículas hechas con el mismo se refiere a cualquier tipo de compuesto capaz de apuntar o rastrear la entrega de un fármaco al cuerpo humano, o un fármaco por sí mismo en particular donde el fármaco es de sitio-específico, tal como un fármaco que se une específicamente a receptores. Los ligandos funcionales se pueden seleccionar en particular de: - compuestos capaces de seguir la toma y distribución de las nanopartículas en una célula, un tejido, un animal, o un paciente, por ejemplo a través de la provisión de una etiqueta que puede proporcionar una imagen de la distribución de nanopartículas; - agentes químicos o biológicos, incluyendo fármacos, que llevan a cabo un efecto final deseado de la nanopartículas, tal como disparando la m uerte celular, o activando o inhibiendo un receptor, una enzima, o un gen ; - ligandos receptores tales como un antagonista de receptor de estrógeno, un antagonista de receptor de andrógeno , ácido fólico, a nisam ida , un péptido RGD, anticuerpos, vectores de gen localizados por péptido, aptámeros, y factor de necrosis de tumor.
Los ligandos funcionales pueden incluir un d ispositivo buscador, un agente de imagenología, un agente sensible a estím ulos (agente termosensi ble, agente sensi ble a pH , agente fotosensi ble etc. ), un agente de acoplamiento, un agente de aumento de penetración cel ular, un agente desintoxicante, un fármaco etc. , dependiendo de las aplicaciones concebidas.
Por ejemplo, un dispositivo buscador que reconoce y se une a un tipo específico de cél ula/tejido podría usarse para apuntar las nanopartículas cargadas con fármaco al tejido específico de órga no/enfermo de interés, lo cual se podría aludir tam bién como 'direccionamiento de fármaco de sitio específico' . Se espera que las nanopartículas de dispositivo buscador de PLA-PEG mejoren la entrega del fármaco encaps ulado al sitio enfermo pretendido, aumenten la concentración local del fármaco en el tejido diana, y al mismo tiem po, faciliten una liberación sostenida de fármaco. Esto puede resultar en una exposición aumentada y prolongada del tejido/cél ulas enfermas al fármaco, y por ende se puede lograr un beneficio terapéutico mejorado y efectos secundarios red ucidos .
Tales agentes buscadores se pueden seleccionar en particular de ligandos de reconocimiento de membrana, tales como anisamida (que tiene afinidad por receptores sigma), ácido fólico (que tiene afinidad por receptores folato sobreexpresados en la superficie de algunas líneas celulares de tumores), anticuerpos (tales como HER2, transferrina, anticuerpos anti-EGFR, etc.) capaces de reconocer el antígeno superficial correspondiente, secuencia RGD que se une a integrinas a?ß3 sobreexpresadas en endotelio angiogénico de tumor, ácido hialurónico que se une a Receptores CD44, transferrina que se une a receptores de transferrina, etc.
En otra instancia, los ligandos incluyen también aquéllos que reconocen y aglutinan compuestos biológicos solubles o que circulan en los fluidos biológicos (por ejemplo, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)), para estrategia terapéutica o de desintoxicación.
Si el ligando funcional acoplado sobre nanopartícula de PLA-PEG es un agente de imagenología/agente de diagnóstico, entonces la nanopartícula puede ser empleada para imagenología/diagnosis de una enfermedad o una imperfección en el cuerpo. Tales imagenología/agentes de diagnóstico se pueden seleccionar en particular de óxido de fierro, complejos de gadolinio, verde indocianina, sondas fluorescentes cercanas al infrarrojo, emisores de positrones (por ejemplo 18F, 68Ga, 64Cu).
Los ligandos funcionales tales como sustancias que responden a estímulos se pueden usar para guiar las nanopartículas de PLA- PEG al sitio de destino usando, por ejemplo, un cam po magnético externo, que crea cam bios locales que responden a estím ulos tal como calor que sigue a la irradiación por luz cercana al infrarrojo. Tales sustancias que responden a estím ulos se puede seleccionar en particular de, por ejem plo, nanopartículas de oro o cualesquiera sustancias activables por rad iación.
Los ligandos fu ncionales, tales como agentes de acoplamiento, se pueden usar para acoplar el fármaco (por ejem plo por el principio de apareamiento de iones), para protegerlo de la degradación y para entregarlo a la ubicación apropiada en el cuerpo. Como un ejem plo, la entrega por vía parenteral de oligonucleótidos puede hacerse más eficiente por acoplamiento de aquéllos a PEG-PLA acoplado por oligopéptido donde el oligopéptido lleva una carga eléctrica opuesta a aquélla del oligonucleótido. Tales agentes de acoplamiento pueden seleccionarse en particular de oligopéptidos (por ejem plo poli-lisi na , poli(leucina-lisi na) , poli(leucina-lisina-lisi na-leuci na)).
Los ligandos fu ncionales tales como los agentes de aumento de penetración celular pueden usarse para mejorar la toma celular de la nanopartícula y por ende su fármaco encapsulado puede cond ucir a una eficacia incrementada del fármaco. Tales agentes de penetración cel ular pueden seleccionarse en particular de secuencias de Transactivador de transcripción (TAT), penetratin, secuencias de poliarginina, secuencias de proteína VP22, etc.
Los ligando funcionales tales como el agente desintoxicante pueden usarse pa ra la eli mi nación de sustancias tóxicas de la circulación sistémica. Tales agentes desintoxicantes pueden seleccionarse en particular de una variedad de sustancias, por ejemplo agentes quelantes (para desintoxicación de metales), cobalamina, cobinamida, enzima rodanesa (para desintoxicación de cianuros), enzima hidrolizante de organofósforo (para desintoxicación de organofósforo), naloxona, atropina (para desintoxicación opioide), anticuerpos/fragmentos de anticuerpo que reconocen una toxina específica.
En consecuencia, un ligando puede seleccionarse entonces, como se mencionó antes, de: ligandos de reconocimiento de membrana seleccionados de un antagonista de receptor de estrógeno, un antagonista de receptor de andrógeno, ácido fólico, anisamida, un anticuerpo capaz de reconocer el antígeno superficial correspondiente tal como HER2, transferrina, o anticuerpos anti-EGFR, una secuencia RGD que se une a integrinas a?ß3 sobreexpresadas en el endotelio angiogénico de tumor, ácido hialurónico que se une a receptores CD44, transferrina que se une a receptores de transferrina, vectores de gen localizados por péptido, aptámeros, y factor de necrosis de tumor, agentes de diagnóstico/imagenología seleccionados de óxido de fierro, complejos de gadolinio, verde de indocianina, sondas fluorescentes cercanas al infrarrojo, o emisores de positrones (por ejemplo 8F, 68Ga, 64Cu), sustancias que responden a estímulos seleccionadas de nanopartículas de óxido de fierro, nanopartículas de oro, o cualesquiera sustancias activables por radiación, agentes de acoplamiento seleccionados de oligopéptidos (por ejemplo poli-lisina, poli(leucina-lisina), poli(leucina-lisina-lisina-leucina), un agente de penetración celular seleccionado de secuencias de Transactivador de transcripción (TAT), penetratin, secuencias de poliarginina, o secuencias de proteína VP22, un agente desintoxicante seleccionado de cobalamina, cobinamida, enzima rodanesa, una enzima hidrolizante de organofósforo, naloxona, atropina, o anticuerpos/fragmentos de anticuerpo que reconocen una toxina específica; o un fármaco seleccionado de un antibiótico, agente anti-cáncer, agente antiviral, agente anti-inflamatorio, un antígeno de vacuna o un producto nutricéutico.
De acuerdo con otro objeto, la presente invención se refiere también al proceso de preparación de los compuestos de la fórmula (A) anterior.
Dicho proceso de preparación de un compuesto de la fórmula (A) comprende acoplar: - un compuesto de la fórmula (I): PLA-PEG-N3 (I) Con - un compuesto de la fórmula (XI): donde PLA, PEG, PEG', y ligando se definen como en la fórmula (A) anterior.
El acoplamiento se puede hacer mediante la llamada "química clic". Este término se refiere a cualquier proceso en donde un compuesto de azida (N3) se hace reaccionar con un grupo alquino para formar un 1 ,2,3-triazol.
La reacción de acoplamiento de la química clic se puede llevar a cabo de acuerdo con la reacción de Huisgen aplicando o adaptando cualquier procedimiento experimental de Huisgen conocido generalmente por la persona experta en particular con referencia a las condiciones descritas en Chem. Rev. 2008, 108, 2952-3015. Generalmente, dicha reacción de acoplamiento de la química clic se lleva a cabo de acuerdo con la reacción de Huisgen, en condiciones ya sea orgánicas o acuosas.
Los compuestos de la fórmula (I) pueden estar en la forma de una solución en un solvente orgánico o en la forma de nanopartículas en un medio acuoso, que contiene, opcionalmente, compuestos de la fórmula (G) como se define más adelante.
En condiciones orgánicas, dicha reacción de acoplamiento de la química clic se lleva a cabo típicamente en la presencia de bromuro de cobre(l) (CuBr) y ?,?,?',?',?''-pentametildietilentriamina (PMDETA) (Chem. Rev. 2008, 108, 2952-3015). Esta reacción puede conducirse, ínter alia, en un solvente orgánico tal como dimetilformamida (DMF), tetrahidrofurano (THF), tolueno, dimetilsulfóxido (DMSO), a una temperatura comprendida entre la temperatura ambiente y la temperatura de reflujo de la mezcla de reacción, ventajosamente en condiciones anhidras. Generalmente, se usa un exceso del compuesto de la fórmula (XI).
En condiciones acuosas, dicha reacción de acoplamiento de la química clic se lleva a cabo típicamente de acuerdo con Chem. Rev. 2008, 108, 2952-3015, en particular en la presencia de agua, y derivados de cobre tal como CuS04-5H20. La presencia de un agente reductor para el catalizador, tal como ascorbato de sodio, puede ser ventajosa. Generalmente, las condiciones acuosas se usan cuando los compuestos de la fórmula (I) están en la forma de nanopartículas, en particular en una suspensión acuosa.
En la reacción clic, las nanopartículas que comprenden compuestos de la fórmula (I) pueden comprender también compuestos de la fórmula (?'): PLA-PEG-OR (I) donde PLA y PEG se definen como en la fórmula (A) y R es H o un alquilo de C-\-C6, tal como metilo.
Los compuestos de la fórmula (?') donde R es metilo se describen, por ejemplo, en US 5,683,723.
Si es necesario, la suspensión de nanopartículas puede incluir también un agente de estabilización, tal como alcohol polivinílico (PVA), Pluronic ® (por ejemplo Pluronic ® F68) o colato de sodio.
Los compuestos de la fórmula (I) involucrados en la preparación de los compuestos de la fórmula (A) son otro objeto distintivo de la invención.
La presente invención también se refiere entonces a un compuesto de la fórmula (I): PLA-PEG-N3 (I) donde PLA y PEG se definen como en el compuesto de la fórmula (A).
Los compuestos de la fórmula (I) pueden formar nanopartículas que son otro objeto de la presente invención.
Dichas nanopartículas pueden comprender también uno o más compuestos idénticos o diferentes de la fórmula (G): PLA-PEG-OR (G) como se definen antes.
Dichas nanopartículas se ilustran en la Figura 1.
Dichas nanopartículas se pueden obtener por nanoprecipitación de uno o más compuestos idénticos o diferentes de la fórmula (I) como se definen antes, opcionalmente en la presencia de uno o más compuestos idénticos o diferentes de la fórmula (G).
La nanoprecipitación se puede llevar a cabo de acuerdo con el método antes descrito con respecto a las nanopartículas que comprenden uno o más compuestos de la fórmula (A).
La nanopartícula que comprende compuestos de la fórmula (A) se puede preparar también haciendo reaccionar una nanopartícula que comprende uno o más compuestos de la fórmula (I) de acuerdo con la invención y descrita más adelante, con uno o más compuestos de la fórmula (XI) como se define antes, seguida opcionalmente por la encapsulación no covalente o conjugación covalente de un fármaco.
El proceso de la invención es altamente versátil porque permite una modificación fácil de las funcionalidades de las nanopartículas formadas por los compuestos de la fórmula (A).
El proceso de la invención incluye la posibilidad de alterar o ajustar como se desee, la densidad de los ligandos en la superficie de las nanopartículas, mezclando los compuestos de la fórmula (I) con copolímero de PLA-PEG en diferentes proporciones para preparar nanopartículas que comprenden compuestos de la fórmula (I) o (A) junto con el copolímero de PLA-PEGs que no están funcionalizadas por un grupo azida (ver la Figura 1), dichas nanopartículas que se hacen reaccionar entonces con los compuestos de la fórmula (XI).
El proceso de la invención permite el uso de compuestos de la fórmula (I) o (A) usando diferentes longitudes de cadena de PEG y PLA (ver la Figura 2) para varias aplicaciones. Por ejemplo, las sustancias terapéuticas que son sensibles a la degradación en compartimiento sistémico (por ejemplo oligonucleótidos), pueden acoplarse a través de un Ligando de agente de acoplamiento al PLA-PEG que contiene PEG de longitud de cadena corta y después mezclarse con el copolímero de PLA-PEG hecho de PEG de cadena larga, de manera que el PEG de cadena larga forma una superficie como brocha en la cual la sustancia terapéutica está oculta y se protege así de la degradación rápida en la circulación sistémica.
Además, el proceso de la invención permite combinar diferentes tipos de Ligando PLA-PEG-funcionales (por ejemplo PLA-PEG-dispositivo buscador + PLA-PEG-agente de imagenología + PLA-PEG-sustancia que responde a estímulos) para la formación de nanopartículas multifuncionales para aplicaciones combinatorias (ver Figura 3).
Los compuestos de la fórmula (I) son pivotales para la invención ya que actúan como una plataforma de copolímero biodegradable clicable, sobre la cual se podría acoplar cualquier ligando alquino-funcional usando química clic (por medio de los compuestos de la fórmula (XI)), para una variedad de aplicaciones dependiendo del tipo de ligando funcional, tal como la entrega de fármacos, imagenología, desintoxicación, etc. Así, las ventajas de la presente invención incluyen, ínter alliae, la flexibilidad para sintetizar una variedad de nanopartículas de copolímero acopladas a ligando funcional que podrían administrarse por vía parenteral. Además, la densidad de ligando funcional en la superficie de la nanopartícula puede ser ajustada mezclando proporciones apropiadas de compuestos de la fórmula (I) y compuestos de la fórmula (?'). Además, las nanopartículas se pueden construir para que tengan porciones de PEG de diferentes longitudes de cadena, para facilitar la entrega intravenosa de sustancias terapéuticas que son químicamente sensibles en la circulación sistémica. Además, la reacción clic para acoplar el ligando funcional se puede realizar ya sea antes de la formación de nanopartícula o sobre la nanopartícula preformada, dependiendo de la naturaleza química del ligando.
De acuerdo con un objeto más, la presente invención se refiere también a un proceso para la preparación de un compuesto de la fórmula (I), que comprende el paso de hacer reaccionar un compuesto de la fórmula (II): H-PEG-X (II) donde PEG se define como en la fórmula (A), y X representa ya sea la función azida (N3) o un halógeno, tal como un átomo de Br, con el compuesto de lacturo de la fórmula: seguido por, cuando X es un átomo de halógeno, hacer reaccionar el compuesto obtenido de la fórmula (III): PLA-PEG-Hal (III) donde PLA y PEG se definen como en la fórmula (A), y Hal representa un átomo de halógeno, tal como Br, con NaN3.
Esta reacción con el lacturo se lleva a cabo generalmente mediante polimerización por abertura de anillo (ROP). Típicamente, esta reacción se lleva a cabo en la presencia de Sn(Oct)2. Puede conducirse a granel, generalmente con calentamiento, o en un solvente orgánico adecuado con un alto punto de ebullición tal como tolueno o xileno.
Generalmente, la cantidad de los compuestos de lacturo depende del n deseado en el compuesto de la fórmula (I) sabiendo que la reacción siempre puede detenerse antes de su terminación. Típicamente, la proporción molar entre el PEG macro-iniciador y el catalizador Sn(Oct)2 está comprendida entre 1 y 10.
La reacción se conduce de preferencia bajo condiciones anhidras y/o a una temperatura comprendida entre la temperatura ambiente y la temperatura de reflujo de la mezcla de reacción.
La reacción con NaN3 se conduce generalmente en un solvente orgánico aprótico tal como DMF, dimetil acetamida (DMA), acetona, etc., con un exceso de NaN3.
El compuesto de la fórmula (II): H-PEG-X (II) puede prepararse a partir de un compuesto de la fórmula (IV): Pg-PEG-OH (IV) donde Pg representa un grupo hidroxilo protector, tal como bencil (fenil-CH2-) y PEG se define como en la fórmula (A) mediante una reacción de sustitución, seguida por una reacción de desprotección.
Un grupo Pg protector, como se menciona más adelante, corresponde a un grupo que permite, por una parte, la protección de una función reactiva tal como un hidroxi o una amina durante un paso de la síntesis y, por otra parte, recuperar la función reactiva intacta al final del paso de la síntesis. Ejemplos de grupos protectores, así como también métodos para proteger y desproteger varios grupos funcionales, se dan en P. G. M. Wuts and T. W. Greene, Greene's Protectlve Groups in Organic Synthesis, 4. ed. (2007), John Wiley & Sons y en J . F . W. McOmie , Protective Groups in Organic Chem istry, Plenum Press, 1 973.
La reacción de sustitución com prende la sustitución del grupo OH con un átomo de halógeno o un grupo azida, por medio del reactivo apropiado, tal como N-halogenosuccinimida ( por ejemplo N-bromosucci nim ida (N BS)) o azida de sodio, respectivamente.
Cuando se va a sustituir un grupo halógeno, esta reacción se cond uce general mente con el reactivo de N-halogenosuccinim ida apropiado, con PPh3 en un solvente orgánico adecuado , tal como diclorometano.
Cuando se va a sustituir un grupo azida , puede conducirse una sustitución inicial con un grupo saliente, como sigue: 1 ) sustituir el grupo OH del com puesto de la fórmula (IV) con u n grupo saliente, 2) sustituir el gru po saliente del compuesto obtenido en el paso 1 ) con u n grupo azida (N3).
Como se usa en la presente, un "grupo saliente" corresponde a un grupo que puede ser escindido fácil mente a partir de una molécula mediante la ruptura de un enlace heterol ítico ((ie) un enlace cuya fisión genera un catión y un anión), con la salida de un par electrónico. Este grupo puede ser remplazado fácilmente después por otro grupo fu ncional, d urante una reacción de sustitución , por ejem plo. Tales grupos salientes pueden consistir en átomos de halógeno o grupos hidroxi activados , tales como grupos mesilato, tosilato, triflato o acetilo, etc. Ejemplos de grupo salientes, así como también referencias relacionadas con su preparación, se dan en « Advances in Organic Chemistry », J. March, 3a Edition, Wiley Interscience, p. 310-316.
Por ejemplo, en el paso 1), el grupo saliente es un mesilato y así la sustitución se lleva a cabo en la presencia de cloruro de mesilo (MsCI). Esta reacción se conduce típicamente en la presencia de DMAP, en un solvente orgánico tal como diclorometano.
La sustitución del grupo saliente con el grupo azida en el paso 2) se puede llevar a cabo en la presencia de azida de sodio, en un solvente orgánico adecuado tal como DMF.
El paso de desprotección comprende hidrolizar el grupo Pg protector del halógeno sustituido o compuesto azido obtenido, para obtener el compuesto de la fórmula (II).
La hidrólisis se lleva a cabo típicamente en condiciones ácidas, de acuerdo con procedimientos bien conocidos, en particular usando HCI concentrado cuando Pg- es fenil-CH2-.
De acuerdo con un objeto más, la presente invención se refiere también a un compuesto de la fórmula (XI): donde PEG' y Ligando se definen como en la fórmula (A).
En particular, la presente invención se refiere a compuestos de la fórmula (XI) con la excepción de De acuerdo con un objeto más, la presente invención se refiere también a un proceso para la preparación de un compuesto de la fórmula (XI): ^ .PEG'— Ligando (XI) que comprende acoplar - un compuesto de la fórmula (XII); ^PEG'— NH2 (XII) con - un ligando Precursor donde PEG' y Ligando se definen como en la fórmula (A) anterior.
Un "Ligando Precursor" es un compuesto que, cuando reacciona con el grupo -NH2 de un compuesto de la fórmula (XII) conduce al grupo -Ligando, donde Ligando es un resto de un ligando funcional como se define en la fórmula (A).
Dicho acoplamiento se puede llevar a cabo en la presencia de un reactivo de acoplamiento de péptido, en la presencia de una base.
Dicho agente de acoplamiento de péptido puede ser seleccionado de agentes de acoplamiento de péptido conocidos y más particularmente de PyBOP (hexafluorofosfato de benzotiazol-1 -il-oxitripirrolidinofosfonio) o EDC/NHS hidrocloruro de (1 -etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida/N-hidroxi sulfosuccinimida).
La base puede ser cualquier base orgánica o mineral, más particularmente una base mineral tal como trietilamina (TEA) o N,N-diisopropiletilendiamina (DI PEA).
En cuanto a combinaciones particulares, en una modalidad, PyBOP (benzotiazol-1 -il-oxitripirrolidino-fosfoniohexafluoro-fosf ato) se usa con ?,?-düsopropiletMendiamina (DIPEA) y, en otra modalidad, se usa EDC/NHS hidrocloruro de (1 -etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida/N-hidroxi sulfosuccinimida) con trietilamina.
La reacción puede conducirse en un solvente orgánico adecuado tal como diclorometano, D F o dimetil sulfóxido (DMSO).
Precursores de ligando representativos incluyen: que es un resto de anisamida; ácido fólico; FP-547-NHS que conduce a Ligando- = -NH-C(=0)-(CH2)2-FP547 que es un resto de FP547.
De acuerdo con una modalidad, el compuesto de la fórmula (XII) se puede preparar mediante: - hacer reaccionar un compuesto de la fórmula (XIII): H-PEG-OH (XIII) con un compuesto de la fórmula (XIV): Hal' (XIV) y una base, donde PEG' se define como en la fórmula (A) y Hal' representa un átomo de halógeno tal como Br, para formar el compuesto de la fórmula (XV): seguido por: - transformar el compuesto de la fórmula (XV) en el compuesto de la fórmula (XII).
La reacción del compuesto de la fórmula (XIII) con el compuesto de la fórmula (XIV) se conduce generalmente en la presencia de una base fuerte, tal como NaH, en un solvente orgánico adecuado tal como DMF.
La transformación del compuesto de la fórmula (XV) en el compuesto de la fórmula (XII) se puede lograr por varios métodos.
En particular, puede comprender: - hacer reaccionar el compuesto de la fórmula (XV) con ftalimida y PPh3 para formar el compuesto de la fórmula (XVI): seguido por: - hacer reaccionar el compuesto de la fórmula (XVI) con hidrazina hidratada para formar el compuesto de la fórmula (XII).
La reacción del compuesto de la fórmula (XV) con ftalimida y PPh3 se conduce generalmente en un solvente orgánico adecuado tal como THF, en la presencia de azodicarboxilato de diisopropilo (DIPAD), típicamente a temperatura ambiente.
La reacción del compuesto obtenido de la fórmula (XVI) con hidrazina hidratada (N2H4.H2O) se puede llevar a cabo en etanol como solvente.
Alternativamente, la transformación del compuesto de la fórmula (XV) en el compuesto de la fórmula (XII) comprende: - hacer reaccionar el compuesto de la fórmula (XV) con un compuesto de la fórmula (XVII): Lg-Hal (XVII) donde Lg es un grupo saliente y Hal" es un átomo halógeno, para formar el compuesto de la fórmula (XVIII): (XVIII) seguido por: - hacer reaccionar el compuesto obtenido de la fórmula (XVIII) con hidrazina hidratada (N2H4.H2O) y ftalato de potasio, para formar el compuesto de la fórmula (XII).
En la fórmula (XVII), Lg es ventajosamente un grupo metansulfonilo (Ms) y Hal" puede ser un átomo de Cl.
Esta reacción se conduce generalmente en la presencia de una base, tal como una base orgánica, por ejemplo trietilamina (Et3N), y opcionalmente un catalizador tal como dimetilaminopiridina (DMAP) y/o en un solvente orgánico adecuado tal como diclorometano.
La reacción del compuesto obtenido de la fórmula (XVIII) se conduce generalmente agregando primero ftalato de potasio y cantidades catalíticas de yoduro de sodio (Nal) en un solvente tal como DMF, seguido por la eliminación del solvente y agregar hidrazina hidratada (N2H4.H2O) en un solvente tal como etanol.
De acuerdo con una modalidad más, el compuesto de la fórmula (XII) se puede preparar también mediante: - hacer reaccionar un compuesto de la fórmula (XIX): H— PEG'-N3 (XIX) con un compuesto de la fórmula (XIV): donde Hal' es un átomo de halógeno, tal como Br y PEG' se define como en la fórmula (A), para formar el compuesto de la fórmula (XX): seguido por: - hacer reaccionar el compuesto de la fórmula (XX) con trifenilfosfina (PPh3), lo que lleva al compuesto de la fórmula (XII).
La reacción de un compuesto de la fórmula (XIX) con un compuesto de la fórmula (XIV) se conduce generalmente en la presencia de una base, tal como NaH, en un solvente orgánico tal como DMF.
La reacción del compuesto de la fórmula (XX) con trifenilfosfina (PPh3) se lleva a cabo generalmente en un solvente tal como tetrahidrofurano (THF), opcionalmente en la presencia de agua.
El compuesto de la fórmula (XIX) se puede preparar a partir del compuesto de la fórmula (XXI): Pg-PEG'-OH (XXI) donde Pg se define como en la fórmula (IV), mediante una reacción de sustitución, seguida por una reacción de desprotección.
Las reacciones de sustitución y de desprotección se pueden llevar a cabo como con respecto al compuesto (II) como se discutió antes.
El proceso de la invención puede comprender también el paso de aislar o purificar los compuestos obtenidos después de cada paso si se desea o requiere y/o conduciendo los pasos deseados en secuencia.
El compuesto así preparado puede ser recuperado a partir de la mezcla de reacción mediante medios convencionales. Por ejemplo, los compuestos se pueden recuperar mediante destilación del solvente de la mezcla de reacción o, si es necesario, después de destilar el solvente de la mezcla de reacción, vaciar el residuo en agua seguido por extracción con un solvente orgánico inmiscible en agua y destilar el solvente del extracto. Adicionalmente, el producto, si se desea, puede ser purificado adicionalmente mediante varias técnicas bien conocidas, tales como recristalización, reprecipitación o las varias técnicas de cromatografía, notablemente cromatografía de columna o cromatografía preparativa de capa delgada.
En los procesos anteriores, los compuestos y reactivos de partida, a menos que se indique otra cosa, están disponibles comercialmente o se describen en la literatura, o pueden ser preparados de acuerdo con métodos descritos en la literatura, como se describe en los ejemplos más adelante o como sabe alguien experto en la técnica.
Las variaciones en los procesos antes descritos serán apreciadas por el experto según sea necesario y también son parte de la invención. Las modificaciones y sustituciones apropiadas son fácilmente aparentes y bien conocidas o fácilmente obtenibles de la literatura científica por aquellos expertos en la técnica. En particular, tales métodos se pueden encontrar en R.C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH publishers, 1989.
El compuesto de la fórmula (A) o las nanopartículas que comprenden por lo menos el compuesto de la fórmula (A) de la invención pueden ser útiles para la preparación de medicamentos.
Por lo tanto, otro objeto de la invención es un medicamento, que comprende por lo menos un compuesto de la fórmula (A), opcionalmente en la forma de una nanopartícula de la invención.
Otro objeto de la invención es también una composición farmacéutica, que comprende, como principio activo, un compuesto de la fórmula (A) opcionalmente en la forma de una nanopartícula de la invención con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
Estas composiciones farmacéuticas comprenden una dosis efectiva de por lo menos un compuesto (A) de acuerdo con la invención, y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Dichos excipientes se seleccionan de acuerdo con la forma farmacéutica y la vía de administración deseada, entre los excipientes usuales conocidos por el experto en la técnica.
En las composiciones farmacéuticas, de acuerdo con la invención, para la administración oral, sublingual, sub-cutánea, intramuscular, intra-venosa, intra-arterial, tópica, local, intratraqueal, intranasal, transdérmica o rectal, el principio activo puede ser administrado como una forma de dosificación unitaria, en mezcla con excipientes farmacéuticos usuales, para animales y seres humanos.
Las formas unitarias de dosificación apropiadas comprenden las formas orales, tales como tabletas, cápsulas de gelatina duras o suaves, polvos, gránulos y soluciones o suspensiones orales, las formas sublingual, bucal, intratraqueal, intraocular, intranasal, por inhalación, las formas tópicas, transdérmica, sub-cutánea, intramuscular, intravenosa o intraarterial, las formas rectal y los implantes. Para la aplicación tópica, los compuestos de la invención pueden usarse como cremas, geles, ungüentos o lociones.
Como un ejemplo, la forma de dosificación unitaria para un compuesto de acuerdo con la invención, en la forma de una tableta, puede comprender los siguientes ingredientes: Compuesto de acuerdo con la invención 50.0 mg Manitol 223.75 mg Croscarmellosa de sod io 6.0 mg Almidón de maíz 1 5.0 mg H idroxipropil metilcelulosa 2.25 mg Estearato de mag nesio 3.0 mg En casos específicos , pueden ser apropiadas dosificaciones mayores o menores; estas dosificaciones están comprendidas dentro del alcance de la presente invención. De acuerdo con la práctica usual , la dosificación adecuada para cada paciente se determina por el facultativo de acuerdo con la vía de ad ministración , el peso y la respuesta del paciente.
Figu ras La Figura 1 ilustra u na superficie de nanopartícula clicable de PLA-PEG-N3 expuesta con densidad diferente de N3. La densidad de N3 en la superficie de la nanopartícula puede ser alterada como se desee mezclando una proporción apropiada de PLA-P EG-N3 con copol ímero de PLA-PEG.
La Figura 2 ilustra una nanopartícula de PLA-PEG clicable sintetizada usando diferentes longitudes de cadena de PEG (más cortas y más largas) para facilitar la carga y entrega intravenosa de sustancias qu ímicamente sensibles (por ejem plo oligonucleótidos).
La Figura 3 ilustra u na nanopartícula m ultifuncional preparada mezclando una variedad de copol ímeros de Ligando PLA-PEG- funcional en proporciones apropiadas para aplicaciones combinatorias (por ejemplo una nanopartícula que contiene un dispositivo buscador, agente de ¡magenología, agente que responde a estímulos).
La Figura 4 representa la evaluación de la habilidad de unión del receptor de nanopartículas de PLA-PEG-Ácido fólico usando experimentos de resonancia de superficie Plasmon. La gráfica indica la evolución de la señal específica (unidad de resonancia, indicada RU) relativa a la concentración de ácido fólico en las nanopartículas de PLA-PEG-Ácido fólico.
La Figura 5a ilustra la citotoxicidad ¡n vitro de nanopartículas de PLA-PEG-Ácido fólico (¦ = S1) comparativamente con nanopartículas de PLA-PEG-OMe (? = S2) en células KB-3-1 que sobre-expresan los receptores folato.
La Figura 5b ilustra la citotoxicidad in vitro de nanopartículas fluorescentes de PLA-PEG-anisamida (¦ = S3) comparativamente con las nanopartículas fluorescentes de PLA-PEG-OMe (? = S4) en células PC-3 que expresan los receptores sigma.
La Figura 6a ilustra la habilidad de penetración celular de las nanopartículas fluorescentes de PLA-PEG-Ácido fólico (¦ = S3') y las nanopartículas fluorescentes de PLA-PEG-OMe (? = S4') en células KB-3-1 que sobre-expresan los receptores folato.
La Figura 6b ilustra la habilidad de penetración celular de las nanopartículas fluorescentes de PLA-PEG-Ácido fólico (¦ = promedio de S1\ S3' y S5') y las nanopartículas fluorescentes de PLA-PEG- OMe (? = promedio de S2', S4' y S6') en células KB-3-1 que sobre-expresan los receptores folato. Las señales de fluorescencia han sido racionalizadas con relación a la fluorescencia de cada muestra antes del experimento.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos describen la síntesis de algunos compuestos de acuerdo con la invención. Estos ejemplos no pretenden ser limitantes y solamente ilustran la presente invención. Los números de los compuestos ejemplificados se refieren a aquéllos en la tabla dada más tarde, que ilustra las estructuras químicas y las propiedades físicas de un número de compuestos de acuerdo con la invención.
Abreviaciones: 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)- MTS 2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio ACN Acetonitrilo N3 Azida Bz Bencilo hexafluorofosfato de (Benzotriazol-1 -iloxi) PyBOP tripirrolidinofosfonio CuBr Bromuro de Cobre(l) CuS04 Sulfato de Cobre(ll) cHex Ciclo-hexano Da Dalton DCM Diclorometano Et20 Éter Dietílico DIAD Azodicarboxilato de diisopropilo DMSO Dimetil sulfóxido DMAP Dimetilaminopiridina DMF Dimetilformamida DMEM Medio de Eagle Modificado de Dulbecco DLS Dispersión de Luz Dinámica EPR Permeabilidad y Retención Incrementadas equiv., Equivalente Eq.
EtOH Etanol AcOEt Acetato de etilo EDTA Ácido etilendiaminatetraacético FBS Suero de Bovino Fetal FC Canal de Flujo FP-547 Fluosonda-547 FBP Proteina de Unión de Folato HPLC Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento N2H4.H20 Hidrazina hidratada HBr Ácido Bromhídrico HCI Ácido Clorhídrico IgG Inmunoglobulina G Sulfato de magnesio Cloruro de metansulfonilo Metanol Metoxi Hidrocloruro de N-(3-dimetilaminopropil)-N' etilcarbodiimida N,N,N',N",N"-Pentametildietilentriamina ?,?-Diisopropiletilamina 10 Nanopartícula N-Bromosuccinimida N-Hidroxisuccinimida Resonancia Magnética Nuclear Peso molecular en Número promedio 15 Salina de Búfer de Fosfato Poli(D,L-Ácido láctico) Poli (D,L-lacturo-co-glicól ido) Poli(Etilenglicol) índice de Polidispersidad 20 Poli(alcohol vinílico) Unidad de resonancia Polimerización por abertura de anillo Roswell Park Memorial Institute Cromatografía de Exclusión de Tamaño 25 Azida de sodio NaCI Cloruro de Sodio NaCh Colato de sodio NaH Hidruro de Sodio NaOH Hidróxido de Sodio Nal Yoduro de sodio Sn(Oct)2 Octoato Estanoso SPR Resonancia de Superficie Plasmon THF Tetrahidrofurano Et3N Trietilamina (TEA) PPh3 Trifenilfosfina Mw Peso Molecular en Promedio de Peso Ejemplo 1: Preparación de precursores para hacer nanopartículas Preparación 1: Síntesis de un compuesto de la fórmula (XII) 1. Procedimiento para la síntesis de mono-alquino polietilenglicol (Preparación 1A) Procedimiento Experimental: Se disolvió trietilenglicol (Sigma-Aldrich, 5620 mg, 37.4 mmol, 1 equiv.) en THF anhidro (50 mL) y la solución resultante se enfrió a 0°C en condiciones secas. Se agregó hidruro de sodio (988 mg, 1.1 equiv.) lentamente seguido por adición en gotas de bromuro de propargilo (80% en peso en tolueno, 4360 µ?_, 1.1 equiv.). La reacción se agitó durante 12 hrs a temperatura ambiente bajo atmósfera inerte.
Proceso de tratamiento: El THF se eliminó bajo presión reducida y el residuo se tomó en cloruro de metileno (diclorometano, DCM) y se lavó varias veces con salmuera. La capa orgánica resultante se secó sobre sulfato de magnesio (MgS04), se filtró, se concentró bajo presión reducida y se secó al vacío. El producto crudo se purificó por cromatografía de columna sobre sílice (eluyente: ciclohexano (cHex)/acetato de etilo (AcOEt): 8/2) y se recuperaron 3.31 g de un aceite amarillo (47% de rendimiento).
Caracterización por RMN: RMN (300 MHz, CDCI3) d 4.15 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 3.70 - 3.60 (m, 10H), 3.57 - 3.53 (m, 2H), 2.70 (m, 1H), 2.41 (t, J = 2.4 Hz, 1H). 2. La síntesis del compuesto de ftalimida-alquino trietilenglicol se ha hecho usando dos rutas diferentes, ya sea en un paso o en dos pasos vía un mesilato intermedio. 2a) Procedimiento de un paso para la síntesis de ftalimida-alquino trietilenglicol (Preparación 1B) Procedimiento Experimental: Preparación 1A: se disolvieron (2000 mg, 10.6 mmol, 1 equiv.), ftalimida (2345 mg, 1.5 equiv) y trifenilfosfina (4179 mg, 1.5 equiv) en THF anhidro (50 ml_) en condiciones secas. Se agregó azodicarboxilato de diisopropilo (DIAD) (3.14 ml_, 1.5 equiv.) lentamente y la reacción se agitó durante 48 hrs a temperatura ambiente bajo atmósfera inerte.
Proceso de tratamiento: El THF se eliminó bajo presión reducida y el residuo se tomó en DCM y se lavó varias veces con salmuera. La capa orgánica resultante se secó sobre MgS04, se filtró, se concentró bajo presión reducida y se secó al vacío. El producto crudo se purificó por cromatografía de columna sobre sílice (eluyente: cHex/AcOEt: 8/2) y se recuperaron 3.37 g de un aceite amarillo (60% de rendimiento). Caracterización por RMN: 1H RMN (300 MHz, CDCI3) d 7.76 (dd, J = 5.4, 3.1 Hz, 2H), 7.64 (dd, J = 5.4, 3.1 Hz, 2H), 4.08 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 3.74 (dt, J = 11.4, 6.0 Hz, 4H), 3.60 - 3.50 (m, 8H), 2.38 (t, J = 2.4 Hz, 1H). 2b) Para la síntesis de dos pasos de ftalimida-alquino trietilenglicol, el mesilato se sintetizó primero como sigue: Procedimiento para la síntesis de mesil-alquino trietilenglicol (Preparación 1C) Procedimiento Experimental: A una solución de alquino trietilenglicol (preparación 1A, 4 g, 212 mmol, 1 equiv.) en DCM 60 mL) se agregó bajo atmósfera inerte una cantidad catalítica de DMAP, cloruro de metansulfonilo (3.3 mL, 2 equiv.) y trietilamina (5.9 mL, 2 equiv.) en gotas. La reacción se agitó durante 4 hrs a temperatura ambiente Proceso de tratamiento: La solución se lavó con salmuera (tres veces con 50 mL), la fase acuosa se extrajo entonces con DCM (50 mL) y las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgS04, se filtraron y concentraron bajo presión reducida.
El producto final se involucró directamente (sin caracterización) en el siguiente paso. 2c) Procedimiento para la síntesis de ftalimida-alquino trietilenglicol (Preparación 1D) Procedimiento Experimental: A una solución de mesil-alquino trietilenglicol (Preparación 1C, 5.1 g, 19.2 mmol, 1 equiv.) en DMF (100 mL) se agregó ftalato de potasio (7.87 g, 2.2 equiv.) y una cantidad catalítica de yoduro de sodio (menos que un equivalente, por ejemplo una punta de espátula). La solución se agitó a 80°C por una noche y el solvente se eliminó bajo presión reducida.
Proceso de tratamiento: El residuo resultante se purificó por cromatografía de columna sobre sílice (eluyente: cHex/AcOEt: 2/8 a 4/6). Se recuperaron 5.7 g de aceite amarillo (94% de rendimiento).
Caracterización por RMN: 1H RMN (300 MHz, CDCI3) d 7.81 (dd, J = 5.5, 3.0 Hz, 2H), 7.69 (dd, J = 5.5, 3.0 Hz, 2H), 4.13 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 3.80 (dt, J = 11.4, 6.0 Hz, 4H), 3.65 - 3.56 (m, 8H), 2.40 (t, J = 2.4 Hz, 1H). 3) Procedimiento para la síntesis de amino-alquino trietilenglicol (Preparación 1E) Procedimiento Experimental: Se disolvió Preparación 1B (2034 mg, 6.4 mmol, 1 equiv.) en etanol (EtOH) (200 mL) y se agregó hidrazina hidratada (3.1 mL, 10 equiv). La mezcla de reacción se agitó durante una noche bajo condiciones de reflujo.
Proceso de tratamiento: La reacción se enfrió a temperatura ambiente y se agregaron 8 mL de ácido clorhídrico concentrado a la reacción (pH~2-3). El precipitado se eliminó mediante filtración y el pH se elevó arriba de 10 usando NaOH (2 M). La fase acuosa se extrajo tres veces con DCM. La capa orgánica resultante se secó sobre MgS04, se filtró, se concentró bajo presión reducida y se secó al vacío. Se recuperaron 911 mg de aceite amarillo (76% de rendimiento).
Caracterización por RMN: 1H RMN (300 MHz, CDCI3) d 4.13 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 3.69 - 3.50 (m, 8H), 3.43 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.38 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 1.33 (s, 2H). 13C RMN (75 MHz, CDCI3) d 79.64, 74.53, 73.47, 70.59, 70.40, 70.25, 69.09, 58.37, 41.80.
Preparación 2: Síntesis de un compuesto de la fórmula (XI) 1) Procedimiento para la síntesis de anisamida-alquino trietilenglicol (Preparación 2A) Procedimiento Experimental: A una solución de la Preparación 1E (200 mg, 1.07 mmol, 1 equiv.) en DCM (20 mL) se agregó, bajo atmósfera inerte, PyBOP (780 mg, 1.4 equiv.), ácido p-metoxibenzoico (229 mg, 1.4 equiv.) y DIEA (260 µ?_, 1.4 equiv.). La reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente.
Proceso de tratamiento: La solución se lavó con salmuera (tres veces con 20 mL), la fase acuosa se extrajo entonces con DCM (20 mL) y las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y concentraron bajo presión reducida. El producto crudo se purificó mediante cromatografía de columna sobre sílice (eluyente: cHex/AcOEt: 5/5 a 7/3) y se recuperaron 300 mg de aceite amarillo (90% de rendimiento).
Caracterización por RMN: 1H RMN (300 MHz, CDCI3) d 7.74 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.87 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.84 (amplio, 1H), 4.14 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.71 - 3.53 (m, 12H), 2.42 (t, J = 2.4 Hz, 1H). 2) Procedimiento para la síntesis de ácido fólico-alquino trietilenglicol (Preparación 2B) Procedimiento Experimental: A una solución de la preparación 1E (319 mg, 1.70 mmol, 1 equiv.) en DMF (70 mL) se agregó, bajo atmósfera inerte, EDC (393 mg, 1.2 equiv.), NHS (236 mg, 1.2 equiv.) y algunas gotas de trietilamina (Et3N). La reacción se calentó hasta 50°C y se agregó ácido fólico (Sigma-Aldrich, 754 mg, 1 equiv.) a la mezcla de reacción. La reacción se agitó entonces durante una noche a 50°C. Proceso de tratamiento: La solución se concentró bajo presión reducida. El residuo se precipitó en DCM y acetona, se filtró y se secó al vacío.
El producto obtenido se analizó en una columna de fase inversa (C18, Kromasil 10 µ??, 4.6x250 mm) por ejemplo usando un gradiente de acetonitrilo de 5 a 95% en búfer de acetato de amonio (ajustado a pH 5) 20 mM en 20 min, después 95% de acetonitrilo durante 5 min.
El producto se disuelve en DMF al 20% en el eluyente. La purificación se lleva a cabo en Kromasil C18 10 pm empacada en una columna de 100 mm (1.5 kg de fase) y elución en un búfer de acetato de amonio al 85% pH 5, 20 mM y 15% acetonitrilo, se eluyen 200 mg de producto crudo al mismo tiempo que el pico de inyección de DMF.
Purificación process (Compuesto B): La purificación final se hace mediante disolución de 200 mg del producto crudo usando HPLC preparativa con una columna de fase inversa Waters XBridge C18 (30x100 mm), 5 pm.
El producto se disuelve primero en DMSO (5 mL) y 5 mL de solución de búfer (carbonato de amonio 10 mM ajustado a pH 9.3 con una solución acuosa amoniacal al 28%).
Se hicieron 10 inyecciones de 1 mi usando un gradiente que va desde 95:5 (solución de búfer (carbonato de amonio)/acetonitrilo) a 5:95 en 12 min a 30 mL/min.
Caracterización por RMN (Compuesto B): 1H RMN (400 MHz, DMSO,d6) d 12.0-11.0 (amplio s, 1H), 8.61 (s, 1H), 8.29 (amplio s, 1H), 7.8 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.03 (amplio s, 2H), 6.85 (amplio t, J = 6.3 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 4.44 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 4.31 (m, 1H), 4.12 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 3.57 - 3.36 (m, 11H), 3.35 - 3.1 (m, 2H), 2.23 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1,91 (m, 2H) LCMS caracterización: 611 [M + H] + 3) Procedimiento para la síntesis de FP547-alquino trietilenqlicol (Preparación 2C) Procedimiento Experimental: A una solución de FP-547-NHS (Interchim, 2.5 mg, 2.55 µ????, 1 equiv.) en DMSO (356 µ?_) se agregó una solución de DMSO (92 µ?_) que contiene EDC (0.49 mg, 1 equiv.), NHS (0.29, 1 equiv.), TEA (0.35 µ?_, 1 equiv.) y de preparación 1E (1.07 mg, 2.2 equiv.).
La solución se agitó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 12 hrs.
Proceso de tratamiento: La reacción se concentró bajo presión reducida, se disolvió en DCM y se extrajo con salmuera. Se obtuvo un aceite rosa.
Caracterización por espectroscopia ultravioletavisible (UV/Vis) y fluorescencia: Los espectros obtenidos fueron similares al dado por la fuente comercial del compuesto fluoróforo.
Preparación 3: Síntesis de un compuesto de la fórmula (II) 1) Procedimiento para la síntesis de benciloxi-azida PEG2500 (Preparación 3A) Procedimiento Experimental: A una solución de PEG2500-bencil (Polimer Source, Mn = 2572 g.mol"1, 2.43 g, 0.94 mmol, 1 equiv.), DMAP (58 mg, 0.5 equiv.) y TEA (747 µ?_, 5.6 equiv.) en DCM (65 mL), enfriada a 0°C, se agrega lentamente MsCI (326 pL, 4.4 equiv.) en 20 min. La reacción se agita durante una noche a temperatura ambiente y se concentra bajo presión reducida. El residuo se disuelve en DMF (20 mL) y se agrega azida de sodio (330 mg, 5.3 equiv.) a la solución. La reacción se agita a 50°C durante 24 hrs.
Proceso de tratamiento: La reacción se concento bajo presión reducida y el residuo se disolvió en DCM (50 mL) y se lavó con salmuera (tres veces con 50 mL). La capa orgánica se seca sobre MgS04, se filtra y se concentra bajo presión reducida a un volumen mínimo de DCM. El último se precipita en éter dietílico. Se obtienen 2.16 g de un polvo blanco.
Caracterización por RMN: 1H RMN (300 MHz, CDCI3) d 7.30 - 7.05 (m, 5H), 4.43 (s, 2H), 3.93 -3.03 (m, 222H), 3.27 (t, 2H). 2) Procedimiento para la síntesis de azida PEG2500 (Preparación 3B) Procedimiento Experimental: Se disolvió Preparación 3A (2.16 g, 0.83 mmol, 1 equiv.) en HCI concentrado (20 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 días.
Proceso de tratamiento: La solución se basifica hasta pH 1 con una solución de NaOH conc. La fase acuosa se extrae con DCM (cuatro veces con 50 mL) y las capas orgánicas combinadas se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y concentran bajo presión reducida hasta un volumen mínimo de DCM. El último se precipita en éter dietílico. Se obtienen 1.89 g de un polvo blanco.
Caracterización por RMN: H RMN (400 MHz, CDCI3) d 3.73 - 3.33 (m, 222H), 3.27 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 2.75 (s, 1 H). 3) Procedimiento para la síntesis de benciloxi-bromo PEG2100 (Preparación 3C) Procedimiento Experimental: A una mezcla de PEG21 OO-bencil preparada de acuerdo con Nicolás et al. Macromol 2008, 41, 8418 (Mn = 2176 g.mol"1, 500 mg, 0.23 mmol, 1 equiv.) y NBS (50 mg, 1.2 equiv.) se agrega una solución fría de trifenil fosfina (PPh3) (75 mg, 1.2 equiv.) en DCM (50 mL). La reacción se agita entonces durante una noche a temperatura ambiente.
Proceso de tratamiento: La reacción se concentra bajo presión reducida hasta 25 mL y se diluye con hexano (100 mL). El precipitado (óxido de trifenilfosfina) se remueve mediante filtración y el polímero se precipita dos veces en éter dietílico (200 mL).
Caracterización por RMN: 1H RMN (300 MHz, CDCI3) d 7.30 - 7.16 (m, 5H), 4.50 (s, 2H), 3.85 -3.15 (m, 188H) 4) Procedimiento para la síntesis de bromo PEG2100 (Preparación 3D) Procedimiento Experimental: Se disolvió Preparación 3C (500 mg, 0.22 mmol, 1 equiv.) en HBr concentrado (20 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 días.
Proceso de tratamiento: La solución se basifica hasta pH 1 con una solución de NaOH conc. La fase acuosa se extrae con DCM (cuatro veces con 50 mL) y las capas orgánicas combinadas se secan sobre MgS04, se filtran y se concentran bajo presión reducida hasta un volumen mínimo de DCM. El último se precipita en éter dietílico para obtenerlo en forma de polvo.
Caracterización por RMN: 1H RMN (300 MHz, CDCI3) d 3.82 - 3.13 (m, 188H), 2.79 (s, 1H) Preparación 4: Síntesis of a compuesto de la fórmula (I) Se han sintetizado compuestos de la fórmula (I) usando 2 rutas diferentes. La primera (4A) es en un paso y la segunda (4B) es en dos pasos.
Preparación 4A: Síntesis de copolímero de bloque PLA-PEG-N3 mediante polimerización por abertura de anillo (ROP) m que es el número de unidades de PLA Procedimiento Experimental: A una mezcla de azido-poli(etilenglicol) (3B, Mn = 2507 g.mol" , 293 mg, 0.12 mmol) y D,L-Lacturo (7,01 g, 48.62 mmol) se agregó, en condiciones secas, una solución de Sn(Oct)2 (18.7 mg, 46.1 pmol) en tolueno anhidro (11.2 ml_). La mezcla de reacción se desgasificó por burbujeo de argón durante 20 min y después se agitó en un baño de aceite pre-calentado a 120°C durante 90 min bajo atmósfera inerte. La reacción se detuvo a aproximadamente 55% de conversión.
Proceso de tratamiento: El tolueno se eliminó bajo presión reducida y el producto obtenido se disolvió en una cantidad mínima de DCM y precipitación posterior en éter dietílico. El precipitado se disolvió después en una cantidad mínima de THF y precipitación posterior en agua y subsecuentemente secado por congelación durante una noche para dar un polvo blanco.
Caracterización por RMN: 1H RMN (400 MHz, CDCI3) d 5.41 - 4.83 (m, 456H), 4.38 - 4.15 (m, 3H), 3.84 - 3.40 (m, 220H), 3.36 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 1.82 - 1.21 (m, 1372H).
Tabla 1: m Teoría Mn m medida Mn (unidad Experimental (unidad PLA) (teoría) PLA) (RMN) 62460 4?5 35340 228 Mn = Número promedio de peso molecular determinado por RMN Teoría: a 100% de conversión NB: Se han sintetizado y usado diferentes lotes del polímero de la Preparación 4A. El valor m varía con cada lote. m fue típicamente entre 180 y 250.
Preparación 4B(1): Síntesis de copolímero de bloque PLA-PEG-Br mediante polimerización por abertura de anillo (ROP) m que es el número de unidades PLA Procedimiento Experimental: A una mezcla de bromo-poli(etilenglicol) (3D, Mn = 2149 g.mol"1, 49 mg, 22.8 pmol) y D,L-Lacturo (0.72 g, 4.97 mmol) se agregó, en condiciones secas, Sn(Oct)2 (1 mg, 2.5 pmol). La mezcla de reacción se desgasificó con argón durante 20 min y después se agitó en condiciones a granel en un baño de aceite pre-calentado a 120°C durante 20 horas bajo atmósfera inerte. La reacción se detuvo en la conversión completa.
Proceso de tratamiento: El producto obtenido se disolvió en una cantidad mínima de DC y se precipitó posteriormente en éter dietílico. El precipitado se disolvió después en una cantidad mínima de THF y se precipitó después en agua y subsecuentemente se secó por congelación durante una noche para dar un polvo blanco.
Tabla 2: m Teoría Mn m medida Mn (unidad Experimental (unidad PLA) (teoría) PLA) (RMN) 35510 218 34120 222 Mn = Número promedio de peso molecular determinado por RMN Teoría: A 100% de conversión m= (Mn experimental determinado por RMN - Mn de PEG-Br)/MW del monómero de lacturo = (34120-2100)/144=222 NB: El valor m varía con cada lote, m fue típicamente entre 100 y 300, más particularmente entre 180 y 250.
Preparación 4B(2): Procedimiento para la síntesis de azida-PEG2100-PLA m definido como en la tabla anterior.
Procedimiento Experimental: A una solución de preparación 4B(1) (200 mg, 5.9 µ????, 1 equiv.) en DMF (10 mL) se agrega azida de sodio (20 mg, 54 equiv.) bajo condiciones inertes. La reacción se agitó después a 50°C durante 3 días bajo atmósfera inerte. 1H RMN (400 MHz, CDCI3) d 5.42 - 4.83 (m, 440H), 4.38 - 4.11 (m, 3H), 3.83 - 3.40 (m, 192H), 3.35 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 1.73 - 1.31 (m, 1320H).
Proceso de tratamiento: La solución se concentra bajo presión reducida y el residuo se disuelve en una cantidad mínima de THF. El último se precipita después en agua.
Preparación 5: Síntesis de compuestos de la fórmula (A) Procedimiento típico para la reacción de Huisgen en condiciones orgánicas. m que es el número de unidades PLA, que varían con cada lote.
Ejemplo de Procedimiento Experimental Optimizado: A una solución previamente desgasificada de compuesto de la fórmula (I) PLA-PEG-N3 preparada de acuerdo con el método descrito para Preparaciones 4A (200 mg, cantidad molar dependiendo del lote, en un caso representativo :6.7 pmol, 1 equiv.) y derivado de aiquino de la fórmula (XI) (0.12 mmol, 18 equiv.) en DMF anhidro (2.5 mL) se agregó, con una jeringa, una solución desgasificada de CuBr (5.8 mg, 6.1 equiv.) y PMDETA (16.8 pL, 17.8 equiv.) en DMF anhidro (400 pL). La mezcla de reacción se agitó durante 15 hrs a 50°C bajo atmósfera inerte. Se usó la misma metodología para todas las preparaciones.
Ejemplo de Proceso de Tratamiento Optimizado: La solución se concentró bajo presión reducida y el residuo se disolvió en una cantidad mínima de THF y se precipitó después en agua. El precipitado se secó por congelación, se disolvió otra vez en una cantidad mínima de THF y se precipitó después en agua. El precipitado se secó por congelación para dar un polvo blanco.
Si el derivado de alquino es insoluble en agua entonces se puede agregar un paso intermedio disolviendo el primer precipitado secado por congelación en una cantidad mínima de DCM y se precipita después en éter dietílico.
El último paso debe ser una precipitación de THF en agua. También, se pueden agregar pasos de purificación si algunos materiales de partida permanecen después. La misma metodología se usó para todas las preparaciones en la elaboración de un compuesto de la fórmula (A) (ver la siguiente tabla 3).
Tabla 3: (*) reacción conducida en la mezcla de Compuestos A y B de la Preparación 2B Mn*: Número promedio de peso molecular determindo por RMN Copo: PLA-PEG-N3 Eq: Equivalente Caracterización por RMN de PLA-PEG-Triazol-PEG'-Anisamida 1H RMN (500 MHz, CDCI3) d 8.31 (m grande, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.81 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.97 - 5.48 (m, 389H), 4.50 (s grande, 4H), 4.10 - 4.26 (m, 3H), 3.80 (s grande, 5H), 3.30 - 3.67 (m, 198H), 1.28 - 1.62 (m, 1164H) Rendimiento: 90%.
Preparación 6: Síntesis de un compuesto de la fórmula (? Procedimiento para la síntesis de copolímero de bloque PLA-PEG-OMe por polimerización por abertura de anillo (ROP) m es el número de unidades PLA Procedimiento Experimental: A una mezcla de metoxipoli(etilenglicol) (Sigma-Aldrich, Mn = 2012 g.mol"1, 245 mg, 0.12 mmol) y D,L-Lacturo (7,01 g, 48.62 mmol) se agregó, en condiciones secas, una solución de Sn(Oct)2 (18.7 mg, 46.1 pmol) en tolueno anhidro (11.2 mL). La mezcla de reacción se desgasificó por burbujeo de argón durante 20 min y después se agitó en un baño de aceite pre-calentado a 120°C durante 30 min bajo atmósfera inerte. La reacción se detuvo a aproximadamente 54.2% de conversión.
Proceso de tratamiento: El tolueno se eliminó bajo presión reducida y el producto obtenido se disolvió en una cantidad mínima de DCM y se precipitó después en éter dietílico. El precipitado se disolvió después en una cantidad mínima de THF y se precipitó después en agua y subsecuentemente se secó por congelación durante una noche para dar un polvo blanco.
Caracterización por RMN: H RMN (400 MHz, CDCI3) d 5.34 - 4.85 (m, 434H), 4.40 - 4.17 (m, 3H), 3.86 - 3.41 (m, 178H), 3.36 (s, 3H), 1.77 - 1.19 (m, 1302H).
Tabla 4: m teoría m medido Mn (teoría) Mn (RMN) (unidad PLA) (unidad PLA) 59560 400 33260 217 Mn = Número promedio de peso molecular determinado por RMN.
Teoría: A 100% de conversión.
Ejemplo 2: Formación de nanopartícula Se prepararon nanopartículas de acuerdo con el siguiente protocolo y usando los componentes y cantidades como se especifica en las siguientes tablas.
General protocolo 1. El copolímero o una mezcla de copolímeros se disuelve en el solvente orgánico (con una concentración final de polímero acuoso que varía entre 1 y 40 mg/mL). 2. La fase orgánica se mezcla con la fase acuosa (con una proporción de volumen acuoso/orgánico que varía entre 2.5 y 5) que contiene el estabilizador (concentración que varía entre 0.1% y 1% p/v). Para la preparación de nanopartículas usando la técnica de emulsificación y reducción de tamaño, la mezcla se agita vigorosamente usando un agitador de vórtice durante 1 minuto para obtener una emulsión. La emulsión se somete a sonicación (usando una sonda con un tiempo que varía de 1 a 10 minutos). 3. La fase orgánica se elimina por evaporación (bajo presión reducida o flujo de aire). 4. Las nanopartículas se ultracentrifugan a 30000 g durante 30 minutos. 5. Las nanopartículas se resuspenden en medio acuoso. 6. Las nanopartículas se filtran sobre un disco de filtro de vidrio de 1 pm (Acrodisc). 7. Las nanopartículas se almacenan a 4°C hasta se uso.
Como un ejemplo se usó el siguiente protocolo donde se usaron 1.2 mi de AcOEt como solvente orgánico (ver los últimos 3 ejemplos en la Tabla 6 más adelante) 1. El copolímero o una mezcla de copolímeros (masa total: 30 mg) se disuelve en AcOEt (1.2 mL). 2. La fase orgánica se agrega a 3.3 mL de una fase acuosa que contiene 1% de Pluronic F68. 3. La mezcla se agita vigorosamente con un agitador de vórtice d urante 1 minuto. 4. La em ulsión se somete a ultrasonido (usando una sonda) durante 3 minutos. 5. La fase orgánica se elimina bajo presión red ucida usando un evaporador giratorio. 6. Las nanopartículas se ultracentrifugan a 30000 g d urante 30 mi nutos. 7. Las nanopartículas se resuspenden en 3m L de salina amortiguada con fosfato (PBS) con pH 7.4. 8. Las nanopartícu las se filtran sobre un disco de filtro de vidrio de 1 pm (Acrodisc) . 9. Las nanopartículas se al macenan a 4°C hasta su uso.
Se caracterizaron nanopartículas usando DLS ( Dispersión de Luz Dinám ica) y un aparato de Malvern (Zetasizer Nano ZS). Cada copol ímero mencionado en las tablas más adelante tienen un peso molecular medio com prendido entre 30000 Da y 35000 Da.
O Tabla 5: Nanopartículas hechas de copolímero de -PEG-OMe y PL-A-PEG^Ñ, Las concentraciones de la concentración de tensoactivos indicadas en la tabla anterior están en %P/V Pluronic® = Pluronic F68; Copo= copolímero; Pdl= Indice de polidispersidad PVA = Pol¡(alcohol vinílico) ~9500 Da PLA = 30,000 Da (promedio); PEG=2500 Da para PLA-PEG-N3 y 2000 Da para PLA-PEG-OMe PLA-PEG-OMe preparado de acuerdo con la preparación 6 PLA-PEG-N3 preparado de acuerdo con la preparación 4A > O Tabla 6: Nanopartículas hechas de copolímero de ligando PLA-PEG mezclado o no con copolímero de PLA-PEG-OMe Las concentraciones de la concentración de tensoactivo indicadas en la tabla anterior están en %P/V Pluronic® = Pluronic F68; Copo= copolímero; Pdl= Indice de Polidispersidad PVA = Poli(alcohol vinílico) ~9500 Da, PLA = 30,000 Da(promedio); PEG = 2500 Da para PLA-PEG-N3 y PEG = 2000 Da para PLA-PEG-OMe PLA-PEG-OMe - preparación 6 PLA-PEG-Anisamida - preparación 5 PLA-PEG- Ácido fólico - preparación 5 PLA-PEG-FP547 - preparación 5 Las tablas anteriores muestran que: - DCM/PVA conduce a nanopartículas físicamente estables con un rango medio diámetro de 230 nm.
- EtOAc/NaCh resultó en nanopartículas físicamente estables con un rango medio de diámetro de 160 nm.
EtOAc/Pluronic® condujo a nanopartículas físicamente estables con un rango medio de diámetro de 110 nm.
- El uso de acetona resultó en micelas con un rango medio de diámetro de 30 nm.
Número de liqandos por nanopartícula: Np = Número de nanopartículas (NPs.L 1 de suspensión) x= contenido de sólidos (g. L"1) D = diámetro promedio (cm) dp = densidad de polímero (g.cm"3) Para polímeros PLA la densidad promedio se menciona con frecuencia como 1.24 o 1.27 g.cm"3.
El diámetro promedio es de alrededor de 110 nm (1.1x10"5 cm).
El contenido de polímero sólido es de alrededor de 10 g.L"1 para la solución madre.
Por lo tanto: Np ~ 1016 NPs.L"1.
Considerando que el copolímero tiene un peso molecular de aproximadamente 35000 g.mol"1.
Considerando que la concentración máxima para el ácido fótico en la superficie de las nanopartículas (para que las nanopartículas sean estables en solución de PBS a pH 7.4) es de alrededor de 30%.
El número de Avogadro es NA = 6.022x1023 mol"1.
Considerando los datos dados antes, por nanopartícula hay: 17000 moléculas de copolímero y 5100 moléculas de ácido fólico (si Mn(copo)=35000 g.mol"1). 20000 moléculas de copolímero y 6000 moléculas de ácido fólico (si Mn(COpO)=30000 g.mol"1).
Ejemplo 3: Resonancia de Superficie Plasmon (SPR) usando nanopartículas de PLA-PEG-Ácido fólico.
Preparación de Chip CM5 de Sensor Serie S (GE Healthcare) Este chip de sensor está cubierto con una matriz de dextran carboximetilado unido covalentemente a la superficie de oro del chip y compuesto por 4 canales.
Inmovilización de Proteina de Unión de Folato ((FBP), Siqma-Aldrichl: El protocolo usado para la inmovilización de la proteína es el que se describe por Johnson (Johnson et al Anal. Biochem. 1991, 198, 268-277). Brevemente, después del equilibrio del instrumento con pH 7.4, PBS, se inyectaron automática y sucesivamente las siguientes muestras al BIAcore T100: (i) NHS/EDC en una solución mezclada (1:1, v/v) durante 420 s para activar el dextran carboxilado; (ii) FBP disuelto a una concentración de 125 µg/mL en búfer de acetato (pH 5.0) durante 420s, (iii) etanolamina durante 420s para desactivar grupo de NHS-ésteres residuales en el chip de sensor. Cada paso fue salpicado con lavados de PBS. El protocolo de inmovilización, que se realizó a un régimen de flujo de 10 pL/min, permitió la unión de ~ 6.8 ng/mm2 de FBP por canal.
El primer canal de flujo (Fc1) fue bloqueado solamente por etanolamina de manera que pudiera usarse como un canal de referencia con el fin de verificar si el dextran está jugando o no un papel en la adsorción de nanopartículas.
Verificación de la conformación de FBP inmovilizado y regeneración de superficie: Con el fin de verificar si el FBP inmovilizado estaba en la conformación correcta se usó un anticuerpo policlonal anti-FBP (IgG anti-FBP, Thermo Scientific). La InmunoglobulinaG (IgG) se inyectó a 50 pg/mL durante 120s a 30 pL/min.
La señal específica es 4.5 veces más grande que la señal no específica (IgG en el canal de referencia Fc1) que representa aproximadamente 22% de la señal total.
Se consideró el uso de glicina y etilenglicol para regenerar la superficie. De hecho, fue posible después obtener una señal específica similar con la IgG anti-FBP.
Se ensayó además una suspensión de nanopartículas en un canal de chip sensor cubierto con proteína preparada recientemente.
Evaluación de la interacción entre nanopartículas de PLA-PEG-Ácido fólico y FBP inmovilizado Se realizaron Análisis de Resonancia de Superficie Plasmon de adsorción de nanopartícuias de PLA-PEG-Ácido fóiico en FBP inmovilizado usando nanopartícuias no conjugadas de PLA-PEG como control. Estos experimentos se condujeron a un régimen de flujo de 5 pL/min con un tiempo de contacto de 500s.
Nanopartícuias usadas: Se prepararon diferentes suspensiones de nanopartícuias, usando el protocolo previamente descrito (con pluronic® como un estabilizador), con el objeto de variar la concentración de ácido fóiico en la superficie de las nanopartícuias. Con el fin de hacer eso, se prepararon nanopartícuias de una mezcla de PLA-PEG-OMe (Mn(RMN)=34820 g.mol"1) y PLA-PEG-Ácido fóiico (Mn(RMN)=32880 g.mol"1).
Tabla 7: Resumen de los datos de caracterización de nanopartícuias usadas para los experimentos de SPR: Pdl : índice de Polidispersidad El porcentaje de ácido fólico se calculó a partir de la cantidad de PLA-PEG-Ácido fólico usado para cada preparación y el rendimiento del acoplamiento de clic entre el alquino-ácido fólico y el PLA-PEG-N3. Más allá de 30% de aglomerado de nanopartículas de copolímero de ácido fólico.
Experimentos de resonancia de superficie Plasmon: Cada suspensión de nanopartículas fue probada en un canal de chip sensor cubierto con proteína preparada recientemente.
Tabla 8: Resumen de los experimentos conducidos: FC = Canal de Flujo RUFBP inmov = Unidad de resonancia de FBP inmovilizado RUNANOS = Unidad de resonancia de nanopartícula inmovilizada Copo = copolímero PBS = Salina amortiguada con fosfato Análisis de Resultado: Los valores finales de las señales obtenidas a partir de sensorgramas de SPR de cada muestra se graficaron en una gráfica contra la concentración de ácido fólico en las nanopartículas (Figura 4).
Por lo tanto, esta gráfica muestra la evolución de la seña l específica relativa a la concentración de ácido fólico en la superficie de la nanopartícula . A 1 2%, se alcanza un máximo donde la señal específica representa aproximadamente 70% de la señal total . Más allá de 1 2% la señal específica es decreciente . Esto se puede deber a algún apilamiento entre las diferentes porciones de ácido fólico previ n iendo así una mejor interacción . La seña l no específica es dada por el valor para nanopartículas que no tienen ácido fólico en su superficie.
Como se m uestra en las primeras 7 l íneas de la tabla, no importa q ue nanopartículas se inyectaron en el canal de referencia, no se obtiene señal. Por lo tanto, la superficie de recubrimiento origi nal (dextran) no ind uce ni nguna adsorción de nanopartículas.
La no especificidad se debe ciertam ente al recubri miento de PEG de las nanopartículas con el FB P.
Ejemplo 4: Citotoxicidad Ejemplo 4a: Citotoxicidad de Nanopartículas de PLA-PEG-Ácido fólico Con el fin de ensayar estas nanopartículas , se usó la línea celular KB-3-1 (H uman Cervix Carcinoma , DSMZ (Germán collection of microorganisms and cells culture, catalog code: ACC 158) ya que expresa receptores de folato.
Cultivo de células: Esta es una línea celular adherente que crece en monocapas y se cultivaron células con el fin de inducir una sobre-expresión de los receptores folato. El medio usado para sobre-expresar los receptores folato fue DMEM 2429 (medio sin ácido fólico) en el cual se agregaron L-Glutamina (200 mM a 0.584 g/L, BioWhittaker, Lonza) y bicarbonato de sodio (3.7 g/L, Sigma-Aldrich) y se suplemento con penicilina/estreptomicina al 1% (Lonza) y Suero de Bovino Fetal al 10% (FBS, Lonza) en una atmósfera humedecida de C02 al 5% a 37°C.
Nanopartículas usadas: Se prepararon dos suspensiones diferentes de nanopartículas, usando el protocolo previamente descrito (con pluronic® como un estabilizador), con el objeto de tener nanopartículas de ácido fólico y nanopartículas de control (sin ácido fólico).
Con el fin de hacer eso, se prepararon nanopartículas a partir de una mezcla de PLA-PEG-OMe (Mn(RMN)=34820 g.mol"1; 70% o 100% en peso) y PLA-PEG-Ácido fólico (Mn(RMN)=32880 g.mol"1; 30% o 0% en peso respectivamente).
Tabla 9: Resumen de los datos de caracterización de nanopartículas usadas para el ensayo citotóxico: Metodología del ensayo de citotoxicidad: En una placa de 96 pozos, se depositaron por pozo 5x102 células diluidas en 50 µ?_ de medio de cultivo (como se describió antes). Después de 24 h en una incubadora de células, se agregaron 50 µ?_ de búfer de PBS que contiene nanopartículas a diferentes concentraciones de copolímero (0.5, 0.1, 0.05, 0.01 mg/mL). Se dejó entonces que la placa reposara en una incubadora de células (C02 al 5%, 37°C) durante 48 h. Después, se agregaron 20 ML de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfo-fenil)-2H-tetrazolio) (MTS, un compuesto de tetrazolio incluido en el CelITiter 96® AQue0us Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega) y la placa se analizó con un lector de microplacas (Labsystem Multiscan MS, Type 352) a 492 nm después de 3 horas de incubación en una incubadora de células.
Los datos se compararon con un pozo que contiene solamente 5x102 células en 50 µ?_ de medio de cultivo y 50 µ?_ de búfer de PBS y se revelaron con 20 µ?_ de MTS. De todos los datos se eliminó un antecedente que consiste de nanopartículas, a la concentración relevante, en 50 µ?_ de medio de cultivo y 50 µ?_ de búfer de PBS y se reveló con 20 µ?_ de MTS. Los experimentos se realizaron por triplicado.
La gráfica se expresó como una función de un porcentaje de células vivas, 100% siendo el pozo que contiene solamente células y MTS.
Resultados: El experimento realizado con CelITiter 96® AQue0us One Solución Cell Proliferation Assay (Promega) se ilustra en la Figura 5a.
Se observó que aún a alta concentración, no importa la presencia o no de ácido fólico, las nanopartículas no inducen ninguna citotoxicidad en las células KB-3-1 que sobre-expresan receptores folato.
Ejemplo 4b: Citotoxicidad de nanopartículas PLA-PEG-Anisamida Con el fin de probar estas nanopartículas, se usó la línea celular PC-3 (Human Prostate Adenocarcínoma, ATCC (Número: CRL-1435)) ya que expresa receptores sigma a los cuales se podría unir la porción anisamida.
Cultivo de células: Esta línea celular adherente se cultivó en RPMI 1640 (Fisher Scientific) suplementado con penicilina/estreptomicina al 1% (Lonza) y Suero de Bovino Fetal al 10% (FBS, Lonza) en una atmósfera humedecida de C02 al 5% a 37°C. Esta línea celular sobre-expresa receptores sigma. Se usaron cultivos de 85-90% de confluencia para todos los experimentos. Las células se tripsínizaron (Tripsina- EDTA, Invitrogen, Gibco), se contaron, se sub-cultivaron en placas de 96 pozos para viabilidad de estudios. Las células se dejaron adherir durante 24 h antes de usar para experimentos.
Nanoparticulas usadas: Se prepararon dos diferentes suspensiones de nanoparticulas, usando el protocolo previamente descrito (con pluronic®® como un estabilizador), con el objeto de tener nanoparticulas fluorescentes de anisamida y nanopartícula fluorescente como control (sin anisamida).
Con el fin de hacer eso, se prepararon nanoparticulas a partir de una mezcla de PLA-PEG-FP547 (Mn(RMN)=34820 g.mol 1; 10% en peso en ambas preparaciones), PLA-PEG-OMe (Mn(R N) = 34820 g.mol"1; 45% o 90% en peso) y PLA-PEG-Anisamida (Mn(RMN)=37060 g.mol"1; 45% o 0% en peso respectivamente).
Tabla 10: Resumen de los datos de caracterización de nanoparticulas usadas para el ensayo de citotoxicidad: Metodología del ensayo de citotoxicidad: En una placa de 96 pozos, se depositaron 5x103 células por pozo diluidas en 50 µ?_ de medio de cultivo (como se describió antes). Después de 24 h en una incubadora de células, se agregaron 50 pL de búfer de PBS que contiene nanopartículas a diferentes concentraciones de copolímero (5, 2.5, 0.5, 0.05 mg/mL). Después, la placa se dejó reposar en una incubadora de células (C02 al 5%, 37°C) durante 48 h. Después, se agregaron 20µ?_ de (3-(4,5-dimetilt¡azol-2-il)-5-(3-carbox¡metoxifenil)-2-(4-sulfo-fenil)-2H-tetrazolio) (MTS, un compuesto de tetrazolio incluido en el CelITiter 96® AQUeous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, (Promega) y la placa se analizó con un lector de microplacas (Labsystem Multiscan MS, Tipo 352) a 492 nm después de 3 horas de incubación en una incubadora de células.
Los datos se compararon con un pozo que contiene solamente 5x103 células en 50 pL de medio de cultivo y 50 pL de búfer de PBS y revelaron con 20 pL de MTS. A partir de todos los datos se eliminó un antecedente que consiste de nanopartículas, a la concentración relevante, en 50 pL de medio de cultivo y 50 pL de búfer de PBS y se reveló con 20 pL de MTS. Los experimentos se realizaron por triplicado.
La gráfica se expresó como una función de un porcentaje de células vivas, 100% siendo el pozo que contiene solamente células y MTS.
Resultados: El experimento realizado con CelITiter 96® AQue0us One Solución Cell Proliferation Assay (Promega) se ilustra en la Figura 5b.
Se observó que aún a altas concentraciones de hasta por lo menos 5 mg/mL, no importa la presencia o no de anisamida, las nanopartículas fluorescentes no indujeron ninguna citotoxicidad en las células PC-3 que expresan receptores sigma.
Ejemplo 5: Ensayo de penetración celular de Nanopartículas de PLA-PEG-Ácido fólico Con el fin de probar estas nanopartículas, se usó la línea celular KB-3-1 (Human Cervix Carcinoma, DSMZ (Germán collection of microorganisms and cells culture, catalog code: ACC 158) ya que expresa receptores folato.
Cultivo de células: Son una línea de células adherentes que crecen en monocapas y se cultivaron con el fin de inducir una sobre-expresión de los receptores folato. El medio usado para sobre-expresar los receptores folato fue DMEM 2429 (medio sin ácido fólico) en el cual se agregaron L-Glutamina (200 mM a 0.584 g/L, BioWhittaker, Lonza) y bicarbonato de sodio (3.7 g/L, Sigma-Aldrich) y suplementado con penicilina/estreptomicina al 1% (Lonza) y Suero de Bovino Fetal al 10% (FBS, Lonza) en una atmósfera humedecida de C02 al 5% a 37°C.
Nanopartículas usadas: Se prepararon tres lotes de 2 diferentes suspensiones de nanopartículas, usando el protocolo previamente descrito (con pluronic® como un estabilizador), con el objeto de tener nanopartículas fluorescentes de ácido fólico y nanopartículas fluorescentes como control (sin ácido fólico). Con el fin de hace eso, se prepararon nanopartículas a partir de una mezcla de PLA-PEG-FP547 (Mn(RMN)=34820 g.mor ), PLA-PEG-OMe (Mn(RMN)=34820 g.mol"1) y PLA-PEG-Ácido fólico (Mn(RMN)=32880 g.mol"1).
El primer lote (S1\ S2') se hizo 23 días antes que el segundo lote (S3\ S4') y 34 días antes del tercer lote (S5\ S6').
Tabla 11: Resumen de los datos de caracterización de nanopartículas usadas para el ensayo de citotoxicidad: Metodología de clasificación de células activadas con fluorescencia: Línea celular KB-3-1 se cultivó en un medio para sobre-expresar sus receptores folato (como se mencionó antes) se dejó crecer en una placa de 24 pozos hasta cerca de confluencia (-300000 células/pozo). El medio de cultivo se remueve entonces y se incuba 1 ml_ de nanopartículas diluidas en el mismo medio de cultivo, a una concentración final de copolímero de ~60 pg/mL, con las células para varias cantidades de tiempo (desde 10 min hasta 24 horas). Después, el medio de cultivo se remueve, cada pozo se lava dos veces con búfer de PBS (1mL) y las células es desprenden con tripsina (200 µ?_ durante 3 min). La tripsina se neutraliza entonces con medio de cultivo (800 µ?_) y se centrifugan las células (5 min a 1000 g). El sobrenadante se remueve, las células se resuspenden en PBS (1 ml_), se centrifugan (5 min a 1000 g) y finalmente se recuperan con paraformaldehído (200 µ?_, 1% en PBS).
El estudio de citometría de flujo se logró usando un analizador celular BD LSRFortessa con una longitud de onda de excitación de 561 nm y una señal de emisión recuperada entre 575 y 589 nm.
Resultados: Los resultados obtenidos de los experimentos FACS se ilustran en las Figuras 6a y 6b.
Se observó que cuando está presente el ácido fólico en la superficie de las nanopartículas (S3 ), las últimas son 115 veces más internalizadas que las nanopartículas sin ácido fólico (S4'). También se observó que se alcanza una plataforma entre 6 y 10 horas de incubación.
También se observó que se podrían obtener los mismos resultados con lotes de 1 mes de edad, 10 días de edad o 1 día de edad. Por lo tanto, se puede concluir que las nanopartículas de ácido fólico son estables en el tiempo y que las porciones de ácido fólico permanecen en la superficie de las nanopartículas.
Ejemplo 6: Encapsulación de docetaxel (DTX) en nanopartículas de PLA-PEG-Anisamida Para encapsular docetaxel, se usó el mismo protocolo previamente mencionado para la preparación de nanopartículas. Se usó docetaxel tritiado durante el proceso para evaluar la carga de fármaco y la eficiencia de entrampamiento.
A 30 mg de copolímeros (una mezcla de PLA-PEG-OMe (Mn(RMN) = 34820 g.mol"1; 60% en peso) y PLA-PEG-Anisamida (Mn(RMN)=37060 g.mol"1; 40% en peso)) diluidos en 1.2 mL de acetato de etilo se agregaron 2.8 mg de DTX (3.24 pmol; 861.9 g.mol"1) y 4 nmol de 3H-DTX (5.38x105 Bq). Esta fase orgánica se mezcló con 3.3 mL de una solución acuosa de pluronic F68 (1% p/v). Las dos fases se agitaron vigorosamente con un vórtice durante 1 min y después con sonido con una sonda durante 3 min. Después, la fase orgánica se eliminó bajo presión reducida y la fase acuosa resultante se filtró a través de un filtro de vidrio de 1 µp? antes de ultra-centrifugación (30 min a 30000 g). El sobrenadante se eliminó y las nanopartículas se resuspendieron en búfer de PBS (10 mL) y se filtraron a través de un filtro de vidrio de 1 pm.
Resultados: El sobrenadante y la solución de NPs se contaron con un contador Beckman beta que permite calcular una carga de fármaco de 4.3% y una eficiencia de entrampamiento de 46%.
Ejemplo 7: Procedimiento típico para la reacción de Huisgen en condiciones acuosas para llevar a cabo química clic sobre las nanopartículas de PLA-PEG-N3 preformadas Tabla 12 Procedimiento Experimental: A una suspensión de nanopartículas (hechas de PLA-PEG-N3 (20% p/p) y PLA-PEG-OMe (80% p/p)) preparada siguiendo el protocolo previamente descrito y estabilizada con poli(alcohol vinílico) (PVA) (1% p/v) se agregó PEG-Alquino (2 equiv comparado con el grupo azido), CuS04.5H20 y ascorbato de sodio (en exceso).
La mezcla de reacción se agitó durante 24 h.
Finalmente, la suspensión se dializó contra agua usando una membrana de celulosa con un corte de 20000 Da (SpectrumLabs). Observación: El tamaño de la suspensión de NPs permanece estable durante el proceso clic: Z-promedio= 198.5 nm y el Pdl = 0.09 De una manera similar, otros ligandos (por ejemplo, ligandos fluorescentes... ) se pueden unir a la nanopartícula de acuerdo con la metodolog ía antes descrita.

Claims (37)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de la fórmula (A) donde: PLA representa un resto de poliácido láctico; PEG representa un resto de polietilenglicol; el enlazador PEG' es un resto de polietilenglicol; y Ligando es un resto de ligando funcional.
2. El compuesto de la fórmula (A) de acuerdo con la reivindicación 1, en donde PEG' es de la fórmula donde: n' es el número de unidades y está comprendido entre 1 y 10 (1) es la unión del enlace al grupo -(CH2)-triazol; (2) es la unión del enlace con el ligando.
3. El compuesto de la fórmula (A) de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde PLA es de la fórmula: donde: (3) es la unión del enlace con la porción de PEG; y m es el número de unidades y está comprendido entre 1 y 500.
4. El compuesto de la fórmula (A) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde PEG es de la fórmula: donde: (4) es la unión del enlace con -PLA; (5) es la unión del enlace con el átomo de nitrógeno de n es el número de unidades y está comprendido entre 1 y 300.
5. El compuesto de la fórmula (A) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde Ligando se selecciona de restos de dispositivos buscadores, agentes de diagnóstico, agentes de imagenología, agentes sensible a estímulos, agentes de acoplamiento, agentes de penetración celular, agentes desintoxicantes y fármacos.
6. El compuesto de la fórmula (A) de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicho dispositivo buscador es un ligando de reconocimiento de membrana.
7. El compuesto de la fórmula (A) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde Ligando se selecciona de: un ligando de reconocimiento de membrana seleccionado de un antagonista de receptor de estrógeno, un antagonista de receptor de andrógeno, ácido fólico, anisamida, un anticuerpo capaz de reconocer el antígeno superficial correspondiente, una secuencia RGD que se une a integrinas a?ß3 sobreexpresadas en el endotelio angiogénico de tumor, ácido hialurónico, transferrina, vectores de gen localizados por péptido, aptámeros, o factor de necrosis de tumor, agentes de diagnóstico/imagenología seleccionados de óxido de fierro, complejos de gadolinio, verde de indocianina, sondas fluorescentes cercanas al infrarrojo, o emisores de positrones, sustancias que responden a estímulos seleccionadas de nanopartículas de óxido de fierro, nanopartículas de oro, o cualesquiera sustancias activables por radiación, agentes de acoplamiento seleccionados de oligopéptidos, un agente de penetración celular seleccionado de secuencias de Transactivador de transcripción (TAT), penetratin, secuencias de poliarginina, o secuencias de proteína VP22, un agente desintoxicante seleccionado de cobalamina, cobinamida, enzima rodanesa, una enzima hidrolizante de organofósforo, naloxona, atropina, o anticuerpos/fragmentos de anticuerpo que reconocen una toxina específica; o un fármaco seleccionado de un antibiótico, agente anti-cáncer, agente antiviral, agente anti-inflamatorio, un antígeno de vacuna o un producto nutricéutico.
8. Una nanopartícula que comprende uno o más compuestos idénticos o diferentes de la fórmula (A) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. La nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende además uno o más compuestos de la fórmula (G): PLA-PEG-OR (G) donde PLA y PEG se definen como en la fórmula (A) y R es H o un alquilo de Ci-C6.
10. La nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, que comprende un fármaco.
11. La nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el fármaco es un agente citotóxico.
12. La nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en donde el fármaco es un taxoide.
13. La nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 10, 11 o 12, en donde el fármaco es docetaxel.
14. La nanopartícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde el fármaco está encapsulado no covalentemente con la nanopartícula.
15. La nanopartícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el fármaco está conjugado covalentemente con la nanopartícula.
16. Un proceso para la preparación de un compuesto de la fórmula (A) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende acoplar: - un compuesto de la fórmula (I): PLA-PEG-N3 (I) con - a compuesto de la fórmula (XI): (XI) donde PLA, PEG, PEG' y Ligando se definen como en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
17. El proceso de acuerdo con la reivindicación 16, en donde dicho acoplamiento se hace mediante química clic.
18. El proceso de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, en donde dicha reacción de acoplamiento se lleva a cabo de acuerdo con la reacción de Huisgen, en condiciones orgánicas o acuosas.
19. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16, 17 o 18, en donde dicha reacción de acoplamiento de la química clic se lleva a cabo en la presencia de CuBr y PMDETA (N, N, ?', N', N"-pentametildietilentriamina).
20. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16, 17 o 18, en donde dicha reacción de acoplamiento de la química clic se lleva a cabo en la presencia de agua, CUSO4-5H2O y ascorbato de sodio.
21. Un compuesto de la fórmula (I): PLA-PEG-N3 (I) donde PLA y PEG se definen de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 4.
22. Una nanopartícula que comprende uno o más compuestos idénticos o diferentes de la fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 21.
23. La nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 22 que comprende además uno o más compuestos de la fórmula (G): PLA-PEG-OR (G) donde PLA y PEG se definen como en cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3 y 4 y R es H o un alquilo de C^-C6-
24. Un proceso para la preparación de un compuesto de la fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 21, que comprende el paso de hacer reaccionar un compuesto de la fórmula (II): H-PEG-X (II) donde PEG se define como en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 y X es un átomo de halógeno o una azida (N3) con el compuesto de la fórmula: mediante polimerización por abertura de anillo (ROP), seguido por, cuando X es un átomo de halógeno, hacer reaccionar el compuesto obtenido de la fórmula (III): PLA-PEG-Hal (III) donde PLA y PEG se definen como en la fórmula (A), y Hal representa un átomo de halógeno, con NaN3.
25. El proceso de acuerdo con la reivindicación 24, en donde dicha reacción se lleva a cabo en la presencia de Sn(Oct)2.
26. El proceso de acuerdo con la reivindicación 24 o 25, que comprende además la preparación del compuesto de la fórmula (II): H-PEG-X (II) compuesto de la fórmula (IV) Pg-PEG-OH (IV) donde Pg representa un grupo hidroxilo protector, X es un átomo de halógeno o una azida (N3) y PEG se define como en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 mediante - una reacción de sustitución de OH con X, seguido por - una reacción de desprotección.
27. El proceso de acuerdo con la reivindicación 26, en donde, cuando X es un grupo azida, la reacción de sustitución comprende: 1) sustituir el grupo OH del compuesto de la fórmula (IV) con un grupo saliente, 2) sustituir el grupo saliente del compuesto obtenido en el paso 1) con un grupo azida (N3).
28. Un compuesto de la fórmula (XI): donde PEG' se define como en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 y Ligando se define como en cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 y 7.
29. Un proceso para la preparación del compuesto de la fórmula (XI) de acuerdo con la reivindicación 28: que comprende hacer reaccionar - un compuesto de la fórmula (XII); ^\.PEG— NH2 (XII) con - un ligando Precursor donde PEG' se define como en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2.
30. El proceso de acuerdo con la reivindicación 29, en donde dicho acoplamiento se lleva a cabo en la presencia de un reactivo de acoplamiento de péptido, en la presencia de una base.
31. El proceso de acuerdo con la reivindicación 30, en donde dicho reactivo de acoplamiento de péptido se selecciona de PyBOP (benzotiazol-1 -il-oxitripirrolidinfosfoniohexafluorofosfato) y la base es ?,?-diisopropiletilendiamina (DIPEA).
32. El proceso de acuerdo con la reivindicación 30, en donde dicho reactivo de acoplamiento de péptido es EDC/NHS hidrocloruro de (1 -etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida/N-hidroxi sulfosuccinimida) y la base es trietilamina.
33. Un proceso para la preparación de la nanopartícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 que comprende hacer reaccionar una nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 22 o 23 con uno o más compuestos de la fórmula (XI) de acuerdo con la reivindicación 28, opcionalmente seguido por encapsulación no covalente o conjugación covalente de un fármaco.
34. Un proceso para la preparación de la nanopartícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 que comprende nanoprecipitar uno o más compuestos de la fórmula (A) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, opcionalmente en la presencia de un compuesto de la fórmula (G) como se define en la reivindicación 9, opcionalmente seguido por encapsulación no covalente o conjugación covalente de un fármaco.
35. Un proceso para la preparación de la nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 22 o 23 que comprende nanoprecipitar uno o más compuestos de la fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 21, opcionalmente en la presencia de un compuesto de la fórmula (G) como se define en la reivindicación 10.
36. Un medicamento, que comprende por lo menos un compuesto de la fórmula (A) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, opcionalmente en la forma de una nanopartícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15.
37. Una composición farmacéutica, que comprende, como principio activo, un compuesto de la fórmula (A) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, opcionalmente en la forma de una nanopartícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
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