CN111875697B

CN111875697B - 一种包含肽标签的融合蛋白

Info

Publication number: CN111875697B
Application number: CN202010768943.4A
Authority: CN
Inventors: 靳维维; 于聪; 陈滨
Original assignee: Hangzhou Healsun Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Healsun Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-08-03
Filing date: 2020-08-03
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2040-08-03
Also published as: CN111875697A

Abstract

本发明提供一种肽标签在纯化融合多肽中的用途，所述肽标签序列与融合多肽连接，用于融合多肽的筛选及纯化，所述融合多肽包含CTLA4胞外区和抗CD73抗体的融合多肽及含有该蛋白的药物组合物。

Description

一种包含肽标签的融合蛋白

技术领域

本发明涉及大分子领域，特别地涉及一种包含肽标签的融合蛋白。

背景技术

肽标签在体内或体外都能被生物素连接酶在赖氨酸残基连接上一个生物素，从而实现蛋白的生物素化。而抗生物素蛋白或链霉亲和素可以专一地与生物素结合，正是基于这两个反应，肽标签技术可以应用于蛋白的固定、纯化和显影等。借助肽标签技术基本上所有的蛋白质都能被有效的、特异性地标记上。

细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA4)，又名CD152，是一种白细胞分化抗原。CTLA4和CD28的配体均为B7分子，而CTLA4与B7分子结合后诱导T细胞无反应性，参与免疫反应的负调节。

CD73是NT5E基因编码的胞外-5’-核苷酸酶，蛋白分子量70KD，由葡糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞表面形成同源二聚体，但同时也可被切割并游离于循环系统。CD73上游的CD39可以催化ATP产生腺苷单磷酸，所产生的AMP被CD73转化为腺苷，而腺苷会结合下游的腺苷受体。有研究显示，A2AR通过激活蛋白激酶A和Csk激酶，抑制LCK、MAPK、PKC等一系列与免疫激活相关的信号通路，从而发挥免疫抑制作用。

联合给药需要依次注射两种或多种抗体，或将抗体做成同一种剂型。然而，一方面依次注射抗体会降低患者的治疗依从性，另一方面，由于不同抗体的物化性质存在差异，很难或几乎不太可能将不同抗体做成同一种剂型。鉴于此仍然有必要研究一种同时阻断B7/CD28和靶向CD73的新型治疗药物。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种包含肽标签的融合蛋白。

本发明是以如下技术方案实现的：

一种肽标签，所述肽标签如SEQ ID NO.15所示，所述肽标签序列与融合多肽连接，用于融合多肽的筛选及纯化。

进一步地，所述融合多肽包含CTLA4分子胞外区和抗CD73抗体。

进一步地，所述融合多肽的结构为信号肽-人CTLA4-连接肽-抗CD73抗体。

进一步地，所述抗CD73抗体包含：

CDR-L1如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，和

CDR-L2如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和

CDR-L3如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，和

CDR-H1如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，和

CDR-H2如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，和

CDR-H3如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

进一步地，所述抗CD73抗体包含抗体重链可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO:8所示或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VH序列；所述抗CD73抗体包含抗体轻链可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO:11所示或与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VH序列。

进一步地，所述抗CD73抗体包含抗体重链可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO:9所示或与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VH序列；所述抗CD73抗体包含抗体轻链可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO:12所示或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VH序列。

由于人类机体的复杂性，不同作用机理的药物联合使用或融合使用可能会出现拮抗、无关、累加或协同等不同的效果，两种或更多种药物联合或融合使用到底如何相互作用只能通过具体的实验研究和创造性思考的情况下才能确定。肿瘤为一种非常复杂的疾病，即使联合使用或融合使用某些药物也罕有实现各个不同作用机理药物所能实现的治疗效果的完全累加或协同的效果，很多都呈现组合无关甚或拮抗的效果。本发明的融合多肽对肿瘤具有增强的治疗效果，本发明的融合多肽表达量高，为肿瘤的治疗提供了一种治疗效果更加优异的候选药物。

本发明的融合多肽同时作用于两个不同的靶点，降低了单一靶点治疗失败或效果不佳的机率，具有重要的经济意义和社会效益。与使用单功能的蛋白(例如CTLA4)情况相比，本发明可降低生产成本，并减少临床给药体积和频率，提高受试者顺从性，在免疫性疾病的预防和治疗上具有巨大的应用前景。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。

本领域公知，抗原结合功能区是指可以与目标分子如抗原发生特异性相互作用的区域，其作用具有高度选择性，识别一种目标分子的序列通常不能识别其他分子序列。

给定的BCR所识别的抗原称之为同源抗原，把同源抗原上BCR真正结合的微小区域称之为表位。为了产生信号，B细胞表面上许多BCR必须聚集在一起。当BCR结合在某一单一抗原的多次重复的表位(如一个蛋白质其一段氨基酸序列重复多次)上时就形成这种BCR簇。BCR也可能通过结合至入侵者表面聚集在一起的单个抗原上的表位上而被簇集。如大部分细菌和病毒表面含有一些不同蛋白质的许多拷贝。因此，如果BCR识别这些蛋白质中的一种蛋白质表位，那么许多的BCR就可能被簇集在入侵者上。最后，通过结合到簇集在一起的抗原表位上，BCR也可能被聚集在一起。

为了产生抗体，必须首先激活B细胞。大多数B细胞从来没有遇到它们的同源抗原，这些细胞通常被称之为原初型B细胞。激活原初型B细胞需要两种信号。第一种信号是B细胞受体和相关的信号分子的簇集，然而，仅仅交联其受体是不足以激活B细胞的，因此需要第二种信号共刺激信号，通常由辅助性T细胞提供(T细胞依赖的激活)。

IgG型抗体包括许多不同的亚型，这些亚型的Fc区有轻微的差别，因此具有不同的功能。例如，IgG型抗体的一种亚型IgG3，可以较其他任何亚型更好地固定补体。相似地，IgG1亚型擅长于结合入侵者并调理它们以利于专职吞噬细胞的吞噬，这是因为在巨噬细胞和中性粒细胞表面有能与已结合入侵者的IgG1抗体Fc区结合的受体。

T细胞共刺激分子中研究最清楚的是表达于APC表面的B7蛋白(B7-1和B7-2)，B7蛋白可以通过插入T细胞表面的受体而对T细胞提供共刺激。迄今为止已分离出了这类受体中的两种—CD28和CTLA-4。大部分T细胞表达CD28蛋白，而CTLA-4分子只在激活的T细胞中表达。现在认为，APC上的B7蛋白通过与原初T细胞的CD28受体结合，而提供激活所必需的共刺激信号。随后，一旦细胞被激活，B7蛋白与CTLA-4受体结合就可促使关掉或“去活化”T细胞。获得性免疫应答行使完其功能后对其实施关闭是非常重要的。

代表性的抗原结合功能区包括：抗体的可变区、抗体可变区的结构变构体、受体的结合域、配体结合域或酶结合域。

抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。

“可变区”是指在抗体间，可变区的某些区段的序列显著不同，所述高度可变区为各3-12个氨基酸，其主要采取β折叠构型，由三个高度可变区连接，这些高度可变区形成环，所述环连接β折叠结构及在一些情况下形成β折叠结构的一部分。各链中的高度可变区是由FR紧挨着结合在一起，而与其他链的高度可变区有助于形成抗体的抗原结合位点，恒定区不直接涉及抗体对抗原的结合。

“抗体的抗原结合片段”指能够与表位结合的抗体的片段、部分、区域或结构域，因此术语“抗原结合”与“表位结合”以及“抗体的抗原结合片段”与“抗体的表位结合片段”是相同的。抗原结合片段可以含有该类抗体的1、2、3、4、5或所有6个CDR域，并且尽管能够结合到所述表位，仍可以展现出不同的特异性、亲和力或选择性。优选地，抗原结合片段含有所述抗体的所有6个CDR域。

“抗体的抗原结合片段”可以是单条多肽链(例如，scFv)的一部分或包含单条多肽链，或者可以是两条或更多条多肽链(各自具有氨基末端和羧基末端，例如，双抗体、Fab片段、Fab2片段等)的一部分或包含两条或更多条多肽链。

“IgG”是免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)的缩写，是血清主要的抗体成分，根据IgG分子中的r链抗原性差异，人IgG有四个亚型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。

一个或多个二硫键链间连接是指第一Fc链及第二Fc链通过一个或多个二硫键链间连接，形成异源二聚体片段。在本发明中，一个或多个二硫键的形成可以是第一Fc链及第二Fc链或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区在同一个细胞内合成时形成，也可以是第一Fc链及第二Fc链或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区在不同细胞内分别合成，之后通过体外还原氧化的方法形成。

“治疗”包括但不限于以下中的一项或更多项试验表征：减轻疾病引起的一或更多种症状；减弱疾病的程度；预防或延迟疾病的恶化；预防或延迟疾病的扩散；预防或延迟疾病的复发；延迟或减缓疾病的进展；改善疾病情况；提供疾病的缓解；减少治疗疾病所需的一或更多种其他药物的剂量；延迟疾病的进展；增加或改善生活质量；增加体重增长及/或延长存活。在本发明中“治疗”可以解释为癌症的病理结果(例如肿瘤体积的减小)。

在一些实施方案中，本发明提供了免疫缀合物，其包含本文中提供的任何双特异性抗体和细胞毒性剂。在一些实施方案中，所述免疫缀合物用于治疗癌症，优选地肺癌(例如非小细胞肺癌)、肝癌、胃癌、结肠癌等。

在一些实施方案中，本发明提供了药学上可接受的载体，药学上可接受的载体是指是指药学领域常规的药物载体，包括但不限于稀释剂、赋形剂和水等；包括但不限于粘合剂如明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；包括但不限于促吸收剂如季铵化合物；包括但不限于表面活性剂如十六烷醇、十二烷基硫酸钠等。

在一些实施方案中，本文所述的方法还包括向所述受试者联合施用有效量的单抗、免疫检查点抑制剂或活性剂，其中本文所述的融合多肽是第一药物。

在一些实施方案中，所述单抗选自抗PD-1单抗、抗PD-L1单抗、抗VEGF单抗、抗IL-17单抗、抗CTLA-4单抗、抗TIM单抗、抗ICOS单抗、抗IL-6单抗、抗4-1BB单抗。

在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂选自抗PD-1免疫检查点抑制剂、抗PD-L1免疫检查点抑制剂、抗VEGF免疫检查点抑制剂、抗IL-17免疫检查点抑制剂、抗CTLA-4免疫检查点抑制剂、抗TIM免疫检查点抑制剂、抗ICOS免疫检查点抑制剂、抗IL-6免疫检查点抑制剂、抗4-1BB免疫检查点抑制剂。

本领域技术人员知晓，虽然本发明在限定所述融合多肽时所用限定语为“包括”，但其并不意味着可以在所述融合多肽中任意加入与其功能不相关的其他序列。在制备复杂组成的融合蛋白如所述融合多肽时，为了保证融合蛋白各个组成成分的空间结构、生物活性、细胞表达水平，以及为了将所述各种组分适当的融合在一起，或为了增强所述融合蛋白的抗水解能力，本领域技术人员在制备所述融合蛋白时，会根据需要在各个组分之间或所述融合蛋白的两端加入一个或多个额外的氨基酸残基，因此，如果用封闭式的表述来限定所述融合多肽将不能真实地覆盖这些情形。

本发明所用的术语“CTLA4分子胞外区”是指细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA4)的胞外区。在某个实施方案中，人CTLA4蛋白的胞外区(ECD)序列如SEQ ID NO：2所示，其为人CTLA4蛋白的第37-161位氨基酸序列(Genbank登录号NM_005214.4)。

在某些实施方案中，本发明所用的术语“能与CD73蛋白结合的活性片段”是指靶向CD73的免疫球蛋白或其修饰物、功能等同物、功能片段或变体，所述IgG为嵌合的、人源化的或全人的IgG。所述修饰物可以是化学修饰物，如酰基化、烷基化、PEG化产物，只要这些修饰物保留了靶向CD73的能力即可。所述功能等同物是指能够实现所述免疫球蛋白靶向结合CD73能力的其他多肽片段。所述功能片段是指保留了靶向CD73的能力的蛋白质片段，如单一结构域抗体、单链抗体、单链可变片段(scFv)、Fab片段或F(ab’)2片段。在某些实施方案中，所述变体是指通过在一个或多个(几个)位置的一个或多个改变，即取代、插入和/或缺失而从亲本蛋白衍生的多肽。

常见的连接片段长度为5-30个氨基酸，在本申请中，所述连接片段的序列为GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS。本发明所用的连接片段并无特殊限制，只要其起到间隔融合蛋白的两个组分，使各个组分能正确形成其各自的空间结构、保留其生物活性、细胞表达水平即可。

氨基酸的保守氨基酸是本领域公知的，本发明使用的术语“同一性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同一性的规则、标准。本发明用不同程度同一性限定的序列还必须要同时具有CTLA4分子胞外区或中和CD73的活性。本领域技术人员公知如何利用上述活性筛选变体序列的方法和手段。

实施例1：

小鼠免疫：选购6-8周龄雌性BALB/c小鼠作为实验动物。初次免疫使用50μg人CD73蛋白与完全弗氏佐剂混合形成乳剂，按0.5ml/只注射量注射小鼠，腹腔注射，每隔两周进行加强免疫，一共加强免疫四次，末次免疫一周后，收集并分离血清ELISA方法检测抗体效价，方法参考说明书。选择具有高效价的小鼠细胞制备杂交瘤制备单脾细胞悬液。收集对数生长的骨髓瘤细胞制备免疫脾细胞悬液，将骨髓瘤细胞与脾细胞按一定比例混合，用不完全培养液洗涤后，离心弃上清，将细胞沉淀和1ml PEG-4000分别置于40℃水浴中预热，之后混合为反应液并静置至出现颗粒，1min内向反应液中加入25ml预热至40℃的不完全培养基终止反应。静置后加入2ml HAT培养基，轻吹沉淀细胞使其悬浮混匀，之后补充HAT培养基至离心管内的脾细胞浓度达到1×10⁷/ml，将上述细胞悬浮液分装至96孔板培养，待细胞表面积达到孔板面积2/3以上时吸出上清液样品供抗体检测。

在96孔高吸附酶标板上包被人CD73，包被量100μL每孔，之后冲洗3次；用含1％BSA的缓冲液阻断并于25℃孵育1h，阻断量280μL/孔，孵育完成后缓冲液洗涤3次，分别向1-90号孔中加入上清液样品以及阳性血清作为对照，孵育1小时，缓冲液洗涤5次；每孔加入100μL以比例1/10000稀释于含1％BSA缓冲液里的抗小鼠IgG抗体，所述抗小鼠IgG抗体被辣根过氧化物酶标记，25℃孵育1小时，缓冲液洗涤5次；每孔加入100μL比色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺TMB，显色10min后终止显色反应，在酶标仪上读取450nm处的吸光度，根据OD450nm的强弱选取能够分泌人CD73结合抗体的阳性克隆。将筛选得到的同时具有抗原结合活性以及抗原中和活性的克隆，进行抗体DNA序列的测定。使用RNA prep Pure试剂盒提取细胞mRNA，合成cDNA第一链，将逆转录产生的cDNA第一链用于后续PCR反应，将PCR扩增得到的目的条带克隆到pGEM-T载体中，挑取单克隆由南京金斯瑞生物科技有限公司完成测序。

实施例2：

经过PCR扩增得到鼠源抗CD73抗体的轻链可变区和重链可变区，排除骨架区序列后即可得到其互补决定区序列；其中轻链的三个互补决定区CDR-L1氨基酸序列如SEQ IDNO:1；CDR-L2氨基酸序列如SEQ ID NO:2、CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；重链的三个互补决定区CDR-H1氨基酸序列如SEQ ID NO:4、CDR-H2氨基酸序列如SEQ ID NO:5、CDR-H3氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。人源化形式的抗人CD73抗体参考MoleculeImmunol的制备方法制备，在Germline数据库中选取与鼠源抗CD73抗体非CDR区匹配最好的人源化模板，将鼠源抗体CDR区移植到选择的人源化模板上，替换得到人源化抗体重链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，替换得到人源化抗体轻链可变区，氨基酸序列如SEQID NO:10所示。通过序列比对选择适合位点进行回复突变，获得的重链可变区氨基酸序列(VH)及轻链可变区氨基酸序列(VL)如表1所示。

表1.回复突变获得的氨基酸序列

CD73抗体VH	序列编号
		YS79b-85-VH	SEQ ID NO:8
YS79b-89-VH	SEQ ID NO:9
		CD73抗体VL	序列编号
YS79b-85-VL	SEQ ID NO:11
		YS79b-89-VL	SEQ ID NO:12

实施例3:

分别将人源化的抗人CD73单抗的重链可变区(SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9)与人抗体IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:13)连接，得到对应的重链全长序列。分别将人源化的抗人CD73单抗的轻链可变区(SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12)与人抗体Kappa轻链的恒定区(SEQID NO:14)连接，分别得到对应的轻链全长序列，将上述所有重链全长序列与轻链全长序列组合得到人源化抗体全长序列，经酶切连接入TL10-11(载体骨架pEGFP-N1)载体中。抗人CD73的抗体YS79b-85(重链氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，重链恒定区SEQ ID NO:13，轻链的恒定区SEQ ID NO:14)，抗人CD73的抗体YS79b-89表达载体(重链氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，重链恒定区SEQ ID NO:13，轻链的恒定区SEQ ID NO:14)，根据常规方法，获得上述抗人CD73抗体重链和轻链的表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗人CD73抗体的重链和轻链。

实施例4：

表达融合多肽A所用信号肽序列如SEQ ID NO：15所示；人CTLA4蛋白的胞外区(ECD)序列如SEQ ID NO：16所示，其为人CTLA4蛋白的第37-161位氨基酸序列(Genbank登录号NM_005214.4)；连接肽为(G₄S)₅，序列如SEQ ID NO：17所示；融合多肽A中的抗CD73抗体为YS79b-85。融合多肽B中的抗CD73抗体为YS79b-89。重链氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。利用TA克隆进入pUC57载体并将所获得的经过测序验证的阳性克隆分别命名为pUC57-CTLA4-YS79b-85和pUC57-YS79b-89，将上述阳性克隆分别与信号肽、连接肽构建表达载体并转染质粒，

扩增得到分别含有A(信号肽-人CTLA4ECD-连接肽-YS79b-85)和B(信号肽-人CTLA4ECD-连接肽-YS79b-89)的质粒A和质粒B，PCR筛选阳性克隆并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。分别将质粒A和质粒B接种至Amp液体培养基(国药集团化学试剂有限公司)，振荡培养过夜。第二天使用无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒转染人胚胎肾细胞293(赛默飞，HEK293-T)。

实施例5：

将生长状态良好、活力达到95％以上的HEK293-T细胞以1.8×10⁷个细胞的接种量接种于细胞工厂，用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养，培养箱内培养48小时使细胞贴壁完全，密度达到80％，即可用于瞬时转染。

将质粒A和质粒B同时转染细胞，分别表达融合多肽A和融合多肽B。融合多肽A和B各批次蛋白表达量为6mg/L。采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统以及亲和色谱柱于4℃下进行纯化融合多肽A和融合多肽B。融合多肽A和B的单体纯度分别为98.7％和97.5％。稳定培养转染后的细胞获得可传代细胞系。

实施例6：

检测获得的融合多肽A、融合多肽B、人源化的抗人CD73单抗与抗原CD73的结合的动力学常数。方法为：利用仪器光学表面等离子体共振技术来检测偶联包被在生物芯片上的分子与待测分子之间的结合和解离。简要地，将抗待测抗体溶于的醋酸钠缓冲溶液(pH5.0)中并偶联到CM芯片上，用1M乙醇胺封闭，结合阶段将不同浓度的anti-CD73。以25μL/min的速度注入3min，在解离阶段用PBS缓冲溶液以25μL/min的速度注入8min，结合动力学常数和解离动力学常数通过Biacore 3000软件进行分析计算。融合多肽A、融合多肽B、人源化的抗人CD73单抗的结合动力学常数、解离动力学常数和解离平衡常数如表2所示。

表2.融合多肽、人源化的抗人CD73单抗与其抗原结合的动力学常数

分别测定融合多肽A、融合多肽B、人源化的抗人CD73单抗的药代动力，简要地，选6-8周龄雌性SD大鼠随机分成2组(编号测试组1，测试组2，每组5只)，测试组1给予25nmol/kg融合多肽A；测试组2给予25nmol/kg融合多肽B。分别在0点，给药后5分钟，30分钟，1小时、2小时、3小时、6小时、9小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、168小时、216小时、264小时眼眶采血并不予抗凝，室温放置血样45min至凝血后，离心获得血清样品，血清样品冷冻于-80℃待测。

单次静脉注射的剂量为25nmol/kg的融合多肽A的药代参数如下：半衰期t_1/2为53小时，药时曲线下面积AUC_last为33728nM.hr，估算零浓度C0为98nM，表观分布容积Vd为34mL/Kg，清除率CL为0.77mL/hr/kg，平均驻留时间MRT_last为73小时。

单次静脉注射的剂量为25nmol/kg的融合多肽B的药代参数如下：半衰期t_1/2为58小时，药时曲线下面积AUC_last为31374nM.hr，估算零浓度C0为81nM，表观分布容积Vd为29mL/Kg，清除率CL为0.72mL/hr/kg，平均驻留时间MRT_last为68小时。

实施例7：

检测抗人CD73人源化单抗、融合多肽A、融合多肽B对接种于小鼠肿瘤移植物的生长抑制作用，实验材料选用人8周龄雌性小鼠(C57BL/6背景)。给试验小鼠接种MC38细胞，共接种20只，待小鼠明显荷瘤切片验证，观察肿瘤生长，记录荷瘤体积，连续给药6周，每周2次。给药第二周起每周测量1次肿瘤体积，测量其长径a，短径b，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝(a x b²)/2。

待小鼠肿瘤体积增至所需体积，按体积分组每组5只：S1,S2,S3,S4,S5(体积约200mm³)；S6,S7,S8,S9,S10(体积约150mm³)；S1,S6设置为溶媒组(注射等体积生理盐水)，S2,S7给药25nmol/kg抗人CD73人源化单抗，S3,S8给药25nmol/kg融合多肽A，S4,S9给药剂量为25nmol/kg融合多肽B，S5,S10给药剂量为等量25nmol/kg等体积抗人CD73人源化单抗和抗人CTLA4单抗混合物，试验结果如表3所示。

表3.肿瘤消融比效果实验

抗人CD73人源化单抗，S3,S8给药25nmol/kg融合多肽A，S4,S9给药剂量为25nmol/kg融合多肽B，S5,S10给药剂量为等量25nmol/kg等体积抗人CD73人源化单抗和抗人CTLA4单抗混合物，试验结果如表3所示。

由表3可见，融合多肽B相较于融合多肽A对大体积肿瘤的治疗效果更优秀，融合多肽A相较于融合多肽B对中等体积肿瘤的治疗效果更优秀，融合多肽A和融合多肽B对于中等体积肿瘤及大体积肿瘤的融瘤率明显高于等体积混合单抗，证明融合多肽的效果并非两种单抗的药效叠加。由此可见，本发明提供的融合多肽在小鼠实验中具有明显抗肿瘤活性，显著抑制了小鼠移植瘤的生长。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 杭州皓阳生物技术有限公司

<120> 一种肽标签在纯化融合多肽中的用途

<141> 2020-08-03

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(8)

<223> CDR-L1

<400> 1

Leu Cys Met Ser Ala Tyr His His

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(6)

<223> CDR-L2

<400> 2

Glu Leu Leu Met Trp Glu

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(10)

<223> CDR-L3

<400> 3

Trp Leu Met Phe Pro Thr Lys Glu Arg Leu

1 5 10

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(9)

<223> CDR-H1

<400> 4

Asn Ala Tyr Pro Leu His Tyr Met Leu

1 5

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(5)

<223> CDR-H2

<400> 5

Glu Ala Asn Pro Ser

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(10)

<223> CDR-H3

<400> 6

Ala Pro His Ile Tyr Thr Phe Val Cys Ala

1 5 10

<210> 7

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(117)

<223> CD73人源化抗体重链可变区

<400> 7

Asp Ile Ile Phe His Thr Leu Asn Arg Glu Gln Asn Val Lys Pro Glu

1 5 10 15

Met Tyr Tyr Val Trp Ala Leu Lys Trp Gln Val Met Asn Ala Tyr Pro

20 25 30

Leu His Tyr Met Leu Gly Pro Met Ala Trp Met Met Ser Tyr Tyr Leu

35 40 45

Asn Asn Met Asn Leu Gly His Met Trp Gly Glu Ala Asn Pro Ser Lys

50 55 60

Tyr Glu Met Ile Val Phe Ser Thr Ala Gln Pro Lys Thr His Leu Glu

65 70 75 80

Phe Gly Gln Tyr Ser Tyr Pro Met Glu Val Ser Arg Asn Ala Pro His

85 90 95

Ile Tyr Thr Phe Val Cys Ala His Ser Phe Tyr His Trp Ala His Asp

100 105 110

Ala Asn Ile Asn His

115

<210> 8

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(117)

<223> YS79b-85-VH

<400> 8

Asp Ile Ile Phe His Thr Leu Asn Arg Glu Gln Asn Val Lys Pro Glu

1 5 10 15

Met Ser Ala Val Trp Ala Leu Lys Trp Gln Val Met Asn Ala Tyr Pro

20 25 30

Leu His Tyr Met Leu Gly Pro Met Ala Trp Met Met Ser Tyr Tyr Leu

35 40 45

Asn Asn Met Asn Leu Gly His Met Trp Gly Glu Ala Asn Pro Ser Lys

50 55 60

Tyr Glu Met Ile Val Phe Ser Thr Ala Gln Pro Lys Thr His Leu Glu

65 70 75 80

Phe Gly Asp Tyr Ser Tyr Pro Met Glu Val Ser Arg Asn Ala Pro His

85 90 95

Ile Tyr Thr Phe Val Cys Ala His Ser Phe Tyr His Trp Ala His Asp

100 105 110

Ala Asn Ile Asn His

115

<210> 9

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(117)

<223> YS79b-85-VH

<400> 9

Asp Ile Tyr Phe His Thr Leu Asn Arg Glu Gln Asn Val Lys Pro Glu

1 5 10 15

Met Ser Ala Val Trp Ala Leu Lys Trp Gln Val Met Asn Ala Tyr Pro

20 25 30

Leu His Tyr Met Leu Gly Pro Met Ala Trp Met Met Ser Tyr Gly Leu

35 40 45

Asn Asn Met Asn Leu Gly His Met Trp Gly Glu Ala Asn Pro Ser Lys

50 55 60

Tyr Glu Met Ile Val Phe Ser Thr Ala Gln Pro Lys Thr His Leu Glu

65 70 75 80

Phe Gly Asp Tyr Ser Asp Pro Met Glu Val Ser Arg Asn Ala Pro His

85 90 95

Ile Tyr Thr Phe Val Cys Ala His Ser Phe Tyr His Trp Ala His Asp

100 105 110

Ala Asn Ile Asn His

115

<210> 10

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(108)

<223> CD73人源化抗体轻链可变区

<400> 10

Asp His Thr Phe Met Pro Trp Trp Ser Tyr Thr Phe Arg Lys Leu Pro

1 5 10 15

Ala Trp Gln Gln His Ala Leu Gly Pro Arg Glu Trp Leu Cys Met Ser

20 25 30

Ala Tyr His His Arg Val Leu Glu Tyr Asp Leu Cys Phe Lys Gln Asp

35 40 45

Ser Asn Met Leu Glu Phe Met Trp Glu Leu Leu Met Trp Glu Gly Gln

50 55 60

Gln Gln Gly Glu Pro Trp Glu Lys Thr Ser Tyr Arg Leu Leu Leu Cys

65 70 75 80

Tyr Phe Pro Tyr Trp Leu Met Phe Pro Thr Lys Glu Arg Leu Thr Thr

85 90 95

Gly Gly Gly Ser Pro Asn Ala Leu Ile Ala Gln Glu

100 105

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(108)

<223> YS79b-85-VL

<400> 11

Asp His Thr Phe Met Pro Trp Trp Ser Tyr Thr Phe Arg Lys Leu Pro

1 5 10 15

Ala Trp Thr Gln His Ala Leu Gly Pro Arg Glu Trp Leu Cys Met Ser

20 25 30

Ala Tyr His His Arg Val Leu Glu Tyr Asp Leu Cys Phe Lys Gln Asp

35 40 45

Ser Asn Met Leu Glu Phe Met Trp Glu Leu Leu Met Trp Glu Gly Gln

50 55 60

Gln Ala Gly Glu Pro Trp Glu Lys Thr Ser Tyr Arg Leu Leu Leu Cys

65 70 75 80

Tyr Phe Pro Tyr Trp Leu Met Phe Pro Thr Lys Glu Arg Leu Thr Thr

85 90 95

Gly Gly Gly Ser Pro Asn Ala Glu Ile Ala Gln

100 105

<210> 12

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(108)

<223> YS79b-85-VL

<400> 12

Asp His Thr Phe Met Pro Trp Asp Ser Tyr Thr Phe Arg Lys Leu Pro

1 5 10 15

Ala Trp Thr Gln His Ala Leu Gly Pro Arg Glu Trp Leu Cys Met Ser

20 25 30

Ala Tyr His His Arg Val Leu Glu Tyr Asp Leu Cys Phe Lys Gln Asp

35 40 45

Ser Asn Met Leu Glu Phe Met Trp Glu Leu Leu Met Trp Glu Gly Gln

50 55 60

Gln Ala Gly Glu Pro Trp Glu Lys Thr Ser Tyr Arg Leu Ala Leu Cys

65 70 75 80

Tyr Phe Pro Tyr Trp Leu Met Phe Pro Thr Lys Glu Arg Leu Thr Thr

85 90 95

Gly Gly Gly Ser Pro Asn Ala Glu Ile Ala Gln Glu

100 105

<210> 13

<211> 329

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(329)

<223> 人抗体IgG1重链恒定区

<400> 13

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

1 5 10 15

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

20 25 30

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

35 40 45

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

50 55 60

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

65 70 75 80

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

100 105 110

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

115 120 125

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

130 135 140

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

145 150 155 160

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

165 170 175

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

180 185 190

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

195 200 205

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

210 215 220

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

225 230 235 240

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

245 250 255

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

260 265 270

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

275 280 285

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

290 295 300

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

305 310 315 320

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 14

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(110)

<223> 人抗体IgG1轻链恒定区

<400> 14

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

1 5 10 15

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

20 25 30

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

35 40 45

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

50 55 60

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

65 70 75 80

Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

85 90 95

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105 110

<210> 15

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(25)

<223> 信号肽序列

<400> 15

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met

20 25

<210> 16

<211> 125

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(125)

<223> 人CTLA4蛋白的胞外区

<400> 16

Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly

1 5 10 15

Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu

20 25 30

Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val

35 40 45

Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp

50 55 60

Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile

65 70 75 80

Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu

85 90 95

Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln

100 105 110

Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp

115 120 125

<210> 17

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(25)

<223> 连接肽

<400> 17

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25

Claims

1.一种包含肽标签的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的结构为肽标签-人CTLA4蛋白胞外区-连接肽-抗CD73抗体，所述肽标签氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述人CTLA4蛋白胞外区氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示，所述连接肽氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示，所述抗CD73抗体包含：CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2和CDR-H3，所述CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

2.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述抗CD73抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述抗CD73抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。

3.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述抗CD73抗体重链可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO:9所示；所述抗CD73抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。