CN110305217A - 双特异性抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了新的抗体和癌症治疗方法。具体地说，本发明涉及靶向CD3和肿瘤抗原靶点例如HER2的双特异性抗体，所述抗体的制备方法及其用途。本发明还涉及包含上述抗体的组合物以及使用所述抗体治疗癌症的方法。

Description

双特异性抗体及其应用

技术领域：

本发明一般性涉及抗体和癌症治疗方法。具体地说，本发明涉及靶向CD3和肿瘤抗原靶点例如HER2的双特异性抗体，所述抗体的制备方法及其用途。本发明还涉及包含上述抗体的组合物以及使用所述抗体治疗癌症的方法。

技术背景：

目前恶性肿瘤在全球的发病率和死亡率逐年增加，同时也有年轻化的趋势。虽然市场上存在多种抗肿瘤药物，但它们不仅难以治愈肿瘤，还具有许多副作用，严重影响患者的预后及生活质量。因此，研发出对肿瘤细胞特异性杀伤力强，且对正常细胞影响较小的抗肿瘤药物成为下一代新药研发的热点。

抗肿瘤药物分为化学药物和生物类药物，前者包括烷化剂、抗代谢药等，而生物类药物包括单克隆抗体、抗体偶联药物和双特异性抗体等。其中，双特异性抗体是人工设计的抗体，由两个不同抗原结合位点的组分构成，可同时与两种不同的抗原结合位点结合，由于它的这种特殊的功能，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。

发明概述

在一方面，本发明涉及抗体或抗体片段，其包含结合CD3的抗原结合域，所述结合CD3的抗原结合域具有GXP2的重链可变区(VH)序列(SEQ ID NO:21)和GXP2的轻链可变区(VL)序列(SEQ ID NO:22)。

在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO:9所示的重链序列，和SEQ ID NO:11所示的轻链序列。

在一些实施方案中，所述抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。

在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段还包含针对肿瘤抗原靶点的另一抗原结合域。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原靶点是HER2。

在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段包含选自Her2-OB1(SEQ ID NO:1)、Her2-OB2(SEQ ID NO:3)、Her2-OB3(SEQ ID NO:5)和Her2-OB4(SEQ ID NO:7)的重链序列，优选所述抗体或抗体片段包含Her2-OB4(SEQ ID NO:7)的重链序列。

在一些实施方案中，所述抗体片段选自Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、F(ab')2片段和scFv片段。

在一个方面，本发明涉及双特异性抗体，其具有两条重链和一条轻链，其中第一重链自N端到C端具有scFv-铰链区-Fc；第二重链自N端到C端具有VH-CH1-铰链区-Fc；所述轻链自N端到C端具有VL-CL，其中所述第一重链的scFv的抗原结合结构域结合肿瘤抗原靶点，所述第二重链的VH-CH1与所述轻链的VL-CL形成另一抗原结合域，其结合免疫效应细胞表面的信号通道受体。

在上述双特异性抗体的一些实施方案中，所述肿瘤抗原靶点是HER2，且所述信号通道受体是CD3。

在上述双特异性抗体的一些实施方案中，所述第二重链的VH具有SEQ ID NO:21的序列，所述轻链的VL具有SEQ ID NO:22序列。

在上述双特异性抗体的一些实施方案中，所述第二重链具有GXP2-VH-OA(SEQ IDNO:9)的序列，所述轻链具有GXP2-VL(SEQ ID NO:11)的序列。

在上述双特异性抗体的一些实施方案中，所述第一重链的scFv自N端到C端具有Ch4D5单克隆抗体的VH区，连接肽[(GGGGS)xN，N＝3,4,5]和Ch4D5单克隆抗体的VL区，或者自N端到C端具有Ch4D5单克隆抗体的VL区，连接肽[(GGGGS)xN，N＝3,4,5]和Ch4D5单克隆抗体的VH区。

在上述双特异性抗体的一些实施方案中，所述第一重链具有选自下组的序列：Her-OB1(SEQ ID NO:1)、Her-OB2(SEQ ID NO:3)、Her-OB3(SEQ ID NO:5)和Her-OB4(SEQID NO:7)，其中优选所述第一重链具有Her-OB4(SEQ ID NO:7)的序列。

在上述双特异性抗体的任意实施方案中，所述第二重链的CH2可以含有L234A，L235A突变。在一些实施方案中，所述第一重链的CH2可以含有L234A，L235A突变。

在上述双特异性抗体的任意实施方案中，所述第二重链的CH3可以含有T394D,P395D,P396D突变，且所述第一重链的CH3可以含有P395K,P396K,V397K突变；或者所述第二重链的CH3可以含有P395K,P396K,V397K突变，且所述第一重链的CH3可以含有T394D,P395D,P396D突变。

在一些实施方案中，相比于对应抗体的野生型Fc区，本发明的双特异性抗体的第一重链和第二重链组成的嵌合Fc区与Fc受体的结合降低。

在一些实施方案中，相比于鼠源单克隆抗体，本发明双特异性抗体结合CD3分子的热变性温度提高。在一些实施方案中，其结合CD3分子的热变性温度提高表现为△T提高至少5℃。在一些实施方案中，其结合CD3分子的热变性温度提高表现为△T提高至少10℃。在一些实施方案中，其结合CD3分子的热变性温度提高表现为△T提高至少12℃。在一些实施方案中，其结合CD3分子的热变性温度提高表现为△T提高5-15℃。在一些实施方案中，其结合CD3分子的热变性温度提高表现为△T提高10-15℃。

在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体具有肿瘤杀伤活性。在一些实施方案中，所述肿瘤是HER2阳性肿瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤选自乳腺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌和肺癌的肿瘤。在一些实施方案中，在体外肿瘤杀伤试验中测试肿瘤杀伤活性。在一些实施方案中，在小鼠体内肿瘤模型中测试肿瘤杀伤活性。

在上述双特异性抗体的任意实施方案中，所述第一重链、第二重链和/或轻链来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。在一些实施方案中，所述第一重链、第二重链和/或轻链来自IgG1。

在另一个方面，本发明涉及核酸分子，其包含编码如本发明的双特异性抗体的第一重链、第二重链和/或轻链的核苷酸序列。

在再一个方面，本发明涉及编码包含本发明的核酸分子的载体。

在一个方面，本发明涉及包含本发明的核酸分子的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞选自293F细胞和CHO细胞。

在另一个方面，本发明涉及抗体偶联物，其包含本发明的抗体或抗体片段，或双特异性抗体，和与所述抗体或抗体片段，或双特异性抗体偶联的部分。在一些实施方案中，所述偶联部分可以选自细胞毒素、放射性同位素、荧光标记物、发光物、显色物质和酶。

在一些实施方案中，与本发明的抗体或抗体片段，或双特异性抗体偶联以形成抗体偶联物的部分是细胞毒素。在一些实施方案中，所述细胞毒素选自：秋水仙素，emtansine,maytansinoid,auristatin,vindesine,tubulysin等。

在一些实施方案中，与本发明的抗体或抗体片段，或双特异性抗体偶联以形成抗体偶联物的部分是放射性同位素。在一些实施方案中，所述放射性同位素选自：At²¹¹,I¹³¹,I¹²⁵,Y⁹⁰,Re¹⁸⁶,Re¹⁸⁸,Sm¹⁵³,Bi²¹²,P³²的放射性同位素等。

在一些实施方案中，与本发明的抗体或抗体片段，或双特异性抗体偶联以形成抗体偶联物的部分选自荧光标记物、发光物和显色物质，例如：FITC,luciferase,HRP等。

在一些实施方案中，与本发明的抗体或抗体片段，或双特异性抗体偶联以形成抗体偶联物的部分是酶，例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其活性片段和/或变体。

在再一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体或抗体偶联物，和任选地药学上可接受的载体，表面活性剂和/或稀释剂。

在一些实施方案中，除本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体或抗体偶联物外，所述药物组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂选自：Opdivo,Keytruda,Tecentriq,Imfinzi,Yervoy等肿瘤免疫药物。

在一个方面，本发明涉及本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体、抗体偶联物或药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。在一些实施方案中，所述疾病是癌症，优选HER2阳性的癌症。

在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌。

在另一个方面，本发明涉及本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体、抗体偶联物或药物组合物，其用于治疗HER2阳性的癌症。

在再一个方面，本发明涉及一种治疗疾病的方法，其包括向受试者施用根据本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体、抗体偶联物或药物组合物的步骤。

在一些实施方案中，所述疾病是癌症，优选HER2阳性的癌症。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌。

在一方面，本发明涉及多肽，其具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在另一方面，本发明涉及多肽，其具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。

在一方面，本发明涉及多肽，其具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在另一方面，本发明涉及多肽，其具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

附图说明

图1.本发明的双特异性抗体的分子结构示意图。

图2A-2B.用蛋白A纯化的双特异性抗体的SDS-PAGE电泳图。图2A是非还原SDS-PAGE电泳图，图2B是还原SDS-PAGE电泳图。其中M为蛋白分子量标记，2-7泳道是不同收集管中的双特异性抗体样品。

图3.双特异性抗体HER2xGXP2、HER2xGXP和HER2xC31以及对照hIgG与人CD3抗原结合活性的ELISA检测结果。

图4.双特异性抗体HER2xGXP2、HER2xGXP和HER2xC31以及对照hIgG与人HER2抗原结合活性的ELISA检测结果。

图5.在不同温度下处理30min后，双特异性抗体HER2xGXP2、HER2xGXP和HER2xC31与人CD3抗原结合活性的ELISA检测结果。其反应了双特异性抗体在不同温度下的热稳定性。

图6A-6D.在37℃和40℃培养箱中放置不同天数后，通过非还原性和还原性SDS-PAGE检测双特异性抗体的稳定性和降解情况。图6A：37℃，非还原性SDS-PAGE；图6B：37℃。还原性SDS-PAGE；图6C：40℃，非还原性SDS-PAGE；图6D：40℃，还原性SDS-PAGE。

图7A-7C.通过SDS-PAGE和ELISA检测双特异性抗体反复冻融后的稳定性实验结果。图7A：非还原性和还原性SDS-PAGE结果；图7B：CD3ELISA结果；图7C：HER2ELISA结果。

图8A-8D.双特异性抗体对细胞因子释放的影响。显示了在来自供体#1和供体#2的PBMC样品中，双特异性抗体HER2xGXP2和对照CD3单抗处理后细胞因子TNF-α和IL-6释放的ELISA结果。图8A：供体#1，IL-6；图8B，供体#1，TNF-α；图8C：供体#2，IL-6；图8D：供体#2，TNF-α。

图9A-9D.不同浓度的双特异性抗体介导的T细胞体外肿瘤杀伤实验的结果。图9A:靶细胞为SKBR-3细胞；图9B：靶细胞为NCI-N87细胞；图9C：靶细胞为MCF-7细胞；图9D：靶细胞为293F细胞。

图10.不同剂量的双特异性抗体在动物肿瘤模型中抑制体内肿瘤生长的结果。

发明详述

术语和缩略语

除非本文另有定义，与本申请结合使用的科学和技术术语及其缩略语应具有本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义。以下列举了本文中使用的部分术语和缩略语。

抗体：antibody，Ab；

免疫球蛋白：immunoglobulin，Ig；

重链：heavy chain，HC；

轻链：light chain，LC；

重链可变区：heavy chain variable domain，VH；

重链恒定区：heavy chain constant domain，CH；

轻链可变区：light chain variable domain，VL；

轻链恒定区：light chain constant domain，CL；

抗原结合区：antigen binding fragment，Fab；

铰链区：hinge region；

Fc片段：fragment crystallizable region，Fc region；

单克隆抗体：monoclonal antibodies，mAbs；

抗体依赖性细胞毒作用：antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC；

补体依赖性细胞毒性作用：complement dependent cytotoxicity，CDC；

自然杀伤细胞：natural killing cell，NK细胞；

双特异性抗体：bispecific antibody，BsAb；

T细胞受体：T cell receptor，TCR；

主要组织相容性复合体：major histocompatibility complex，MHC；

互补决定区：complementarity determining region，CDR，是指抗体的抗原互补结合区；

免疫受体酪氨酸活化基序：immunoreceptor tyrosine-based activationmotif，ITAM；

人类表皮生长因子受体2：human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2；

单链可变区抗体片段(又称单链抗体)：single-chain variable fragment，scFv；

过继免疫治疗：adoptive cellular immunotherapy，ACI；

淋巴因子激活的杀伤细胞：lymphokine-activated killer cell，LAK细胞；

肿瘤浸润淋巴细胞：Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL细胞；

细胞因子诱导的杀伤细胞：cytokine-induced killer cell，CIK细胞；

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法：Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使用，是指由氨基酸残基组成的多聚物。一个氨基酸的羧基末端和另一氨基酸的氨基末端经过脱水缩合形成肽键而彼此相连。多肽链和蛋白质可通过化学合成，也可重组表达，且没有最小氨基酸长度的限制。

本文所用“氨基酸”是指20种天然存在的氨基酸或者任何可能出现在某一特定的位置非天然的氨基酸类似物。

本文所用“氨基酸突变”是指多肽链中某一个氨基酸的添加、取代、插入和/或删除。

本文所用“抗体”包括全长抗体和抗体片段，涉及来自有机体的天然抗体、基因工程抗体或者通过重组技术获得的抗体。术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体等。术语“抗体”还包括鼠源抗体、人源化抗体和人抗体等。

术语“抗体片段”或“抗原结合片段”包括但不限于：(i)Fab片段，其具有V_L、C_L、V_H和C_H1域；(ii)Fab'片段，其是在C_H1域的C端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)具有V_H和C_H1域的Fd片段；(iv)Fd'片段，其具有V_H和C_H1域和在CH1域的C端的一个或多个半胱氨酸残基；(v)Fv片段，其具有抗体的单一臂的V_L和V_H域；(vi)dAb片段，其由VH域或VL域组成；(vii)F(ab')2片段，一种包含由铰链区处的二硫桥连接的两个Fab'片段的二价片段；(viii)单链可变片段(scFv)。本文所用“抗体片段”不仅包含上述抗体片段，还包括由全抗体改造而来的抗体及使用重组DNA技术而合成的新的抗体。

本文所用“双特异性抗体”是指是人工设计的抗体，其由两个不同抗原结合位点的组分构成，可同时与两种不同的抗原结合位点结合。

本文所用“Fc”或“Fc区”或“Fc片段”是指由IgA、IgD及IgG的CH2和CH3结构域，或者由IgE及IgM的CH2、CH3和CH4结构域通过铰链区的组成的多肽。尽管Fc片段的分解是可变的，但是人IgG的重链Fc片段通常指从A231到其羧基末端这一段多肽。

本文所用“铰链区”是指抗体中位于CH1与CH2之间，富含脯氨酸，易伸展弯曲的多肽链。而公认的IgG铰链区为第216位至230位的氨基酸残基构成的多肽链。

本文所用“IgG”是指由已确认的免疫球蛋白γ基因编码的一类抗体，人IgG包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

本文所用术语“EC50”即半最大效应浓度(concentration for 50％of maximaleffect)，是指引起50％最大效应所对应的抗体浓度。

本文所用“人源化抗体”是指人源免疫球蛋白(受体抗体)的部分或者全部CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或者抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或者反应性的非人源(如小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的架构区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或者被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步改善或者优化抗体的一种或多种特性。

本文所用“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。抗原决定簇大多存在于抗原物质的表面，有些存在于抗原物质的内部，须经酶或其他方式处理后才暴露出来。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团，如氨基酸、碳水化合物或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的点和特征。抗原表位可以是“线性的”或者“构象的”。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(如抗体)之间所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在；在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。一个天然抗原物质可有多种和多个决定簇。抗原分子越大，决定簇的数目越多。

本文所用“特异性结合”是指，两种分子间的非随机的结合反应，如抗体及其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方案中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、或10^-10M或更小的亲和力(K_D)结合该抗原。在本发明的一些实施方案中，术语“靶向”指特异性结合。

本文所用“K_D”是指，特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，用于描述抗体与抗原间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、或10^-10M或更小的平衡解离常(K_D)结合抗原。

本文所用“载体(Vector)”是指可以将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。而当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，该载体称为表达载体。载体可以通过转化、转导或者转染等方法导入宿主细胞，继而使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内获得表达。载体是本领域技术人员公认的、包括但不局限于：(1)质粒；(2)噬菌粒；(3)柯斯质粒；(4)人工染色体，如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；(5)噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及(6)动物病毒，如逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、孢疹病毒(如单纯孢疹病毒)、痘病毒、杆状病毒。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不局限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因；此外，载体还可以含有复制起始位点。

抗体是抗原刺激机体产生免疫反应后，由浆细胞分泌的能与抗原特异性结合的免疫球蛋白，由于是天然产生的，所以毒副作用较小。近十年来，传统的单克隆抗体在肿瘤免疫治疗中取得了巨大的成功。截至2016年底全球已有63个抗体类药物上市，2016年全球抗体销售额超过1000亿美元。2016年全球销售前10名的药品中，有7个是生物药，其中6个是抗体类药物，占全球药品销售额的20％以上。单抗药物的作用机理包括阻断生长信号、阻断肿瘤血管生成、诱导细胞凋亡、激活免疫细胞产生免疫效应，其中单抗发挥重要功能主要是通过Fc与免疫细胞(如NK细胞、单核细胞等)表面的FcγR(Fcγ受体)结合激活细胞增强ADCC(antibody dependent cellular cytotoxicity，抗体依赖的细胞毒性作用)、ADCP(antibody dependent cellular phagocytosis)或通过Fc与补体蛋白C1q结合增强CDC(complement dependent cytotoxicity，补体依赖的细胞毒性作用)来发挥细胞杀伤作用。

抗体药物区别于传统化学治疗方法的低毒性和高特异性是其成功优势，但抗体药物面临总体有效性低的问题。另外抗体药物的治疗效果也受到耐药性的困扰，肿瘤异质性以及肿瘤细胞自身的多信号通路调节使得单一靶点的免疫治疗容易产生耐药性。这些问题都与单克隆抗体的作用机理有关，单克隆抗体是通过自身的Fc片段来结合NK细胞表面的Fc受体，从而激活NK细胞来杀伤肿瘤。但人的Fc受体存在遗传多态性，表达高亲和力受体(VV基因型)的人群只占20％左右，而表达低亲和力的人群对单克隆抗体作用的应答率较差。这些都决定了单抗药物在人群中的总反应率不高。同时NK细胞只占总免疫细胞PBMC的总数的5-8％左右，单抗药物在肿瘤杀伤过程中不能发挥其他免疫细胞的作用。

目前普遍认为T细胞才是抗肿瘤杀伤最重要的免疫细胞，它占PBMC总数的20％以上，包括CD8+的细胞毒性T细胞，CD4+的辅助T细胞等。为了在肿瘤病人体内建立特异性抗肿瘤的细胞免疫，很多能够同时结合肿瘤相关抗原和T细胞激活信号通路的受体的双特异性抗体被设计出来了。这一类双特异性抗体的一端结合T细胞或其他免疫细胞上的受体分子，如CD3，TCR，CD28，CD16，NKG2D等等；另一端可结合肿瘤细胞上的靶标，从而促免疫T细胞能够识别、结合肿瘤细胞，并形成免疫桥链，以清除肿瘤细胞。

本发明人对多株抗人CD3复合物的鼠源抗体进行了深入的分析和比较，包括CRIS-7，UCHT-1，TRX4，OKT3，MEM-57，SP34，HiT3a，并对其中一株鼠源抗体GXP(SP34)进行了序列优化及人源化改造。

GXP(SP34)是一株抗人CD3的鼠源单克隆抗体，在多个专利文献中都有所披露，而且也有一些公司对其进行了人源化改造(US9587021，PCT/US20121038219)。本发明人对其VH及VL的框架区序列进行人源化改造，并保留鼠源重链的和轻链的所有的CDR1、CDR2及CDR3序列不变。另一个重要原则是尽量保留每个CDR区N端或C端附近的鼠源序列，以降低对抗体结构稳定性及对抗原亲和力的影响。

本发明人确定的所述抗体的人源化最终序列命名为GXP2，其相比于野生型抗体，经过本发明优化的该株CD3鼠源抗体的人源化序列GXP2获得了许多独特的性能和优势。这些新的特性使这一新的人源化抗体更适合于抗体药物的开发。具体而言，与该鼠源抗体或其他人源化序列相比，本发明优化的抗体序列，抗体蛋白的表达量明显增加，热稳定性也大幅度提高，对CD3抗原的亲和力与结合也有提高，在用于双特异性抗体制备时，显示出更强的肿瘤杀伤活性。本发明的公开的这一人源化序列比其他公司的人源化序列有更多的优势和特点，用于制备抗肿瘤新药显示出更好的杀肿瘤活性，而且理化稳定性也大幅度提高，更适合于抗肿瘤药物的筛选和开发，这一创造性的成就构成了本发明的有益的效果和极高的医疗应用价值。

因此，在一方面，本发明涉及一种抗体或抗体片段，其包含结合CD3的抗原结合域，所述结合CD3的抗原结合域具有GXP2的重链可变区(VH)序列(SEQ ID NO:21)和GXP2的轻链可变区(VL)序列(SEQ ID NO:22)。在一个实施方案中，抗体或抗体片段可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段可以是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。

在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO:9所示的重链序列，和SEQ ID NO:11所示的轻链序列。

在一些实施方案中，本发明的抗体是双特异性抗体或多特异性抗体，所述双特异性抗体或多特异性抗体还包含针对肿瘤抗原靶点的另一抗原结合域。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原靶点是人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factorreceptor-2，HER2)。

已经鉴定出与特定癌症相关的许多肿瘤相关抗原。如本文所用，术语“肿瘤抗原靶点”是指由癌细胞差异表达，因此可以利用以靶向癌细胞的抗原。癌症抗原是可以潜在地刺激明显的肿瘤特异性免疫应答的抗原。这些抗原中的一些由正常细胞编码，但不一定由正常细胞表达。这些抗原可以表征为在正常细胞中通常是沉默(即不表达)的那些抗原、仅在某些分化阶段表达的那些抗原和那些在特定时间上表达的那些抗原，如胚胎和胎儿抗原。其它癌症抗原由突变细胞基因如癌基因(例如激活的ras癌基因)、抑制基因(例如突变型p53)和由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白编码。其它癌症抗原可以由病毒基因编码，如RNA和DNA肿瘤病毒上携带的基因。许多肿瘤抗原已经根据多种实体瘤定义：MAGE 1、2和3，由免疫定义；MART-1/Melan-A、gp100、癌胚抗原(CEA)、HER-2、粘蛋白(即MUC-1)、前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)。此外，已经显示了乙肝(HBV)、埃巴(EBV)和人乳头瘤(HPV)等病毒蛋白分别在肝细胞癌、淋巴瘤和子宫颈癌的发展中起重要作用。然而，肿瘤使用或受益于一系列不同的免疫逃避机制，使得癌症患者的免疫系统通常不能对肿瘤抗原识别或响应。通常与睾丸、胎盘和卵巢的精母细胞或精原细胞相关的癌抗原的一些实例包括癌症-睾丸(CT)抗原BAGE、GAGE、MAGE-1和MAGE-3、NY-ESO-1、SSX。这些抗原存在于黑素瘤、淋巴瘤、肺癌、膀胱癌、结肠癌和乳腺癌中(例如，如Butterfield et al.,J.Immunotherapy2008；31:294-309；Markowicz et al.,J Clin Oncol 27:15s,2009中所述)。通常在黑素细胞、上皮组织、前列腺和结肠中发现的癌症抗原还包括分化抗原Gp100、Melan-A/Mart-1、酪氨酸酶、PSA、CEA和Mammaglobin-A。这些抗原存在于黑素瘤、前列腺癌和结肠癌和乳腺癌中。一些癌症抗原是以低水平普遍表达但在癌症中过表达的共享抗原。过表达的癌症抗原的实例包括在食道、肝脏、胰腺、结肠、乳腺、卵巢、膀胱和前列腺癌中发现的p53、HER-2/neu、livin和存活蛋白。其它癌症抗原是独特的，如与黑素瘤、非小细胞肺癌和肾癌的一种或多种相关的β-连环蛋白-m、β-肌动蛋白/4/m、肌球蛋白/m、HSP70-2/m和HLA-A2-R170J。其它癌症抗原是通常在上皮组织如肾、肠和结肠直肠组织中发现的肿瘤相关的碳水化合物抗原。这些癌症抗原包括可以在黑素瘤、成神经细胞瘤、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中发现的GM2、GD2、GD3、MUC-1、sTn、abd globo-H。另外的肿瘤抗原、肽表位及其描述于美国专利No.7,906,620；7,910,692；8,097,242；7,935,531；8,012,468；8,097,256；8,003,773；Tartour et al.,Immunol Lett 2000；74(1):1-3，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，使用完整的癌抗原，而在其它实施方案中，使用癌抗原的肽表位(通过蛋白水解消化或重组制备)。因此，与本文所述的组合物和方法一起使用的肿瘤或癌症抗原的非限制性实例包括但不限于Her2、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、β-连环蛋白-m、B细胞成熟抗原(BCMA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙网膜蛋白(calretinin)、MUC-1，上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、Mammaglobin-A、黑素瘤相关抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病的液状蛋白(gross cystic disease fluid protein)(GCDFP-15)、EBV、gp100、HMB-45抗原、蛋白melan-A(被T淋巴细胞识别的黑素瘤抗原；MART-1)、livin、存活蛋白、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触囊泡蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、丙酮酸激酶同工酶M2型的二聚体形式(肿瘤M2-PK)，CD19，CD22，CD27，CD30，CD70，GD2(神经节苷脂G2)EphA2,CSPG4,CD138,FAP(成纤维细胞活化蛋白),CD171,kappa,lambda,5T4,α_vβ₆整联蛋白,B7-H3,B7-H6,CAIX,CD19,CD20,CD22,CD30,CD33,CD44,CD44v6,CD44v7/8,CD70,CD123,EGFR,EGP2,EGP40,EpCAM,fetal AchR,FRα,GAGE,GD3,HLA-A1+MAGE1,MAGE-3,HLA-A1+NY-ESO-1,IL-11Rα,IL-13Rα2,Lewis-Y,Muc16,NCAM,NKG2D Ligands,NY-ESO-1,PRAME,ROR1,SSX,存活蛋白,TAG72,TEMs,VEGFR2,EGFRvIII(表皮生长因子变体III)，精子蛋白17(Sp17)，间皮蛋白(mesothelin)，PAP(前列腺酸性磷酸酶)，prostein，TARP(T细胞受体γ交替读码框蛋白)，Trp-p8，STEAP1(前列腺六跨膜上皮抗原1(six-transmembrane epithelial antigen of the prostate 1))，HSP70-2/m和HLA-A2-R170J，酪氨酸酶，异常ras蛋白或异常p53蛋白。

HER2是人类表皮生长因子受体家族(又称ErbB家族)的第二个成员。该家族属于Ⅰ型酪氨酸激酶，共有HER1、HER2、HER3和HER4四个成员，对正常或异常的表皮细胞的生长、分化和转移都起非常重要的调控作用，故与多种肿瘤的发生发展密切相关。

HER2定位于人染色体17q21上，编码分子量为185KD的具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白(Akiyama T et al.The product of the human c-erbB-2gene:a185-kilodaltonglycoprotein with tyrosine kinase activity.Science.1986Jun 27；232(4758):1644-6)。HER2通常只在胎儿期表达，成年后在极少数正常组织内有微量表达，如乳腺、胃肠道、肾脏和心脏(Olayioye MA.Update on HER-2as a target for cancer therapy:intracellular signaling pathways of ErbB2/HER-2and family members.BreastCancer Res.2001；3:385–9；Yamamoto T et al.Similarity of protein encoded by thehuman c-erbB-2gene to epidermal growth factor receptor.Nature.1986；319:230–4)。正常情况下，细胞内的HER2基因处于非激活状态，且只有2个拷贝；当发生基因突变时，HER2基因可被激活并扩增20倍甚至更多，随后上调转录和增加蛋白合成，抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞增殖；还可以通过促进肿瘤组织的血管和淋巴管生成，从而增强肿瘤细胞的侵袭。此外，HER2蛋白在二聚化和自身磷酸化后，可激活PI3K/AKT通路和RAS/MAPK信号通路，促进细胞无限增殖和分化，也抑制细胞凋亡，从而促使细胞发生癌变(Browne BC etal.HER-2signaling and inhibition in breast cancer.Curr Cancer Drug Targets2009；9(3):419–38；Castaneda CA et al.The phosphatidyl inositol 3-kinase/AKTsignaling pathway in breast cancer.Cancer Metastasis Rev 2010；29(4):751–9)。此外，HER2过表达可以启动多种转移相关机制，从而增加肿瘤细胞迁移能力，包括细胞迁移率、侵袭力等。一般而言，表现为HER2基因扩增和(或蛋白过表达)的肿瘤一般恶性程度高、转移能力强。可见，HER2基因的过表达不仅与肿瘤的发生发展密切相关，还是一个重要的临床治疗监测及预后指标，并且是肿瘤靶向治疗药物选择的一个重要靶点(Slamon DJ etal.Use of chemotherapy plus a momoclonal antibody against HER2for metastaticbreast cancer that overexpression HER2.N Engl J Med.2001Mar 15；344(11):783-92)。

研究发现，HER2过表达存在于多种恶性肿瘤当中，包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌等。20％-30％的原发性乳腺癌中存在HER2基因的扩增和蛋白的过表达，是引起肿瘤细胞的恶性转移的重要因素。HER2过度表达的乳腺癌患者病情进展迅速，化疗缓解期短，内分泌治疗效果差，无病生存和总生存率低。有研究表明，HER2阴性的转移性乳腺癌患者的存活率是17-22个月，而HER2的患者的生存率仅有8-10个月，仅为前者的一半(SlamonDJ et al.Science 1987；235:177-82)。

胃癌在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位，而在7％-34％的胃癌中有HER2过表达的现象。胃癌预后差，进展期胃癌5年从生存率只有5％-20％，中位生存时间不超过1年。研究表明，胃癌的HER2阳性表达与肿瘤的分化程度、Lauren分型和WHO分型相关，与性别、年龄、肿瘤部位无相关性。

在18％-43％的卵巢癌也有HER2过表达的现象(GlenMark communication)。有研究报道，与HER2阴性卵巢癌患者(0/1+)相比，HER2阳性患者(2+/3+)的总生存率显著降低(Verri E et al.HER2/neuoncopprotein overexpression in epthelial ovariancancer:evaluation of its precalence and prognostic significance.Oncology,2005,68:154-161)。

此外，HER2在前列腺癌和肺癌同样存在过表达现象。Signoretti等人检测不同临床阶段前列腺癌样本的DNA、RNA和蛋白质水平，发现HER2过表达在接受不同治疗方法的患者中比率是有区别的，仅手术切除前列腺癌的患者中占25％，手术前接受抗雄性激素治疗的患者中占59％，而高达78％的雄性激素治疗失败后且发生骨转移(雄性激素依赖型AI)的患者存在HER2过表达。而肺癌中HER2过表达与基因转录及转录后修饰密切相关。

现在临床上使用的HER2靶向药包括前文所述的TrastuzumabPertuzumab和Ado-trastuzumabemtansine虽然有一定的治疗效果，但都还存在许多局限性：(1)约60-70％的患者对Herceptin有原发性耐药；(2)大概70％患者在使用Herceptin治疗1年就会产生获得性耐药；(3)Kadcyla一线治疗效果并不如Herceptin，而且其价格非常昂贵，给患者造成很大的经济负担(GlenMarkcommunication)。

本发明参照单克隆抗体Ch4D5的氨基酸序列(PDB Database#1N8E)，设计并构建了结合肿瘤靶点Her2/neu的ScFv结构，并进一步设计了VH-接头-VL，VL-接头-VH及VH-接头-VL加上L234A，L235A突变等几种形式。具体设计如下：

在第一种实施方案中，结合肿瘤靶点Her2的scFv从N端到C端由抗Her2抗体Ch4D5的VH与15个氨基酸的短肽接头(GGGGS)x3连接，再与Ch4D5的VL连接。所得scFv与铰链区及具有OB突变序列(T394D,P395D,P396D)的Fc相连，形成结合Her2的ScFv-Fc重链，即Her2-OB1(SEQ ID NO:1)。

在第二种实施方案中，结合肿瘤靶点Her2的scFv从N端到C端由Ch4D5的VL与15个氨基酸的短肽接头(GGGGS)x3连接，再与Ch4D5的VH连接。所得scFv与铰链区和具有OB序列的Fc相连，形成结合Her2的ScFv-Fc重链，即Her2-OB2(SEQ ID NO:3)。

在第三种实施方案中，结合肿瘤靶点Her2的ScFv-Fc重链的结构与第一种实施方案相似，即由抗Her2抗体Ch4D5的VH与15个氨基酸的短肽接头(GGGGS)x3连接，再与Ch4D5的VL连接。所得的scFv与铰链区及具有OB序列的Fc相连。由于Her2-OB1(SEQ ID NO:1)在VL区与铰链区之间包含NcoI和Bg1II多克隆位点，因此包含额外的非人源的氨基酸TVAMVR。在本实施方案中该序列被置换为人源抗体序列GEPK，形成结合Her2的ScFv-Fc重链Her2-OB3(SEQ ID NO:5)。

第四种实施方案为在第三种实施方案的基础上在单克隆抗体Ch4D5重链的CH2区引入了L234A，L235A的突变，以降低抗体的ADCC功能及CDC功能，避免对T细胞的损伤。所得序列为Her2-OB4(SEQ ID NO:7)。

以上四种构建体均显示对Her2/neu的高亲和力，其中具有VH-接头-VL结构的OB1、OB3、OB4比具有VL-接头-VH结构的OB2显示更高的亲和力。

因此，在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含选自Her2-OB1(SEQ IDNO:1)、Her2-OB2(SEQ ID NO:3)、Her2-OB3(SEQ ID NO:5)和Her2-OB4(SEQ ID NO:7)的重链序列，优选所述抗体包含Her2-OB4(SEQ ID NO:7)的重链序列。所述重链序列以高亲和力结合HER2，与上述GXP2的VH序列(SEQ ID NO:21)和GXP2的VL序列(SEQ ID NO:22)(结合CD3的抗原结合域)组成双特异性抗体或多特异性抗体，用于治疗HER2阳性的癌症，例如HER2阳性的乳腺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌和肺癌等。

在一些实施方案中，如上文所述的抗体片段选自Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、F(ab')2片段和scFv片段。

在一个方面，本发明涉及一种双特异性抗体，其具有两条重链和一条轻链，其中第一重链自N端到C端具有scFv-铰链区-Fc；第二重链自N端到C端具有VH-CH1-铰链区-Fc；所述轻链自N端到C端具有VL-CL，其中所述第一重链的scFv的抗原结合结构域结合肿瘤抗原靶点，所述第二重链的VH-CH1与所述轻链的VL-CL形成另一抗原结合域，其结合免疫效应细胞表面的信号通道受体。

图1显示了本发明的双特异性抗体的分子结构示意图。

本发明所披露的这一双特异性抗体在结构上具有以下特点：

1.由于该双特异性抗体分子含有两个不同的抗原结合区域，其中一个可以特异性识别肿瘤相关抗原，另一个可以特异性地识别并结合免疫效应细胞上的信号通路靶点。它可以特异性地捕捉人体内的免疫细胞，将它们带到肿瘤细胞附近，并可以促使免疫细胞与肿瘤细胞之间形成免疫效应连桥，从而激活免疫细胞，如T细胞、NK细胞、巨噬细胞等，对肿瘤细胞进行杀伤、清除。

2.由于该分子结构的一个抗原结合区是scFv结构，另一个抗原结合区是Fab结构，整个分子由两条不同的重链和一条轻链组成。其中形成Fab结合区域的一条轻链只能与该区域的重链可变区结合，所以不会出现轻链与相应重链错配的现象。

3.由于该双特异性抗体分子是非对称性结构，在生产过程中产生的大量的目的产物(异源二聚体)与少量非目标产物(同源二聚体)的分子量和电荷分布等都有较大差异，有利于下游纯化分离。

在上述双特异性抗体的一些实施方案中，所述肿瘤抗原靶点是HER2，且所述信号通道受体是CD3。在一些实施方案中，所述第二重链的VH具有GXP2的VH序列(SEQ ID NO:21)，所述轻链的VL具有GXP2的VL序列(SEQ ID NO:22)。

在上述双特异性抗体的一些实施方案中，所述第二重链具有GXP2-VH-OA的序列(SEQ ID NO:9)，所述轻链具有GXP2-VL的序列(SEQ ID NO:11)。

在上述双特异性抗体的一些实施方案中，所述第一重链的scFv自N端到C端具有Ch4D5单克隆抗体的VH区，连接肽[(GGGGS)xN，N＝3,4,5]和Ch4D5单克隆抗体的VL区，或者自N端到C端具有Ch4D5单克隆抗体的VL区，连接肽[(GGGGS)xN，N＝3,4,5]和Ch4D5单克隆抗体的VH区。

在上述双特异性抗体的一些实施方案中，所述第一重链具有选自下组的序列：Her-OB1(SEQ ID NO:1)、Her-OB2(SEQ ID NO:3)、Her-OB3(SEQ ID NO:5)和Her-OB4(SEQID NO:7)，其中优选所述第一重链具有Her-OB4(SEQ ID NO:7)的序列。

在上述双特异性抗体的任意实施方案中，所述第二重链的CH2和/或第一重链的CH2可以含有L234A，L235A突变，以降低抗体的ADCC功能及CDC功能，避免对T细胞的损伤。

在WO2017034770A1中，公开了对抗体的重链部分进行改造以增加两条重链之间的结合活性和特异性的方法，包括在一条重链中引入如下突变：P395K,P396K,V397K，该突变命名为OA；在另一条重链中引入如下突变：T394D,P395D,P396D，该突变命名为OB。

因此，在上述双特异性抗体的任意实施方案中，所述第二重链的CH3可以含有P395K,P396K,V397K突变，且所述第一重链的CH3可以含有T394D,P395D,P396D突变。

或者，所述第二重链的CH3可以含有T394D,P395D,P396D突变，且所述第一重链的CH3可以含有P395K,P396K,V397K突变。以增强重链之间的结合亲和力和特异性。

在本说明书和权利要求书中，免疫球蛋白重链中残基的编号方式是如Kabat etal.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中的EU索引的编号方式，其也可以在万维网上获得，并且通过引用明确地完整并入本文。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1EU抗体的残基编号方式。如本文所用，“Kabat序列编号方式”或“Kabat标记”是指如Kabat中的EU索引编号编码可变区的序列。对于重链可变区，根据Kabat编号，高变区范围为CDR1的氨基酸位置31至35，CDR2的氨基酸位置50至65，以及CDR3的氨基酸位置95至102。对于轻链可变区，根据Kabat编号，高变区范围为CDR1的氨基酸位置24至34，CDR2的氨基酸位置50至56，CDR3的氨基酸位置89至97。

在一些实施方案中，相比于对应抗体的野生型Fc区，本发明的双特异性抗体的第一重链和第二重链组成的嵌合Fc区与Fc受体的结合降低。例如，在一些实施方案中，其Fc受体的结合降低。抗体Fc区的Fc受体结合降低能够降低抗体的ADCC功能及CDC功能，避免对T细胞的损伤。

在一些实施方案中，相比于鼠源单克隆抗体，本发明双特异性抗体结合CD3分子的热变性温度提高。例如，在一些实施方案中，其结合CD3分子的热变性温度提高。在一些实施方案中，其结合CD3分子的热变性温度提高表现为△T提高至少5℃。在一些实施方案中，其结合CD3分子的热变性温度提高表现为△T提高至少10℃。在一些实施方案中，其结合CD3分子的热变性温度提高表现为△T提高至少12℃。在一些实施方案中，其结合CD3分子的热变性温度提高表现为△T提高5-15℃。在一些实施方案中，其结合CD3分子的热变性温度提高表现为△T提高10-15℃。

在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体具有肿瘤杀伤活性。在一些实施方案中，所述肿瘤是HER2阳性肿瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤选自乳腺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌和肺癌的肿瘤。在一些实施方案中，在体外肿瘤杀伤试验中测试肿瘤杀伤活性。在一些实施方案中，在小鼠体内肿瘤模型中测试肿瘤杀伤活性。

在上述双特异性抗体的任意实施方案中，所述第一重链、第二重链和/或轻链来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。在一些实施方案中，所述第一重链、第二重链和/或轻链来自IgG1。

此外，在一方面，本发明涉及多肽，其具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在另一方面，本发明涉及多肽，其具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。

在一方面，本发明涉及多肽，其具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在另一方面，本发明涉及多肽，其具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

核酸、载体和宿主细胞

在一个方面，本发明涉及核酸，其包含编码如本发明的双特异性抗体的第一重链、第二重链和/或轻链的核苷酸序列。

在另一个方面，本发明涉及编码包含本发明的核酸的载体，例如表达载体。

本发明的表达载体的实例包括基于pFUSEss CHIg-hG1载体或其它载体构建的表达载体。其中，通过PCR扩增抗HER2的scFv结构域，并把酶切位点(EcoR I和Xho I)引入scFv；将扩增好的基因片段与酶切过的载体pFUSEss CHIg-hG1进行连接，获得装入抗HER2的scFv-Fc的表达载体，命名为(pFuse HER2-OB)。

本发明的载体的实例还包括通过PCR扩增抗CD3的重链VH片段,把酶切位点(EcoRI和Xho I)引入重链，并与酶切过的载体pFUSEss CHIg-hG1进行连接，获得装入抗CD3重链的表达载体，命名为(pFUSE GXP2-OA-VH)。

本发明的载体的实例还包括基于pcDNA 3.1(+)或其它载体构建的表达载体。其中通过PCR扩增抗CD3的轻链VL片段,把酶切位点(Hind III和Xho I)引入轻链，并与酶切过的载体pcDNA 3.1(+)进行连接，得到插入抗CD3轻链的表达载体，命名为(pCK GXP2-VL)。

在一个方面，本发明涉及包含本发明的核酸分子的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞选自HEK293F细胞和CHO细胞。

本发明还涉及提供了一种双特异性抗体的制备方法，所述方法包括：

1.将含有scFv的结合区域的第一重链构建到第一表达载体上，将含有Fab结构的结合区域的第二重链构建到第二表达载体上；将含有Fab结构的结合区域的轻链构建到第二载体或任选的第三表达载体上；

2.将第一、第二和任选的第三表达载体一起共转染到哺乳动物宿主细胞中，优选地，所述细胞是293F细胞或CHO细胞；

3.培养已转染的293F或CHO细胞并收集培养上清；

4.从培养上清中纯化目的双特异性抗体；分离步骤包括蛋白A亲和层析柱从表达上清中捕获带有Fc片段的抗体分子，然后通过阳离子交换层析实现目的双特异性抗体与副产物的分离，最后浓缩更换缓冲液。

在一些实施方案中，所述第一表达载体是pFuse HER2-OB。在一些实施方案中，所述第二表达载体是pFUSE GXP2-OA-VH。在一些实施方案中，所述第三表达载体是pCK GXP2-VL。

抗体偶联物

近年来，抗体偶联物因其良好的靶向性及抗癌活性而受到越来越多的关注。抗体偶联物由抗体、连接短链和选自下组的偶联物组成：细胞毒素、放射性同位素、荧光标记物、发光物、显色物质或酶，它将抗体的靶向性与上述偶联物相结合。抗体偶联物进入血液循环后，抗体部分识别靶细胞表面的靶标；识别靶标后，抗体经过靶标复合物经过细胞内吞作用而进入细胞内，随后被溶酶体内的酶类逐渐分解，抗体携带的毒性物质释放到胞浆并杀伤靶细胞。抗体偶联物可以降低化药类抗肿瘤药物的不良反应，提高肿瘤治疗的选择性。

相应的，本发明还涉及由本发明的抗体或双特异性抗体与另外的部分偶联形成的抗体偶联物。在一些实施方案中，所述另外的部分选自细胞毒素、放射性同位素、荧光标记物、发光物、显色物质或酶。

在一些实施方案中，与本发明的抗体或双特异性抗体偶联以形成抗体偶联物的部分是细胞毒素。在一些实施方案中，所述细胞毒素是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质，并包括小分子细胞毒素。在一些实施方案中，所述细胞毒素选自秋水仙素，emtansine,maytansinoid,auristatin,vindesine,tubulysin等。

在一些实施方案中，与本发明的抗体或双特异性抗体偶联以形成抗体偶联物的部分是放射性同位素。在一些实施方案中，所述放射性同位素包括例如At²¹¹,I¹³¹,I¹²⁵,Y⁹⁰,Re¹⁸⁶,Re¹⁸⁸,Sm¹⁵³,Bi²¹²,P³²和Lu的放射性同位素。

在一些实施方案中，与本发明的抗体或双特异性抗体偶联以形成抗体偶联物的部分选自荧光标记物、发光物和显色物质，例如：FITC,luciferase,HRP等。

在一些实施方案中，与本发明的抗体或双特异性抗体偶联以形成抗体偶联物的部分是酶，例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其活性片段和/或变体。

药物组合物和疾病治疗方法

在一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体或抗体偶联物，和任选地药学上可接受的载体，表面活性剂和/或稀释剂。

短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、介质、包封材料、制造助剂(例如润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或锌或硬脂酸)或溶剂包封材料，其涉及维持LAP结合剂的稳定性、溶解度或活性。在与配制剂的其它成分相容并且不对患者有害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(8)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(9)二醇，如丙二醇；(10)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(11)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(12)琼脂；(13)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(14)海藻酸；(15)无热原水；(16)等张盐水；(17)林格氏溶液；(19)pH缓冲溶液；(20)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；(21)填充剂，如多肽和氨基酸(22)血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL；(23)C2-C12醇，如乙醇；和(24)药物配制剂中使用的其它无毒相容物质。释放剂、包衣剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于药物配制剂中。诸如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等的术语在本文中可互换使用。

在一些实施方案中，除本发明的抗体、双特异性抗体或抗体偶联物外，所述药物组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。

在一些实施方案中，所述另外的治疗剂包括但不限于化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、用于放射疗法的试剂、抗血管生成剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它治疗癌症的试剂，如抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如厄洛替尼)、血小板衍生生长因子抑制剂(例如，GLEEVEC^TM(伊马替尼甲磺酸盐(Imatinib Mesylate)))、COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib))、干扰素、细胞因子、拮抗剂(例如中和抗体)，其结合一种或多种以下靶物PD-1、PD-L1、PD-L2(例如，派姆单抗(pembrolizumab)；nivolumab；MK-3475；AMP-224；MPDL3280A；MEDI0680；MSB0010718C；和/或MEDI4736)；CTLA-4(例如，tremelimumab(PFIZER)和ipilimumab))；LAG-3(例如BMS-986016)；CD103；TIM-3和/或其它TIM系列成员；CEACAM-1和/或其它CEACAM家族成员、ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体、TRAIL/Apo2和其它生物活性和有机化学剂等。本文所述的方法也特别考虑其组合。

在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是化疗剂。化疗剂的非限制性实例可以包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)、替莫唑胺(temozolomide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide,triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide,triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew.Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(caminomycin,carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis,chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin,potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤、和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elformithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofuran,sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、无克列莫佛(Cremophor-free)、清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他塞(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)和多西他塞(doxetaxel)(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱；NAVELBINE,长春瑞滨(vinorelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar,CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸(leucovorin)的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)，卡培他滨(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；甲酰四氢叶酸(LV)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；lapatinib(TYKERB.)；PKC-alpha、Raf、H-RasVEGF-A的抑制剂；和上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

本文所述的药物组合物可以特别配制用于以固体、液体或凝胶形式向受试者施用化合物，包括适用于以下的那些：(1)肠胃外施用，例如通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射，作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放配制剂；(2)表面应用，例如作为施用于皮肤的霜剂、软膏剂或受控释放贴片或喷雾剂；(3)阴道内或直肠内，例如作为子宫托、乳膏或泡沫；(4)眼；(5)经皮；(6)经粘膜；或(7)鼻。

在一个方面，本发明涉及本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体、抗体偶联物或药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。在一些实施方案中，所述癌症是HER2阳性的癌症。

在另一个方面，本发明涉及本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体、抗体偶联物或药物组合物，其用于治疗癌症。在一些实施方案中，所述癌症是HER2阳性的癌症。

在再一个方面，本发明涉及治疗癌症的方法，其包括向受试者施用本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体、抗体偶联物或药物组合物的步骤。在一些实施方案中，所述癌症是HER2阳性的癌症。

癌症的实例包括但不限于基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和CNS癌；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；胆管癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝癌；上皮内新生物；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(例如唇、舌、口、和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；畸胎癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；以及其它癌和肉瘤；和移植后淋巴增生性疾病(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生，水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)、原始起源肿瘤和梅格斯(Meigs)氏综合征。

在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌。

具体实施方法

以下将结合实施例进一步说明本发明的内容。应当理解以下实施例仅是说明性的，而不应被认为是对本发明范围的限制。

实施例1：双特异性抗体的构建

1.构建结合肿瘤抗原的第一重链

参照单克隆抗体Ch4D5的氨基酸序列(PDB Database#1N8E)，本发明人设计并构建了结合肿瘤靶点Her2/neu的ScFv结构作为双特异性抗体的第一结合域，并进一步设计了VH-接头-VL，VL-接头-VH及VH-接头-VL加上L234A，L235A突变等几种形式。具体设计如下：

在第一种实施方案中，结合肿瘤靶点Her2的scFv从N端到C端由抗Her2抗体Ch4D5的VH与15个氨基酸的短肽接头(GGGGS)x3连接，再与Ch4D5的VL连接。所得scFv与铰链区及具有OB突变的Fc相连，形成结合Her2的ScFv-Fc重链，即Her2-OB1(SEQ ID NO:1)。

在第二种实施方案中，结合肿瘤靶点Her2的scFv从N端到C端由Ch4D5的VL与15个氨基酸的短肽接头(GGGGS)x3连接，再与Ch4D5的VH连接。所得scFv与铰链区和具有OB序列的Fc相连，形成结合Her2的ScFv-Fc重链，即Her2-OB2(SEQ ID NO:3)。

在第三种实施方案中，结合肿瘤靶点Her2的ScFv-Fc重链的结构与第一种实施方案相似，即由抗Her2抗体Ch4D5的VH与15个氨基酸的短肽接头(GGGGS)x3连接，再与Ch4D5的VL连接。所得的scFv与铰链区及具有OB序列的Fc相连。由于Her2-OB1(SEQ ID NO:1)在VL区与铰链区之间包含NcoI和Bg1II多克隆位点，因此包含额外的氨基酸TVAMVR。在本实施方案中该序列被置换为人源抗体序列GEPK，形成结合Her2的ScFv-Fc重链Her2-OB3(SEQ ID NO:5)。

第四种实施方案为在第三种实施方案的基础上在单克隆抗体Ch4D5重链的CH2区引入了L234A，L235A的突变，以降低抗体的ADCC功能及CDC功能，避免对T细胞的损伤。所得序列为Her2-OB4(SEQ ID NO:7)。

从ELISA结果看，以上四种构建体均显示对Her2/neu的高亲和力，其中具有VH-接头-VL结构的OB1、OB3、OB4比具有VL-接头-VH结构的OB2显示更高的亲和力。

2.构建结合T细胞表面抗原CD3的重链和轻链可变区

本发明人对多株抗人CD3复合物的鼠源抗体进行了深入的分析和比较，并对其中的鼠源抗体GXP(SP34)的可变区进行了序列优化及人源化改造。

GXP(SP34)是一株抗人CD3的鼠源单克隆抗体，并且已经有报道对其进行的人源化改造(参见US9587021，PCT/US20121038219)。本发明人对其VH及VL的框架序列进行人源化改造，并保留鼠源重链和轻链的CDR1、CDR2及CDR3序列不变。另一个重要的改造原则是尽量保留每个CDR区附近的鼠源序列，以降低对抗体结构稳定性及对抗原亲和力的影响。

本发明人确定的最终序列如表1A和表1B所示，其命名为GXP2。

表1A

表1B

本发明人使用GXP(SP34)的鼠源序列，人源化的GXP2序列以及US9587021中公开的一种人源化序列(命名为C31)，构建了双特异性抗体Her2xGXP，Her2xGXP2及Her2xC31，并对它们的热稳定性及生物学活性进行了比较，结果出乎意料地发现GXP2对人源CD3的亲和力比较鼠源GXP以及人源化序列的C31提高，热稳定性也大幅度提高(△T大于12℃)；在37℃和40℃存放27天，或反复冻融的条件下保持稳定，没有降解。

我们进一步评估了双特异性抗体肿瘤杀伤的效果及诱发细胞因子风暴的活性，该结果显示GXP2对于Her2阳性的肿瘤细胞的杀伤能力有大幅度提高，而诱发细胞因子风暴的活性比抗CD3单克隆抗体有明显降低。并且在NOD-SCID小鼠的移植瘤模型中表现出优异的抗肿瘤杀伤活性。以上结果显示，GXP2是一种有潜力的抗肿瘤候选药物。

实施例2：双特异性抗体的表达及纯化

本实验涉及的所有双特异性抗体均采用瞬时转染或稳定转染表达，首先利用大提试剂盒(OMEGA)进行质粒大提，制备的具体操作按照常规的普通分子生物学方法进行。293F细胞使用OPM-CD03293培养基于37℃，5％CO₂细胞培养摇床以130rpm摇瓶培养，待细胞生长进入对数生长期后，使用转染试剂PEI将不同组合的质粒共转染到293F细胞中，以表达一系列抗HER2×CD3的双特异性抗体。转染后24小时和96小时时分别加入细胞培养补料，并在转染第7天后3500rpm离心收集细胞培养上清。

本发明利用Protein A亲和层析柱(GE)从细胞培养上清中捕获双抗。先用10个柱体积的平衡缓冲液(PBS，PH7.4)平衡柱子，再上样流过亲和层析柱，用洗脱缓冲液(100mM甘氨酸-HCl，pH 3.5，含150mM氯化钠)进行洗脱。然后用阳离子交换层析，过Hitrap SP HP柱(GE)，将目的双特异性抗体与副产物分离，用平衡缓冲液(50mM磷酸缓冲液，pH 6.0)平衡柱子后，用洗脱缓冲液50mM磷酸缓冲液(pH 6.0，A液)和50mM磷酸缓冲液含1M氯化钠(pH 6.0，B液)混合进行梯度洗脱，洗25个柱体积；最后浓缩置换成PBS Buffer(pH 7.4)进行保存。

随后对纯化后的产物进行SDS-PAGE检测鉴定，其结果见图2A-2B。其中，图2A是非还原SDS-PAGE结果，图2B是还原SDS-PAGE结果，其中M为蛋白分子量标记，2-7孔为ProteinA纯化后洗脱的双特异性抗体HER2×GXP2样品。由图2A-2B中的结果可知，使用Protein A一步纯化后就可获得纯度很高的目的双特异性抗体。这表明轻链能与同源的重链特异性结合，不会发生错配，从而保证表达产物中含有高纯度的目的双特异性抗体。由于本发明披露的双特异性抗体是非对称的结构，目的抗体与对应的同源二聚体分子量大小不一致，更有利于下游纯化。

实施例3：双特异性抗体与靶抗原CD3和HER2结合活性的分析

本研究采用ELISA分析法。具体实验步骤为：将抗原CD3或者抗原HER2包被于酶标板(NUNC)上，4℃包被过夜，洗板后加入脱脂牛奶封闭，洗板后再加入双特异性抗体以及对照样品，室温孵育1.5小时，洗板，再加入1:2000稀释的二抗(过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG，Proteintech^TM)，室温孵育1小时，洗板，然后加入发光底物A+B(A:B＝1：1)，3分钟后在酶标仪(Synergy HTX，BioTeck)检测吸光度。

ELISA结果显示双特异性抗体对CD3抗原表现出阳性结合，且其结合率呈现剂量依赖关系。本发明披露的人源化抗体HER2-OB1×GXP2与CD3抗原的结合活性高于人源化抗体HER2-OB1×C31以及鼠源抗体HER2-OB1×GXP，三者与CD3抗原的结合的EC50分别为1.402μg/mL、3.522μg/mL和3.153μg/mL(图3)。

此外，双特异性抗体也可以特异性识别和结合肿瘤细胞的表面抗原HER2，且其结合率呈现剂量依赖关系。双特异性抗体HER2-OB1×GXP2、HER2-OB1×C31以及HER2-OB1×GXP与HER2抗原的结合活性相差不大，说明HER2序列与不同的CD3抗体序列组合并不影响其与HER2抗原的结合(见图4)。

实施例4：双特异性抗体的热稳定性分析

1.双特异性抗体经过热处理后的稳定性及亲和力检测

将适量的双特异性抗体样品分装至PCR管，每个样品各10管，在PCR仪(Mygene^TM)上设置温度梯度恒温加热30min，温度设置为：35℃、40.6℃、45℃、50℃、55.6℃、60℃、65℃、70.6℃、75℃，剩余1管原始抗体-20℃保存作为对照。处理完毕，将样品冷却至室温后放置-20℃备用。

用CD3抗原或HER2抗原包被酶标板，洗板后，用牛奶封闭，再洗板，然后加入原始双特异性抗体对照以及热处理过的双特异性抗体，孵育1小时后，洗板，加入酶标抗体，孵育，洗板，加入与酶标抗体反应的发光底物，然后再通过多功能酶标仪(Synergy HTX，BioTek)检测其吸光度，该吸光度与特异性结合的抗体的量成正比。结果显示，HER2-OB1×GXP2双特异性抗体的热变性曲线的中点值T₅₀达到58.28℃。

将上述处理后的双特异性抗体通过ELISA检测其与CD3抗原的结合能力，以此鉴定其热稳定性。结果显示，本发明的人源化抗体HER2-OB1×GXP2热稳定性明显提高，其热变性曲线的中点值T50达到58.28℃，不仅比鼠源抗体HER2-OB1×GXP(T50为45.71℃)提高了约12℃，还比另一人源化双特异性抗体HER2-OB1×C31(T50为49.55℃)提高了近10℃(见图5)。这些结果说明经过本发明优化改造后，HER2-OB1×GXP2的热稳定性显著提高，更适合用作治疗癌症的抗体药物。

2.双特异性抗体的长期热稳定性检测

将适量双特异性抗体分装至20个1.5mL EP管，然后将其中10管放置在37℃，剩余10管放置在40℃。两组实验都分别在第0天、1天、3天、6天、10天、13天、17天、20天、24天、27天时依次向其中一管样品加入SDS-PAGE加样缓冲液，冻存于-20℃。最后将所有样品进行SDS-PAGE检测。

电泳结果显示，无论是在37℃还是40℃环境下保存27天，双特异性抗体HER2×GXP2都没有明显的降解(见图6A-6D)。以上结果说明，HER2×GXP2双特异性抗体具有良好的长期稳定性。

3.双特异性抗体反复冻融后的稳定性检测

将适量双特异性抗体分装至4个1.5mL EP管，标记F-T0-3，然后将F-T0放置在4℃，F-T1-3放置在-20℃。待F-T1-3冷冻为固体，迅速融化F-T1-3并将F-T1放置在4℃，F-T2-3放置在-20℃。待F-T2-3冷冻为固体，迅速融化F-T2-3并将F-T2放置在4℃，其反复冻融2次；F-T3放置在-20℃。待F-T3冷冻为固体，迅速融化F-T3，其反复冻融3次。最后将所有样品进行SDS-PAGE检测和ELISA分析。

SDS-PAGE结果显示，经过反复冻融三次后，双特异性抗体HER2×GXP2没有出现明显的降解，其条带仍与未冻融样品保持一致(见图7A)，说明该双特异性抗体在反复冻融的情况下的稳定性。与此相一致的是，在CD3及HER2ELISA试验中，冻融样品、未冻融样品与相应的抗原结合的吸光度基本相同(见图7B和7C)，说明在反复冻融的情况下，双特异性抗体HER2×GXP2保留了与CD3抗原和HER2抗原的高结合活性。

实施例5：双特异性抗体对细胞因子释放的影响

本发明采用PBMC细胞测定双特异性抗体对细胞因子释放的影响。将PBMC细胞用PBS清洗后，用1640培养基调整细胞密度为2×10⁶/mL，然后100μL/孔加入96孔板，即2×10⁵个细胞/孔。用1640培养基将抗体稀释至2μg/mL，然后每孔加入100μL抗体稀释溶液，即抗体终浓度为1μg/mL，将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时。本实验采用双抗体夹心ELISA法检测样品中细胞因子的浓度。特异性结合细胞因子的单克隆捕获抗体已包被于酶标板上，样品中的细胞因子会与捕获抗体结合。随后，生物素化的抗细胞因子抗体与细胞因子结合，形成捕获抗体、细胞因子和生物素化的抗体的免疫复合物。具体实验步骤为：将上述含有PBMC细胞的96孔板1000rpm离心5min，取上清以100μL/孔加入相应孔中，用封口膜封住反应孔，室温孵育120分钟。洗板5次，加入生物素化抗体100μL/孔，用封口膜封住反应孔，室温孵育60分钟。洗板5次，加入HRP-链霉亲和素100μL/孔，用封口膜封住反应孔，室温避光孵育10～20分钟，洗板5次，加入显色剂TMB溶液100μL/孔，用封口膜封住反应孔，室温避光孵育20分钟。加入终止液50μL/孔，混匀后立即用酶标仪检测450nm处的吸光度值。实验结果显示在图8A-8D中。

使用等量的HER2×GXP2抗体或CD3单抗与来自不同健康供体的PBMC共同孵育过夜，取其上清进行上述ELISA夹心法实验，检测细胞因子IL-6、TNF-α的释放量，以此鉴定T细胞是否被非特异性活化并产生细胞因子风暴。实验结果显示，在不存在HER2阳性细胞的情况下，使用高剂量(1μg/mL)的HER2×GXP2抗体与不同供体的PBMC共孵育，没有出现T细胞非特异性活化的现象。CD3单抗导致高水平的细胞因子的释放，包括IL-6和TNF-α，证明本实验所用的T细胞功能正常，可被CD3单抗活化。而本发明双特异性抗体HER2×GXP2则与之相反，其IL-6、TNF-α水平与阴性对照组(RPMI1640培养基)相近，都明显低于CD3单抗组；并且使用不同供体的PBMC得到相似的结果(图8A和图8B分别显示供体^#1的IL-6和TNF-α的结果；图8C和图8D分别显示供体^#2的IL-6和TNF-α的结果)。以上结果表明，若在临床上使用本发明的HER2×GXP2双抗治疗HER2阳性肿瘤，将可以减少细胞因子风暴的发生，其安全性也将大大提高。

实施例6：双特异性抗体介导PBMC细胞对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤的测定

1.靶细胞的培养

将SKBR细胞(HER2+++)，N87细胞(HER2++)，MCF-7细胞(HER2+)培养于T75培养瓶中，置于37℃，5％CO₂培养箱培养。上述细胞对应的培养基为：SKBR-3：DMEM(Gibco)，N87：1640(Gibco)，MCF-7：MEM(Gibco)，培养基都含有10％FBS，1×GlutaMax-Ⅰ和100U/mL双抗生素。对照293F细胞(HER2阴性)用OPM CD03 293培养基于37℃，5％CO₂培养摇床培养。

2.PBMC的分离

静脉采集新鲜全血后用生理盐水稀释2倍，吸取淋巴细胞分层液置于刻度离心管中，用滴管将稀释的全血沿管壁缓慢加至分离液上面，保持两者界面清晰。用水平离心机以760g离心30min。观察白膜层位置，用毛细吸管轻轻插到混浊带，用滴管轻轻吸出此层细胞，移入另一支离心管中(避免吸取过多的分层液或血浆，以免混入其他细胞成分)。用PBS洗涤细胞3次，室温水平离心，第一次427g离心15min，第2次273g离心10min，第3次229g离心10min，则可去掉大部分混杂的血小板。将细胞悬于1640培养基(含10％FBS和双抗)，37℃，5％CO2培养箱中培养。

3.ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)

本研究基于以下原理，即双特异性抗体与靶细胞和T细胞结合，通过其同时识别HER2阳性的靶细胞和T细胞上的CD3复合物，使肿瘤细胞与T细胞相互靠近，从而激活T细胞杀伤肿瘤细胞。本发明使用LDH释放实验来检测双特异性抗体的杀伤活性，即细胞内的乳酸脱氢酶被释放到上清中，取一定量的上清，加入反应底物乳酸和适量的酶溶液，乳酸脱氢酶与乳酸发生反应，可通过测定吸光值确定肿瘤细胞释放的乳酸脱氢酶的量，从而间接测定抗体刺激PBMC的杀肿瘤细胞活性。

用胰酶消化靶细胞(包括SKBR-3细胞，NCI-N87细胞，MCF-7细胞)，制备单细胞悬液，293F细胞培养时已是单细胞悬液。用5％FBS-1640培养基调整细胞浓度至0.20×10⁶/mL，以50μL/孔加入96孔板中，使每孔含有1.0×10⁴个细胞。本实验使用的效应细胞：靶细胞比例为15:1。实验中设有对照孔，其中相同体积的5％FBS-1640培养基补满。

用5％FBS-1640培养基将抗体稀释至4μg/mL，然后按1:4的比例进行倍比稀释，得到10个浓度分别为4000ng/mL、1000ng/mL、2500ng/mL、625ng/mL、156.25ng/mL、39.06ng/mL、9.77ng/mL、2.44ng/mL、0.61ng/mL、0.15ng/mL的抗体。按实验设计以50μL/孔加入相应抗体，对照孔用等体积的5％FBS-1640培养基补满。将细胞和抗体混匀后于37℃，5％CO₂培养箱培养。18-20小时后，用乳酸脱氢酶细胞毒性试剂盒(Beyotime)来检测细胞的杀伤毒性，进而计算双抗的杀伤活性，计算公式如下：

杀伤率％＝(实验值-S_自发)/(Max-S_自发)×100％

其中，S_自发＝OD_{自发释放孔(靶细胞+效应细胞)}，Max＝OD_{最大释放孔(靶细胞)}

使用HER2表达水平不同的肿瘤细胞株与来自健康人的PBMC以及梯度稀释的HER2×GXP2共孵育，通过测定上清中乳酸脱氢酶的含量来判断肿瘤细胞的杀伤情况。结果显示，本发明的双特异性抗体HER2×GXP2对HER2高表达的肿瘤细胞杀伤效果非常好，对HER2低表达的肿瘤细胞也有杀伤，但是对于HER2阴性的细胞没有杀伤活力。说明双特异性抗体在体外细胞毒性实验中，对HER2阳性的肿瘤细胞均表现出良好的杀伤效果，而对于HER2阴性的细胞则不具有杀伤性。

具体而言，人乳腺癌细胞SKBR-3属于HER2抗原高表达的细胞株(HER2+++)。HER2×GXP2能有效介导免疫细胞杀伤SKBR-3，其EC50比另一人源化抗体HER2×C31的低5倍，比目前临床上使用的乳腺癌治疗药物Herceptin(赫赛丁)低100倍以上(见图9A)。

人胃癌细胞NCI-N87(HER2++)的HER2表达量略低于SKBR-3细胞，其中HER2×GXP2的EC50为3.952×10^-4μg/mL，明显低于对照组的Herceptin和HER2×C31(分别为2.182×10^-2μg/mL和3.647×10^-3μg/mL)(见图9B)，其趋势与SKBR-3细胞中的结果一致。

低表达HER2抗原或者HER2阴性的细胞株，如MCF-7细胞和293F细胞(HER2+/-，相当于正常细胞)，对双特异性抗体HER2×GXP2介导的杀伤不敏感，没有明显的杀伤效果(见图9C和图9D)。

综上所述，高表达HER2的肿瘤细胞，如SKBR-3、NCI-N87细胞对抗HER2×CD3的双特异性抗体HER2×GXP2非常敏感，使用较低浓度的HER2×GXP2就能达到很好的杀伤效果；而且，本文披露的双特异性抗体HER2×GXP2对SKBR-3、NCI-N87细胞的杀伤力的EC50明显低于Herceptin和HER2×C31，说明使用更低浓度的HER2×GXP2就可以达到与高浓度的Herceptin相似的杀伤效果。

除此之外，双特异性抗体HER2×GXP2对于HER2低表达或HER2阴性的细胞，如MCF-7和293F细胞，没有明显的杀伤作用，综合HER2×GXP2对SKBR-3、NCI-N87细胞的杀伤效果，说明HER2×GXP2能够在不伤害正常细胞的前提下，刺激免疫细胞特异性地杀伤HER2阳性肿瘤细胞。

实施例7：双特异性抗体在动物肿瘤模型中体内杀伤肿瘤的效果分析

将24只小鼠随机分为4组，每组6只。动物分组后，收集对数生长期的SKOV-3细胞(HER2阳性的卵巢癌细胞，Her2表达量为Her2⁺⁺到Her2⁺⁺⁺之间)，离心并将SKOV-3细胞细胞浓度调整为5×10⁷个/mL，将PBMC细胞浓度调整为5×10⁷个/mL。将SKOV-3细胞与PBMC等体积混合后以0.2mL/只接种于小鼠右侧腋窝皮下。肿瘤细胞接种后，根据分组将本发明的双特异性抗体HER2×GXP2以低剂量(0.5mg/kg)、中等剂量(1mg/kg)和高剂量(5mg/kg)在第1天、第3天、第5天和第8天各给药1次。阴性对照组给予等体积的无菌生理盐水。分组时(即首次给药前)1次、给药后每周2次、安乐死前1次，测量并记录肿瘤长径、短径，计算肿瘤体积，并根据肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线，比较各组间肿瘤生长曲线的差异。按照以下公式计算肿瘤体积：V＝1/2×长径×短径²。图10显示了肿瘤体积随时间变化的曲线。

上述结果显示，以低剂量、中等剂量和高剂量给药的本发明的双特异性抗体HER2×GXP2均有效抑制了小鼠体内的肿瘤生长。上述结果证明本发明的双特异性抗体HER2×GXP2不仅在体外介导免疫细胞靶向有效杀伤HER2阳性肿瘤细胞，在体内也能有效抑制HER2阳性肿瘤的生长。

序列表

<110> 广州爱思迈生物医药科技有限公司

<120> 双特异性抗体及其应用

<130> 1

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 478

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(478)

<223> Her2-OB1

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser

130 135 140

Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala

145 150 155 160

Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly

180 185 190

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

210 215 220

Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

225 230 235 240

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ser Met Val Arg Ser Asp Lys Thr His Thr

245 250 255

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

260 265 270

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

275 280 285

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

290 295 300

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

305 310 315 320

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

325 330 335

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

340 345 350

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

355 360 365

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

370 375 380

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

385 390 395 400

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

405 410 415

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Asp Asp Asp Val Leu Asp Ser Asp

420 425 430

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

435 440 445

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

450 455 460

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470 475

<210> 2

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaggtgcagc tggtggaatc cggaggcgga ctggtgcagc ctggaggaag cctgagactg 60

agctgcgccg ccagcggctt caacatcaag gacacctata tccattgggt gaggcaggct 120

cccggaaaag gcctggagtg ggtggccagg atctacccta ccaacggcta caccaggtac 180

gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcgccgaca ccagcaagaa caccgcctac 240

ctgcagatga acagcctcag agccgaggac accgccgtgt attactgcag cagatggggc 300

ggcgacggct tctacgctat ggattactgg ggacagggca cactggtgac cgtgagctcc 360

ggaggcggcg gcagcggcgg cggaggcagc ggcggcggcg gcagcgacat cgtgatgaca 420

cagtccccta gcagcctgag cgctagcgtg ggcgacaggg tcacaatcac ctgcagggcc 480

agccaggatg tgaacaccgc cgtggcctgg taccaacaga agcccggcaa ggcccccaaa 540

ctgctgatct acagcgccag cttcctgtac tccggcgtgc cctccagatt cagcggcagc 600

aggagcggca ccgacttcac cctgaccatc agcagcctgc agcccgagga cttcgccacc 660

tactattgcc agcagcacta cacaacccct cccaccttcg gccagggcac caaggtggag 720

atcaagagga ccgtggcttc catggttaga tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 780

ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 840

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 900

gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 960

aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1020

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1080

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1140

accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1200

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1260

aactacaaga ccgatgacga tgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1320

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcac 1380

gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa 1434

<210> 3

<211> 476

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(476)

<223> Her2-OB2

<400> 3

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1 5 10 15

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35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

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Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

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Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn

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Ser Ala Ser Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

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Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

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Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

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<210> 4

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工序列

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tacctccaga tgaatagtct ccgggcagaa gacaccgccg tttattactg tagtcgctgg 660

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ccagagctgc tgggagggcc tagcgttttc ctgttccctc ccaaaccaaa ggacactctg 840

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gttgacaaga gtcgctggca gcagggaaat gttttcagtt gctcagtgat gcatgaagca 1380

ctccataacc actatacaca gaaatccctg tccctgtctc ccggaaaa 1428

<210> 5

<211> 476

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(476)

<223> Her2-OB3

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala

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165 170 175

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450 455 460

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470 475

<210> 6

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaagtccagc tcgttgaatc tggtggcggg ctcgtgcagc ctggtggctc actgagactc 60

tcctgtgctg ccagcggatt caatatcaag gacacatata tccactgggt tcggcaggct 120

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agccaggatg ttaataccgc agtggcatgg tatcaacaga agcccggcaa ggctcccaaa 540

ctgctgatct attctgccag cttcctgtac tccggagtgc cctcccgctt ttccggaagt 600

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<210> 7

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(476)

<223> Her2-OB4

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

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Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala

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Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly

180 185 190

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

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Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

210 215 220

Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

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Ile Lys Arg Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

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Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

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Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

275 280 285

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Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

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Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

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<212> DNA

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ctccagatga atagtctccg ggcagaagac accgccgttt attactgtag tcgctggggc 300

ggtgatgggt tttacgcaat ggattactgg ggtcagggaa ccctcgtgac cgtttcatca 360

ggaggcggtg gaagtggcgg cggaggatca ggcggcggtg ggtctgatat acagatgacc 420

cagagcccaa gttcactgag cgcctctgtc ggcgatagag tgacaatcac atgccgcgca 480

agccaggatg ttaataccgc agtggcatgg tatcaacaga agcccggcaa ggctcccaaa 540

ctgctgatct attctgccag cttcctgtac tccggagtgc cctcccgctt ttccggaagt 600

cgctctggaa ctgacttcac tctgaccata tcctctctcc agccagagga ttttgctaca 660

tactactgcc agcagcatta cacaacacct ccaaccttcg gccagggcac aaaggtcgag 720

attaaaagag gcgaacccaa gtcctgcgat aagacacaca cctgcccacc ctgccctgca 780

ccagaggctg caggagggcc tagcgttttc ctgttccctc ccaaaccaaa ggacactctg 840

atgatctcca gaacacctga agtgacctgt gtggtggtgg atgttagcca cgaggaccca 900

gaagtcaagt ttaactggta cgtggacggt gtggaggtgc ataacgccaa aaccaaacct 960

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gattggctga acggtaagga atataagtgt aaagtgtcta ataaagctct gccagcacca 1080

attgagaaaa ccatttctaa agccaagggc cagccaaggg agccacaggt gtatacactg 1140

ccacctagca gggatgagct gaccaagaac caggtttcac tgacatgcct ggtgaagggc 1200

ttttatccaa gcgatattgc agtcgagtgg gaatccaacg gtcagcctga aaacaactat 1260

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gttgacaaga gtcgctggca gcagggaaat gttttcagtt gctcagtgat gcatgaagca 1380

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(455)

<223> GXP2 重链

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Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

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Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

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Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

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Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

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Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

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agttgcgccg cttccggttt tacattcaac acttatgcca tgaattgggt gcgccaggct 120

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gaagctgccg gcggtccaag cgtgtttctc tttcctccaa agcccaagga caccctgatg 780

atctctcgca ctcctgaggt gacctgtgtg gtcgttgacg tgtcacacga agacccagag 840

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tatccctccg acatcgcagt tgaatgggag agcaatggtc agcccgagaa caattacaaa 1200

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cataatcact acactcagaa gtctctcagt ctgtctcctg gaaagtga 1368

<210> 11

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(216)

<223> GXP2 轻链

<400> 11

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ccaccctccg acgagcaact gaaaagtggc acagcctccg tcgtctgtct gctgaacaat 420

ttctaccctc gggaggccaa ggtccagtgg aaggtggaca acgctctcca gagtggaaat 480

agccaagagt ccgttactga gcaggactct aaggattcaa cctacagcct ctccagcacc 540

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cagggactca gctcacccgt taccaagtct ttcaacaggg gagagtgt 648

<210> 13

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(440)

<223> GXP 重链

<400> 13

Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly

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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile

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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

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Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

245 250 255

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

275 280 285

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

340 345 350

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

355 360 365

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

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Asn Tyr Lys Thr Thr Gln Glu Glu Ala Gly Leu Arg Arg Leu Leu Leu

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Pro Leu Gln Gln Ala His Arg Gly Gln Glu Gln Val Ala Ala Gly Glu

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Arg Leu Leu Met Leu Arg Asp Ala

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<210> 14

<211> 1323

<212> DNA

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<400> 14

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aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 720

ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 780

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 840

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caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1020

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1080

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tga 1323

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<400> 15

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu

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Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

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Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly

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Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

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Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

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Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Val Thr Met Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Thr Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 16

<211> 660

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

caggccgtgg tgacacagga gtcagctctg accacatccc caggcgaaac agtgactctg 60

acctgcagat ccagcactgg agcagtgact acctctaact acgctaattg ggtgcaggag 120

aagcccgacc acctgttcac tgggctgatc ggcggaacca acaaaagggc acccggtgtg 180

cctgcccggt tttctggcag tctgatcgga gacaaggccg ctctgacaat tactggcgcc 240

cagacagagg atgaagctat ttacttctgt gcactgtggt atagcaatct gtgggtgttt 300

gggggtggca ccaagcttgt caccatggaa atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360

ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420

ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480

tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540

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<210> 17

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(437)

<223> C31 重链

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

130 135 140

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

195 200 205

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

210 215 220

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

325 330 335

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Lys Lys Lys Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Lys Leu Thr Val Gly Gln Glu Gln Val Ala Ala Gly Glu Arg Leu Leu

420 425 430

Met Leu Arg Asp Ala

435

<210> 18

<211> 1314

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gaggtgcagc tggtggaaag cgggggtgga ctggtgcagc ctggtggtag cctgcgactg 60

tcttgtgccg cttctggttt cactttcaac acatacgcca tgaattgggt gagacaggct 120

ccaggcaagg gactggagtg ggtggctcgg atcaggtcta agtacaacaa ttatgccaca 180

tactatgctg acagcgtgaa ggatagattc accatctccc gcgacgatag caagaactcc 240

ctgtatctgc agatgaatag cctgaagaca gaggacaccg ccgtgtacta ttgcgctcgc 300

cacggcaact tcggcaattc ttacgtgagc tggtttgcct attggggcca gggcacactg 360

gtgactgtgt cttccgctag caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 420

aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 480

ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 540

gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 600

ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 660

aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 720

gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 780

atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 840

gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 900

gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 960

tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1020

gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1080

ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1140

tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1200

accacgaaga agaagctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1260

ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atga 1314

<210> 19

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(217)

<223> C31 轻链

<400> 19

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Val Thr Met Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

115 120 125

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

130 135 140

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

145 150 155 160

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

180 185 190

Lys Val Tyr Thr Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

195 200 205

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 20

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gacatccaga tgacccagag cccttcctcc ctgtccgcca gcgtgggaga cagggtgaca 60

atcacctgca gggcctccca ggatatccgg aactacctga actggtacca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac accagcaggc tggagtccgg agtgccctcc 180

aggttttccg gctccggcag cggaaccgac tacaccctga ccatctccag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgtcagcag ggcaacacac tgccttggac ctttggccag 300

ggcaccaagc ttgtcaccat ggaaatcaaa cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360

ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420

aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480

aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540

accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacacctg cgaagtcacc 600

catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttag 654

<210> 21

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(125)

<223> GXP2重链VH

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 22

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(109)

<223> GXP2轻链VL

<400> 22

Asp Ile Gln Met Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Thr Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Ile Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Val

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

Claims (37)

1.抗体或抗体片段，其包含结合CD3的抗原结合域，所述结合CD3的抗原结合域具有SEQID NO:21的重链可变区(VH)序列和SEQ ID NO:22的轻链可变区(VL)序列。

2.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其包含SEQ ID NO:9所示的重链序列，和SEQID NO:11所示的轻链序列。

3.根据权利要求1或2所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或抗体片段，其还包含结合肿瘤抗原靶点的另一抗原结合域。

5.根据权利要求4所述的抗体或抗体片段，其中所述肿瘤抗原靶点是HER2。

6.根据权利要求5所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体包含选自Her2-OB1(SEQ IDNO:1)、Her2-OB2(SEQ ID NO:3)、Her2-OB3(SEQ ID NO:5)和Her2-OB4(SEQ ID NO:7)的重链序列。

7.根据权利要求6所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体包含Her2-OB4(SEQ ID NO:7)的重链序列。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体片段选自Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、F(ab')2片段和scFv片段。

9.双特异性抗体，其具有两条重链和一条轻链，其中第一重链自N端到C端具有scFv-铰链区-Fc；第二重链自N端到C端具有VH-CH1-铰链区-Fc；所述轻链自N端到C端具有VL-CL，其中所述第一重链的scFv的抗原结合结构域结合肿瘤抗原靶点，所述第二重链的VH-CH1与所述轻链的VL-CL形成另一抗原结合域，其结合免疫效应细胞表面的信号通道受体。

10.根据权利要求9所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤抗原靶点是HER2，且所述信号通道受体是CD3。

11.根据权利要求9或10所述的双特异性抗体，其中所述第二重链的VH具有SEQ ID NO:21的序列，所述轻链的VL具有SEQ ID NO:22的序列。

12.根据权利要求9-11中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二重链具有SEQ IDNO:9的序列，所述轻链具有SEQ ID NO:11的序列。

13.根据权利要求9-12中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一重链的scFv自N端到C端具有Ch4D5单克隆抗体的VH区，连接肽[(GGGGS)xN，N＝3,4,5]和Ch4D5单克隆抗体的VL区，或者自N端到C端具有Ch4D5单克隆抗体的VL区，连接肽[(GGGGS)xN，N＝3,4,5]和Ch4D5单克隆抗体的VH区。

14.根据权利要求9-13中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一重链具有选自下组的序列：Her2-OB1(SEQ ID NO:1)、Her2-OB2(SEQ ID NO:3)、Her2-OB3(SEQ ID NO:5)和Her2-OB4(SEQ ID NO:7)。

15.根据权利要求9-14中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一重链具有Her2-OB4(SEQ ID NO:7)的序列。

16.根据权利要求9-15中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二重链的CH2含有L234A，L235A突变，和/或所述第一重链的CH2含有L234A，L235A突变。

17.根据权利要求9-16中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二重链的CH3含有T394D,P395D,P396D突变，且所述第一重链的CH3含有P395K,P396K,V397K突变，或者所述第二重链的CH3含有P395K,P396K,V397K突变，且所述第一重链的CH3含有T394D,P395D,P396D突变。

18.根据权利要求9-17中任一项所述的双特异性抗体，其中由第一重链和第二重链组成的嵌合Fc区与Fc受体的结合相比于野生型Fc区降低。

19.根据权利要求9-18中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗体结合CD3分子的热变性温度相比于对应的鼠源单克隆抗体提高。

20.根据权利要求9-19项中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗体具有肿瘤杀伤活性。

21.根据权利要求9-20中任何一项所述的双特异性抗体，其中所述第一重链、第二重链和/或轻链来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。

22.根据权利要求21所述的双特异性抗体，其中所述第一重链、第二重链和/或轻链来自IgG1。

23.核酸，其包含编码权利要求9-22中任一项的双特异性抗体的第一重链、第二重链和/或轻链的核苷酸序列。

24.载体，其包含权利要求23的核酸。

25.宿主细胞，其包含权利要求23的核酸或权利要求24的载体。

26.偶联物，其包含权利要求1-8中任一项所述的抗体或抗体片段，或权利要求9-22中任一项所述的双特异性抗体，以及与所述抗体或双特异性抗体偶联的部分，其中所述部分选自细胞毒素、放射性同位素、荧光标记物、发光物、显色物质或酶。

27.药物组合物，其包含权利要求1-8中任一项所述的抗体或抗体片段，权利要求9-22中任一项所述的双特异性抗体，或权利要求26所述的偶联物，以及药学上可接受的载体，表面活性剂和/或稀释剂。

28.根据权利要求27所述的药物组合物，其还包含一种或多种另外的治疗剂。

29.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或抗体片段，权利要求9-22中任一项所述的双特异性抗体，权利要求26所述的偶联物，或权利要求27或28所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

30.根据权利要求29中所述的用途，其中所述癌症是HER2阳性的癌症。

31.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或抗体片段，权利要求9-22中任一项所述的双特异性抗体，权利要求26所述的偶联物，或权利要求27或28所述的药物组合物，其用于治疗HER2阳性的癌症。

32.治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的受试者施用1-8中任一项所述的抗体，权利要求9-22中任一项所述的双特异性抗体，权利要求26所述的偶联物，或权利要求27或28所述的药物组合物的步骤。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述癌症是HER2阳性的癌症。

34.多肽，其具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。

35.多肽，其具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。

36.多肽，其具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

37.多肽，其具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列。