CN111748040B

CN111748040B - 多价抗体及其制备方法

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Publication number: CN111748040B
Application number: CN202010763424.9A
Authority: CN
Inventors: 李浩强; 唐慧娴; 平小芽
Original assignee: Hangzhou Healsun Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Healsun Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2020-07-31
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2040-07-31
Also published as: CN111748040A

Abstract

本发明提供多价抗体及其制备方法，所述多价抗体包括双特异性抗体，所述抗体包含能与CD19特异性结合的第一个抗原结合功能区和能与CD37特异性结合的第二个抗原结合功能区，所述抗体包含通过一个或多个二硫键链间连接的第一Fc链及第二Fc链，该第一Fc链和第二Fc链通过共价键或连接体分别连接到CD19抗原结合功能区和CD37抗原结合功能区上，或者该第一Fc链和第二Fc链通过共价键或连接体分别连接到CD37抗原结合功能区和CD19抗原结合功能区上。

Description

多价抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及抗体领域，特别地涉及多价抗体及其制备方法。

背景技术

随着全球环境的恶化和人们生活习惯的改变，肿瘤的发病率越来越高，肿瘤患者的死亡率也逐渐上升，故抗肿瘤药物的市场将不断扩大。肿瘤免疫治疗就是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法，包括单克隆抗体类免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞治疗和小分子抑制剂等。

近几年，肿瘤免疫治疗的好消息不断，目前已在多种肿瘤如黑色素瘤，非小细胞肺癌、肾癌和前列腺癌等实体瘤的治疗中展示出了强大的抗肿瘤活性，多个肿瘤免疫治疗药物已经获批准临床应用，虽然它们给肿瘤免疫治疗带来了突破性的成效，但是其疗效及适应症依然有限。

CD19是参与B细胞活化与增殖的重要膜抗原之一，是所有B细胞共有的表面标志，B细胞活化后不消失，是最重要的B细胞标记因子，同时CD19也是B细胞表面的传达信号复合体的构成部分，CD19的细胞外部分同其他膜抗原结合进行信号传导。CD19阳性细胞升高见于B淋巴细胞系统的恶性肿瘤，如CD19在95％急性前B淋巴细胞白血病细胞和94％急性成熟B淋巴细胞白血病细胞表达，也见于慢性淋巴细胞性白血病和淋巴瘤等；CD19阳性细胞降低见于体液免疫缺陷病。

双特异性抗体(BsAb)能分别识别和结合两种不同的抗原，所以它可以把免疫细胞、病毒分子等连接到肿瘤细胞上，进而增强对靶细胞的杀伤作用，同时它也可以结合同一肿瘤细胞上的不同抗原以增强其结合特异性，从而减少脱靶毒性等副作用。这种具有双功能的重组抗体作为治疗肿瘤的药物拥有比单抗药物更高的疗效。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供多价抗体及其制备方法。

本发明是以如下技术方案实现的：

多价抗体，所述抗体包含能与CD19特异性结合的第一个抗原结合功能区和能与CD37特异性结合的第二个抗原结合功能区，所述抗体包含通过一个或多个二硫键链间连接的第一Fc链及第二Fc链，该第一Fc链和第二Fc链通过共价键或连接体分别连接到CD19抗原结合功能区和CD37抗原结合功能区上，或者该第一Fc链和第二Fc链通过共价键或连接体分别连接到CD37抗原结合功能区和CD19抗原结合功能区上。

进一步地，所述抗体包括：抗CD19抗体，所述抗CD19抗体包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列的CDR-L1，和/或包含SEQ ID NO:02的氨基酸序列的CDR-L2，和/或包含SEQ ID NO:03的氨基酸序列的CDR-L3，和/或包含SEQ ID NO:04的氨基酸序列的CDR-H1，和/或包含SEQID NO:05的氨基酸序列的CDR-H2，和/或包含SEQ ID NO:06的氨基酸序列的CDR-H3。

进一步地，所述抗体包括：抗CD37抗体，所述抗CD37抗体包含SEQ ID NO:07的氨基酸序列的CDR-L1，和/或包含SEQ ID NO:08的氨基酸序列的CDR-L2，和/或包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列的CDR-L3，和/或包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H1，和/或包含SEQID NO:11的氨基酸序列的CDR-H2，和/或包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H3。

进一步地，所述抗体包含抗体重链可变区氨基酸序列，所述抗体重链可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO:13所示或如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列和/或如SEQ ID NO:17所示或如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。

进一步地，所述抗体包含抗体轻链可变区氨基酸序列，所述抗体轻链可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO:14所示或如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列和或如SEQ ID NO:18所示或如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。

进一步地，所述抗体包含选自人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的任一Fc端的氨基酸序列。

进一步地，所述抗体的生产步骤包括：在培养基中和合适的培养条件下培养含有上述抗体的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收产生的抗体及其抗体片段。

进一步地，所述抗体能够用于抑制生物体内无限增殖细胞的增值进程。

进一步地，所述抗体可以与至少一种治疗剂偶联以形成免疫偶联物，所述治疗剂选自细胞毒素剂、放射性核素、硼原子、免疫调节剂、免疫偶联物、寡核苷酸中的一种或多种。

进一步地，包括从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收产生的抗体及其抗原结合片段并与药学上可接受的载体制成药物用于治疗肿瘤的用途，所述肿瘤包括但不限于胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、白血病、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌。

附图说明

图1显示抗CD19/CD37双特异性抗体的结构；

图2显示了抗CD19/CD37双特异性抗体的CD37、CD19同时结合活性。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。

本领域公知，抗原结合功能区是指可以与目标分子如抗原发生特异性相互作用的区域，其作用具有高度选择性，识别一种目标分子的序列通常不能识别其他分子序列。

给定的BCR所识别的抗原称之为同源抗原，把同源抗原上BCR真正结合的微小区域称之为表位。为了产生信号，B细胞表面上许多BCR必须聚集在一起。当BCR结合在某一单一抗原的多次重复的表位(如一个蛋白质其一段氨基酸序列重复多次)上时就形成这种BCR簇。BCR也可能通过结合至入侵者表面聚集在一起的单个抗原上的表位上而被簇集。如大部分细菌和病毒表面含有一些不同蛋白质的许多拷贝。因此，如果BCR识别这些蛋白质中的一种蛋白质表位，那么许多的BCR就可能被簇集在入侵者上。最后，通过结合到簇集在一起的抗原表位上，BCR也可能被聚集在一起。

为了产生抗体，必须首先激活B细胞。大多数B细胞从来没有遇到它们的同源抗原，这些细胞通常被称之为原初型B细胞。激活原初型B细胞需要两种信号。第一种信号是B细胞受体和相关的信号分子的簇集，然而，仅仅交联其受体是不足以激活B细胞的，因此需要第二种信号共刺激信号，通常由辅助性T细胞提供(T细胞依赖的激活)。

IgG型抗体包括许多不同的亚型，这些亚型的Fc区有轻微的差别，因此具有不同的功能。例如，IgG型抗体的一种亚型IgG3，可以较其他任何亚型更好地固定补体。相似地，IgG1亚型擅长于结合入侵者并调理它们以利于专职吞噬细胞的吞噬，这是因为在巨噬细胞和中性粒细胞表面有能与已结合入侵者的IgG1抗体Fc区结合的受体。

T细胞共刺激分子中研究最清楚的是表达于APC表面的B7蛋白(B7-1和B7-2)，B7蛋白可以通过插入T细胞表面的受体而对T细胞提供共刺激。迄今为止已分离出了这类受体中的两种—CD28和CTLA-4。大部分T细胞表达CD28蛋白，而CTLA-4分子只在激活的T细胞中表达。现在认为，APC上的B7蛋白通过与原初T细胞的CD28受体结合，而提供激活所必需的共刺激信号。随后，一旦细胞被激活，B7蛋白与CTLA-4受体结合就可促使关掉或“去活化”T细胞。获得性免疫应答行使完其功能后对其实施关闭是非常重要的。

代表性的抗原结合功能区包括：抗体的可变区、抗体可变区的结构变构体、受体的结合域、配体结合域或酶结合域。

抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。

“可变区”是指在抗体间，可变区的某些区段的序列显著不同，所述高度可变区为各3-12个氨基酸，其主要采取β折叠构型，由三个高度可变区连接，这些高度可变区形成环，所述环连接β折叠结构及在一些情况下形成β折叠结构的一部分。各链中的高度可变区是由FR紧挨着结合在一起，而与其他链的高度可变区有助于形成抗体的抗原结合位点，恒定区不直接涉及抗体对抗原的结合。

“抗体的抗原结合片段”指能够与表位结合的抗体的片段、部分、区域或结构域，因此术语“抗原结合”与“表位结合”以及“抗体的抗原结合片段”与“抗体的表位结合片段”是相同的。抗原结合片段可以含有该类抗体的1、2、3、4、5或所有6个CDR域，并且尽管能够结合到所述表位，仍可以展现出不同的特异性、亲和力或选择性。优选地，抗原结合片段含有所述抗体的所有6个CDR域。

“抗体的抗原结合片段”可以是单条多肽链(例如，scFv)的一部分或包含单条多肽链，或者可以是两条或更多条多肽链(各自具有氨基末端和羧基末端，例如，双抗体、Fab片段、Fab2片段等)的一部分或包含两条或更多条多肽链。

“IgG”是免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)的缩写，是血清主要的抗体成分，根据IgG分子中的r链抗原性差异，人IgG有四个亚型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。

一个或多个二硫键链间连接是指第一Fc链及第二Fc链通过一个或多个二硫键链间连接，形成异源二聚体片段。在本发明中，一个或多个二硫键的形成可以是第一Fc链及第二Fc链或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区在同一个细胞内合成时形成，也可以是第一Fc链及第二Fc链或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区在不同细胞内分别合成，之后通过体外还原氧化的方法形成。

“治疗”包括但不限于以下中的一项或更多项试验表征：减轻疾病引起的一或更多种症状；减弱疾病的程度；预防或延迟疾病的恶化；预防或延迟疾病的扩散；预防或延迟疾病的复发；延迟或减缓疾病的进展；改善疾病情况；提供疾病的缓解；减少治疗疾病所需的一或更多种其他药物的剂量；延迟疾病的进展；增加或改善生活质量；增加体重增长及/或延长存活。在本发明中“治疗”可以解释为癌症的病理结果(例如肿瘤体积的减小)。

在一些实施方案中，本发明提供了免疫缀合物，其包含本文中提供的任何双特异性抗体和细胞毒性剂。在一些实施方案中，所述免疫缀合物用于治疗癌症，优选地肺癌(例如非小细胞肺癌)、肝癌、胃癌、结肠癌等。

在一些实施方案中，本发明提供了药学上可接受的载体，药学上可接受的载体是指是指药学领域常规的药物载体，包括但不限于稀释剂、赋形剂和水等；包括但不限于粘合剂如明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；包括但不限于促吸收剂如季铵化合物；包括但不限于表面活性剂如十六烷醇、十二烷基硫酸钠等。

在一些实施方案中，本文所述的方法还包括向所述受试者联合施用有效量的第二单抗、免疫检查点抑制剂或活性剂，其中本文所述的双特异性抗体是第一药物。

在一些实施方案中活性剂选自化疗剂。

在一些实施方案中，所述第二单抗选自抗PD-1单抗、抗PD-L1单抗、抗VEGF单抗、抗IL-17单抗、抗CTLA-4单抗、抗TIM单抗、抗ICOS单抗、抗IL-6单抗、抗4-1BB单抗。

在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂选自抗PD-1免疫检查点抑制剂、抗PD-L1免疫检查点抑制剂、抗VEGF免疫检查点抑制剂、抗IL-17免疫检查点抑制剂、抗CTLA-4免疫检查点抑制剂、抗TIM免疫检查点抑制剂、抗ICOS免疫检查点抑制剂、抗IL-6免疫检查点抑制剂、抗4-1BB免疫检查点抑制剂。

实施例1：

小鼠免疫：选购6-8周龄雌性BALB/c小鼠(购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司)作为实验动物。初次免疫使用45μg人CD19蛋白(购自南京双领生物科技有限公司)与完全弗氏佐剂混合形成乳剂，按0.5ml/只注射量注射小鼠，腹腔注射，每隔两周进行加强免疫，加强免疫方法为：将不完全福氏佐剂与22.5μg人CD19蛋白混合充分制成乳液，按0.5ml/只注射量注射小鼠，腹腔注射，一共加强免疫四次，末次免疫一周后，收集并分离血清ELISA方法检测抗体效价，方法参考说明书，选择具有高效价的小鼠细胞制备杂交瘤制备单脾细胞悬液。收集对数生长的骨髓瘤细胞制备免疫脾细胞悬液，将骨髓瘤细胞与脾细胞按一定比例混合，用不完全培养液洗涤后，离心弃上清，将细胞沉淀和1ml PEG-4000分别置于40℃水浴中预热，之后混合为反应液并静置至出现颗粒，1min内向反应液中加入25ml预热至40℃的不完全培养基终止反应。静置后加入2ml HAT培养基，轻吹沉淀细胞使其悬浮混匀，之后补充HAT培养基至离心管内的脾细胞浓度达到1×10⁷/ml，将上述细胞悬浮液分装至96孔板培养，待细胞表面积达到孔板面积2/3以上时吸出上清液样品供抗体检测。

小鼠免疫：选购6-8周龄雌性BALB/c小鼠(购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司)作为实验动物。初次免疫使用50μg人CD37蛋白(购自南京双领生物科技有限公司)与完全弗氏佐剂混合形成乳剂，按0.5ml/只注射量注射小鼠，腹腔注射，每隔两周进行加强免疫，加强免疫方法为：用25μg人CD37蛋白与不完全福氏佐剂充分混合形成乳液，按0.5ml/只注射量注射小鼠，腹腔注射，一共加强免疫四次，末次免疫一周后，收集并分离血清ELISA方法检测抗体效价，方法参考说明书，选择具有高效价的小鼠细胞制备杂交瘤制备单脾细胞悬液。收集对数生长的骨髓瘤细胞制备免疫脾细胞悬液，将骨髓瘤细胞与脾细胞按一定比例混合，用不完全培养液洗涤后，离心弃上清，将细胞沉淀和1ml PEG-4000分别置于40℃水浴中预热，之后混合为反应液并静置至出现颗粒，1min内向反应液中加入25ml预热至40℃的不完全培养基终止反应。静置后加入2ml HAT培养基，轻吹沉淀细胞使其悬浮混匀，之后补充HAT培养基至离心管内的脾细胞浓度达到1×10⁷/ml，将上述细胞悬浮液分装至96孔板培养，待细胞表面积达到孔板面积2/3以上时吸出上清液样品供抗体检测。

实施例2：

筛选杂交瘤培养上清液的抗人CD19抗体和抗人CD37抗体。在96孔高吸附酶标板上包被人CD19(购自南京双领生物科技有限公司)，包被量100μL每孔，之后冲洗3次；用含1％BSA的缓冲液阻断并于25℃孵育1h，阻断量280μL/孔，孵育完成后缓冲液洗涤3次，分别向1-90号孔中加入75μL上清液样品以及阳性血清作为对照，25℃孵育1小时，缓冲液洗涤5次；每孔加入100μL以比例1/10000稀释于含1％BSA缓冲液里的抗小鼠IgG抗体，所述抗小鼠IgG抗体被辣根过氧化物酶标记，25℃孵育1小时，缓冲液洗涤5次；每孔加入100μL比色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，30℃显色10min后终止显色反应，在酶标仪上读取450nm处的吸光度，根据OD450nm的强弱选取能够分泌人CD19结合抗体的阳性克隆。方法同上，根据OD450nm的强弱选取能够分泌人CD37结合抗体的阳性克隆。将筛选得到的同时具有抗原结合活性以及抗原中和活性的克隆，进行抗体DNA序列的测定。使用RNA prep Pure试剂盒提取细胞mRNA，合成cDNA第一链，将逆转录产生的cDNA第一链用于后续PCR反应，将PCR扩增得到的目的条带克隆到pGEM-T载体中，挑取单克隆由南京金斯瑞生物科技有限公司完成测序。

实施例3：

经过PCR扩增得到鼠源抗CD19抗体的轻链可变区和重链可变区，排除骨架区序列后即可得到其互补决定区序列；其中轻链的三个互补决定区CDR-L1氨基酸序列如SEQ IDNO:1；CDR-L2氨基酸序列如SEQ ID NO:2、CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；重链的三个互补决定区CDR-H1氨基酸序列如SEQ ID NO:4、CDR-H2氨基酸序列如SEQ ID NO:5、CDR-H3氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；抗体轻链恒定区氨基酸序列来源自鼠源IgVH4-21*07、抗体重链恒定区序列鼠源IgVH2-09*01，轻链全长序列为将抗体轻链可变区和轻链恒定区连接即得；重链全长序列为将抗体重链可变区和重链恒定区连接即得，将上述可变区序列及恒定区序列分别克隆到真核细胞表达载体TL10-11中(载体骨架pEGFP-N1)。将抗体轻链及抗体重链表达载体转染293F细胞系。转染前一天接种细胞，转染当天将细胞离心收集细胞，将细胞重悬于新鲜的表达培养基中，细胞密度为1.5×10⁷细胞/mL。按照转染体积加入质粒，终浓度为39.1μg/mL，加入线性聚乙烯亚胺至终浓度为45μg/mL。将上述混合物放入细胞培养箱37℃培养1小时，之后向培养液中加入新鲜培养基至终体积为20倍转染体积，继续培养5～6天后收集上清。

经过PCR扩增得到鼠源抗CD37抗体的轻链可变区和重链可变区，排除骨架区序列后即可得到其互补决定区序列；其中轻链的三个互补决定区CDR-L1氨基酸序列如SEQ IDNO:7；CDR-L2氨基酸序列如SEQ ID NO:8、CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；重链的三个互补决定区CDR-H1氨基酸序列如SEQ ID NO:10、CDR-H2氨基酸序列如SEQ ID NO:11、CDR-H3氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；抗体轻链恒定区氨基酸序列来源自鼠源IgVH4-21*07、抗体重链恒定区序列鼠源IgVH2-09*01，轻链全长序列为将抗体轻链可变区和轻链恒定区连接即得；重链全长序列为将抗体重链可变区和重链恒定区连接即得，将上述可变区序列及恒定区序列分别克隆到真核细胞表达载体TL10-11中。将抗体轻链及抗体重链表达载体转染293F细胞系。转染前一天接种细胞，转染当天将细胞离心收集细胞，将细胞重悬于新鲜的表达培养基中，细胞密度为1.5×10⁷细胞/mL。按照转染体积加入质粒，终浓度为39.1μg/mL，加入线性聚乙烯亚胺至终浓度为45μg/mL。将上述混合物放入细胞培养箱37℃培养1小时，之后向培养液中加入新鲜培养基至终体积为20倍转染体积，继续培养5～6天后收集上清。

实施例4：

检测实施例1获得的抗人CD19鼠源单抗(以下简称OM-anti-CD19)与其抗原结合的动力学常数。检测实施例1获得的抗人CD37鼠源单抗(以下简称OM-anti-CD37)与其抗原结合的动力学常数。具体方法为：利用仪器光学表面等离子体共振技术来检测偶联包被在生物芯片上的分子与待测分子之间的结合和解离。简要地，将OM-anti-CD19溶于的醋酸钠缓冲溶液(pH 5.0)中并偶联到CM芯片上，用1M乙醇胺封闭。结合阶段将不同浓度的OM-anti-CD19以27μL/min的速度注入3min，在解离阶段用PBS缓冲溶液以27μL/min的速度注入8min，结合动力学常数和解离动力学常数通过Biacore3000软件进行分析计算。OM-anti-CD19的结合动力学常数为3.38E+01(1/Ms)、解离动力学常数为1.57E-04(1/s)、解离平衡常数为0.03(nM)。按上述方法检测OM-anti-CD37的结合动力学常数为3.23E+04(1/Ms)、解离动力学常数为1.47E+03(1/s)、解离平衡常数为0.02(nM)。

实施例5：

人源化形式的抗人CD19抗体参考Molecule Immunol的制备方法制备，在Germline数据库中选取与OM-anti-CD19非CDR区匹配最好的人源化模板，将鼠源抗体CDR区移植到选择的人源化模板上，替换得到人源化抗体重链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，替换得到人源化抗体轻链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。相同方法获得CD37人源化抗体，抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。通过序列比对选择适合位点进行回复突变，获得的重链可变区氨基酸序列(VH)及轻链可变区氨基酸序列(VL)如表1所示。

表1.回复突变获得的氨基酸序列

CD19抗体VH	序列编号
		CD19-ORI-VH	SEQ ID NO:13
AzzH-13-VH	SEQ ID NO:15
		CD19抗体VL	序列编号
CD19-ORI-VL	SEQ ID NO:14
		AzzL-13-VL	SEQ ID NO:16
CD37抗体VH	序列编号
		CD37-ORI-VH	SEQ ID NO:17
XsH-23-VH	SEQ ID NO:19
		CD37抗体VL	序列编号
CD37-ORI-VL	SEQ ID NO:18
		XsL-23-VL	SEQ ID NO:20

实施例6:

将人源化的抗人CD19单抗的重链可变区(SEQ ID NO：15)与人抗体IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:21)连接，得到对应的重链全长序列。将人源化的抗人CD19单抗的轻链可变区(SEQ ID NO：16)与人抗体Kappa轻链的恒定区(SEQ ID NO:22)连接，分别得到对应的轻链全长序列，将上述所有重链全长序列与轻链全长序列组合得到人源化抗体全长序列，经酶切连接入TL10-11(载体骨架pEGFP-N1)载体中。分别构建抗人CD19的抗体的重链和轻链的TL10-11表达载体(重链氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示)，根据常规方法，获得抗人CD19抗体重链和轻链的表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗人CD19抗体的重链和轻链。

将人源化的抗人CD37单抗的重链可变区(SEQ ID NO：19)与人抗体IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:21)连接，得到对应的重链全长序列。将人源化的抗人CD37单抗的轻链可变区(SEQ ID NO：20)与人抗体Kappa轻链的恒定区(SEQ ID NO:22)连接，分别得到对应的轻链全长序列，将上述所有重链全长序列与轻链全长序列组合得到人源化抗体全长序列，经酶切连接入TL10-11(载体骨架pEGFP-N1)载体中。分别构建抗人CD37的抗体的重链和轻链的TL10-11表达载体(重链氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示)，根据常规方法，获得抗人CD37抗体重链和轻链的表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗人CD37抗体的重链和轻链。

实施例7：

分别将含抗人CD19抗体的重链和轻链的表达载体转染293F细胞，另外分别将含抗人CD37抗体的重链和轻链的表达载体也转染293F细胞。常规方法培养后，离心收集转染5～6天的细胞培养上清。通过ELISA的方法测定表达量。在应用层析柱纯化之前，以0.2μm滤膜过滤以去除沉淀物。此步骤在4℃下进行。采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(GEHealthcare)以及亲和色谱柱于4℃下进行纯化。首先以流动相A(20mM磷酸钠缓冲液，150mM氯化钠，pH 7.4)平衡色谱柱，在基线稳定后将经过上述处理的细胞上清液进行上样，流速为5ml/min，并在上样后以流动相A进行平衡。样品分别为抗CD19表达产物和抗CD37表达产物。之后，首先以流动相B1(含有0.5M精氨酸的流动相A)冲洗5个柱体积；然后以流动相B2(100mM柠檬酸，pH 3.0)洗脱5个柱体积，收集洗脱峰即为目的蛋白峰；以上洗脱步骤流速都为5ml/min。将上述方法获得的抗CD19表达产物和抗CD37表达产物，进行体外重组以获得异源二聚体。首先将上述纯化收集的蛋白溶液通过超滤浓缩管超滤浓缩，将溶液置换为磷酸盐缓冲液PBS。将获得的抗CD19表达产物和抗CD37表达产物分别加所述PBS调整到1mg/ml，加入1/200倍终体积的1M DTT，4℃还原6小时，还原过程中二硫键被打开，抗CD19表达产物中含有的少量的抗体同源二聚体分子的铰链区二硫键也打开，形成了含有一条重链和一条轻链的半抗体分子，结构如图1(A)所示。抗CD37表达产物中含有的少量的抗体同源二聚体分子的铰链区二硫键也打开，形成了含有一条重链和一条轻链的半抗体分子，结构如图1(B)所示。

将还原的抗CD19和抗CD37半抗体分子等摩尔比例混合，在4℃条件下进行重组反应，重组过程中抗CD19和抗CD37半抗体分子分子通过CH2/CH3的非共价作用力形成了同时含有抗CD19以及抗CD37半抗体分子的异源二聚体形式的双特异抗体，之后将蛋白溶液通过超滤浓缩管超滤浓缩(标称截留分子量10KDa)，将溶液置换为磷酸盐溶液终止还原，通过空气或者氧化剂进行氧化反应，使异源二聚体的双特异抗体的二硫键重新形成。异源二聚体分子结构如图1(C)所示。对上述异源二聚体形式的抗CD19/CD37双特异性抗体进行纯化，将纯化产物通过SDS-PAGE方法分析，纯度为96.9％。

异源二聚体的制备还可以参考WO2013060867中描述的一种大规模生产异二聚体双特异抗体的方法，该方法先还原两种混合的同源二聚体形式抗体，然后通过在这两种同源二聚体抗体的Fc区引入不对称氨基酸突变从而促使不同抗体的Fab臂发生交换，最后通过氧化铰链区的链间二硫键形成稳定的双特异抗体。

实施例8：

检测获得实施例7获得的双特异性抗体与抗原CD19，抗原CD37的结合的动力学常数。方法为：利用仪器光学表面等离子体共振技术来检测偶联包被在生物芯片上的分子与待测分子之间的结合和解离。简要地，将抗待测抗体溶于的醋酸钠缓冲溶液(pH 5.0)中并偶联到CM芯片上，用1M乙醇胺封闭。结合阶段将不同浓度的anti-CD19和/或anti-CD37以25μL/min的速度注入3min，在解离阶段用PBS缓冲溶液以25μL/min的速度注入8min，结合动力学常数和解离动力学常数通过Biacore 3000软件进行分析计算。anti-CD19、anti-CD37以及抗CD19/CD37双抗的结合动力学常数、解离动力学常数和解离平衡常数如表2所示。

表2.双特异性抗体与其与其抗原结合的动力学常数

测定抗CD19/CD37双抗在大鼠体内的药代动力，简要地，选6-8周龄雌性SD大鼠随机分成2组(编号测试组1，测试组2，每组5只)，测试组1给予25nmol/kg双特异性抗体；测试组2给予50nmol/kg双特异性抗体。分别在0点，给药后5分钟，30分钟，1小时、2小时、3小时、6小时、9小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、168小时、216小时、264小时眼眶采血并不予抗凝，室温放置血样45min至凝血后，离心获得血清样品，血清样品冷冻于-80℃待测。

单次静脉注射的剂量为50nmol/kg的双特异性抗体的药代参数如下：半衰期t_1/2为56小时，药时曲线下面积AUC_last为41683nM.hr，估算零浓度C0为122nM，表观分布容积Vd为53mL/Kg，清除率CL为0.83mL/hr/kg，平均驻留时间MRT_last为105小时。

单次静脉注射的剂量为25nmol/kg的双特异性抗体的药代参数如下：半衰期t_1/2为38小时，药时曲线下面积AUC_last为25188nM.hr，估算零浓度C0为88nM，表观分布容积Vd为35mL/Kg，清除率CL为0.72mL/hr/kg，平均驻留时间MRT_last为76小时。

实施例9：

用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗CD19/CD37双特异性抗体的双靶点的结合活性。简要地，用碳酸盐缓冲溶液(pH 9.3)在96孔高吸附酶标板上包被重组人CD19(浓度1μg/mL，100μL)和重组人CD37(浓度1μg/mL，100μL)，4℃过夜；PBST洗涤5次后用PBST(含1％BSA)封闭孔(280μL/孔)，25℃孵育1h；PBST洗涤5次后加入稀释在PBST(含1％BSA)的双特异性抗体样品以及对照(100μL)，25℃孵育1h，PBST洗涤5次，然后加入稀释的生物素标记的CD37-Fc(0.5μg/mL，每孔100μL)，25℃孵育1h，加稀释在的PBST里的链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物(1:1000)，每孔100μL，25℃孵育1h，PBST洗涤5次，加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10min。加入H₂SO₄(1M,100μL/孔)终止显色，在酶标仪上读取450nm处的吸光度，结果如图2所示，CD37单抗和CD19单抗的组合不能同时结合CD37、CD19，抗CD19/CD37双抗具有同时结合两种抗原的活性。

实施例10：

检测抗人CD19人源化单抗(AzzH-13)，抗人CD37人源化单抗(XsH-23)，抗CD19/CD37双抗对接种于小鼠肿瘤移植物的生长抑制作用，实验材料选用人8周龄雌性小鼠(C57BL/6背景，购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司)。给试验小鼠接种MC38细胞，共接种20只，待小鼠明显荷瘤切片验证，观察肿瘤生长，记录荷瘤体积，连续给药6周，每周2次。给药第二周起每周测量1次肿瘤体积，测量其长径a，短径b，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝(a x b²)/2。

待小鼠肿瘤体积增至所需体积，按体积分组每组5只：S1,S2,S3,S4,S5(体积约150mm³)；S6,S7,S8,S9,S10(体积约100mm³)；S1,S6设置为溶媒组(注射等体积生理盐水)，S2,S7给药25nmol/kg抗人CD19抗体(AzzH-13)，S3,S8给药25nmol/kg抗人CD37抗体(XsH-23)，S4,S9给药剂量为25nmol/kg抗CD19/CD37双抗，S5,S10给药剂量为50nmol/kg抗CD19/CD37双抗，试验结果如表3所示。

表3.肿瘤消融比效果实验

由表3可见，抗CD19/CD37双抗相较于抗人CD19人源化单抗和CD37在肿瘤消融比例上有显著提高，给药浓度不同并未带来药效上的巨大差异，抗CD19/CD37双抗针对150mm³、100mm³级别的肿瘤均有较好的消融效果，由此可见，本发明提供的抗CD19/CD37双抗在小鼠实验中具有明显抗肿瘤活性，显著抑制了小鼠移植瘤的生长。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 杭州皓阳生物技术有限公司

<120> 多价抗体及其制备方法

<141> 2020-07-31

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(7)

<223> Anti-CD19 CDR-L1

<400> 1

Leu Trp Lys Trp Arg Asn Asn

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(5)

<223> Anti-CD19 CDR-L2

<400> 2

Ser Glu Leu Gln Ser

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(10)

<223> Anti-CD19 CDR-L3

<400> 3

Asn Glu Cys Arg Phe Ser Thr Trp Pro Ala

1 5 10

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(7)

<223> Anti-CD19 CDR-H1

<400> 4

Glu Leu Ser His Thr Ser Gly

1 5

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(6)

<223> Anti-CD19 CDR-H2

<400> 5

Asp Val Asp Ile Asn Arg

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(10)

<223> Anti-CD19 CDR-H3

<400> 6

Asn Glu Cys Arg Phe Ser Thr Trp Pro Ala

1 5 10

<210> 7

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(8)

<223> Anti-CD37 CDR-L1

<400> 7

Lys Cys Tyr Lys His Tyr Ile Glu

1 5

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(5)

<223> Anti-CD37 CDR-L2

<400> 8

Cys Ile Pro Ile Tyr

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(9)

<223> Anti-CD37 CDR-L3

<400> 9

Ser Leu Arg Phe Cys Lys Leu Ala Ile

1 5

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(7)

<223> Anti-CD37 CDR-H1

<400> 10

Leu Ile Ala Gln Leu Leu Asp

1 5

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(5)

<223> Anti-CD37 CDR-H2

<400> 11

Ser Glu Leu Gln Ser

1 5

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(10)

<223> Anti-CD37 CDR-H3

<400> 12

Asn Glu Cys Arg Phe Ser Thr Trp Pro Ala

1 5 10

<210> 13

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(116)

<223> CD19-ORI-VH

<400> 13

Gly Phe Val Leu Ser Met Thr His Trp Ile Arg Gln Gly Pro Gln His

1 5 10 15

Ile Asp Thr Ile Pro His Trp Gln Glu Leu Ser His Thr Ser Gly Pro

20 25 30

Asp Phe Ser Gln Trp Pro Ala Gly Ser Ile Ile Leu Ala His Met Arg

35 40 45

Arg Trp Ser Glu Trp Val Asn Val Trp Val Gly Ile Tyr Lys Asp Val

50 55 60

Asp Ile Asn Arg Val His Gly Trp Met Val Phe Ala Phe Gly Tyr Arg

65 70 75 80

Val Leu His Gln Ser Phe Arg Ile Met Tyr Pro His Asp Thr Cys Arg

85 90 95

Glu Phe Trp Glu Gln Val Asn Met His Asn Gly Gln Trp Arg Ser Asp

100 105 110

Thr Pro Ser Thr

115

<210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(112)

<223> CD19-ORI-VL

<400> 14

Met Thr Arg Ser Ile Lys Glu Gln Cys Tyr Cys Gly Arg Arg His Tyr

1 5 10 15

Ser Asp Pro Trp Glu Phe Met Met Leu Trp Lys Trp Arg Asn Asn Lys

20 25 30

Asn Val Ser Asn His Trp Trp Pro Phe Arg Asn Ser His Glu Glu Asn

35 40 45

His Glu Tyr Glu Arg Cys Arg Asp Tyr Ser Glu Leu Gln Ser Met Pro

50 55 60

Thr Trp Gly Arg Met Gln Ala Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Glu Trp Pro

65 70 75 80

Asn Glu Cys Arg Phe Ser Thr Trp Pro Ala Lys Ser Tyr Thr Pro Ser

85 90 95

Thr Phe Arg Tyr Lys Val Glu Tyr Gln Trp His Leu Met Gln Ser His

100 105 110

<210> 15

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(116)

<223> AzzH-13-VH

<400> 15

Gly Phe Ala Leu Ser Met Thr Asp Trp Ile Arg Gln Gly Pro Gln His

1 5 10 15

Ile Asp Thr Ile Pro His Trp Gln Glu Leu Ser His Thr Ser Gly Pro

20 25 30

Asp Phe Ser Gln Trp Pro Ala Gly Ser Ile Ile Leu Ala His Met Arg

35 40 45

Arg Trp Ser Glu Trp Val Asn Val Trp Val Gly Ile Tyr Lys Asp Val

50 55 60

Asp Ile Asn Arg Val His Gly Trp Met Val Phe Ala Phe Gly Tyr Arg

65 70 75 80

Val Leu His Gln Ser Phe Arg Ile Met Tyr Pro His Asp Thr Cys Arg

85 90 95

Glu Phe Trp Glu Thr Val Asn Met His Asn Gly Gln Trp Arg Ser Asp

100 105 110

Thr Pro Ser Thr

115

<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(112)

<223> AzzL-13-VL

<400> 16

Met Thr Arg Ser Ile Lys Glu Gln Ala Tyr Cys Gly Arg Arg His Tyr

1 5 10 15

Ser Asp Pro Trp Glu Phe Met Met Leu Trp Lys Trp Arg Asn Asn Lys

20 25 30

Asn Val Ser Asn His Trp Trp Pro Phe Arg Asn Gln His Glu Glu Asn

35 40 45

His Glu Tyr Glu Arg Cys Arg Asp Tyr Ser Glu Leu Gln Ser Met Pro

50 55 60

Thr Trp Gly Arg Met Gln Ala Gln Thr Tyr Trp Glu Leu Glu Trp Pro

65 70 75 80

Asn Glu Cys Arg Phe Ser Thr Trp Pro Ala Lys Ser Tyr Thr Pro Ser

85 90 95

Thr Phe Arg Tyr Lys Val Glu Tyr Gln Trp His Leu Met Gln Ser His

100 105 110

<210> 17

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(118)

<223> CD37-ORI-VH

<400> 17

Tyr His Val Leu Lys Phe Ala Glu Asn Asp Ile Tyr Ile Lys Asn Tyr

1 5 10 15

Val Asn Glu Tyr Pro Ile Gln Trp Leu Ile Ala Gln Leu Leu Asp Asp

20 25 30

Ala Lys Pro Glu His Cys Tyr Gly Val Asn Tyr Thr Lys Gly Asp Ser

35 40 45

Glu Asn Lys Asn Ala Cys Trp Cys Ile Pro Ile Tyr Gln Ile Ala Ile

50 55 60

Phe Ser Gln Tyr Thr Phe Cys Glu Trp Glu Val Asn Thr Met Glu Glu

65 70 75 80

Asp Gly Gln Ser Leu Arg Phe Cys Lys Leu Ala Ile Leu Val Tyr Thr

85 90 95

Trp Asn His Cys Cys Tyr Glu Asn Pro His Cys Glu Val Val Phe Thr

100 105 110

Phe Arg Gln Asp Trp Met

115

<210> 18

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(113)

<223> CD37-ORI-VL

<400> 18

Tyr Val Asp Thr Val Leu Asp Pro Gln Glu His Val Asp Ser Pro His

1 5 10 15

Glu Cys Pro Ile Ser Cys His Met Gln Gln Arg Lys Cys Tyr Lys His

20 25 30

Tyr Ile Glu Trp His Arg His Trp Ile Lys Gln Arg Tyr Tyr Asn Asp

35 40 45

Val Trp Phe Phe Leu Ala Trp Gly Tyr Thr His Tyr Ser Ile Met Gly

50 55 60

Phe Met Gln Trp Val Lys Phe Asp His Ile Trp Cys Cys Glu His Cys

65 70 75 80

Thr Ser Trp Phe Thr Arg Arg Ala Trp Ser Phe Gln Ala Ser Tyr Cys

85 90 95

Asp Phe Lys Tyr Arg Thr Pro Val Tyr Asp Thr His Pro Gly Val Ile

100 105 110

Pro

<210> 19

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(118)

<223> XsH-23-VH

<400> 19

Tyr His Val Leu Lys Phe Ala Glu Asn Asp Ile Tyr Ala Lys Asn Tyr

1 5 10 15

Val Asn Glu Tyr Pro Ile Gln Trp Leu Ile Ala Gln Leu Leu Asp Asp

20 25 30

Ala Lys Pro Glu His Cys Tyr Gly Val Asn Tyr Thr Lys Gly Asp Ser

35 40 45

Glu Asn Lys Asn Ala Cys Trp Cys Ile Pro Ile Tyr Gln Ile Ala Ile

50 55 60

Phe Ser Gln Tyr Thr Phe Cys Asp Trp Glu Val Asn Thr Met Glu Glu

65 70 75 80

Asp Gly Gln Ser Leu Arg Phe Cys Lys Leu Ala Ile Leu Val Tyr Thr

85 90 95

Trp Asn His Cys Ser Tyr Glu Asn Pro His Cys Glu Val Val Phe Thr

100 105 110

Phe Arg Gln Asp Trp Met

115

<210> 20

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(113)

<223> XsH-23-VL

<400> 20

Tyr Val Asp Thr Val Leu Asp Pro Gln Glu Gln Val Asp Ser Pro His

1 5 10 15

Glu Cys Pro Ile Ser Cys His Met Gln Gln Arg Lys Cys Tyr Lys His

20 25 30

Tyr Ile Glu Trp His Arg His Trp Ile Lys His Arg Tyr Tyr Asn Asp

35 40 45

Val Trp Phe Phe Leu Ala Trp Gly Tyr Thr His Tyr Ser Ile Met Gly

50 55 60

Phe Met Gln Trp Val Lys Phe Asp His Ile Trp Cys Cys Glu His Cys

65 70 75 80

Thr Ser Trp Phe Thr Arg Arg Ala Trp Ser Phe Gln Ala Ser Tyr Cys

85 90 95

Asp Phe Gln Tyr Arg Thr Pro Val Tyr Asp Thr His Pro Gly Val Ile

100 105 110

Pro

<210> 21

<211> 329

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(329)

<223> 人抗体IgG1重链恒定区

<400> 21

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

1 5 10 15

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

20 25 30

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

35 40 45

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

50 55 60

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

65 70 75 80

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

100 105 110

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

115 120 125

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

130 135 140

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

145 150 155 160

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

165 170 175

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

180 185 190

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

195 200 205

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

210 215 220

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

225 230 235 240

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

245 250 255

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

260 265 270

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

275 280 285

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

290 295 300

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

305 310 315 320

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 22

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(110)

<223> 人抗体IgG1轻链恒定区

<400> 22

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

1 5 10 15

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

20 25 30

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

35 40 45

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

50 55 60

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

65 70 75 80

Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

85 90 95

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105 110

Claims

1.多价抗体，其特征在于，所述抗体包含能与CD19特异性结合的第一个抗原结合功能区和能与CD37特异性结合的第二个抗原结合功能区，所述抗体包含通过一个或多个二硫键链间连接的第一Fc链及第二Fc链，该第一Fc链和第二Fc链通过共价键或连接体分别连接到CD19抗原结合功能区和CD37抗原结合功能区上，或者该第一Fc链和第二Fc链通过共价键或连接体分别连接到CD37抗原结合功能区和CD19抗原结合功能区上，所述能与CD19特异性结合的第一个抗原结合功能区包含氨基酸序列如SEQ ID NO:01所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID NO:02所示的CDR-L2，氨基酸序列如SEQ ID NO:03所示的CDR-L3，氨基酸序列如SEQID NO:04所示的CDR-H1，氨基酸序列如SEQ ID NO:05所示的CDR-H2，氨基酸序列如SEQ IDNO:06所示的CDR-H3，所述能与CD37特异性结合的第二个抗原结合功能区包含氨基酸序列如SEQ ID NO:07所示的CDR-L1，氨基酸序列如SEQ ID NO:08所示的CDR-L2，氨基酸序列如SEQ ID NO:09所示的CDR-L3，氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的CDR-H1，氨基酸序列如SEQID NO:11所示的CDR-H2，氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的CDR-H3。

2.根据权利要求1所述抗体，其特征在于，所述抗体包含抗体重链可变区氨基酸序列，所述抗体重链可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO:13所示或如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列和/或如SEQ ID NO:17所示或如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述抗体，其特征在于，所述抗体包含抗体轻链可变区氨基酸序列，所述抗体轻链可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO:14所示或如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列和/或如SEQ ID NO:18所示或如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述抗体，其特征在于，所述抗体包含选自人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的任一Fc端的氨基酸序列。